Funktionel magnetisk resonans-spektroskopi på 7 T i rotte tønde Cortex under bakkenbart aktivering

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Efter kontrol af blod-ilt-niveau-afhængige funktionel magnetisk resonans imaging (fed fMRI), at tilsvarende somatosensoriske tønde felt cortex området (kaldet S1BF) er korrekt aktiveret, vigtigste mål for denne undersøgelse er at kvantificere laktat indhold udsving i de aktiverede rotte hjerner af lokaliserede proton Kernemagnetisk resonans-spektroskopi (1H-MRS) på 7 T.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Blanc, J., Roumes, H., Mazuel, L., Massot, P., Raffard, G., Biran, M., Bouzier-Sore, A. K. Functional Magnetic Resonance Spectroscopy at 7 T in the Rat Barrel Cortex During Whisker Activation. J. Vis. Exp. (144), e58912, doi:10.3791/58912 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi tilbyder mulighed for at måle cerebral metabolit indholdet i vivo og noninvasively. Takket være den teknologiske udvikling over det sidste årti og stigningen i magnetisk feltstyrke er det nu muligt at få god opløsning spektre i vivo i rotte hjernen. Neuroenergetics (dvs., undersøgelse af hjernens stofskifte) og, især, metabolisk interaktioner mellem de forskellige celletyper har tiltrukket flere og flere interesse i de seneste år. Blandt disse metaboliske interaktioner drøftes eksistensen af laktat transport mellem neuroner og astrocytter stadig. Det er således af stor interesse at udføre funktionelle proton Kernemagnetisk resonans-spektroskopi (1H-MRS) i en rotte model af hjernen aktivering og overvåge laktat. Men methyl laktat peak overlapper lipid resonans toppe og er vanskeligt at kvantificere. Protokollen beskrevet nedenfor giver mulighed for metaboliske og laktat udsving skal overvåges i en aktiveret hjernen område. Cerebral aktivering er fremstillet af bakkenbart stimulation og 1H-MRS udføres i tilsvarende aktiveret tønde cortex, hvis område er opdaget ved hjælp af blod-ilt-niveau-afhængige funktionel magnetisk resonans imaging (fed fMRI). Alle trin er fuldt beskrevet: valget af anæstetika, spoler og sekvenser, at opnå effektiv bakkenbart stimulation direkte i magnet og databehandling.

Introduction

Hjernen besidder iboende mekanismer, der tillader regulering af sin store substrat (dvs., glukose), både for sine bidrag og sin udnyttelse, afhængigt af variationer i lokale hjerneaktiviteten. Selvom glukose er den største energi substrat for hjernen, har eksperimenter udført i de seneste år vist at laktat, som er produceret af astrocytter, kunne være en effektiv energi substrat for neuroner. Dette rejser hypotese af laktat transport mellem astrocytter og neuroner1. Kendt som ANLS, for astrocyte-neuron laktat shuttle2, teorien er stadig stærkt debatteret men har ført til forslaget om at glukose, i stedet for at gå direkte til neuroner, kan indtaste astrocytter, hvor det metaboliseres til laktat, en metabolit, der er , derefter overført til neuroner, der anvender det som effektiv energi substrat. Hvis sådan en shuttle findes i vivo, ville det have flere vigtige konsekvenser, både for forståelse af de grundlæggende teknikker i funktionel cerebral skanning (positron emissions tomografi [kæledyr]) og decifrere stofskifteforandringer observeret i hjernen patologier.

At studere hjernens stofskifte og, især, metabolisk interaktioner mellem neuroner og astrocytter, fire vigtigste teknikker er til rådighed (ikke herunder mikro-/ sensorer): Autoradiografi, PET, to-photon fluorescerende Konfokal mikroskopi og fru. Autoradiografi var en af de første metoder foreslået og giver billeder af den regionale akkumulering af radioaktivt 14C-2-deoxyglucose i hjernen skiver, mens PET udbytter i vivo billeder af den regionale udbredelse af radioaktivt 18 F-deoxyglucose. De begge har Ulempen ved at bruge irradiative molekyler samtidig producerer billeder i lav-rumlige opløsning. To-foton mikroskopi giver cellulære opløsning af fluorescerende sonder, men lysspredning af væv begrænser de billeddiagnostiske dybde. Disse tre teknikker har været brugt tidligere til at studere neuroenergetics i gnavere under bakkenbart stimulation3,4,5,6. In vivo MRS har den dobbelte fordel at være noninvasive og ikke-radioaktive, og enhver hjerne struktur kan udforskes. Derudover kan MRS udføres under neuronal aktivering, en teknik kaldet funktionelle MRS (fMRS), som er blevet udviklet for nylig i gnavere7. Derfor foreslås en protokol til at overvåge hjernens stofskifte under hjerneaktiviteten ved 1H-MRS i vivo og noninvasively. Proceduren er beskrevet i voksen sund rotter med hjerne aktivering fremstillet ved en luft-puff bakkenbart stimulation udføres direkte i en 7 T magnetisk resonans (MR) imager men kan tilpasses i genetisk modificerede dyr, såvel som i enhver patologisk tilstand .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr procedurer blev gennemført i overensstemmelse med retningslinjerne dyr eksperimenter i de europæiske Fællesskaber Rådets direktiv af 24 November 1986 (86/609/EØF). Protokollen mødte de etiske retningslinjer for det franske ministerium for landbrug og skove og blev godkendt af de lokale etiske udvalg (Comité d 'éthique pour L' expérimentation Animale Bordeaux n ° 50112090-A).

Bemærk: Under hr. målinger, et passende niveau af anæstesi og fysiologiske overvågning (kropstemperatur, respirationsfrekvens) er uundværligt krav.

1. dyr

  1. Brug mandlige Wistar rotter vejer mellem 350 og 450 g.
  2. Holde dem på en 12:12 h lys: mørke cyklus og giver mad og vand ad libitum.

2. anæstesi

  1. Forberede det nødvendige udstyr til anæstesi (figur 1A, B, se Tabel af materialer): en 5 mL sprøjte indeholdende medetomidine i fysiologisk kogsaltopløsning løsning (240 µg/kg/h, med en perfusion 20 µL/min), en 0,5 mL sprøjte indeholdende Atipamezol (20 μL, i 0,5 mL af saltopløsning), og øjet salve.
    Bemærk: Hold alt udstyr under emhætte, undtagen 5 mL sprøjte indeholdende medetomidine, som er placeret i sprøjten pumpe nær magnet for anæstesi under hr. erhvervelser.
  2. Placere rotten i salen, induktion, starte anæstesi ved at levere 4% isofluran og justere ilt flow til 1,5 L/min.
  3. Vurdere dybde af anæstesi ved at vurdere tilbagetrækning af pote reflekser.
  4. Når rotten ikke reagerer på stimulation, tage den ud af boksen anæstesi, placere den på bænken med sin næse i isofluran maske og vedligeholde anæstesi ved at levere 2,5% ilt på 1,5 L/min.
  5. Blidt massage halen og placere tourniquet (figur 1 c).
    Bemærk: Massage kan udføres i varmt vand med en temperatur på mellem 38 og 42 ° C, for at opnå bedre vasodilation af venerne.
  6. Indsæt den perifer intravenøst kateter (22 G), tidligere heparinized i venstre eller højre hale vene. Bemærk at en venøs tilbagevenden er observeret (en dråbe blod er synlig på den distale del af nålen) når kateteret er korrekt indsat (fig. 1 d).
  7. Blæse ud nogen luftbobler i kateteret dead space volumen bruger en 2 mL sprøjte indeholdende fysiologisk saltvand løsning og heparin.
  8. Anvende øjet salve og forberede sprøjte indeholdende Atipamezol (17 µg/mL) for at vække rotten i slutningen af forsøget.

3. rotte placering i Magnet for bakkenbart Stimulation

  1. Placere en vejrtrækning sensor på magnet seng og derefter overføre rotten fra bænken til magnet seng. Placere den i den liggende stilling med sin næse i isofluran maske, med vejrtrækning sensor placeret mellem brystkassen og magnet seng.
    Bemærk: Alt udstyr, der kommer ind i Mr rummet bør være Mr-safe.
  2. Sænke isofluran (fra 4% til 1,5%-2%) under rotte placering og skifte anæstesi til medetomidine i slutningen af denne procedure. Sikre, at de rigtige whiskers er gratis, efter at have skåret højre kant på forsiden af rotte Mr bed på forhånd at tillade flytning af knurhår.
  3. Hold rotten i position med tape og overvåge sin vejrtrækning, som skal være mellem 60 og 80 vejrtrækninger pr. minut.
  4. Gøre et sejl, der fælder alle rigtige whiskers i papir tape (figur 2). Juster fleksible outlet rør af luft-puff system langs rotte Mr bed, således at den del, der forlader røret er vinkelret og på omkring 1,5 cm fra sejlet. Fix det med papir tape.

4. bakkenbart Stimulation

  1. Tilslut fleksible inlet røret fra en komprimeret luft kilde (1 bar) til en solenoide kontrol ventil input og outlet rør til solenoide kontrol ventil output (figur 3). Sikre, at kontrol magnetventil forbliver uden for magnet rum.
  2. Stik den pulserende enhed i magnetventil og ind i magneten ved hjælp af transistor-transistor logic (TTL)-port. Konfigurere det så den pulserende frekvens = 8 Hz, den pulserende tid = 20 s, og den hvile tid = 10 s.
    Bemærk: Disse parametre, visualiseret på den lille flydende crystal display (LCD) skærm, er justerbar via de tre dedikeret analogisk potentiometre. Den elektroniske pulserende enhed, som styrer paradigmet, skal være sammensat af høj kvalitet elektroniske komponenter til at undgå enhver afdrift i tiden parametre (for korrekt efterbehandling).

5. fed fMRI erhvervelse

  1. Placere den rotte hjerne, så det er i en oprejst position og bruge øre barer til at vedligeholde det. Placer volumen array spolen over rottens hoved (figur 4A) og ordne det ved hjælp af tape. Kontroller, at sejlet flytter korrekt (anteroposterior bevægelse, ingen rotation og ingen friktion af sejl) Når luft-puff system er aktiveret ; derefter skifte det ud.
  2. Indsæt sengen og spolen i midten af magneten. Kontroller, at sejlet er stadig bevæger sig korrekt når sengen er inde i magneten når luft-puff systemet er ; derefter skifte det ud. Skifte helt fra isofluran til medetomidine (perfusion sats: 20 µL/min).
  3. Tjek at rotten er godt beliggende ved hjælp af en lokalisering sekvens (TE = 2,5 ms; TR = 100 ms; gennemsnitlige = 1; gentagelse = 1; udsnit = 1 mm; billedstørrelse = 256 x 256; Field of view (FOV) = 50 x 50 mm; Skan tid = 12 s 800 ms). Træk fanen Localizer sekvens i instruktion navn og klik på Fortsæt.
  4. Træk fanen T2_Star_FID_EPI sekvens i instruktion navn, center FOV på midten af hjernen, og klik på fanen justering platform til at åbne den redigerede scan instruktion. Optage et B0 kort og gå videre til en scanning shim.
    Bemærk: For en B0 kort, bruge følgende parametre: første echo tid = 1,65 ms; TR = 20 ms, gennemsnitlige = 1; flip vinkel = 30°; ECHO afstand = 3.805 ms; udsnit = 58 mm; billedstørrelse = 64 x 64 x 64; FOV = 58 x 58 x 58 mm; Skan tid = 1 m 24 s 920 ms. For scanning shim, kan bruge følgende parametre: voxel selektive excitation = damp Gaussisk puls; TE = 5 ms; blande tid = 10 ms; erhvervelse varighed = 204.8 ms; båndbredde = 10.000 Hz; hviletiden = 50 μs).
  5. Starte T2 Star_FID_EPI sekvens (TE = 16.096 ms; TR = 500 ms; gennemsnitlige = 1; gentagelse = 600; udsnit = 1 mm; fire på hinanden følgende udsnit; billedstørrelse = 128 x 128; FOV = 20 x 20 mm; båndbredde = 333,333.3 Hz; Skan tid = 5 min 00 s).
    Bemærk: På grund af TTL porten, vil en ekstern udløser signal starte luft-puff system på samme tid. Paradigmet = [20 s aktivering + 10 s resten] x 10, for den samlede varighed af de 600 scanninger, 500 ms pr scan. Skiverne er centreret på midten af tønde feltet område.
  6. Erhverve en anden lokalisering sekvens, (samme som i et enkelt beskrevet i trin 5.3) for at sammenligne med den første, og tjekke om rotten har flyttet under T2_Star_FID_EPI-sekvensen.
  7. Bringe sengen til sin oprindelige holdning, fjerne volumen array coil, og Tilslut overflade spolen.

6. fed behandling

  1. Åbn filen T2 Star_FID_EPI og læse T2 Star_FID_EPI billede i Billedvisning. Åbn vinduet opstart af den funktionelle controller, kaldet FunController.
  2. I denne behandling under fanen Vælg vinduet funktionel billeddannelse og definere stimulation protokol (varighed og vekslen af On/Off perioder, svarende til paradigmet anvendes).
  3. Vælg protokol-vinduet (datasæt med 600 frames) og indsætter værdien af 40 i fanen På periode og 20 i Off perioden -tab. Klik på fanen Invertere Attribution og træk skydekontrollen Stimulation stater til venstre for at vælge den værdien 1.
  4. Klik på på Median filter i flyet til forbehandling og Median filter (2D, 3D) for efterbehandling i vinduet forbehandling.
  5. Klik på fanen Execute og træk markører for at justere overlay opslagstabel. Visualisere aktiveret hjernen område (figur 4B).

7. proton fru opkøb

  1. For at korrekt placere overflade spolen, ændre placeringen af rotte hoved. Drej hovedet (ca. 30° med uret), så overfladen spolen (figur 5A) kan placeres lige over venstre tønde cortex samtidig være horisontale og beliggende på byens magnet når inde i magneten.
  2. Placer overflade spolen, ordne det på rotte hjernen ved hjælp af tape (figur 5B), og kontroller, at sejlet flytter korrekt (anteroposterior bevægelse, ingen rotation og ingen friktion af sejlet) Når luft-puff system er aktiveret ; Skift det derefter slukke på hovedafbryderen.
  3. Kontroller, at sejlet bevæger sig korrekt, når sengen er inde i magneten når luft-puff systemet er tændt. Derefter skifte det ud.
  4. Tjek er rotten placeret korrekt ved hjælp af en lokalisering sekvens. Indstille parametre som følger: TE = 2,5 ms; TR = 100 ms; gennemsnitlige = 1; gentagelse = 1; udsnit = 1 mm; billedstørrelse = 256 x 256; FOV = 50 x 50 mm; Skan tid = 12 s 800 ms.
    1. Træk fanen Localizer sekvens i vinduet instruktion navn og klik på Fortsæt for at udføre scan-programmet.
  5. Når hjernen lokalisering er korrekte, Træk fanen T2_TurboRARE rækkefølge i vinduet instruktion navn og klik på Fortsæt for at udføre scan-programmet. Disse anatomiske billeder, sammen med den tidligere fed fMRI erhvervelse, vil tillade den korrekte lokalisering af voxel i S1BF for MRS.
    Bemærk: T2_TurboRARE parametre er 14 skiver, 2 mm pr. skive, FOV = 2,5 x 2,5 cm, TE = 100 ms, TR = 5.000 ms, matrix = 128 x 128, sekvens tid = 2 min. 40 s.
  6. Træk fanen LASER sekvens i vinduet instruktion navn , skal du placere voxel (2 mm høj, 2,5 mm lang, 3 mm dyb) i midten af S1BF området.
    1. Brug en rotte hjernen atlas og fed fMRI ekstraudstyr til at lokalisere zonen på T2 billeder (figur 6). Klik på fanen justering platform til at åbne den redigerede scan instruktion. Klik på fanen Wobble og ændre impedans (elektronisk lastning) på Modtag spolen lidt til at tune den. Klik på fanen Anvend når tuning er færdig lukke instruktion editoren og anvende ændringerne i den redigerede instruktion.
  7. Optage et B0 kort og gå videre til at scanne shim og derefter udføre en lokal shim.
    Bemærk: Til B0 kort, bruge følgende parametre: første echo tid = 1,65 ms; TR = 20 ms, gennemsnitlige = 1; flip vinkel = 30°; ECHO afstand = 3.805 ms; udsnit = 58 mm; billedstørrelse = 64 x 64 x 64; FOV = 58 x 58 x 58 mm; Skan tid = 1 m 24 s 920 ms. For scanning shim, kan bruge følgende parametre: voxel selektive excitation damp Gaussisk puls; TE = 5 ms; blande tid = 10 ms; erhvervelse varighed = 204.8 ms; båndbredde = 10.000 Hz; hviletiden = 50 μs. For den lokale shim, kan bruge følgende parametre: vand undertrykkelse, dampe erhvervelse varighed = 1,363.15 ms; point = 4096; båndbredde i Hz = 3,004.81 Hz; båndbredde i ppm = 10 ppm; hviletiden = 166.40 μs; spektrale opløsning = 0,37 Hz/point. Parametre, LASER: echo tid = 19.26 ms; TR = 2.500 ms; gennemsnit = 128 eller 32; Skan tid = 5 min 20 s eller 1 min. 20 sek. erhvervelse point = 4096.
  8. Udføre 1H-fru.
    1. Start 1H-MRS erhvervelse først under en hvileperiode (4 x 32 LASER scanninger + 128 LASER scanner; 2.500 ms pr. Skan).
    2. Erhverve en anden lokalisering sekvens, (samme som i et enkelt beskrevet i trin 5.3) for at sammenligne med den første indspillede og sikre, at rotten ikke har flyttet under LASER erhvervelse.
    3. Udføre 1H-MRS under bakkenbart aktivering ved hjælp af LASER-sekvens (4 x 32 LASER scanninger + 128 LASER scanner; 2.500 ms pr. Skan) med luft-puff system (paradigme = 20 s aktivisering og 10 s hvile).
    4. Igen, udføre en lokalisering sekvens for at kontrollere, om rotten har flyttet.
      Bemærk: Antallet scanninger og hvile/aktiveret perioder kan blive tilpasset og ændret, men altid sørge for at rotten ikke er bevægelse af regelmæssigt udfører en lokalisering sekvens.
  9. Bringe sengen til sin oprindelige holdning, fjerne overflade spolen, og flytte rotten tilbage til bænken. Tilføre en hud fold i rottens tilbage til omvendt anæstesi og vække det Atipamezol.

8. proton fru behandling

  1. Åbn LCModel-softwaren og klikke på den relevante fane til at vælge den rigtige datatype ( Gratis induktion henfald fil) og vælge den rigtige fil. Klik på fanen OK , når dette er gjort.
  2. Optimere kvantificering kontrolparametre trin for trin.
    1. I afsnittet titel manuelt indtaste en titel og definere en passende ppm interval (fx, 0,2 til 4.0 ppm) ved manuelt at skrive i den nødvendige værdi i de respektive felter.
    2. Vælg i afsnittet grundlaget file og hente den ønskede fil til at passe makromolekyle baseline korrekt (det kan være fastsat af software leverandøren).
    3. Definere og indlæse input kontrolparametre. Forberede Gem proces af alle nyttige filtyper på forhånd (tabel = kompakt tabeller; PS = nødvendige PostScript-output; CSV = formatet for regneark; KOORD = koordinater for parceller). Klik på fanen RunLCModel til at starte LCModel kvantificering.
  3. Definere udvalgte metabolitter for at generere statistikker.
    Bemærk: LCModel giver metabolit kvantificering og skøn fejl af en værdi, der kaldes Cramér-Rao nedre grænse (CRLB). En værdi med en CRLB < 15 betragtes som en optimal kvantificering. En CRLB > 25 angiver en upålidelig værdi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol giver mulighed for kvantificering af metabolitten udsving under cerebral aktivering, der er fremstillet ved højre bakkenbart stimulation direkte i magneten.

I denne undersøgelse var det overordnede mål med fed fMRI til at kontrollere, at bakkenbart stimulation var effektiv, at visualisere det aktiverede S1BF område og korrekt finde voxel for 1H-fMRS. Enheden er bygget til bakkenbart aktivering er effektiv. Faktisk, når rigtige whiskers blev stimuleret ved hjælp af hjemmelavet luft-puff system, et positivt signal om fed blev fundet i den venstre tønde cortex (figur 4B), også kaldet S1BF, til feltet somatosensoriske tønde (n = 8). Et positivt signal enhancement blev fundet i den venstre tønde cortex i otte ud af otte rotter, mens kun baggrund blev opdaget i de højre hjernehalvdel. Når fed fMRI blev udført uden bakkenbart stimulation, blev ingen signal enhancement observeret enten venstre eller højre S1BF.

I en sammenligning mellem anatomiske hr. billeder og rat brain atlas ordninger8tillader området aktiveret hjernen visualiseret ved fed fMRI voxel skal placeres i området S1BF, som aktiveres under bakkenbart stimulation. Denne voxel ligger på tre på hinanden følgende dias (1 mm tyk), da den tønde cortex er 3 mm lange. Når hjernen dias er stort set opdelt i fire kvartaler, voxel er placeret i øverste venstre fjerdedel på en cirka 45° vinkel (figur 6).

Paradigme for bakkenbart stimulation blev tændt, konstateredes en stigning i laktat indhold i den venstre S1BF (figur 6, typisk spectra er fremstillet i en rotte). Bedre visualisere metaboliske udsving mellem hvile og aktiveret perioder, en spektral subtraktion blev udført (figur 6). Fra denne fratrukkede spektrum, stigningen i laktat indhold med hjerne aktivering blev visualiseret meget mere let, mens i denne rotte, N-acetylaspartate (Nielsen) signal var lidt faldt. Laktat stigning under neuronal stimulation blev også observeret på den spektrale deconvolution (figur 7AB). Mens laktat højdepunkt var næppe fundet på i vivo spektrum i hvile, var LCModel i stand til at kvantificere det (figur 7A) med nøjagtighed og gode CRLB værdier. Ud af 23 rotter havde kun én spektrum faktisk en CRLB værdi for laktat kvantificering svarende til 24. Ingen var > 25. For alle andre spektre, værdierne varierede mellem 3 og 19.

Variationer i laktat indhold i alle 23 rotter er præsenteret i figur 8. Ud af 23 rotter, blev et fald i laktat indhold observeret i en rotte. Der var en statistisk signifikant forskel i laktat indhold mellem hvile og aktiveret perioder (0.132 ± 0,012 og 0.163 ± 0.011, henholdsvis værdier slægtninge til PCr + Cr indhold, parret t-test, p = 0.0005 [parametrisk, tosidet] n = 23). Derfor, en stigning på 31,6% ± 7,8% i laktat indhold blev målt under neuronal stimulation.

En mindre nedgang i NAA indhold kan ses i figur 6, som repræsenterer typisk spectra er fremstillet i et dyr. Men denne NAA variation ikke var væsentlig (en 1,2% ± 1,2% fald blev målt, n = 23).

Figure 1
Figur 1: udstyr og skridt for anæstesi. (A) billede af udstyr skal forberedes før anæstesi. (B) isofluran pumpe og induktion kammer. (C) Tourniquet placering. (D) billede viser kateteret er indsat korrekt; Bemærk dråbe blod i kateteret nål, som er et positivt tegn på en korrekt placering i venen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: bakkenbart stimulation. Alle rigtige whiskers er fanget i et sejl lavet med papir tape. Sejlet giver mulighed for alle rigtige whiskers at blive stimuleret på samme tid med luft-puff system og derfor maksimerer neuronal aktivering af tønde cortex. Outlet af luft-puff system (sort tube) bør være placeret omkring 1,5 cm og vinkelret på sejlet. Check uden for magnet for at sikre at sejlet er bevægelige korrekt ved at tænde air-puff system. Sejlet skal flytte på 8 Hz i anteroposterior retning (ingen rotation). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: luft-puff system for bakkenbart stimulation. (A) A fleksible rør forbinder trykluft til (B) solenoide kontrolventil. En anden fleksible rør bringer pulserende luft fra solenoide kontrol ventil output til sejlet. Solenoide kontrolventil er sluttet til den pulserende enhed, som styrer paradigme. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: fed fMRI. (A) volumen array coil placering. Rotte hoved er i en vandret position og blokeret af øre barer. Kontroller at sejlet er bevæger sig frit og ikke er blokeret af spolen eller Mr seng. (B) en typisk fed signal i den aktiverede venstre tønde cortex (rød pil). Intet signal registreres i de kontralaterale højre hjernehalvdel (blå pil). Tærsklen, der er angivet på 76,5% af maksimalt antal intensitetsværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: overflade coil. (A) billede af overflade spolen anvendes i denne undersøgelse. (B) overflade coil placering. Rotte-lederen slås lidt således at venstre tønde cortex og derfor overflade spolen er placeret i midten af Mr sengen (hovedet er vendt i en vinkel på omkring 30°, et godt kompromis mellem den korrekte placering af den venstre tønde cortex for Kont CE-coil og frie bevægelser af sejl af de rigtige whiskers, som ikke bør være blokeret af Mr seng). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: typisk lokaliseret 1H-MRS i hvile (blå spektrum) og under bakkenbart aktivering (røde spektrum). Voxel (grøn firkant) ligger i den venstre S1BF på de anatomiske T2_TurboRARE billeder ved hjælp af rotte hjernen atlas ordninger og signal forstærkning på fed fMRI billeder. Den spektrale subtraktion er afbildet i sort. Laktat og N-acetylaspartate (Nielsen) toppe er angivet på 1.32 og 2.02 ppm, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: typisk spektrale deconvolution MRS Spectra. (A) Deconvolution af et 128-scan resten spektrum. (B) Deconvolution en 128-scanning aktiveret spektrum. Rester, subtraktion mellem eksperimentelle spektrum (rå data), og LCModel fit; MM = makromolekyle; CR = kreatin + fosforkreatin; PCho + GPC = phosphocholine + glycerophosphocholine; NAA = N-acetylaspartate; Lac = laktat; GABA = γ-aminosmørsyre; Localisation = glutamin; Glu = glutamat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: variationer i laktat indhold under hjernestimulation. Blå prik: laktat indhold i hvile, bestemmes af LCModel og i forhold til kreatin + fosforkreatin indhold. Rød prik: laktat indhold under bakkenbart stimulation, bestemmes af LCModel og i forhold til kreatin + fosforkreatin indhold. Forskellen mellem aktiveret og hvile, p = 0.0005, parret t-test (parametrisk, to-sidet), n = 23. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tønde cortex, også kaldet S1BF for somatosensoriske cortex eller tønde felt, er en region inden for den kortikale lag IV, som kan observeres ved hjælp af cytokrom c oxidase farvning9, og dets organisation er kendt, da det har været stort set beskrevet 10,11. En vibrissa er forbundet til en tønde, hvor omkring 19.000 neuroner er organiseret i en kolonne12. Bakkenbart til tønde cortex pathway har flere fordele. Først, den kan aktiveres inde i magneten ved hjælp af en Mr-kompatible luft-puff system, som kan være let hjemmelavet (for at sikre, at i den største del af S1BF området, der svarer ca til størrelsen af voxel som MRS udføres alle knurhår er klemt i et sejl, der giver mulighed for stimulering af et maksimum af vibrissa). Andet lige bakkenbart aktivering fører til venstre tønde cortex aktivering, og denne hjerne område er beliggende i den somatosensoriske cortex, som tillader brug af en høj-følsom overflade coil. For det tredje, denne metode for at aktivere den somatosensoriske cortex er noninvasive sammenlignet med elektrisk pote stimulation, har Ulempen at stimulere andre hjernestrukturer, herunder nogle i højre hjernehalvdel13. Den protokol, der bruges her er derfor den mest egnede til at udføre en in vivo noninvasive og langsgående undersøgelse af hjernens stofskifte under cerebral aktivering.

Valg af anæstesi er afgørende, da mange af anæstetika fremkalde ændringer i neurovaskulære kobling, hjernens stofskifte, og/eller hjerne aktivitet14,15. For eksempel isofluran, den mest almindelige anæstesi anvendes til Mr, fører til en tre-til seksdobling stigning i hjernen laktat indhold15,16 og bør derfor ikke anvendes i hjernen metaboliske undersøgelser. Medetomidine er en en2-adrenoreceptor agonist, som inducerer pålidelige sedation, analgesi, muskelafslapning og anxiolysis17. Disse virkninger kan vendes hurtigt ved hjælp af Atipamezol, en en2-antagonist. Medetomidine er den bedste kandidat til at udføre funktionelle studier i gnavere18 , da det har en meget ringe indvirkning på fed signalet og de laveste ændringer i hjernen metabolit indholdet.

Det er også vigtigt at følge bakkenbart aktivering paradigme korrekt. Da NMR erhvervelser vare flere minutter, er brugen af successive aktivering/hviletid afgørende for at begrænse desensibilisering af neuroner i området aktiveret hjernen. Parametrene for dette paradigme (20 s af aktivering efterfulgt af en hviletid på 10 s) blev udvalgt til at opnå den højeste fed fMRI signal i den tilsvarende tønde cortex. Meget pleje skal tages til at respektere disse tidsvinduer, da det er afgørende at fastslå aktiveret/hviletid for fed behandling, selvom det er kontrolleret af TTL porten. For at opnå et højt niveau af tønde cortex aktivering, sejlet at grupper knurhår sammen er også vigtigt, da det giver mulighed for den største del af S1BF området at blive stimuleret. Meget pleje skal tages til at placere outlet luft røret foran dette sejl, så den kan bevæge sig på en anteroposterior fly. Hyppigheden er kalibreres omhyggeligt, da det har vist sig at neuroner i den tønde cortex er aktiveret når bakkenbart stimulation frekvens er mellem 5 og 15 Hz19. Ved hjælp af en lavere eller højere frekvens vil ikke føre til aktivering af S1BF området.

Den protokol, der bruges i denne undersøgelse gør det muligt at sammenligne spektre erhvervet i den samme hjerne område i hvile og under brain stimulation, og derfor, for at overvåge metaboliske ændringer forbundet med cerebral aktivering. Det er vigtigt at foretage en lokalisering sekvens i begyndelsen og slutningen af NMR spektroskopi protokol, at sikre at dyret ikke er flyttet, og at forskelle i metaboliske indhold målt mellem hvile og aktiveret på grund af hjernen stimulation og ikke til bevægelsen artefakter.

Ved hjælp af den protokol, der er beskrevet heri, en stigning i laktat indhold blev målt mellem hvile og aktiveret perioder. Laktat stigning ved hjælp af i vivo NMR spektroskopi under hjerne aktivering blev først observeret i mennesker i de tidlige 1990s20,21. Men de fleste målinger blev udført i mennesker snarere end gnavere, hvor signal-støj-forholdet er meget lavere. I rat, blev ex vivo NMR kvantificering af laktat under rotte hjerne aktivering udført af Mazuel et al. 22, der observeret en stigning i hjernen laktat indhold med neuronal aktivering. Resultaterne præsenteres her viser, at laktat var steget under bakkenbart aktivering. Da lokaliserede MRS ikke tillader cellulære opløsning, er det imidlertid stadig ukendt fra hvilke cellulære rum laktat kommer (neuroner eller astrocytter). For at gå videre i forståelsen af cerebral metaboliske udvekslinger, som stadig drøftes ANLSH (astrocyte-neuron laktat shuttle hypotese), har denne protokol skal anvendes på genetisk modificerede dyr for de centrale elementer i denne transport, som den monocarboxylate transportører.

I undersøgelsen beskrives her, blev ingen statistisk signifikant forskel i NAA indhold observeret. Et fald i NAA indhold under visuel stimulation blev tidligere fundet i mennesker23,24,25, men ikke bekræftet af Mangia og Tkac26. I den aktuelle undersøgelse observeret vi en stigning i NAA indhold under hjerne aktivering i 50% af rotterne og et fald i anden halvdelen. NAA bør derfor undgås som intern reference til kvantificering under funktionelle Mrs ingen andre variation i metabolit indhold blev opdaget.

Begge laktat og NAA variationer under neuronal aktivering har ført til kontroverser23,26,27,28,29. For at fremme vores forståelse af disse metaboliske udsving knyttet til hjerneaktivitet, ville det være interessant at anvende denne protokol til transgene dyr. Dette ville give yderligere oplysninger om den underliggende proces. Samlede, lokaliseret 1H-MRS under en opgave eller funktionelle MRS29, er en spirende teknik i gnavere, relevante for studiet af regionale dynamiske ændringer i metabolitter i normal eller patologiske hjerner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af LabEx TRAIL grant, reference ANR-10-LABX-57, og en fransk-schweiziske ANR-FNS tildele reference ANR-15-CE37-0012. Forfatterne vil gerne takke Aurélien Trotier for hans teknisk support.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mL syringe with needle Becton, Dickinson and Company, USA 2020-10 0.33 mm (29 G) x 12.7 mm
1H spectroscopy surface coil Bruker, Ettlingen, Germany T116344
7T Bruker Biospec system Bruker, Ettlingen, Germany 70/20 USR
Arduino Uno based pulsing device custom made
Atipamezole Vétoquinol, S.A., France V8335602 Antisedan, 4.28 mg
Breathing mask custom made
Eye ointment TVM laboratoire, France 40365 Ocry gel 10 g
Induction chamber custom made 30x17x15 cm
Inlet flexible pipe Gardena, Germany 1348-20 4.6-mm diameter, 3m long
Isoflurane pump, Model 100 series vaporizer, classic T3 Surgivet, Harvard Apparatus WWV90TT from OH 43017, U.S.A
Isoflurane, liquid for inhalation Vertflurane, Virbac, France QN01AB06 1000 mg/mL
KD Scientific syringe pump KD sientific, Holliston, USA Legato 110
LCModel software LCModel Inc., Ontario, Canada 6.2
Medetomidine hydrochloride Vétoquinol, S.A., France QN05CM91 Domitor, 1 mg/mL
Micropore roll of adhesive plaster 3M micropore, Minnesota, United States MI912
Micropore roll of adhesive plaster 3M micropore, Minnesota, United States MI925
Monitoring system of physiologic parameter SA Instruments, Inc, Stony Brook, NY, USA Model 1025
NaCl Fresenius Kabi, Germany B05XA03 0.9 % 250 mL
Outlet flexible pipe Gardena, Germany 1348-20 4.6-mm diameter, 4m long
Paravision software Bruker, Ettlingen, Germany 6.0.1
Peripheral intravenous catheter Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon SP500930S 22 G x 1", 0.85x25 mm, 35 mL/min
Rat head coil Bruker, Ettlingen, Germany
Sodic heparin, injectable solution Choai, Sanofi, Paris, France B01AB01 5000 IU/mL
Solenoid control valves, plunger valve 2/2 way direct-acting Burkert, Germany 3099939 Model type 6013
Terumo 2 ml syringe Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon SY243 with 21 g x 5/8" needle
Terumo 5 mL syringe Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon 05SE1
Wistar RJ-Han rats Janvier Laboratories, France

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55, 1251-1262 (2007).
  2. Pellerin, L., Magistretti, P. J. Glutamate uptake into astrocytes stimulates aerobic glycolysis: a mechanism coupling neuronal activity to glucose utilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10625-10629 (1994).
  3. Cholet, N., et al. Local injection of antisense oligonucleotides targeted to the glial glutamate transporter GLAST decreases the metabolic response to somatosensory activation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21, 404-412 (2001).
  4. Voutsinos-Porche, B., et al. Glial Glutamate Transporters Mediate a Functional Metabolic Crosstalk between Neurons and Astrocytes in the Mouse Developing Cortex. Neuron. 37, 275-286 (2003).
  5. Zimmer, E. R., et al. [18F]FDG PET signal is driven by astroglial glutamate transport. Nature Neuroscience. 20, (3), 393-395 (2017).
  6. Haiss, F., et al. Improved in vivo two-photon imaging after blood replacement by perfluorocarbon. The Journal of Physiology. (2009).
  7. Mullins, P. G. Towards a theory of functional magnetic resonance spectroscopy (fMRS): A meta-analysis and discussion of using MRS to measure changes in neurotransmitters in real time. Scandinvian Journal of Psychology. 59, 91-103 (2018).
  8. Rat Brain Atlas. Available from: http://Labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas/ (2018).
  9. Wong-Riley, M. T., Welt, C. Histochemical changes in cytochrome oxidase of cortical barrels after vibrissal removal in neonatal and adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77, 2333-2337 (1980).
  10. Petersen, C. C. The functional organization of the barrel cortex. Neuron. 56, 339-355 (2007).
  11. Cox, S. B., Woolsey, T. A., Rovainen, C. M. Localized dynamic changes in cortical blood flow with whisker stimulation corresponds to matched vascular and neuronal architecture of rat barrels. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13, 899-913 (1993).
  12. Feldmeyer, D. Excitatory neuronal connectivity in the barrel cortex. Frontiers in Neuroanatomy. 6, 24 (2012).
  13. Boussida, S., Traore, A. S., Durif, F. Mapping of the brain hemodynamic responses to sensorimotor stimulation in a rodent model: A BOLD fMRI study. PLoS One. 12, e0176512 (2017).
  14. Heinke, W., Koelsch, S. The effects of anesthetics on brain activity and cognitive function. Current Opinion in Anesthesiology. 18, 625-631 (2005).
  15. Horn, T., Klein, J. Lactate levels in the brain are elevated upon exposure to volatile anesthetics: a microdialysis study. Neurochemistry International. 57, 940-947 (2010).
  16. Boretius, S., et al. Halogenated volatile anesthetics alter brain metabolism as revealed by proton magnetic resonance spectroscopy of mice in vivo. Neuroimage. 69, 244-255 (2013).
  17. Sinclair, M. D. A review of the physiological effects of alpha2-agonists related to the clinical use of medetomidine in small animal practice. Canadian Veterinary Journal. 44, 885-897 (2003).
  18. Weber, R., et al. A fully noninvasive and robust experimental protocol for longitudinal fMRI studies in the rat. Neuroimage. 29, 1303-1310 (2006).
  19. Hartmann, M. J., Johnson, N. J., Towal, R. B., Assad, C. Mechanical characteristics of rat vibrissae: resonant frequencies and damping in isolated whiskers and in the awake behaving animal. The Journal of Neuroscience. 23, 6510-6519 (2003).
  20. Prichard, J., et al. Lactate rise detected by 1H NMR in human visual cortex during physiologic stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 5829-5831 (1991).
  21. Sappey-Marinier, D., et al. Effect of photic stimulation on human visual cortex lactate and phosphates using 1H and 31P magnetic resonance spectroscopy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 12, 584-592 (1992).
  22. Mazuel, L., et al. A neuronal MCT2 knockdown in the rat somatosensory cortex reduces both the NMR lactate signal and the BOLD response during whisker stimulation. PLoS One. 12, e0174990 (2017).
  23. Castellano, G., et al. NAA and NAAG variation in neuronal activation during visual stimulation. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 45, 1031-1036 (2012).
  24. Sarchielli, P., et al. Functional 1H-MRS findings in migraine patients with and without aura assessed interictally. Neuroimage. 24, 1025-1031 (2005).
  25. Baslow, M. H., Hrabe, J., Guilfoyle, D. N. Dynamic relationship between neurostimulation and N-acetylaspartate metabolism in the human visual cortex: evidence that NAA functions as a molecular water pump during visual stimulation. Journal of Molecular Neuroscience. 32, 235-245 (2007).
  26. Mangia, S., Tkac, I. Dynamic relationship between neurostimulation and N-acetylaspartate metabolism in the human visual cortex: evidence that NAA functions as a molecular water pump during visual stimulation. Journal of Molecular Neuroscience. 35, 245-248 (2008).
  27. Baslow, M. H., Hrabal, R., Guilfoyle, D. N. Response of the authors to the Letter by Silvia Mangia and Ivan Tkac. Journal of Molecular Neuroscience. 35, 247-248 (2008).
  28. Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilisation in the brain. The Journal of Physiology. 596, 347-350 (2018).
  29. Bak, L. K., Walls, A. B. CrossTalk opposing view: lack of evidence supporting an astrocyte-to-neuron lactate shuttle coupling neuronal activity to glucose utilisation in the brain. The Journal of Physiology. 596, 351-353 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics