Eine neue Portable In-vitro- Exposition Kassette für Aerosol-Sampling

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Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um tragbare zellulären Aerosol Belichtungen durchführen und zelluläre Reaktion zu messen. Die Methode verwendet Zellen, an der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle, imitiert in Vivo Physiologie gewachsen. Zelluläre Reaktion auf Kupfer Nanopartikel Aerosole wurde als oxidativer Stress durch reaktiven Sauerstoff-Spezies-Generation und Zytotoxizität als Laktat-Dehydrogenase Freisetzung beobachtet.

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Secondo, L. E., Wygal, N. J., Lewinski, N. A. A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling. J. Vis. Exp. (144), e58916, doi:10.3791/58916 (2019).

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Abstract

Dieses Protokoll stellt ein neues in-vitro- Belichtung System, getragen wird, einschließlich seiner Charakterisierung und Leistung. Air-Liquid-Schnittstelle (ALI) in-vitro- Belichtung Systeme sind oft groß und sperrig, Transport zum Feld und Betrieb an der Quelle der Emission oder innerhalb der Atemzone erschwert. Durch Miniaturisierung dieser Systeme kann im Labor gebracht werden, zum Feld, Beschleunigung Verarbeitungszeit und Bereitstellung einer angebrachter Belichtungsmethode, die nicht das Aerosol vor der Kontaktaufnahme mit den Zellen verändert wird. Die Portable In-vitro- Exposition Kassette (PIVEC) passt eine 37-mm-Filterkassette für in-vitro- Toxizitätstests außerhalb der traditionellen Labor ermöglichen. Die PIVEC war geprägt mit drei Größen der Kupfernanopartikel Ablagerung Effizienz basierend auf gravimetrische bestimmen und Partikelanalyse Nummer Konzentration. Anfängliche Zytotoxizität Experimente wurden mit exponierten Lungenzellen zu bestimmen, die Fähigkeit des Systems, Partikel zu hinterlegen, unter Beibehaltung der Zellviabilität durchgeführt. Die PIVEC bietet eine ähnliche oder höhere Ablagerung Effizienz im Vergleich zur verfügbaren senkrecht fließen in-vitro- Belichtungsgeräte. Trotz der geringeren Probendurchsatz verleiht der Kleinheit einige Vorteile der aktuellen in-vitro- ALI Belichtung Systeme. Dazu gehören die Fähigkeit, persönliche Überwachung getragen werden, Mobilität aus dem Labor, um die Quelle der Emissionen und die Option zum Einrichten mehrerer Systeme für räumliche Auflösung und gleichzeitig einen niedrigeren Benutzer Kosten. Die PIVEC ist ein System, das Sammeln von Aerosolen im Feld und in die Atemzone auf einem Luft-Schnittstelle, in-vitro- Modell.

Introduction

Persönlichen Probenahme mittels in-vitro- Techniken könnten umfassende Informationen über die biologischen Wirkungen der Aerosole am Arbeitsplatz. 1 Forderungen an Verunreinigungen in der Luft enthalten Forderungen gegenüber dem chemischen Stoff selbst, um die gesammelten Luftproben getauchten Bedingungen wo das Gas die Zellsuspension intermittierende Exposition mit einem Gerät wie ein Rocker oder direkte eingeführt ist Forderungen an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit (ALI). 2 viele dieser Techniken erfolgt mit Zellen in Suspension oder die Entnahme von Proben vor der Belichtung, von die jede die toxikologische Studie aufgrund von möglichen Änderungen in das Aerosol beeinflussen kann. 3 um diese Änderungen zu vermeiden, kann das Labor zum Feld mit mehreren in-vitro- ALI Kultur Belichtung Systeme gebracht werden, die in der Literatur,4,5,6,7verwendet werden, 8,9,10,11,12,13 aber nur wenige sind im Handel erhältlich. 8 , 9 , 12 dieser Systeme sind oft sperrig, vor allem wenn Sie Instrumente zur Regulierung der Temperatur und Luftfeuchtigkeit von der zellulären Umgebung und der Durchflussmenge des Aerosols Probe. Mithilfe der PIVEC können Aerosol Belichtungen außerhalb einer traditionellen Testumgebung oder innerhalb der Atemzone durchgeführt werden, während der Inhalation Bedingungen imitiert.

Die Bestimmung des Aerosol Deposition in Vitro ist wichtig, die Untersuchung der Auswirkungen auf die Gesundheit durch Inhalation. Der Atemzone ist der Bereich innerhalb 30 cm vom Mund und Nase,14 entscheidend für das Verständnis der Exposition mit Nanopartikeln und für die Anbindung an die biologischen Effekte in der Lunge. 2 oft die Ablagerung auf Zellen einen Wirkungsgrad von Ablagerung, die Partikel abgeschieden auf und von den Zellen geteilt durch die Partikel in die System-6,-15 oder Masse anhand der gleichen Mengen verabreicht aufgenommen bezeichnet. 4 , 16 die aktuellen Methoden zur Messung von Aerosolen in die Atemzone sind Filter basieren, Erfassung von Teilchen innerhalb einer bestimmten Abtastzeitabschnitts und Filter verwenden, um weitere Tests durchzuführen. 17 persönliche Überwachung erfordert ein kleines System, das mit dem Kompromiss von weniger Proben kommt.

Es gibt viele Ansätze, die die gesundheitlichen Auswirkungen von Aussetzung zu ein Aerosol zu bestimmen. Das ALI-Modell ermöglicht das Aerosol direkt auf die Zellen durch die Luft wie ein echter Expositionsszenario verabreicht werden aber es ist kostengünstiger und weniger zeitintensiv als in Vivo Studien während imitiert die Luft-Flüssigkeit Barrieren wie die Augen, Haut und Lunge. Gewachsen auf der ALI Lungenzellen haben die Fähigkeit, erzeugen eine polarisierte Sperrschicht,18,19 die physiologischen Eigenschaften, die das in Vivo Lunge Epithel produziert, einschließlich Schleim und Tensid Produktion in bestimmten ähneln bronchiale oder alveoläre Zelllinien, Zilien schlagen,19 tight Junctions,19,20 und Zelle Polarisation. 18 Änderungen wie diese die zelluläre Reaktion gemessen in Toxizitätsstudien beeinflussen können. 21 darüber hinaus ergibt sich ALI in-vitro- Modell sind oft empfindlicher als Zellen über Aussetzung Modelle22 verfügbar gemacht und sind in der Lage zum Modell akuten in Vivo Inhalation Toxizität. 23 , 24 daher ist ein ALI Belichtungssystem, die Durchführung von Messungen innerhalb der Atemzone kann ein logischer nächster Schritt.

Indem man die Zellen Aerosol direkt an der Quelle der Emission, tritt Untersuchung der Auswirkungen aller Gase, semi-flüchtige Verbindungen und Partikel in die Mischung beteiligt. Wenn die Mischung auf einem Filter gesammelt, die Gase und flüchtige Verbindungen werden nicht erfasst und die ganze Mischung kann nicht untersucht werden. Darüber hinaus kann die Rekonstitution der Partikel in ein Pulver oder eine flüssige Suspension zu Aggregation oder Partikel-Fluid Interaktionen, wie Auflösung, in der liquid Suspension führen. 25 , 26 wenn Aerosol-Partikel in der Flüssigkeit hinzugefügt werden, gibt es ein höheres Potenzial für die Agglomeration,25,27 Bildung eines Proteins Corona,28 oder Interaktion mit Verbindungen in die Flüssigkeit, die Ablagerung beeinflussen können und beeinflussen Sie die biologische Reaktion. 29 , 30

Exposition in der ALI basiert auf drei wesentlichen Aerosol Profile, Wolke Beilegung, parallel Fluss und senkrecht Fluss. Cloud, Abrechnung, verwendet durch Air-Liquid Interface Zelle Exposition (ALICE),4 ist ein Batchsystem einzahlen wo Partikel durch Schwerkraft und Diffusionsprozess absetzen, da das Aerosol als eine Einheit behandelt wird. Parallele Strömung, verwendet durch die elektrostatische Aerosol in-vitro- Belichtung System (Traufe)5 und Multikultur Exposition Kammer (MEC) II,6 ermöglicht die Abscheidung durch die Zugabe von Brownsche Bewegung durch das Strömungsprofil. Senkrecht-Flow, verwendet durch eine Mikrosprayer,7 Nano Nebelkammer für In-vitro-Toxizität (NACIVT),11 und kommerziellen ALI Systeme8,9,10,12, fügt die Impaktion von Partikel in der Ablagerung-Region. Viele dieser Belichtung Systeme sind groß und sperrig, dass überschüssige Systeme für Aerosol Vorklimatisierung, Pumpen für die Strömung, oder sogar Heizung Kammern für die Inkubation der Zellen. Dieser große Größe verringert die Portabilität des Systems. Anstelle von Probenahme direkt an der Quelle der Emission haben diese Systeme oft Proben ins Labor oder Modell Aerosole erzeugt für die Analyse. Die Komplexität des emittierten Aerosols kann in der Übersetzung aus dem Bereich ins Labor verloren. Die PIVEC ist kleiner als die aktuelle Systeme mit einer Außenfläche von ca. 460 cm2 und wiegt nur 60 Gramm, mit thermischen und Feuchtigkeitskontrolle in das System ermöglicht ein sehr portables Gerät integriert. Die geringere Größe und Gewicht lassen das System getroffen, um die Quelle der Exposition, direkte Probenahme bei schönem oder getragen werden.

Die Größe der aktuellen Belichtung Systeme verringert auch die Fähigkeit, Probenahme zur Untersuchung der räumlichen Gradienten in Konzentrationen führen. Diese Auflösung ist Schlüssel bei der Bestimmung von toxikologischer Wirkungen vieler Potenzial Umwelt-und betriebliche Unfallgefährdungen wie Feinstaub Angelegenheit oder am Arbeitsplatz Tätigkeiten Fahrzeugverkehr Auspuff bei Aerosolization auftritt. Sofort nach Emission, dort wird eine räumliche Abweichung in Partikelkonzentration. Dies wächst mit der Zeit wie die Partikel in der Atmosphäre zu verteilen und diese Effekte können je nach den Umgebungsbedingungen wie Temperatur, Druck, Wind und Sonne. Partikel können beginnen zu altern und oxidieren auch einmal abgegebene31,32 und Zerstreuung Preise von der Topographie betroffen sind; höhere Konzentrationen finden Sie in den Schluchten und Tunnel, wo Dispersionseffekte werden verlangsamt, und niedrigere Konzentrationen finden wo gibt es eine große Fläche für Dispersion. 33 diese Steuersatzänderungen Streuung können erhebliche Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit haben und können gesehen werden, wenn die Zahl der Asthmatiker Erwachsenen Leben in städtischen und in ländlichen Gebieten zu vergleichen. 34 während viele Belichtung Systeme mehrere Proben gleichzeitig zur Verfügung stellen, sind mehrere Systeme erforderlich mit einer Fülle von Großgeräten räumlichen Auflösung durchführen.

Indem das Labor auf das Feld, kann die Zeit der Analyse mithilfe der ganzen Zelle als Sensor verringert werden. Nach bekannten biologischen Mechanismen und Endpunkte kann bei der Ermittlung der Aerosol-Zusammensetzung und Größe helfen. Aufgrund der langsamen Clearance-Methoden, einschließlich Mucociliary Clearance, Phagozytose und Translokation sind diese Partikel oft Interaktion mit Zellen ca. Tage bis Wochen3 Erzeugung von oxidativen Stress, Entzündungen und sogar Zelltod. Diese biologische Endpunkte können Ausgangspunkte für negativen Ausgang Wege zur kardiovaskulären Erkrankungen oder chronisch obstruktiver Lungenerkrankung sein. Wiemenn Et Al. durchgeführt darüber hinaus eine Reihe von in-vitro- Tests mit Literatur Werte für kurzfristige in Vivo Inhalation Toxizität zu vergleichen. 35 In Vivo Antwort wurde mit zwei der vier positive Ergebnisse aus Tests Zytotoxizität über Laktat-Dehydrogenase Release, oxidativen Stress von Glutathion Reduktion und Wasserstoffperoxid Bildung und Freisetzung und Entzündung von potenziellen vorhergesagt. Das Tumor-Nekrose-Faktor alpha gen. Aus zehn Schichtmaterialien Metalloxide getestet, sechs getestet als aktiv (Titandioxid, Zinkoxid und vier verschiedenen Cerium-Oxid) mit Aufnahmen in Vitro mit Bestätigung in Vivo

Zur Untersuchung der Auswirkungen von Aerosolen in einem beruflichen Umfeld entwickelt unser Labor PIVEC für Aufnahmen im Bereich. Darüber hinaus die PIVEC kann für persönliche Probenahme zu überwachen und untersuchen Inhalationsexposition wie die 37-mm-Filter Kassette36 getragen werden oder mehrere Systeme können verwendet werden, um räumliche Auflösung in einem bestimmten Gebiet zu erreichen. In diesem Protokoll wird die Charakterisierung und Einsatz von der PIVEC diskutiert. Nach der Belichtung werden die biologischen Effekte durch Zytotoxizität Assays beobachtet.

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Protocol

Betreiber tragen persönlichen Schutzausrüstung (z.B. Kittel, Handschuhe, Schutzbrille) beim Ausführen der Schritte 1, 2, 3, 5 und 6.

1. Vorbereitung der Materialien

  1. Bereiten Sie Materialien für System-Montage und Belichtung Wiederholbarkeit zu gewährleisten.
    1. Stellen Sie sicher, Einsatz neuer oder 70 % igem Ethanol gereinigt ¼" Innendurchmesser leitfähigen Schlauch und ¼" Außendurchmesser Anschlüsse für den Systemaufbau.
    2. Shop Testmaterialien inklusive Filter, PIVEC Komponenten, Pinzette und Partikel-Pulver in einer kontrollierten Umgebung in Bezug auf Temperatur und Feuchtigkeit für mindestens 24 h vor dem Experiment.
      Hinweis: Die Temperatur sollte bei Raumtemperatur ca. 20 ° C, mit weniger als 35 % Relative Luftfeuchtigkeit. Dies ist sehr wichtig, Wiederholbarkeit von Experimenten zu erreichen.
    3. Bereiten Sie Partikelzähler mit Isopropanol Teile reinigen und ermöglichen dem System Warm-up entsprechend den Empfehlungen des Herstellers, einschließlich der scanning Mobility Particle Sizer (SMPS) und optische Particle Sizer (OPS) für die Messung vor.

2. Generation von trockenem Aerosol

Hinweis: Operatoren sollten in einer Dampfhaube Aerosolerzeugung führen.

  1. Montage eines Systems zur trockene Aerosole generieren
    Hinweis: Die Aussetzung der Partikel im Gas oder Flüssigkeit sollte für die modellierten Anwendung und Zelle Kultur geeignet. Die folgende Methode kann mit einer Flüssigkeit-basierte Aerosol durchgeführt werden. Das Design der das trockene Aerosol-System stammt von Tiwari Et Al. 37 eine schematische Darstellung des trockenen Zerstreuung-System ist in Abbildung 1dargestellt.
    1. Schließen Sie das Kugelventil an beiden Enden des Rohres 4" 1/8 Gewinde Größe, dies wird als die Partikel Trichter dienen. 2" 1/8 Größe Leitung an einem Ventil anschließen.
    2. Kupfernanopartikel wiegen, in dieser Studie die Massenkonzentration für jede Partikelgröße war konstant gehalten während der Bestimmung der Effizienz der Ablagerung. Verwenden Sie ca. 7,5 mg 40 nm Kupfer Nanopartikel, 7 mg von 100 nm Kupfer-Nanopartikeln und 13 mg 800 nm Kupfer Nanopartikel pro Exposition. Legen Sie Kupfernanopartikel in den Trichter der Partikel durch das offene Ende.
      Hinweis: Die Höhe der Kupfernanopartikel wog dienen als die Masse verabreichte Konzentration basiert.
    3. Legen Sie eine 3" Stück Außendurchmesser (OD) Schlauch ½" rund um die 2" Rohr und Ort ein HEPA filter innerhalb dieser kurzen Schlauch so, dass die Durchflussrichtung durch den Kugelhahn.
    4. Verbinden Sie den Vakuum-Erzeuger mit anderen Kugelhahn mit Gewinde. Verbinden Sie Vakuum-Erzeuger mit Lufttank indem man ein OD Schlauch 5/16" in der Push-Lock-Anschluss. Verwenden Sie ¼" OD Schläuche zum Austritt des Vakuum-Erzeuger der Versuchsaufbau herstellen, indem man den Schlauch über den Ausgang der Vakuum-Erzeuger.
  2. Verwendung von trockenem Aerosol System, trockene Aerosol zu generieren
    1. Öffnen Sie den Lufttank durch Drehen des Hauptventils und ermöglichen Sie den Luftstrom um das System zu. Öffnen Sie das Ventil an den Durchflussregler auf den Lufttank und so eingestellt, dass der Durchfluss durch das System die gewünschten Einstellungen auf die Vakuumpumpe entspricht.
    2. Öffnen Sie das Kugelventil, HEPA-Filter am nächsten, dann öffnen Sie das Kugelventil, Vakuum-Erzeuger am nächsten. Bewahren Sie diese für ca. 3 s, um Partikel in den Luftstrom gezogen werden können.
    3. Schließen Sie das Kugelventil, Vakuum-Generator dann Kugelhahn am nächsten an HEPA-Filter schließen am nächsten. Lassen Sie Luft aus dem Tank für die Dauer des Experiments nach Bedarf fließen.
    4. Schließen Sie Haupt- und Regler Ventile Lufttank zu unterbrechen. Saubere Kugelhähne und Vakuum-Erzeuger mit 70 % Ethanol. Metallrohre Autoklav für die Sterilisation.

3. Abscheidung Effizienz-Messung mit PIVEC

Hinweis: Operatoren sollten in einer Dampfhaube Aerosol-Exposition führen.

  1. Die Abscheidung durch das Sammeln der Kupfer Nanopartikel Aerosols erzeugt im Schritt 2.2 auf einem vorgewogene Filter zu messen. Verwenden Sie die hinterlegten Dosis, anhand der gesammelten Mass auf dem Filter und der verabreichten Dosis, gemessen mit dem gewogenen Kupfer-Partikel, die Ablagerung Effizienz zu bestimmen.
    1. Behalten Sie 1,00 µm Pore Glasfaser Filter Bedingungen niedriger Luftfeuchtigkeit, beschrieben in 1.1.2 für mindestens 24 h vor Vorbelichtung Messungen bei. Weigh einen unbenutzten Filter dreimal und nimmt die Filter-Gewichte. Fügen Sie ein Ort der nicht verwendeten Filter in einer Zellkultur.
    2. Wählen Sie die entsprechende Zelle Kultur einfügen Adapter (6 Brunnen oder 24 gut) für PIVEC, die Zelle Kultur einfügen mit dem Filter zu unterstützen. Ort der Zellkultur einfügen Adapterstück oben auf der Basis von PIVEC, rastet so einzustellen, dass die Basis des das Adapterstück breiter als oben ist.
    3. Verwendung einer Pinzette Filter geladen Zellkultur platzieren einfügen innerhalb Adapterstück. Legen Sie das obere Stück auf Adapterstück in Ort absetzen, so dass die Grundlage für den oberen Teil breiter als oben ist. Wickeln Sie PIVEC mit einer einzigen Schicht von Klebeband.
    4. Verbinden Sie 37 mm Kassette Stücke auf Ober- und Unterseite des PIVEC durch Drücken einrastet. Legen Sie Adapter ¼" Stacheldraht in Kassette Einlass und Auslass.
    5. Wickeln Sie die Ohmsche Heizung um PIVEC, derart, dass die Drähte an der Basis sind. Klebeband zu sichern.
    6. Wickeln Sie PIVEC mit ~ 8 runden Alu-Folie für Isolierung. Mit Klebeband sichern.
    7. Connect 2" langes Stück 1/2" Außendurchmesser Schlauch an den Adapter auf PIVEC. Entfernen Sie poröse Schläuche aus sterilem Wasser und Platz im Schlauch auf PIVEC.
    8. Ort PIVEC in Klammer auf dem Ring stehen und zu sichern. Komplette Einrichtung mit der Vakuumpumpe, Partikelzähler und Aerosol-Set-up.
      Hinweis: Die zahlenbasierte hinterlegte Dosis kann bestimmt werden, nur wenn Partikelzähler vor der PIVEC und nach PIVEC auf separaten läuft platziert werden.
    9. Setzen Sie Filter mit Schritt 2.2 Protokoll und gewünschte Belichtung Zeit und Strom Tarife, in dieser Studie wurde eine Belichtungszeit von 10 min bei 0,5 l/min verwendet. Das Set-up entnehmen Sie PIVEC. Nehmen Sie Zelle Kultur einfügen und platzieren Sie den exponierten Filter im Siebträger unter niedrigen Luftfeuchtigkeit mindestens 24 h vor der Messung.
    10. Reinigen Sie PIVEC mit 70 % Ethanol. Sterilisation mit UV-Licht für mindestens 30 min vor der nächste Versuch.
    11. Wiegen des exponierten Filters dreimal und notieren Sie die Filter-Gewichte. Exponierten Filter in einer beschrifteten Filterhalter für Lagerung einsetzen.

4. Berechnung der hinterlegten Dosis und Ablagerung Effizienz

Hinweis: Kenntnisse der Ablagerung ist wichtig für Aerosol-Verwaltung und Interpretation der zellulären Antwort.

  1. Ablagerung von Masse-basierten Messungen zu berechnen
    1. Berechnen Sie die abgeschiedene Masse auf Filter als die Differenz zwischen dem Vorbelichtung Durchschnittsgewicht und Post-Exposition Durchschnittsgewicht. Dieser Wert ist die Masse-basierte hinterlegten Dosis für das Experiment.
    2. Verwendung verwaltete Masse, m-Admin, und Masse-basierte Dosis bestimmt in 4.1.1, mDep, zur Berechnung des Masse-basierte Abscheidung Wirkungsgrad ηm, für das Experiment hinterlegt.
      Equation
    3. Mittelwerte aus 4.1.1 und 4.1.2 für mindestens 3 Versuche festzustellen, Abscheidung und Ablagerung Effizienz für PIVEC Partikelgröße.
  2. Ablagerung von zahlenbasierte Messungen zu berechnen
    1. Sicherstellen Sie, dass die Messungen mit Partikelzähler mit Zähler nach der PIVEC und bestimmen die Partikelkonzentration vor der PIVEC durchgeführt wurden. Die Partikelkonzentration im Laufe der Zeit für den Partikelzähler zu integrieren dann integrieren über Partikeldurchmesser zu bestimmen, die insgesamt gemessenen Partikel.
    2. Berechnen Sie die hinterlegten Partikelanzahl als Differenz zwischen den Partikeln verabreicht und der gemessenen Partikel Post-PIVEC. Dieser Wert ist die zahlenbasierte hinterlegten Dosis für das Experiment.
    3. Verwendung verwaltete Partikel, nAdmin, zahlenbasierte hinterlegt Dosis, nDep, Volumenstrom, V, und die Zeit t, um das zahlenbasierte Ablagerung Effizienz, ηn, für das Experiment zu berechnen.
      Equation
    4. Durchschnittliche Werte von 4.2.2 und 4.2.3 für mindestens 3 Versuche festzustellen, Abscheidung und Ablagerung Effizienz für PIVEC Partikelgröße.

(5) Aerosol-Exposition von Zellen

Hinweis: Für die Zelle wird Kultur an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit der Leser Blank Et al.bezeichnet. 38 Operatoren sollten Zelle Kultur einfügen (Schritte 5.1.2-5.1.4) innerhalb eines Biosafety Kabinett laden führen. Operatoren sollten in einer Dampfhaube Aerosol-Exposition führen.

  1. Zellkulturen an Air-Liquid-Schnittstelle
    1. Heben Sie A549 Zellen vom Kultur-Kolben durch Zugabe von Trypsin-EDTA, 3 mL für ein T75-Fläschchen oder 1 mL für ein T25-Fläschchen und 5 min bei 37 ° c inkubieren Fügen Sie 7 mL komplette Medien für ein T75-Fläschchen oder 4 mL komplette Medien für ein T25 Kolben, Kolben und spülen Kolben Wand mit Zellsuspension der wiederhergestellten Handynummer zu maximieren. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine sterile 15 mL konische Rohr dann Zentrifuge Zellen bei 800 X g für 3 min.
    2. Entfernen Sie die überstand mit Trypsin-EDTA und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL komplette Medien. Entfernen Sie 10 µL Zellsuspension und fügen Sie der Hemocytometer hinzu. Zählen von Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer, um die Konzentration und die Gesamtzahl der Zellen zu bestimmen.
    3. 0,5 mL der komplette Medien in jede Vertiefung innerhalb einer 24-well-Platte zu platzieren. Legen Sie ungenutzte Zelle Kultur Einsätze in Brunnen. Samen Zellkultur Einsätze an der apikalen Seite bei einer Zelle Dichte in der Nähe von 1 x 105 Zellen/cm2 für Zelltypen, die in der Nähe von Verdoppelung pro Tag wachsen. Samen A549 Zellen innerhalb eines 24 gut einfügen, einfügen Samenzellen in einer Dichte von 1 x 105 Zellen/cm2 durch Zugabe von 35.000 Zellen in der Zellkultur.
      Hinweis: Zellen mit einem langsameren Wachstum können in eine höhere Zelldichte ausgesät werden.
    4. Die apikale Seite der Zelle Kultur einfügen, um das Endvolumen erreicht (für 24 well-Platte Endvolumen 0,25 mL ist) fügen Sie komplette Medien hinzu.
    5. Kultur für 7 Tage im getauchten Bedingungen ersetzen Medien alle 1-2 Tage. Entfernen Sie nach 7 Tagen die apikale Medien und Kultur für mindestens 1 Tag im ALI Bedingungen, nur die basolateralen Medien ersetzen.
  2. PIVEC montieren
    1. Zellen, um die Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle für mindestens 24 h vor der Belichtung equilibrate zu ermöglichen.
    2. Wählen Sie die entsprechende Zelle Kultur einfügen Adapter für PIVEC, die Zelle Kultur einfügen mit dem Filter zu unterstützen. Zellkultur Ort einfügen Adapterstück auf PIVEC Basis, rastet so einzustellen, dass die Basis des das Adapterstück breiter als oben ist. Der Brunnen von der Basis der PIVEC 4 mL Zellkulturmedien hinzufügen.
    3. Verwendung einer Pinzette die Zellkultur zu platzieren einfügen innerhalb Adapterstück in Schritt 5.2.3 gelegt. Legen Sie oben auf Adapterstück in Ort absetzen, so dass die Grundlage für den oberen Teil breiter als oben ist. Wickeln Sie sorgfältig, PIVEC mit einer einzigen Schicht von Klebeband.
    4. Verbinden Sie 37 mm Kassette Stücke auf Ober- und Unterseite des PIVEC, durch Drücken einrastet. Legen Sie Adapter ¼" Stacheldraht in Kassette Einlass und Auslass.
    5. Wickeln Sie Ohmsche Heizung um PIVEC, so dass die Drähte an der Basis sind. Klebeband zu sichern.
    6. Wickeln Sie PIVEC mit ~ 8 runden Alu-Folie für Isolierung. Mit Klebeband sichern.
    7. Kurzes Stück 1/2" Außendurchmesser Schlauch an den Adapter an der Oberseite PIVEC anschließen. Entfernen Sie poröse Schläuche aus sterilem Wasser und Platz im Schlauch auf PIVEC.
    8. Ort PIVEC in Klammer auf dem Ring stehen und zu sichern. Füllen Sie das Set-up mit der Vakuumpumpe und Aerosol-Set-up.
  3. Setzen Sie Zellen in ALI mit der PIVEC
    1. Verwenden Sie Ablagerung Effizienz in Schritt2 ermittelt, um die Masse der Teilchen zu aerosolized werden zu berechnen. Wiegen Sie entsprechenden Masse und fügen Sie dem Aerosol-System richten Sie nach Schritt 2 in der Dunstabzugshaube.
    2. Expose Zellen, indem Sie die folgenden Schritt 2.2, in dieser Studie der biologischen Endpunkte die Zellen wurden ausgesetzt, etwa 3,5 mg Kupfer Nanopartikel mit einem Volumenstrom von 0,5 l/min und eine Expositionsdauer von 10 min.-Kontroll-Studien durchgeführt befeuchtete Luft zur Bestimmung der Einfluss der Luft allein. Das Set-up entnehmen Sie PIVEC. Nehmen Sie die Zelle Kultur einfügen, legen Sie in den sterilen well-Platte und zurück zur CO2 -Inkubator (37 ° C, 5 % CO2, 90 % RH).
    3. Aspirieren Sie Medien von PIVEC. Wenn Sie zusätzliche Experimente durchführen, gepuffert spülen unten PIVEC mit Phosphat Lösung dann wiederholen Sie Schritt 5.1 und 5.2.
    4. Reinigen Sie PIVEC mit 70 % Ethanol, wenn Sie fertig sind. Sterilisation mit UV-Licht für mindestens 30 min vor der nächste Versuch.
  4. Biologische Assay-Verfahren
    Hinweis: Assays durchgeführt in dieser Studie wurden oxidativen Stress-Generierung durch die RLKV-DA-Assay und Zytotoxizität durch Laktat-Dehydrogenase (LDH) Freigabe.
    1. Auflösen von 24,4 mg RLKV-DA in 50 mL Methanol, 1 mM RLKV-DA Lösung zu machen. Diese Lösung kann für bis zu 4 Monate bei-20 ° C aufbewahrt werden. Verdünnen Sie 1 mM RLKV-DA Lösung durch Mischen von 0,1 mL 1 mM RLKV-DA Lösung mit 9,9 mL HBSS zu 10 mL von 10 µM RLKV-DA.
    2. Zelle Nährmedien und waschen Zelle Kultur einfügen mit ca. 1 mL PBS zu entfernen. Fügen Sie 0,5 mL 10 µM RLKV-DA Lösung in jede Vertiefung, Einsätze, wenn Sie fertig sind zu ersetzen. Abdeckplatte mit Alufolie zu verhindern, dass Photoaktivierungen des Farbstoffs und 37° C Inkubator für 1 h wieder.
    3. Entfernen Sie Zellen aus dem Inkubator und aspirieren Sie die RLKV-DA Arbeitslösung aus den Brunnen. Brunnen 0,5 mL HBSS hinzu und ersetzen Sie Zelle Kultur Einsätze zu.
    4. Laden Sie die well-Platte in Platte Leser und Maßnahme Grundlinie Fluoreszenz mit Erregung/Emission Wellenlängen von 485/530 nm. Entfernen Sie aus Platte Leser und Last einfügen in PIVEC für die Belichtung.
    5. Zellen für gewünschte Expositionsdauer aussetzen. Entfernen Sie Einfügen von PIVEC und wieder zu well-Platte. 50 µL der basolateralen Flüssigkeit aus well-Platte und in Weiß 96-well-Platte zu entfernen. Messen Sie die Fluoreszenz des DCF mit Erregung/Emission Wellenlängen von 485/530 nm alle 30 min. nach Belichtung für 2 h.
    6. Basolateralen Flüssigkeit equilibrate auf Raumtemperatur für 20-30 min. hinzufügen 50 µL LDH-Assay-Lösung, gemischte folgende Hersteller-Protokoll, auf basolateralen Flüssigkeit aus well-Platte und lassen Sie für 10 Minuten reagieren hinzufügen 25 µL Stopplösung gut zu lassen. Lesen Fluoreszenz Resorufin Produkt mit Erregung/Emission Wellenlängen von 560/590 nm.
    7. Entfernen Sie zusätzliche basolateralen Flüssigkeit zu, und wiederholen Sie Schritt 5.4.6 bei 4 h und 24 h nach Exposition.

6 statistische Methoden

  1. Analyse der biologischen Test Daten
    1. ROS-Produktion als die Erhöhung der Intensität der Fluoreszenz der behandelten Zellen im Vergleich zu Baseline-Messungen zu melden. LDH-Aktivität als Erhöhung der Intensität der Fluoreszenz der behandelten Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen zu melden.
    2. Führen Sie Einzelfaktor ANOVA zu statistischen Unterschiede zwischen Datensätzen zu bestimmen. Gegebenenfalls führen Sie Student t-Test bei einem Wert von Bedeutung von 0,05. Berichtsdaten Sie als Mittelwert ± Standardabweichung von mindestens drei Messungen.

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Representative Results

Am Arbeitsplatz in-vitro- Toxikologie umfasst Erhaltung zelluläre Lebensfähigkeit während der Durchführung von Aerosol-Exposition. Das PIVEC-System ist in Abbildung 2, unter anderem die Temperatur und feuchte-Steuerung und abgenutzte PIVEC dargestellt. Die Temperatur wurde über eine batteriebetriebene Ohmsche Heizung gepflegt und das Aerosol befeuchtet mit erhöht natürliche Befeuchtung durch eine poröse, benetzte Rohr. In einer kontrollierten Aerosol in ein Labor einrichten kann die PIVEC Set-up für die Belichtung, die in Abbildung 1dargestellt. Charakterisierung des Systems erlaubt die Bestimmung der hinterlegten Dosis auf die Zellen, die dann in die zelluläre Antwort korreliert werden können.

Die Effizienz der Ablagerung ist abhängig von der Größe der Partikel, die dem System hinzugefügt, da Ablagerung Streitkräfte Impaktion, Sedimentation und Diffusion umfassen. Darüber hinaus ist die Abscheidung Durchfluss, Belichtungszeit und die Eigenschaften des Systems der Exposition abhängig. Mit diesen Informationen kann die Ablagerung vorhergesagt werden. Die Ablagerung Effizienz der PIVEC wurde durch zwei Methoden, gravimetrische Analyse und Nummer Partikelzählung ermittelt. Gleichungen 1 und 2 wurden verwendet, um die Ablagerung Effizienzvorteile in Tabelle 1 mit dem Filter basierend, scanning Mobility Particle Sizer (SMPS) und optische Particle Sizer (OPS) Messungen, Abbildung 3zu bestimmen. Erhöhte Absetzung wird insgesamt beobachtet, für die 24 gut-design als die 6 nun design und leicht verringert sich für 100 nm im Vergleich zu 40 nm und 800 nm Kupfer-Partikel. Die Abscheidung in den 24 Brunnen ist sehr gleichmäßig über den Einsatz, Ablagerung in den 6 auch Design fehlt jedoch Einheitlichkeit als die meisten der Partikel Kaution nahe dem Zentrum des Einsatzes. Post-Belastungsanalyse kann beschleunigt werden durch die Bestimmung der Dosis-Beziehung zwischen der 37-mm-Filter und die Zelle Kultur einfügen, verringern die Notwendigkeit, die Dosis nach der zellulären Exposition zu bestimmen. Vergleich der Ablagerung innerhalb der 37-mm-Filter-Kassette und die PIVEC zeigt eine starke Korrelation für alle Größen und Brunnen mit einer Pearson-Korrelation von über 0,7, allerdings nur für 800 nm ist die Korrelation signifikant mit einem p < 0,05, siehe Abbildung 4. Im Vergleich zu ähnlichen Systemen in der gesamten Literatur, ist11,12 die Ablagerung Effizienz der PIVEC über den Bereich der Partikelgrößen getestet vergleichbar oder erhöhte über gemeldeten Werte, die in Abbildung 5zu beobachten. Die Ablagerung Effizienz innerhalb der PIVEC kann verbessert werden durch Minimierung der Verluste an das System mit elektrostatischen dissipative oder leitfähigen Kunststoff oder ähnlichem Material, um die PIVEC zu entwerfen.

Filter in einer Feuchte-kontrollierten Umgebung vor der Exposition nicht gut getrocknet, überschüssiges Wasser erhöht die Ausgangsmasse und nichtphysische, negative hinterlegte Dosen produzieren kann. Variable Volumenströme können auch inkonsistente hinterlegte Dosen innerhalb des Systems fördern. Um diese Probleme zu vermeiden, lassen Sie mindestens einen Tag vor und nach der Exposition für den Filter in eine feuchte-kontrollierten Umgebung trocknen.

Zelluläre Reaktionen beeinflusst werden durch die hinterlegten Dosis und durch Expositionsdauer betroffen sein könnten, wenn die Zellen nicht richtig gepflegt werden. A549 Zellen, einer alveolären epitheliale Karzinom Zelllinie wurden für 10 min in unterschiedlichen Größen Kupfer Nanopartikel mit einer Durchflussrate von 0,5 l/min ausgesetzt. Alternative senkrecht fließen zwischen 0,005 LPM und 1,5 l/min lang anhaltende Exposition Belichtung Systeme verwendet, während diese Methode verwendet eine moderate Durchflussmenge während einer schnellen. Mit der Masse-basierte Abscheidung Effizienz gemessen und verwaltet Dosis, 1,58 ± 0,04 mg/cm2 von 40 nm Kupfer, 0,30 ± 0,00 mg/cm2 100 nm Kupfer Teilchen und 0,32 ± 0,01 mg/cm2 800 nm Kupfer Teilchen auf die Zellen abgelagert wurden. Zytotoxizität und oxidativem Stress wurden innerhalb der ersten 24 Stunden nach Exposition beobachtet. Zytotoxizität wurde mit der Veröffentlichung von Laktat-Dehydrogenase (LDH) von geschädigten Zellen sofort, 4 Stunden und 24 Stunden nach Exposition gemessen. Innerhalb von 4 Stunden der Exposition, Abbildung 6 bgab es keine signifikante Toxizität von Kupfer Nanopartikel unter 1,62 mg/cm2 . Vierundzwanzig Stunden nach Exposition es war eine statistisch signifikante Abnahme im Zellviabilität von weniger als 20 % Lebensfähigkeit für Zellen, Kupfernanopartikel. Die intrazelluläre oxidative Stress war mit der RLKV-DA-Test durch die Oxidation von RLKV durch reaktiven Sauerstoff-Spezies innerhalb der ersten zwei Stunden nach Exposition, Abbildung 6auntersucht. Hohes Niveau von oxidativem Stress wurden in dreißig Minuten nach Exposition für Zellen, Kupfernanopartikel aller Größen gemessen. Das Niveau von oxidativem Stress weiter zu ähnlichen Preisen für alle Größen getestet innerhalb von zwei Stunden beobachtet.

Erfolg der Ausstellungen kann durch die Wiederholbarkeit der zelluläre Reaktion bestimmt werden. Zwei Kriterien vorgeschlagen für Zytotoxizität Assays gehören: (1) die % total LDH Leckage für die Positivkontrolle sollte größer als 50 %, und (2) der positiven und Probe replizieren Koeffizient der Variationen sollte innerhalb von 50 %. 39 wenn diese Kriterien nicht erfüllt, dieses vorschlagen Unterschiede zwischen Experimenten, z. B. veränderte Ablagerung Beträge oder mangelhafte Luftfeuchtigkeit oder Temperatur Kontrolle. Darüber hinaus kann beobachten Zytotoxizität Messungen zum Verständnis der experimentelle Kontrollen führen und helfen bei der Bestimmung des Fehlers. Wenn der Durchfluss zu hoch ist, können hohe Mengen an Schubspannung Zellen sterben. Durch die Absenkung der Durchflussmenge, kann der Stress auf die Zellen aus dem Fluss verringert werden.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische trocken Zerstreuung und Versuchsaufbau. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: PIVEC Design. (A) vollständige Design mit 30 cm hohen Box zum Vergleich abgebildet. (B) PIVEC mit Temperatur- und Feuchteregelung abgebildet mit 30 cm hohen Box zum Vergleich. (C) getragenen PIVEC. (D) PIVEC Oberteil. (E) Zell-Kultur-Adapter für 24 gut (links) und 6 Brunnen (rechts). (F) Bodenstück. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Anzahl der Grundlage Ablagerung Wirkungsgrad (%) Masse der Grundlage Ablagerung Wirkungsgrad (%)
6 gut 40 nm 17.83 ± 32,13 5.85 ± 0.85
100 nm 0,47 ± 4.06 5.11 ± 0,94
800 nm 3.70 ± 35.00 6.39 ± 1.01
24 gut 40 nm 1,43 ± 2,43 12.61 ± 1.34
100 nm 1.37 ± 19,45 2.95 ± 0,75
800 nm 6,98 ± 3.93 15,95 ± 0,53

Tabelle 1. PIVEC Deposition Effizienz.

Figure 3
Abbildung 3. Partikelanzahlkonzentration Kupfer Nanopartikel Aerosole. (A) SMPS-Messung. (B) OPS-Messung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. Beziehung zwischen Ablagerung auf Zelle einfügen und SKC 37 mm Filter. Fehler ± 0,002 mg. (A) 40 nm Kupfer Partikel. (B) 100 nm Kupfer Partikel. (C) 800 nm Kupfer Partikel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5. Ablagerung Effizienz der PIVEC im Vergleich zu senkrecht Fließsystemen Exposition in der Literatur. Literatur Werte von senkrecht Flow Belichtung Systems werden in festen Marker dargestellt und PIVEC Werte sind in leeren Marker. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6. Zelluläre Reaktion auf Nanopartikel nach Exposition (PE) Kupfer. Für alle Messungen, n = 3 und p < 0,05. (A) oxidativen Stress unter Verwendung der RLKV-DA-Assay bestimmt. (B) Zytotoxizität durch die LDH-Assay bestimmt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Filterkassetten bieten eine einfache, kostengünstige Methode des Sammelns Aerosole in die Atemzone; jedoch Aerosol Proben extrahiert vom Filter nicht repräsentieren das gesamte Aerosol (d.h. Gase, flüchtigen Stoffen und Partikeln) und daher die Bewertung der damit verbundenen biologischen Wirkungen zu begrenzen. Mit den ersten Entwurf der 37-mm-Filter-Kassette, die PIVEC soll Portabilität zu erhalten und die in Vivo Abscheidung von Partikeln aus Inhalation zu imitieren. Die PIVEC ist deutlich kleiner als die aktuelle ALI Belichtung Systeme, etwa so groß wie eine Kleenexbox mit Temperatur und Luftfeuchtigkeit Control enthalten. Die Größe ist ähnlich wie persönliche Kaskade Impaktoren und bietet Daten über zelluläre Antwort auf das Aerosol zusätzlich. Während die PIVEC Platz für eine Probe im Vergleich zu anderen aktuellen Belichtung Systemen enthält, ermöglicht die geringe Größe mehrere Systeme gleichzeitig genutzt werden daher erhöhen die Größe der Stichprobe und damit für räumliche Verteilung überwacht werden.

Es gibt mehrere wichtige Schritte im Protokoll. Um die Effizienz der Ablagerung zu bestimmen, ist es wichtig, die Filter richtig Zustand, wie in Schritt 1 beschrieben. Darüber hinaus ist es wichtig, richtig Wiegen der Kupfernanopartikel vor der Exposition und der Filter Post Exposition gegenüber der Masse-basierte Abscheidung Leistungsfähigkeit festzustellen. Die Nummer Ablagerung Effizienz muss anhand der Differenz in Ablagerung der ersten Aerosolkonzentration und Endkonzentration anhand der Partikelzähler ermittelt werden. Wenn die Ablagerung Effizienz nicht richtig bestimmt wird, ist es schwierig zu bestimmen, die biologische Reaktion Unterschiede zwischen Aerosol. Änderungen zur Ablagerung gehören die Ablagerung zu verändern. Ablagerung kann durch Ändern der Flow Rate und Exposition Dauer erhöht werden. Dies kann auch die Zellviabilität mit dem Potential der Austrocknung der Zellen beeinflussen. Die Konditionierung von Aerosolen wird häufig durchgeführt, um physiologische Eigenschaften wie Körpertemperatur und Befeuchtung in den Atemwegen zu kompensieren. Erhöhter Luftfeuchtigkeit, mehr als 50 %, imitiert die eingeatmete Luft und sinkt Zelltod durch Fahrzeug-Exposition. 43 wenn Temperatur und Feuchtigkeit nicht gut kontrolliert werden, kann die zelluläre Reaktion beeinflusst werden. Durch eine Verringerung der Fließgeschwindigkeit, werden zusätzliche Partikel in allen Größen einzahlen, erhöhen die Ablagerung. Expositionsdauer ist proportional zur Ablagerung, ermöglicht mehr Partikel über einen längeren Zeitraum experimentelle zu hinterlegen. Konditionierung des Aerosols ist wichtig, wenn die Expositionsdauer zu erhöhen, so dass die Zellen nicht austrocknen der biologische Reaktionen beeinflussen können.

Die PIVEC nutzt senkrecht Strömung um Partikel über Impaktion, Sedimentation und Diffusion auf die Zellen zu hinterlegen, die haben das Potenzial, die Zellen durch den Fluss austrocknen und Stress auf die Zellen hinzugefügt. Die Effizienz der Ablagerung ist abhängig von der Größe der Teilchen durch die Kräfte der Ablagerung. Viele der aktuellen Belichtung Systeme mit senkrecht Flow haben einen Ablagerung Wirkungsgrad von unter 10 % und viel näher an 1 %. Die PIVEC hat eine Ablagerung Effizienz durch gravimetrische Analyse von 3 % bis 16 % für einen 24 bestimmt gut Zell-Kultur einfügen. Die Partikel zahlenbasierte Ablagerung Effizienz ist etwa 1 % bis 7 % für den gleichen Einsatz. Bei einer 6 gut Zellkultur fügt, diese Zahlen zu verringern, mit Ausnahme der kleinsten Partikelgröße, aufgrund der Straffung des Aerosols, wie mehr Partikel in die Zelle Kultur einfügen ohne Raum für den Fluss entwickeln beschränkt sind. Die 6 gut Zelle Kultur Einsätze erlauben die Aerosol-Streams, Ablagerung zu umgehen. Anderen senkrecht Fließsystemen geprägt auf Masse Basis mit 60 nm Fluorescein Partikel40, 80 nm und 180 nm Kupfer Partikel16und 60 nm Adipinsäure saure Partikel41. Die daraus resultierenden Ablagerung Wirkungsgrade sind in der Regel zwischen 0,05 % und 11 %. Auf Nummer Basis sind diese Systeme mit Polystyrol Partikel12,15, Kohlenstoff-Nanopartikel12und Kieselsäure Partikel42, wodurch Wirkungsgrade zwischen 0,2 % und 11 % gekennzeichnet. Die PIVEC bietet, ähnliche oder höhere, Ablagerung im Vergleich zur Verfügung zellulären Belichtungsgeräte.

Zelle Aufnahmen erfolgten mit Kupfernanopartikel von 40 nm, 100 nm und 800 nm. Zellviabilität wurde die LDH-Assay mit keine signifikante Abnahme der Lebensfähigkeit innerhalb von vier Stunden nach Exposition mit definiert. Die LDH-Assay diente mit einem kommerziellen Belichtungssystem für 74 ng/cm2 nach 2 Stunden und 148 ng/cm2 nach 4 Stunden 9,2 nm Kupfer-Oxid Partikel44 und 1 µg/cm2 nach einer sequentiellen 4 Stunden Inkubation für 2 hinterlegt Stunden, dann eine andere Belichtung für 4 Stunden von 25 nm Kupfer-Oxid Partikel40, beide Messen signifikante Abnahme im Zellviabilität. Zytotoxizität wurde in ein anderes System für 1,6-7,6 µg/cm2 180 nm Partikel gemessen Kupfernanopartikel16 Trypan blauen Farbstoff Ausgrenzung beobachtet. Belichtungszeiten von 15 Minuten, 40-80 nm Kupfer-Oxid-Nanopartikel verminderte Lebensfähigkeit, 24 Stunden Post Belichtung gemessen. Die geringere Toxizität mit der PIVEC beobachtet wurde wahrscheinlich durch die kürzere Belichtungszeit von 10 Minuten und kürzere Post Messung Belichtungszeiten. Nach vier Stunden nach Exposition verringerte Lebensfähigkeit der Zellen in der PIVEC ausgesetzt. Zellen ausgesetzt an feuchter Luft Steuerelemente keine signifikante Zytotoxizität, in Übereinstimmung mit anderen Studien 9,40,44,45,46beobachtet. Der oxidative Stress wurde unter Verwendung der RLKV-DA-Assay bestimmt. Die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, wie Wasserstoffperoxid oder Sauerstoff-Radikale, generiert eine Menge Stress, die zum Wachstum Festnahme oder Zelle Tod führen kann. Nach der Zelle Belichtungen gab es eine minimale Erhöhung in oxidativen Stress für die Zellen in den Inkubator als Kontrolle gehalten und Zellen, feuchter Luft ausgesetzt. Erhöhten oxidativer Stress erfolgte für alle Korngrößen, innerhalb von 30 Minuten nach Exposition erhöhen. Im Rahmen einer Studie, 9,2 nm Kupferoxid Partikel44 und 25 nm Kupferoxid Partikel verursachten40 auch oxidativen Stress über die Carboxy-RLKV-DA-Assay gemessen. Erhöhte Belichtungszeit von 2 Stunden bis 4 Stunden erhöhten oxidativen Stress für 9,2 nm Kupferoxid Partikel44. Nach vier Stunden der Exposition, die 9,2 nm Kupfer Oxidpartikel produziert eine ähnliche oxidative Reaktion als die sequentiellen Belichtung von 25 nm Kupfer-Oxid Partikel40, was darauf hindeutet, dass die Exposition Dauer hat einen höheren Einfluss auf oxidativen Stress-Reaktion als Partikelgröße. Zellen innerhalb der PIVEC produziert erhöhten oxidativen Stress im Vergleich zu dieser Studie, aber die Partikel in das alternative System ausgesetzt sind Kupferoxid und löst sich weniger schnell als das Kupfer in der PIVEC ausgesetzt. Untersuchungen über die Auflösung des Kupfers, die aufgrund der Zusammensetzung und Größe der Partikel stimmen zu, dass größere Partikel und die Metalloxide lösen Ionen langsamer als Metallpartikel oder ihre Nanopartikel Pendants16,47 , 48 , 49 da die feuchte Luft-Steuerelemente nicht erhebliche Mengen von oxidativem Stress im Vergleich zu den Inkubator Kontrolle geführt hat, ist der Einfluss von Kupfer-Partikel, die oxidativen Stress auslösen innerhalb der PIVEC, ähnlich wie in-vitro- Exposition konsistent Systeme. Die biologischen Reaktionen beobachtet, mit der PIVEC vermuten, dass die PIVEC ein geeignetes System zur zellulären Exposition.

Während die Charakterisierung und zelluläre Studien über die PIVEC gut mit Literatur überein, hat9,16,40,44,46 das Gerät Grenzen. Die kleine Bauweise verringert sich die Anzahl der Samples, die gleichzeitig in einem einzigen Gerät im Vergleich zu anderen Systemen Exposition ausgesetzt werden können. Anderen Systemen können mindestens drei zellulären Forderungen an die gleichen Aerosol9,12 wiederholte Messungen zu erleichtern. Obwohl die PIVEC nur für einen Einsatz pro System erlaubt, ermöglicht die geringe Größe mehrere Systeme leicht verwendet werden, dazu beitragen, um dieses Problem zu mildern. Während andere persönliche monitoring-Systeme keine Zellen verwenden, muss die PIVEC in der Nähe von vertikal zu verschütten die Zellkulturmedien notwendig, zelluläre Lebensfähigkeit zu bewahren gehalten werden. Obwohl die PIVEC für bestimmte Partikel Bereiche (z. B. PM10, PM2,5, PM0,1) noch nicht optimiert wurden, wurde die PIVEC für eine Reihe von Partikelgrößen gekennzeichnet. Ähnlich wie bei anderen senkrecht Flow-Systeme, die PIVEC zeigt eine verminderte Fähigkeit zu Partikel in der Nähe von 100 nm im Durchmesser, während 40 nm und 800 nm Partikel abgeschieden mit ähnlichen Wirkungsgrad.

Die Analyse der Zellen nach Exposition kann beschleunigt werden, durch eine parallele Collection von Aerosolen in die PIVEC und ein SKC 37-mm-Filterkassette durchführt. Eine hohe Korrelation der gravimetrischen Grundlage Ablagerung ermöglicht die Schätzung der Partikelmasse gesammelt auf die Zellen von Daten mit Hilfe von 37 mm filtern. Vergleich des Einsatzes der Filter-Kassette verringert die Notwendigkeit, zusätzliche Proben und zusätzliche Messungen zur Bestimmung der Dosis zu sammeln. Unfertige Erzeugnisse umfasst die Integration von ein Echtzeit-monitoring-System für Zytotoxizität, oxidativen Stress oder anderen biologischen Endpunkten. Die geringe Größe der PIVEC ermöglicht es, in einer Vielzahl von Einstellungen, wie z. B. auf den Körper als persönlicher Monitor auf eine Drohne über eine Chemiefabrik verwendet werden oder im Freien in der Umgebung für räumliche Auflösung. Diese Methode hat den Einsatz der PIVEC für die Sammlung von Aerosolpartikeln auf Zellkulturen mit dem ALI gewachsen gezeigt. Durch Konditionierung das Aerosol 37 ± 1 ° C und > 80 % Relative Luftfeuchtigkeit, kann zelluläre Lebensfähigkeit bei akuten Belichtungszeiten gepflegt werden. Diese Methode eignet sich für flüssige Tröpfchen und solide partikelbasierte Aerosole und hat gezeigt, dass Partikel zwischen 40 nm und 800 nm in Zelle Kultur Einsätze. Die Vielseitigkeit der PIVEC ermöglicht diese Methode in mehreren Einstellungen mit einer Vielzahl von biologischen Endpunkte verwendet werden.

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Disclosures

Die Zugehörigkeit der Autoren ist auf dem Deckblatt dargestellt. Die Autoren sind von Virginia Commonwealth University, finanziell unterstützt wo die Fertigstellung in Richmond, VA. Die Autoren haben die alleinige Verantwortung für das Schreiben und den Inhalt dieses Papiers. Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt gibt.

Acknowledgments

Die Autoren möchten Boris Solomonov und der Virginia Commonwealth Innovation Machine Shop für Hilfe mit rapid Prototyping Gerät danken. Die Autoren möchten auch Danke Cristian Romero-Fuentes des Arbeitskreises Lewinski, Dr. Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov und die Virginia Commonwealth Nanomaterialien Kern Charakterisierung Anlage für ihre Hilfe mit Partikelcharakterisierung. Diese Arbeit wurde von Startup-Fonds Dr. Lewinski von der College of Engineering an der Virginia Commonwealth University zur Verfügung gestellten unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scanning mobility particle sizer (SMPS) TSI, Inc. 3910 NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS) TSI, Inc. 3330
Stainless Steel Pipe, 4" Long McMaster-Carr 4830K116 Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever Handle McMaster-Carr 4112T12 Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" Long McMaster-Carr 7753K121 Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filter GE Healthcare 09-744-12 HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum Generator PISCO USA VCH10-018C
PIVEC VCU For design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectors Zefon International, Inc. 459743
Porous tubing Scientific Commodities, Inc. BB2062-1814A Hydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insert Fisherbrand 353095 24 well plate insert
Filter Forceps Fisherbrand 09-753-50
Transfer Pipette ThermoScientific 13-711-27
Glass Fiber Filters SKC 225-7 Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro Balance A&D BM-22 Housed in environmental chamber
37 mm filter cassette SKC 225-3250 Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pump SKC 220-5000TC AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1090 40 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1088 100 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1117M 800 nm

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