تطبيقات رسم الخرائط الزمانية وتقنيات تحليل الجسيمات للتحديد الكمي لداخل الخلية Ca2 + إشارات في الموقع

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

وراثيا المرمزة Ca2 + المؤشرات (جيسيس) قد تغيرت تغيرا جذريا في الموقع كيف Ca2 + تصوير تتم. إلى أقصى حد ممكن لاستعادة البيانات من هذه التسجيلات، مطلوب تحليل Ca2 + إشارات مناسبة. البروتوكولات في هذه الورقة تيسير التحديد الكمي ل Ca2 + إشارات سجلت في الموقع باستخدام رسم الخرائط الزمانية المكانية والتحليل القائم على الجسيمات.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Drumm, B. T., Hennig, G. W., Baker, S. A., Sanders, K. M. Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ. J. Vis. Exp. (143), e58989, doi:10.3791/58989 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ca2 + تصوير الخلايا المعزولة أو أنواع محددة من الخلايا داخل أنسجة سليمة وكثيراً ما تكشف عن أنماط معقدة من Ca2 + إشارات. ويتطلب هذا النشاط تحليلات متأنية ومتعمقة، والتقدير الكمي لالتقاط قدر ممكن من المعلومات حول الأحداث الأساسية. المكانية، الزمانية وكثافة معلمات المضمنة إلى Ca2 + إشارات مثل تواتر ومدة، ونشر، والسرعة والسعة قد توفر بعض المعلومات البيولوجية اللازمة للإشارات داخل الخلايا. عالية الاستبانة Ca2 + التصوير عادة النتائج في الحصول على ملفات البيانات الكبيرة التي تستغرق وقتاً طويلاً للعملية من حيث ترجمة المعلومات التصوير إلى بيانات قابلة للقياس الكمي، وهذه العملية يمكن أن تكون عرضه للخطأ البشري والتحيز. تحليل Ca2 + الإشارات من الخلايا في الموقع يعتمد عادة على قياسات كثافة بسيطة من مناطق مختارة تعسفاً للفائدة (ROI) ضمن مجال رؤية (FOV). وهذا النهج يتجاهل الكثير من المعلومات الهامة إرسال الإشارات الواردة في فوف. وهكذا، من أجل تحقيق أقصى قدر من استرداد المعلومات من هذه التسجيلات عالية الدقة التي تم الحصول عليها مع Ca2 +الأصباغ أو أوبتوجينيتيك Ca2 + التحليل المكاني والزماني التصوير، والمناسبة من Ca2 + الإشارات مطلوب. وسيصف البروتوكولات المبينة في هذه الورقة كيف يمكن الحصول على حجم كبير من البيانات من Ca2 + تصوير تسجيلات لتيسير تحليل أكثر اكتمالا والتحديد الكمي ل Ca2 + الإشارات المسجلة من الخلايا باستخدام مزيج من خريطة الزمانية المكانية (STM)-استناداً إلى التحليل والتحليل القائم على الجسيمات. كما وصف البروتوكولات كيف مختلف أنماط Ca2 + الإشارات الملحوظة في خلية مختلفة يمكن تحليل السكان في الموقع المناسب. للتوضيح، الطريقة التي ستدرس Ca2 + إشارات في عدد سكان متخصصة من الخلايا في الأمعاء الدقيقة، الخلايا فراغي من كيال (ICC)، استخدام جيسيس.

Introduction

Ca2 + هو رسول داخل الخلايا في كل مكان التي تسيطر على مجموعة واسعة من العمليات الخلوية، مثل العضلات انكماش1،2،3من الأيض، خلية انتشار3،4، 5، والحث على إطلاق سراح العصبي في الأعصاب الطرفية6،7، وتفعيل النسخ العوامل في النواة. 7 داخل الخلية Ca2 + إشارات غالباً ما تتخذ شكل ارتفاعات عابرة في كاليفورنيا سيتوسوليك2 +، وهذه يمكن أن تكون عفوية أو تنشأ من التحفيز مؤثر تبعاً لنوع الخلية8. المكانية، الزمانية وكثافة معلمات المضمنة إلى Ca2 + إشارات مثل التردد والمدة، ونشر، والسرعة والسعة ويمكن توفير المعلومات البيولوجية المطلوبة ل التنبيه داخل الخلايا5، 7 , 9-هيولى Ca2 + إشارات يمكن أن تنجم عن تدفق Ca2 + من الفضاء خارج الخلية أو عن طريق Ca2 + الإصدار من هيولى (ER) عبر قنوات Ca2 + الإصدار مثل مستقبلات ريانوديني (ريرس) ومستقبلات اينوزيتول-ثلاثي-الفوسفات (IP3Rs)10. ريرس والملكية الفكرية3روبية قد تسهم على حد سواء لتوليد إشارات Ca2 + ويمكن أن يؤدي فتح هذه القنوات، الذي جنبا إلى جنب مع مختلف Ca2 + تدفق آليات منسقة في عدد ضخم من Ca2 + يشير إلى أنماط أن تتشكل بالأرقام وفتح احتمال Ca2 + قنوات تدفق، التعبير الشخصية من Ca2 + الإفراج عن القنوات، القرب بين Ca2 + تدفق والإفراج عن القنوات، والتعبير والتوزيع من كاليفورنيا2 + البروتينات امتصاص والنتوء. Ca2 + إشارات قد تتخذ شكل موحد، طويلة الأمد، ذبذبات عالية الكثافة العالمية التي قد تستمر لعدة ثوان أو دقائق حتى، نشر داخل الخلايا وبين الخلايا Ca2 + الأمواج التي قد تعبر المسافات داخل الخلايا ما يزيد على 100 ميكرومتر10،11،،من1213،14،،من1516، أو المزيد من الأحداث موجزة، ومكانيا مترجمة مثل Ca2 + الشرر و Ca2 + نفث التي تحدث على عشرات الجداول الزمنية ميلي ثانية واحدة، وانتشار أقل من 5 ميكرومتر17،،،من1819،20.

مجهر فلوري قد استخدمت على نطاق واسع لرصد Ca2 + الإشارات في الخلايا المعزولة ومثقف وفي أنسجة سليمة. وتقليدياً، هذه التجارب انطوت على استخدام الفلورية Ca2 + المؤشرات، راتيوميتريك والأصباغ غير راتيوميتريك مثل Fura2 أو Fluo3/4 أو Rhod2، من بين آخرين 21،،من2223. هذه المؤشرات قد صممت لتكون نفاذية أغشية الخلايا وثم أصبحوا محاصرين في الخلايا بالانقسام من جماعة إستر عبر esterases الذاتية. ملزمة من Ca2 + لمؤشرات ترابط عالية تسبب التغييرات في الأسفار عندما كانت مضاءة الخلايا والأنسجة بالمناسبة الأطوال الموجية للضوء. استخدام الخلية نفاذية Ca2 + مؤشرات تتعزز فهمنا من Ca2 + إشارات في الخلايا الحية ويسمح القرار المكانية والتحديد الكمي لهذه الإشارات التي لم يكن من الممكن بالمعايرة Ca2 + إشارات من خلال وسائل أخرى، مثل الكهربية. ومع ذلك، قد Ca2 + المؤشرات التقليدية العديد من القيود، مثل فوتوبليتشينج التي تحدث على مدى فترات ممتدة من تسجيل24. في حين أحدث Ca2 + مؤشر الأصباغ مثل Cal520/590 قد تحسنت كثيرا إشارة إلى نسب الضوضاء والقدرة على اكتشاف المحلية Ca2 + إشارات25، قضايا مع فوتوبليتشينج يمكن لا تزال مصدر قلق لبعض المحققين 2627،،28. فوتوبليتشينج متسرعة كما يقيد التكبير، المعدل للحصول على الصور، والقرار التي يمكن استخدامها للتسجيلات، كما تتطلب زيادة قوة موضوعية ومعدلات أعلى للحصول على الصور زادت كثافة الضوء الإثارة التي يزيد من فوتوبليتشينج.

هذه القيود التقليدية Ca2 + مؤشر الأصباغ تتفاقم عند تسجيل Ca2 + إشارات في الموقع، على سبيل المثال عند تسجيل داخل الخلية Ca2 + إشارات من أنسجة سليمة. بسبب المشاكل المذكورة أعلاه، التصور Ca2 + إشارات في الموقع باستخدام الخلية نفاذية Ca2 + مؤشرات تم محدودة إلى تضخم منخفضة الطاقة وتخفيض المعدلات لالتقاط الصور، ويقيد قدرة المحققين لتسجيل و تحديد Ca2 + إشارات سوبسيلولار المقيدة زمنياً أو مكانياً. وبالتالي، كان من الصعب التقاط وتحليلها، ونقدر تعقيد المكانية والزمانية Ca2 + الإشارات، التي يمكن أن تكون هامة في توليد الاستجابات البيولوجية المطلوبة، كما هو مبين أعلاه. تحليل Ca2 + الإشارات من الخلايا في الموقع يعتمد عادة على قياسات كثافة بسيطة من مناطق مختارة للفائدة (ROI) ضمن مجال رؤية (FOV). يمكن تحيز الاختيار التعسفي لعدد وحجم وموضع رويس، تعتمد على أهواء الباحث، شدة النتائج المتحصل عليها. كذلك التحيز المتأصل بتحليل العائد على الاستثمار، هذا النهج يتجاهل الكثير من أهمية مما يشير إلى المعلومات التي تتضمنها فوف، كدينامية Ca2 + الأحداث داخل تعسفاً المختار يتم تحديد العائد على الاستثمار للتحليل. وعلاوة على ذلك، فشل تحليل رويس لتقديم معلومات عن الخصائص المكانية من Ca2 + إشارات لاحظ. على سبيل المثال، قد لا يكون ممكناً للتمييز بين ارتفاع Ca2 + الناتجة نشر Ca2 + موجه وكاليفورنيا مترجمة عالية2 + الإفراج عن الحدث من تبويبات Ca2 + إشارات داخل العائد على الاستثمار.

ظهور المرمزة وراثيا Ca2 + المؤشرات (جيسيس) قد تغيرت تغيرا جذريا في كيف يمكن أن يكون Ca2 + تصوير المؤداة في الموقع29،30،،من3132،33 . وهناك العديد من المزايا لاستخدام جيسيس أكثر الأصباغ. وربما الأكثر أهمية هو أن التعبير عن جيتشي يمكن أن يؤديها بطريقة محددة في خلية، مما يقلل من تلوث الخلفية غير المرغوب فيها من الخلايا لا فائدة. ميزة أخرى جيسيس فوق Ca2 + المؤشرات التقليدية أن فوتوبليتشينج انخفاض (كما الأسفار والتبعية فوتوبليتشينج فقط يحدث عندما الخلايا تكون نشطة)، بالمقارنة مع عينات محملة بصبغة، لا سيما في عالية التكبير، والمعدلات العالية للصورة التقاط34. وهكذا، التصوير مع جيسيس، مثل سلسلة جكامب من أجهزة استشعار أوبتوجينيتيك، يتيح للمحققين القدرة على تسجيل موجز، المترجمة دون الخلوية Ca2 + إشارات في الموقع والتحقيق Ca2 + الإشارات في الخلايا داخل بهم بيئات الأصلي الذي لم يكن ممكناً سابقا. لتحقيق أقصى قدر من استرداد المعلومات من هذه التسجيلات عالية الاستبانة، التحليل المكاني والزماني المناسب من Ca2 + الإشارات مطلوب. تجدر الإشارة إلى أنه بينما يمكن أن توفر جيسيس بعض مزايا واضحة، قد كشفت الدراسات الأخيرة أن Ca2 + تصوير يمكن أن يتم بنجاح من إعداد كبيرة من السكان من مختلف الطبقات الكيميائية العصبية من الخلايا العصبية في وقت واحد باستخدام التقليدية Ca2 + المؤشرات التي لا يتم ترميز وراثيا في الحيوان35. هذا النهج المستخدمة immunohistochemistry المخصصة بعد الكشف عن عدة فئات مختلفة من الخلايا العصبية يطلقون النار على الترددات العالية في رشقات نارية متزامنة، وتجنب احتمال أنه قد يكون تدخل التعديلات الوراثية للحيوان مع الفسيولوجية سلوك المحقق يسعى إلى فهم35،36.

تيسير البروتوكولات المبينة في هذه الورقة تحليل أكثر اكتمالا والتحديد الكمي ل Ca2 + إشارات مسجل من الخلايا في الموقع باستخدام مزيج من الخريطة الزمانية المكانية (STM)-استناداً إلى التحليل والتحليل القائم على الجسيمات. كما وصف البروتوكولات كيف مختلف أنماط Ca2 + الإشارات الملحوظة في خلية مختلفة يمكن تحليل السكان في الموقع المناسب. للتوضيح، الطريقة التي ستدرس Ca2 + الإشارات في عدد سكان متخصصة من الخلايا في الأمعاء الدقيقة، الخلايا فراغي من كيال (المحكمة الجنائية الدولية). المحكمة الجنائية الدولية هي خلايا متخصصة في الجهاز الهضمي (غي) أن المعرض الحيوية داخل الخلايا Ca2 + إشارات، كما تصور استخدام الفئران معربا عن جكامبس37،،من3839،40، ،من 4142. Ca2 + العابرين في المحكمة الجنائية الدولية المرتبطة بالتنشيط من Ca2 +-تنشيط قنوات (المشفرة بواسطة Ano1) التي تعتبر مهمة في تنظيم استثارة العضلات الملساء المعوية الخلايا (سمكس)43، Cl ،من 4445. وهكذا، دراسة Ca2 + إشارات في المحكمة الجنائية الدولية أمر أساسي لفهم حركية الأمعاء. الأمعاء موريني يقدم مثالاً ممتازا لهذه التظاهرة، كما أن هناك فئتين من المحكمة الجنائية الدولية أن تكون مفصولة تشريحيا ويمكن تصور بشكل مستقل: أنا) المحكمة الجنائية الدولية الموجودة في المنطقة الواقعة بين العضلات الملساء الطولية والدائرية طبقات، المحيطة الضفيرة myenteric (المحكمة الجنائية الدولية-بي). هذه الخلايا تعمل كخلايا تنظيم ضربات القلب، وتوليد النشاط الكهربائي المعروف بموجات بطيئة46،47،،من4849؛ ثانيا) المحكمة الجنائية الدولية أيضا تقع بين ضفيرة غنية بالمحطات الطرفية للخلايا العصبية الحركية (الضفيرة العضلية العميقة، وبالتالي المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث). هذه الخلايا تعمل كوسطاء ردود على كبيرة الحركية المعوية37،39،،من4050. بي-المحكمة الجنائية الدولية والمحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث تختلف شكلياً Ca2 + إشارات سلوكهم تختلف جذريا على إنجاز المهام المحددة. المحكمة الجنائية الدولية-بلدي النجمية في الشكل وتشكل شبكة خلايا المترابطة عن طريق الفجوة تقاطعات51،52. Ca2 + إشارات في بيان المحكمة الجنائية الدولية-بلدي مختصرة ومترجمة مكانياً Ca2 + الإفراج عن الأحداث التي تقع في مواقع متعددة بشكل متزامن من خلال شبكة بي-المحكمة الجنائية الدولية كتصور داخل فوف (تصويرها مع هدف X 60)38. ويتم تنظيم هذه الإشارات غير متزامن وقتيا في الثانية 1 التكتلات التي، عندما جدولت معا، تصل إلى ارتفاع خلوية s 1 صافي في Ca2 +. هذه الإشارات نشر خلية إلى خلية داخل الشبكة المحكمة الجنائية الدولية وذلك تنظيم Ca2 + إشارات، وتولد من المواقع الفرعية الخلوية، في أنسجة واسعة Ca2 + موجه. تجميع الزمانية والجمع من Ca2 + إشارات في سمي المحكمة الجنائية الدولية-بلدي Ca2 + مجموعات عابرة (ريادية)38. تحدث ريادية إيقاعي (مماثلة تماما مثل المدد الزمنية وفترات مماثلة بين ريادية) 30 مرة في الدقيقة في الماوس. على العكس من ذلك، المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث محور الدوران على شكل خلايا، بعض العمليات الثانوية، التي توزع بين سمكس والعمليات العصبية دوالي ولا بشكل مستقل شبكة،من5152. بيد أن المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث تشكل تقاطعات الفجوة مع سمكس، وتعمل داخل هذا سينسيتيوم أكبر، المعروف باسم سينسيتيوم المسبار53. Ca2 + إشارات تحدث في مواقع متعددة على امتداد أطوال الخلايا، ولكن لم يتم العالق هذه العابرين أو وقتيا متفاوت المسافات، كما لوحظ في المحكمة الجنائية الدولية-بلدي37. Ca2 + إشارات في المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث تحدث بطريقة عشوائية، مع كثافات متغيرة والمدد الزمنية والمكانية الخصائص. البروتوكولات أدناه، باستخدام مثال Ca2 + إشارات في بلدي-المحكمة الجنائية الدولية والمحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث، وصف تقنيات تحليل إشارات معقدة في أنواع معينة من الخلايا في الموقع. نحن تستخدم النظام ف لوكس Cre إيندوسيبلي للتعبير عن GCaMP6f حصرا في المحكمة الجنائية الدولية، بعد حمل تفعيل Recombinase لجنة المساواة العرقية (Cre) مدفوعا مروج المحكمة الجنائية الدولية محددة (مجموعة أدوات).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وكانت جميع الحيوانات المستخدمة والبروتوكولات المضطلع بها في هذه الدراسة وفقا "المعاهد الوطنية للصحة دليل" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. وافق جميع الإجراءات المؤسسية استخدام الحيوان ورعاية اللجنة في جامعة نيفادا، رينو.

1-جيل فئران KitGCaMP6f

  1. عبر Ai95 (RCL-GCaMP6f)-د (الفئران GCaMP6f) ومجموعة ج+ لجنة المساواة العرقية-ERT2 (Cre طقم الفئران) لإنشاء المحكمة الجنائية الدولية محددة GCaMP6f وإذ تعرب عن الحيوانات (الفئران كيت-لجنة المساواة العرقية-GCaMP6f).
    ملاحظة: واستخدمت GCaMP6f بسبب كفاءتها المبلغ عنها في التقارير المترجمة، موجزة داخل الخلية Ca2 + إشارات في الموقع والمجراه في54.
  2. حقن الفئران كيت-لجنة المساواة العرقية-GCaMP6f مع تاموكسيفين في الإعمار من 6 – 8 أسابيع للحث على تفعيل لجنة المساواة العرقية ريكومبيناسي والتعبير GCaMP6f اللاحقة في المحكمة الجنائية الدولية (الشكل 1).
    1. لإنشاء حل تاموكسيفين، يحل 80 ملغ تاموكسيفين (انظر الجدول للمواد) في 800 ميكروليتر من الإيثانول (انظر الجدول للمواد) ومبومو ودوامه لمدة 20 دقيقة.
    2. إضافة 3.2 مل زيت القرطم (عام) لإنشاء حلول 20 ملغ/مل وثم sonicate لمدة 30 دقيقة قبل الحقن.
    3. حقن الفئران (الحقن داخل؛ الملكية الفكرية) مع 0.1 مل من محلول تاموكسيفين (2 ملغ تاموكسيفين) لمدة ثلاثة أيام متتالية. تأكيد التعبير GCaMP6f بالتنميط واستخدام الفئران بعد الحقن الأول 10 أيام.
      1. النمط الوراثي الفئران بقطع قطعة صغيرة من الإذن من كل الحيوانات. ثم استخدم أسلوب العامل البارع55 لعزل الحمض النووي الجينوم التي تفرخ مقاطع الإذن عند 95 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة في 75 مل من هيدروكسيد الصوديوم وتحييد ثم قبل 75 مل تريس المخزن المؤقت. استخدام PCR القياسية لتحديد النمط الوراثي من كل الحيوان، 2 مل من الحمض النووي في رد فعل 20 مل مع GCaMP6f الإشعال محددة56. تشغيل 10 مل منتج بكر على 2% [اغروس] هلام لتحديد نوع البرية (297 bp) والمسخ (~ 450 bp) العصابات.

2-إعداد الأنسجة Ca2 + تصوير

  1. تخدير الفئران باستنشاق مع إيسوفلوراني (4%، انظر الجدول للمواد) في هود التهوية والتضحية ثم بخلع عنق الرحم.
  2. استخدام مقص حاد فتح البطن للفئران، إزالة الأمعاء ووضعه في المسابقة كريبس بيكربونات الحل (كربوفانتسي). فتح الأمعاء على طول الحدود المساريقي العلوي ويغسل أي محتويات إينترالومينال مع كربوفانتسي. استخدام تشريح حاد، إزالة طبقات الغشاء المخاطي والغشاء المخاطي الفرعية.
    ملاحظة: الحل كربوفانتسي بالتشكيل التالي (مم): 118.5 كلوريد الصوديوم، 4.7 بوكل، كاكل2 2.5، مجكل2 1.2، ناكو3 23.8، 1.2 خ2ص4 ، 11.0 سكر العنب. يحتوي هذا الحل على pH قدرة 7.4 في 37 درجة مئوية عند bubbled بالتوازن مع 95% O2-5% CO2.
  3. استخدام دبابيس صغيرة، دبوس أنسجة الأمعاء الدقيقة لقاعدة لوحدة التخزين 5 مل، طبق المغلفة سيلجارد قطرها 60 ملم مع طبقة العضلات الملساء الدائرية مواجهة. نتخلل الإعداد مع الحل كربوفانتسي المعالجون في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة قبل التجريب الموازنة.
  4. بعد هذه الفترة الموازنة، نفذ في الموقع Ca2 + تصوير الصغيرة الأمعاء بلدي-المحكمة الجنائية الدولية والمحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل] (تم اقتناء الصور في هذا البروتوكول مع مجهر [كنفوكل] مزودة بقرص غزل). نظراً لفوائد جيسيس الموصوفة أعلاه، تستخدم صور عالية الدقة الوقت الفاصل بين (> 30 إطارا في الثانية، في الثانية الواحدة) جنبا إلى جنب مع أهداف عالية القوة (60 – 100 x) للحصول على أفلام من Ca2 + إشارات حيوية في المحكمة الجنائية الدولية.
    ملاحظة: للحد من حركة الأنسجة، تطبيق نيكارديبيني (0.1 – 1 ميكرومتر) خلال التسجيلات كما هو موضح سابقا37،،من3839،،من4041.
  5. تميز بي-المحكمة الجنائية الدولية والمحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث في الأمعاء الدقيقة باستخدام مواقعها التشريحية المختلفة، ومورفولوجيا والقاعدية Ca2 + أنماط النشاط.
    1. موقع المحكمة الجنائية الدولية-بلدي على مستوى ضفيرة مينتيريك، بين طبقات العضلات الملساء الطولية والدائرية للامعاء الدقيقة. وهم النجمية الشكل، تشكيل شبكة اتصال (الشكل 3A). نشر ريادية (المذكورة أعلاه) من خلال الشبكة من المحكمة الجنائية الدولية-بلدي حدثاً عادياً من دورات ~ 30 لكل دقيقة.
    2. على العكس من ذلك، قم بتحديد موقع المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث في طائرة واحدة على صعيد الضفيرة العضلية العميقة، ما بين طبقة العضلات الملساء الدائرية والضفيرة سوبموكوسال. المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث لا تشكل شبكة، وهي محور الدوران على شكل الخلايا (الشكل 2A) أن يحمل أية أحداث نشر العادية، وبدلاً من ذلك إطلاق النار العشوائية، المترجمة Ca2 + العابرين داخل الخلايا.
  6. بغض النظر عن اقتناء البرمجيات المستخدمة، وحفظ الأفلام ككومة من الصور TIFF.

3-تحليل العشوائية Ca2 + إشارات في المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث باستخدام رسم الخرائط الزمانية (STM)

  1. تحليل المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث باستخدام رسم الخرائط الزمانية مع مزيج من البرمجيات ImageJ (المعاهد الوطنية للصحة، الولايات المتحدة الأمريكية، مجاناً للتحميل في http://imagej.nih.jov/ij) وبرامج مخصصة الصنع (فولوميتري، الإصدار G8d، GWH، قابلة للتشغيل على نظام التشغيل Mac OS، اتصل grant.hennig@ هنيغ منحة med.uvm.edu فيما يتعلق الاستفسارات للحصول على فولوميتري واستخدامها)
    ملاحظة: كما يتوفر نهج بديل لتحليل هذه الخرائط الزمانية مع ImageJ وحدها تماما في أقسام لاحقة (بداية في الخطوة 3، 9).
  2. فتح فولوميتري واستخدام نقرات الماوس الأيمن لفتح المجلدات التي تحتوي على ملفات الأفلام. غادر انقر على ملف الفيلم ليتم تحليلها لفتحه في فولوميتري (يجب أن يكون بتنسيق TIFF غير مضغوط). بمجرد فتح، فسترد الفيلم داخل إطار الأزرق تحدها (نافذة الفيلم) التي سوف تشمل مساحة كبيرة من الشاشة الأيسر. سوف تحتوي على الجانب الأيسر من الشاشة إطار مؤامرة (العلوي 4/5ths) وإطار آثار (أقل 1/5th).
  3. ضبط أبعاد الفيلم بضغط SHIFT باستمرار وفي نفس الوقت التمرير حتى مع زر الماوس الأوسط (MMB، يقلل من حجم) أو التمرير لأسفل مع MMB (زيادة الحجم). بدء أو إيقاف التشغيل بالضغط على 'ألف'؛ يمكن ضبط سرعة التشغيل بالضغط الأعلى وأسفل مفاتيح الأسهم.
  4. لإنشاء الوحدات التدريبية الموحدة استخدام فولوميتري، رسم العائد على الاستثمار أكثر من خلية كاملة بضغط SHIFT باستمرار أثناء النقر والسحب بزر الماوس الأيسر. ضبط اتجاه العائد على الاستثمار بالتمرير مع MMB في الزوايا من العائد على الاستثمار. عندما يكون العائد على الاستثمار في مكان فوق الخلية يتم تحليلها (الشكل 2A)، استخدام الحق النقر في "إطار الفيلم" للوصول إلى 'STMs دوروا – ستميافج > إكسروو' وغادر انقر لإنشاء تحقيق الاستقرار والانتساب لنشاط الخلية في "إطار مؤامرة" (وهناك أيضا خيار لتحديد ' ستمكسافج > يرو ث '، واحد الذي يتم تحديد سوف يعتمد على ما إذا كان اتجاه الخلية هو أكثر توافقاً مع x أو المحور y، على سبيل المثال الخلية إبراز الشكل 2A هو أكثر الموجه على المحور y').
  5. غادر انقر على تحقيق الاستقرار والانتساب في "إطار مؤامرة" واضغط 'P' طرح متوسط الضوضاء واضغط 'ح' زيادة تباين تحقيق الاستقرار والانتساب. حفظ في تحقيق الاستقرار والانتساب عن طريق الحق النقر عليها للوصول إلى 'تحقيق الاستقرار والانتساب تحميل حفظ-حفظ STM ك tif.' وغادر ثم النقر فوق حفظ كملف TIFF.
  6. سوف تنفذ ما تبقى تحليل للمحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث في إيماجيج. إيماجيج يتكون من عنصرين رئيسيين هما، شريط أدوات مع موقع ثابت على أعلى الشاشة وواجهة مستخدم الهاتف المحمول. باستخدام إيماجيج، افتح ملف TIFF تحقيق الاستقرار والانتساب للمحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث Ca2 + النشاط (فتح ملف شريط أدوات الصورة J).
  7. فتح إنشاء فولوميتري تحقيق الاستقرار والانتساب، التي سيكون لها وقت الموجه عمودياً. إيماجيج سيتم فتحه تلقائياً ملفات TIFF ك RGB أو الصور 16-بت. لتحسين جودة الصورة، غادر انقر 'صورة' في شريط الأدوات إيماجيج. التمرير في الخيار الأول 'نوع' للكشف عن القائمة المنسدلة قائمة تنسيقات الصور المختلفة، انتقل أكثر من 32-بت '، وغادر انقر لتغيير.
  8. جعل في تحقيق الاستقرار والانتساب للقراءة مع الزمن من اليسار إلى اليمين، غادر انقر على شريط الأدوات إيماجيج على المسار التالي: 'الصورة-تحويل استدارة إلى اليسار درجة 90'. من الممكن أيضا لإنشاء STMs في الموقع المرجع المصدق ca2 + النشاط باستخدام لينيسكانس مع إيماجيج وحدها دون فولوميتري، وهذا هو مفصل أدناه.
    ملاحظة: حالما يتم إنشاء STMs أنهم يتم تحليل بنفس الطريقة بغض النظر عن الذي تم استخدام البرمجيات لتوليد لهم. لتخطي هذا الأسلوب البديل لخلق STMs في إيماجيج، قم بالتخطي إلى الخطوة 3.19.
  9. لإنشاء STMs مع إيماجيج، فتح كومة ملفات TIFF التي تقوم بإنشاء تسجيل نشاط2 + Ca المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث (فتح ملف شريط أدوات إيماجيج). إيماجيج سيتم فتحه تلقائياً ملفات TIFF ك RGB أو الصور 16-بت. لتحسين جودة الصورة، غادر انقر 'صورة' في شريط الأدوات إيماجيج. التمرير في الخيار الأول 'نوع' للكشف عن القائمة المنسدلة قائمة تنسيقات الصور المختلفة، انتقل أكثر من 32-بت '، وغادر انقر لتغيير.
  10. ينبغي الآن طرح ضجيج الخلفية (الناجمة عن الضوضاء الكاميرا أو صف السيارات) من الفيلم. غادر انقر فوق الدالة '"مستطيل التحديد"' في واجهة إيماجيج ورسم العائد على الاستثمار (بترك النقر والسحب إلى الحجم المطلوب والشكل) أكثر من الأسفار خلفية للفيلم.
  11. بعد تحديد العائد على الاستثمار، غادر انقر على 'تحليل' في شريط الأدوات إيماجيج، ومن ثم غادر انقر فوق 'الرسم البياني' من القائمة المنسدلة الناتجة. ثم يظهر مربع منبثق تستفسر عن قيم مجموعة البيكسل لحساب؛ وقد إيماجيج قيم دوروا المختارة حتى اليسار انقر 'موافق'.
  12. بعد النقر فوق 'موافق'، سيظهر مربع منبثق جديد الذي يحتوي على الرسم بياني تبين توزيع قيم بكسل ضجيج الخلفية داخل العائد على الاستثمار. يحيط علما بمتوسط القيمة المدرجة أدناه على الرسم البياني ثم قم بإغلاق مربع منبثق.
  13. انقر فوق العودة إلى الفيلم 32-بت وحدد فوف كامل بترك النقر فوق 'تحرير' على شريط الأدوات إيماجيج، والتمرير إلى 'اختيار' وغادر النقر فوق "تحديد الكل" من القائمة المنسدلة وكشف.
  14. غادر انقر فوق 'عملية' على شريط الأدوات إيماجيج، قم بالتمرير إلى 'الرياضيات' وغادر انقر فوق 'طرح' من القائمة المنسدلة كشفت.
  15. سوف يظهر مربع منبثق بحيث يمكن إدخال قيمة لطرح من فوف. أدخل القيمة يعني اكتسبت من الرسم البياني في الخطوة 3، 12 أعلاه وانقر فوق 'موافق'. ثم سوف يطلب إيماجيج لمعالجة كافة الإطارات في مكدس TIFF (وليس فقط إطار واحد الفيلم حاليا في). انقر فوق 'نعم'.
  16. بعد النقر فوق 'نعم'، سيتم إيقاف الفيلم الأسود. لتصحيح هذه المشكلة، غادر انقر فوق 'صورة' في شريط الأدوات إيماجيج والتمرير عبر 'ضبط'. غادر انقر على الخيار الأول كشف عن 'السطوع/التباين' (ب وج). وهذا سيجلب يطفو على السطح مربع حيث يمكن تعديل جوانب مختلفة من السطوع والتباين. غادر انقر على الخيار 'السيارات' مرة واحدة للكشف عن زيادة نوعية في الفيلم. اترك هذا ب & ج البوب مربع مفتوح للاستخدام في المستقبل.
  17. لإنشاء linescan، أولاً حق انقر على أداة التحديد الخط في واجهة إيماجيج للكشف عن الخيارات المتعلقة بخطوط مختلفة؛ غادر انقر على '"خط مجزأة"' اختياره من القائمة. مع تحديد أداة '"خط مجزأة"'، غادر النقر فوق استخدام واحد لرسم خط على طول محور المحكمة الجنائية الدولية الفردية-برنامج إدارة الكوارث في منتصف. سيتم إصلاح كل واحدة فوق الأيسر فوق السطر في هذه النقطة بالذات، والخط يمكن ثم بحرية نقل مزيد من أي زاوية المنشود. عند الانتهاء من السطر، ضعف اليسار انقر لإصلاح الخط في مكان.
  18. غادر انقر فوق 'صورة' على شريط الأدوات إيماجيج والتمرير عبر 'رزمة' واليسار انقر على الخيار 'ريسليسي'. سوف يظهر مربع منبثقة؛ غادر انقر على خيار 'تدوير 90 درجة'، وهذا سيتم توجيه linescan من اليسار إلى اليمين حتى أنه يمكن معايرة وقراءة ضد الوقت على المحور س، مع مساحة على المحور ص. انقر فوق 'موافق' لإنشاء في تحقيق الاستقرار والانتساب.
  19. سيتم إنشاء كثافة تحقيق الاستقرار والانتساب على اللون رمادي مع كثافة عالية Ca2 + إشارات سيظهر كدرجات متفاوتة من الأبيض، وقبالة رمادي أبيض أو فاتح اعتماداً على قوتها. عادة، على النقيض linescan تم إنشاؤه سوف تحتاج إلى تحسين. القيام بذلك بواسطة النقر فوق 'السيارات' على البوب ب & ج مربع.
  20. كثافة الأسفار linescan يرد على تحقيق الاستقرار والانتساب في قيم بكسل التعسفي. من أجل دقة قياس السعة لكاليفورنيا2 + إشارات من تحقيق الاستقرار والانتساب، قيم الأسفار "تحقيق الاستقرار والانتساب" (F) الآن بحاجة إلى تطبيع. استخدام الدالة '"مستطيل التحديد"' في واجهة إيماجيج، رسم العائد على الاستثمار في منطقة تحقيق الاستقرار والانتساب الذي يعرض منطقة موحدة الأكثر والأقل كثافة من الأسفار (و0).
  21. كرر الخطوات التي اتخذت في 3.11-3.12 للحصول على قيمة متوسط (و0) كثافة داخل دوروا المحددة ومن ثم حدد في تحقيق الاستقرار والانتساب كاملة بترك النقر فوق 'تحرير-التحديد-حدد"جميع"' من شريط الأدوات إيماجيج.
  22. غادر انقر فوق 'عملية' على شريط الأدوات إيماجيج، انتقل إلى 'الرياضيات'؛ غادر انقر فوق 'تقسيم' كشف أحد الخيارات. في مربع منبثق اللاحقة، أدخل القيمة الوسطية (و0) التي تم الحصول عليها من الخطوة 3.21. عند قسمة تحقيق الاستقرار والانتساب كاملة (و0) سوف تتحول تحقيق الاستقرار والانتساب الأسود؛ تصحيح هذا عن طريق النقر فوق 'السيارات' على ب & ج يطفو على السطح مربع. الآن معايرة linescan على السعة، بكثافة الأسفار معبراً و/و0.
  23. سيتم عرض تحقيق الاستقرار والانتساب حاليا عدد الإطارات في مكدس TIFF على المحور السيني وعدد وحدات البكسل التي تمثل طول الخلية على المحور ص. من أجل التحديد الكمي للمعلومات المكانية والزمانية من Ca2 + إشارات، معايرة تحقيق الاستقرار والانتساب للمكان والزمان. غادر انقر فوق 'صورة' في شريط الأدوات إيماجيج وغادر انقر فوق 'خصائص'. سيظهر مربع منبثق. ضمن هذا الإطار، قم بإدخال القيم المناسبة لمعايرة تماما في تحقيق الاستقرار والانتساب.
  24. '"بكسل"عرض'، أدخل طول الوقت الذي يستغرقه لالتقاط إطار واحد في ثوان. للحصول على أمثلة، في الثانية 5، قم بإدخال قيمة 0.2، لإدخال 50 إطارا في الثانية قيمة 0.02، ل 33 FPS أدخل قيمة 0.033، إلخ. ل '"بكسل ارتفاع"'، أدخل كم ميكرون كل بكسل يمثل (سيعتمد على الهدف المستخدمة ويستخدم لاقتناء كاميرا). يتم ترك 'عمق فوكسل' في 1 قبل النقر فوق 'موافق'. أية معلمات أخرى تحتاج إلى تعديل في داخل الإطار.
    ملاحظة: بعد النقر فوق 'موافق'، سوف معايرة تحقيق الاستقرار والانتساب كاملة السعة والمساحة والوقت. سوف أعرب عن السعة على تحقيق الاستقرار والانتساب و/والوقت على المحور السيني سيعبر عنها في ثوان، وسوف أعرب عن الفضاء على المحور الصادي في ميكرومتر (الشكل 2). Ca2 + الأحداث على تحقيق الاستقرار والانتساب وأصبحت الآن جاهزة قياس، وتحقيق الاستقرار والانتساب معايرة كما يمكن حفظها كصورة TIFF واحدة تحليلها في وقت لاحق.
  25. وقد إيماجيج عددا من بني في جدول البحث لون مشفرة (طرفيات المستعملين المحليين) التي يمكن استخدامها للون رمز تحقيق الاستقرار والانتساب. تطبيق بنيت في طرفية بترك النقر فوق على شريط الأدوات إيماجيج على المسار '"جداول"بحث الصورة' واختر طرفية لتطبيق. يمكن أيضا استيراد العرف طرفيات المستعملين المحليين إلى تحقيق الاستقرار والانتساب بترك النقر فوق على شريط إيماجيج على طريق 'ملف-استيراد-طرفية' ثم تحديد طرفية المستعملين المحليين للاستيراد. فعلى سبيل المثال كان STM هو مبين في الشكل 2 طرفية المستعملين المحليين مخصص 'كوبباليتي' (كوينز جامعة بلفاست، المملكة المتحدة) مطبقة عليه، إلى رمز الألوان الحارة (الأحمر والبرتقالي) مناطق ذات كثافة Ca2 + الأسفار والألوان الباردة (الأسود، الأزرق) كمناطق منخفضة Ca2 + الأسفار.
  26. لإدراج قضيب معايرة سعة للإشارة إلى نطاق ستريك ممثلة بألوان مختلفة، غادر انقر فوق 'تحليل' من شريط الأدوات إيماجيج، قم بالتمرير إلى 'أدوات'، وحدد 'معايرة شريط' من القائمة وكشف. يتم إعطاء خيارات الحجم والتكبير/التصغير، نطاق والموقف على تحقيق الاستقرار والانتساب لشريط المعايرة؛ ضبط هذه الإعدادات كما هو مطلوب ثم انقر فوق 'موافق'. لاحظ أنه عندما يتم إدراج شريط المعايرة، يخلق ImageJ الموحدة جديدة التي تحتوي عليه، ترك النسخة الأصلية دون شريط المعايرة سليمة ومنفصلة.
    ملاحظة: إذا كان المربع 'تراكب' هو قليلاً عند إدراج شريط المعايرة، لن يتم إنشاء تحقيق الاستقرار والانتساب جديد.
  27. غادر انقر لبدء تحليل Ca2 + أحداث فردية على محدد '"خط مستقيم"' على واجهة إيماجيج. بالبداية غادر النقر على تحقيق الاستقرار والانتساب، رسم خط أفقي مستقيم من خلال مركز Ca2 + حدث مواز للمحور السيني (ضد الزمن). إكمال السطر بترك النقر مرة ثانية (الشكل 2D).
  28. انقر فوق 'تحليل' على شريط الأدوات إيماجيج واليسار انقر على '"الأرض الشخصية"'. سوف يظهر مربع جديد مع التشكيل الجانبي مؤامرة Ca2 + الحدث (الشكل 2E).
    ملاحظة: الخيار 'قائمة' داخل هذا المربع سيقوم بإنشاء قائمة قيم س وص للمؤامرة التي تم إنشاؤها، والتي يمكن نسخها إلى برنامج جدول بيانات لإنشاء آثار إذا رغبت في ذلك.
  29. لقياس السعة Ca2 + الحدث تمثل في التشكيل الجانبي للأرض، غادر انقر فوق محدد '"خط مستقيم"' على واجهة إيماجيج. ثم رسم خط عمودي من خط الأساس للتشكيل الجانبي للأرض إلى ذروة Ca2 + الحدث؛ طول السطر (كما هو موضح في واجهة إيماجيج) سيمثل السعة للحدث معبراً عنها ΔF/و0 (الشكل 2E).
  30. استخدام قيمة السعة المكتسبة، مدة Ca2 + الحدث يمكن أن يقاس برسم خط مستقيم عبر عرض الحدث عند نقطة السعة 50% كحد أقصى (المدة الكاملة في نصف السعة القصوى، فدهم) أو المدة الكاملة للحدث ويمكن قياس إذا رغبت في ذلك (الشكل 2E).
    ملاحظة: المجربون وسوف تحتاج إلى تصميم معيار محدد لمستوى العتبة صالحة Ca2 + الأحداث في هذه التسجيلات. في تجاربنا، اعتبرت Ca2 + الأحداث يجري صالحة للتحليل إذا كان لها السعة > 15% الحدث السعة القصوى في المقطع عنصر تحكم التسجيل. ومع ذلك، ستتوقف هذه العتبات في أنسجة محددة والخلايا قيد الدراسة وهي فقط التعسفي التوجيهية التي تتطلب التحسين المحددة لكل نوع من الأنسجة والخلايا.
  31. رسم خط على طول أوبستروكي أو downstroke من Ca2 + حدث مؤامرة التشكيل الجانبي، بمعدل ارتفاع أو سقوط يمكن أن يحسب تبعاً لذلك. بعد أن يتم رسم الخط، يمكن نقل رأس مؤشر الماوس إلى النقطة حيث يبدأ السطر وينتهي. عندما يكون المؤشر ثابتة على هذه النقاط، سيتم عرض x, y إحداثيات لهذا الموقع في الجانب الأيسر السفلي من واجهة إيماجيج. وهكذا، من خلال الحصول على x, قيم y حيث يبدأ السطر (س1، ص1) وينتهي (س2، ص2)، ويمكن حساب معدل الارتفاع أو الانخفاض (ΔF/s) كميل الخط، ص2 1 /س-2 ×1 (الشكل 2 واو ).
  32. بغية حساب نشر أو الحيز المكاني Ca2 + حدث، بقي فوق على محدد '"خط مستقيم"' على واجهة إيماجيج. ثم رسم خط مستقيم عمودي على طول Ca2 + الحدث على طول المحور الصادي. طول السطر (كما هو موضح في واجهة إيماجيج) سوف يمثل انتشار المكاني للحدث معبراً ميكرومتر (الشكل 2).
  33. تحديد سرعة نشر Ca2 + حدث برسم خط على طول الجبهة نشر الحدث وحساب منحدر الخط. يمكن إجراء ذلك يدوياً بنفس الطريقة الموضحة في الخطوة 3، 32، بواسطة تحديد x، قيم y حيث يبدأ السطر (س1، ص1) وينتهي (س2، ص2)؛ سيتم عرض هذه القيم في الجانب الأيسر السفلي من الواجهة ImageJ عندما يقع مؤشر الماوس على تحقيق الاستقرار والانتساب.
  34. بناء على مجموعة المعلمات المطلوبة Ca2 + الحدث التقدير الكمي وتجمع هذه القيم في المتوسط لتوليد قيم المتوسط الحسابي لكل معلمة على أساس الخلية الواحدة؛ وبدلاً من ذلك، وضع كل من القيم الخام في توزيع الرسم بياني لإظهار مداها (الشكل 2 ح).

4-تحديد مقدار ريادية في الجسيمات باستخدام المحكمة الجنائية الدولية-بلدي على أساس تحليل

  1. قبل تحليل الأفلام في فولوميتري مع بتكلس، سوف تحتاج إلى معايرة المكانية والزمانية للفيلم سيتم إدراجه في اسم الملف. تحرير كافة الملفات يتم تحليلها في فولوميتري لاحتواء ضمن العنوان عدد الثواني التي يساوي كل إطار وأيضا فصل عدد ميكرون التي يساوي كل بكسل بشرطة واحدة، مع قيم المغطى في أقواس مربعة. على سبيل المثال، يجب أن يكون فيلم المكتسبة في الثانية 33 مع هدف 60 x (512 × 512) [0.22 – 0.033] إدراج اسم الملف الخاص به.
  2. فتح فولوميتري واستخدام نقرات الماوس الأيمن لفتح المجلدات التي تحتوي على ملفات الأفلام. غادر انقر على ملف الفيلم ليتم تحليلها لفتحه في فولوميتري (الشكل 3 ألف، يجب أن يكون بتنسيق TIFF غير مضغوط).
  3. من أجل حساب دقة Ca2 + إشارات من فوف كامل، سيخضع الفيلم أولاً التمايز وتجانس لإزالة خلفية التدخل (الضوضاء الكاميرا، صف السيارات إلخ) وزيادة إشارة إلى نسبة الضوضاء. في "إطار الفيلم"، انقر على الحق إحضار قائمة واستخدام نقرات حق الوصول 'STK تصفية-التفريق بين'، انقر على الحق مرة أخرى لإدخال قيمة للتفريق، اضغط ENTER، وانقر فوق اليسار لتطبيق (لأفلام المكتسبة في الثانية 33 قيمة 2 (∆t = ± 66-70 مللي ثانية) يعمل بشكل جيد، يتم زيادة القيمة كمعدل الزيادات التقاط الصورة).
    ملاحظة: التمايز في هذا السياق سوف يقلل كثافة المناطق من التسجيل (بكسل) التي تظهر أي نشاط حيوي على مدى عدد الإطارات المحددة. وهكذا، إذا تم إدخال قيمة '2'، ويتم تحليل كل بكسل في كل إطار من التسجيل وإذا ضمن هذا الإطار يوجد أي تغيير حيوي في الإطار الأسفار 1 بكسل قبل والإطار 1 بعد، سوف تطرح الكثافة داخل تلك بكسل من التسجيل. وهكذا، يتم إزالة الضوضاء الخلفية غير الدينامية وهو زيادة إشارة إلى الضوضاء.
  4. سلسة الفيلم متمايزة بتطبيق عامل تصفية ضبابي. انقر على الحق في "إطار الفيلم" إلى إحضار قائمة واستخدام نقرات حق الوصول 'STK غاوس تصفية"كرنل"'، انقر على الحق مرة أخرى لإدراج قيمة (استخدم دائماً عدد فردي، للأفلام التي اكتسبت في الثانية 33، قيمة 5 يعمل بشكل جيد، 1.5 x 1.5 ميكرومتر ، الانحراف المعياري 1.0) إدخال قيمة، اضغط ENTER، وانقر فوق اليسار لتطبيق (الشكل 3B).
  5. البدء في إنشاء بتكلس بأول تحديد مدة الفيلم الذي يشمل فترة هادئة (20 – 40 إطارات) متبوعاً بحدوث لجنة مكافحة الإرهاب وأيضا 20 – 40 الإطارات بعد لجنة مكافحة الإرهاب. للقيام بذلك، التمرير خلال الفيلم باستخدام في MMB للتمرير من اليسار إلى اليمين على شريط أصفر.
  6. مع التحديد الذي تم إجراؤه، الحق نقرات الاستخدام في "إطار الفيلم" الوصول إلى 'STK مكتب خدمات المشاريع--بتكلينفو س المنحدر' وغادر انقر فوق تطبيق. هذه الدالة يتم تشغيل روتين تحليل شركة الاتصالات الباكستانية تدريجيا سلالم العتبة من أقصى شدتها إلى حدة الأدنى. وهذا سيتم عرض رسومياً في "إطار مؤامرة" كقطعة ضوضاء، وأيضا في "إطار آثار" كآثار الملونة الثلاث، مع التتبع الخضراء تبين عدد بتكلس، التتبع الحمراء عرض متوسط حجم شركة الاتصالات الباكستانية، وتتبع الأزرق تبين كثافة مطلقة العتبة.
    ملاحظة: يتم احتساب عدد ومتوسط حجم بتكلس على كل عتبة تلقائياً وثم يتم تطبيق عتبة شبه يدوي باستخدام الكثافة فيه الساعة التي متوسط حجم بتكلس يبدأ في الانخفاض، الذي يحدث عند نقطة انعطاف للتتبع الحمراء في إطار تتبع (3D الشكل، أي بسبب الإعداد الكبيرة من الضوضاء محدود مكانياً بتكلس تقليل حجم متوسط بتكلس).
  7. ضمن "إطار المؤامرة"، اضغط 'ح' إلى رصيد الرسم البياني مؤامرة سيظهر من الضجيج شركة الاتصالات الباكستانية. دورة من خلال أنظمة الألوان بالضغط على '[' حتى الخلفية البيضاء الملونة مع آثار الملونة في الأعلى.
  8. اضغط 'و' إحضار أداة قياس واليسار انقر على الأرض عند التقاطع حيث تحول القطع الملونة على الجانب الأيمن. وهذا سيمثل خط عمودي واحد في شريط التمرير "النافذة آثار" أدناه.
  9. ضمن "إطار التتبع"، قم بالتمرير لليسار MMB إلى اليمين من نقطة انعطاف للتتبع الحمراء حتى الخط العمودي البيضاء المعلمة التي تم إنشاؤها في الخطوة 4، 10، والتأكد من أن تتبع الأزرق محدداً بالحق النقر عليه، قراءة قبالة 'يافج' التي سيتم عرضها في تي أنه خفض الجانب الأيسر من "إطار التعقب". قم بإلغاء التحديد بالضغط MMB مرة واحدة داخل "الإطار آثار".
  10. ضمن "إطار الفيلم"، اضغط على 'ج' لإحضار عجلة ألوان، ثم أن الصحافة ' لضبط عتبة. الآن سيظهر بتكلس صالح الأحمر في "إطار فيلم" (الشكل 3)، وتلك التي تشبع سوف تكون بيضاء. إزالة المناطق البيضاء بالتمرير حتى مع زر الماوس الأيسر.
  11. قم بالتمرير لأعلى أو لأسفل مع MMB لضبط القيمة العددية الأصفر في عجلة اللون، وضبط هذه القيمة إلى قيمة يافج مأخوذة من الخطوة 4، 11. سيقوم هذا بتعيين كل شيء باللون الأحمر كنشطة Ca2 + عابر شركة الاتصالات الباكستانية في نقطة العتبة المحددة. لحفظ هذا ملف كملف جسيمات استناداً إلى تنسيق، استخدام الحق نقرات للوصول إلى 'STK 3D-حفظ بتكلس 0' واليسار ثم انقر فوق حفظ الملف.
  12. قم بإنهاء فولوميتري وإعادة فتحه. فتح ملف شركة الاتصالات الباكستانية (ملف.gpf) التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.13. في هذا النوع من الملفات، يتم حفظ كافة النشطة Ca2 + العابرين كشركة الاتصالات الباكستانية أزرق موحد (رقم 3E). كما شركة الاتصالات الباكستانية كل كيان فردية الخاصة به معرف ومنطقة ومحيط إحداثيات، إعلام الدولة (انظر أدناه) ومصفوفات النتائج، تبسيط تحليل الخصائص الزمانية بتكلس، أو بين بتكلس.
  13. للبدء بتحليل بتكلس، إزالة أي ضجيج المتبقية في شركة الاتصالات الباكستانية (بتكلس غير صالح الصغيرة التي تم إنشاؤها عندما يتم إنشاء ملف.gpf) باستخدام نقرات الحق في "إطار الفيلم" للوصول إلى '"شركة الاتصالات الباكستانية"ستكوبس العلم بتكلس > دقيقة = 70' وغادر انقر فوق تطبيق. هذا الإجراء سوف العلم بتكلس أكبر من 6 ميكرون2 (~ قطرها > 2µm) وسوف فولوميتري تعيينها إلى اختيار 'العلم 1'. عند اكتمال هذا، بتكلس التي أعلى من هذا الحد (1 علامة) ستظهر كلون أرجواني فاتح في "إطار الفيلم"، بينما سيظل بتكلس أي عتبة لونها أزرق قاعدة (3F الشكل).
  14. إنشاء عروض تقديمية خريطة الحرارة من نشاط شركة الاتصالات الباكستانية باستخدام النقرات الصحيحة في "إطار الفيلم" للوصول إلى '"العلم"ستكوبس-ستاتماب شركة الاتصالات الباكستانية ='. جانب الحق النقر على هذا المسار النهائي، يمكن إدخالها بإحالة علم تحليل. وهكذا، إذا الراغبة في تحديد مقدار بتكلس تم تعيينها إلى العلامة 1، أدخل ببساطة '1' واضغط ENTER واليسار ثم انقر فوق تطبيق. سيؤدي هذا إلى إنشاء خريطة حرارة بتكلس الإجمالي لطول التسجيل، مع ألوان مختلفة تمثل التواجد (%) في جميع أنحاء التسجيل (الشكل 3، ألوان دافئة تشير إلى حدوث زيادة في هذا الموقع).
  15. حفظ خرائط الحرارة عن طريق الحق النقر عليها للوصول إلى 'تحقيق الاستقرار والانتساب تحميل حفظ-حفظ STM ك tif.' وغادر ثم النقر فوق حفظ كملف TIFF.
  16. تحديد حجم نشاط شركة الاتصالات الباكستانية باستخدام نقرات الحق في "إطار الفيلم" للوصول إلى 'شركة الاتصالات الباكستانية التدبير-بتكلستاتس STK ='، بالحق النقر على هذا المسار النهائي، يمكن إدخالها بإحالة علم تحليل. وهكذا، إذا الراغبة في تحديد مقدار بتكلس تم تعيينها إلى العلامة 1، أدخل ببساطة '1' واضغط ENTER واليسار ثم انقر فوق تطبيق. سيؤدي هذا إلى إنشاء سلسلة من آثار في "إطار تتبع".
  17. فولوميتري سيتم بشكل افتراضي ركب آثار شركة الاتصالات الباكستانية التي تم إنشاؤها في الخطوة 4، 17 فوق بعضها البعض. تفصل بينهما استخدام الحق النقر في "إطار تتبع" الوصول إلى 'محاذاة منفصلة"تتبع"' وغادر انقر فوق تطبيق. هذا وسوف تكشف عن آثار شركة الاتصالات الباكستانية أربعة مختلفة أن التحديد الكمي للمرجع المصدق Ca2 + نشاط شركة الاتصالات الباكستانية في فيلم عرض شركة الاتصالات الباكستانية المنطقة (الخضراء) وشركة الاتصالات الباكستانية العد (أحمر) وحجم شركة الاتصالات الباكستانية (سماوي) وشركة الاتصالات الباكستانية حجم الانحراف المعياري (الأزرق) تآمروا ضد الزمن (الشكل 3 ح).
  18. قد يتم حفظ هذه الآثار كملف نصي التي يمكن استيرادها إلى برنامج جداول بيانات لمزيد من التحليل. لإنقاذ آثار، اضغط SHIFT باستمرار واستخدام النقرات الحق في "إطار تتبع" الوصول إلى 'تفريغ Assorted"دوروا"كنص' وغادر انقر لحفظ الملف. ثم يتم جمع هذه المعلومات والموضح في رسوم بيانية أو تمثيلات رسومية أخرى مناسبة (الشكل 3 ح).
  19. لنظره الأولى لوقوع بتكلس (أي، إلقاء نظرة على إطلاق مواقع)، نظراً لهذه بتكلس الأولى بإحالة علم مختلفة. لعزل أفضل إطلاق مواقع التي تحدث داخل الشبكة، فقط تلك بتكلس التي لا تتداخل مع أي جزيئات في الإطار السابق ولكن التداخل مع جزيئات في ms 70 القادم يعتبر إطلاق مواقع.
  20. لتطبيق هذه العتبة، الحق النقر فوق استخدام في "إطار الفيلم" للوصول إلى 'شركة الاتصالات الباكستانية F1-سلوك"إينيتسيتيس"> F = 3' واليسار انقر فوق تطبيق. سيقوم هذا بتعيين بدء بتكلس ك 'العلم 3'، والآن سوف تظهر بتكلس التي تفي بهذه المعايير كلون جير أخضر في الفيلم (الشكل 4 أ).
  21. فولوميتري كما يتيح القدرة على قياس وارسم عدد مواقع إطلاق شركة الاتصالات الباكستانية في إعطاء FOV، فضلا عن التآمر احتمال إطلاق النار أثناء لجنة مكافحة الإرهاب. لتحليل هذه المعلمات، إنشاء مخطط حرارة لبدء بتكلس (3 علامة) كما هو موضح في الخطوة 4، 16 (الشكل 4 باء).
  22. غادر انقر فوق في "إطار مؤامرة" وثم اضغط 'C' لإحضار عجلة الألوان والصحافة أن ' إلى الحد الأدنى. خريطة الحرارة بدء إرادة بتكلس ثم تشغيل الرمادي والأبيض. إزالة جميع البيض بالتمرير حتى مع زر الماوس الأيسر وعتبة بتكلس في خريطة الحرارة حيث أن بتكلس صالحة فقط مشمولة في الرمادي (ضبط عتبة بالتمرير صعودا وهبوطاً مع MMB).
  23. استخدام الحق النقرات على الخريطة الحرارة في "إطار مؤامرة" الوصول إلى 'تحقيق الاستقرار والانتساب بتكلس-يجد بتكلس 70' وغادر انقر فوق تطبيق. سيقوم هذا بتعيين جميع بتكلس الرمادية في الخريطة التي تزيد عن 70 بكسل2 في المساحة المخصصة كبدء منفصلة لوناً مميزاً شركة الاتصالات الباكستانية أو شركة الاتصالات الباكستانية إطلاق الموقع (الشكل 4).
  24. ارسم النشاط لكل من هذه المواقع إطلاق النار ضد الوقت بالنقر على الحق في شركة الاتصالات الباكستانية إطلاق خريطة والوصول إلى 'تحقيق الاستقرار والانتساب بتكلس--إنشاء"شركة الاتصالات الباكستانية"رويس' وغادر النقر فوق تطبيق. سيؤدي هذا إلى إنشاء صورة جديدة في "إطار الفيلم" مع جميع منفصلة ملونة شركة الاتصالات الباكستانية إطلاق المواقع التي يتم عرضها مع دوروا حولها.
  25. استخدام الحق النقر في "إطار الفيلم" للوصول إلى '"شركة الاتصالات الباكستانية"التدبير-بتكلبيكسرويبم > = 1' وغادر انقر فوق تطبيق. وسيحدد هذا رويس كافة في "إطار الفيلم" الذي يحتوي على واحد على الأقل من شركة الاتصالات الباكستانية وسوف ارسم كل نشاط داخل هذه رويس في "إطار آثار". بشكل افتراضي، سيتم فرضه هذه الآثار على بعضها البعض. الفصل بينهما، الحق بالنقر فوق استخدام في "إطار تتبع" الوصول إلى 'محاذاة منفصلة"تتبع"' وغادر انقر فوق تطبيق. لإنقاذ آثار، اضغط SHIFT باستمرار واستخدام النقرات الحق في "إطار تتبع" الوصول إلى 'تفريغ Assorted"دوروا"كنص' وغادر انقر لحفظ الملف.
  26. كما يمكن رسم نشاط كل موقع إطلاق النار كمخطط تواجد. للقيام بذلك، استخدام حق النقرات في "إطار الفيلم" للوصول إلى '"شركة الاتصالات الباكستانية بينولا"دوروا التدبير = 10' وغادر انقر فوق تطبيق. سيؤدي هذا إلى إنشاء قطعة من جميع مواقع إطلاق النار ضد الزمن في "إطار مؤامرة". سيتم عرض كل موقع إطلاق النار ككيان منفصل ملونة، كل بمفردها 'لين' وهذه المؤامرات التي تناظر Ca2 + بتكلس الشروع خلال ريادية (الشكل 4، هاء) حفظ هذه الخرائط الحدوث عن طريق الحق النقر عليها للوصول إلى ' تحقيق الاستقرار والانتساب تحميل حفظ-حفظ STM ك tif. ' ثم غادر بالنقر فوق حفظ كملف TIFF.
  27. لتقدير احتمال إطلاق النار على كل موقع إطلاق النار أثناء لجنة مكافحة الإرهاب، الحق النقر فوق استخدام في "إطار الفيلم" للوصول إلى '"شركة الاتصالات الباكستانية هو"السلوك-مارك = 1' وغادر انقر فوق تطبيق. هذا سوف تحديد كل الإطارات في الفيلم التي تحتوي على بتكلس فوق العتبة وهذه سيتم وضع علامة في الجزء السفلي من "إطار الفيلم" كخطوط زرقاء رأسية.
  28. إظهار ريادية التجميع السريع لإطلاق النار غير متزامنة من عدة مواقع إطلاق النار داخل فوف مع ~ 1 s الفجوات بين كل دورة من دورات اللجنة. يتم استخدام هذا الانتظام وفجوة طويلة من لا بتكلس النشطة بين ريادية لزيادة تعريف لجنة مكافحة الإرهاب للتحليل.
  29. استخدام الحق النقر في "إطار الفيلم" للوصول إلى 'الفجوة"هو"كتلة سلوك شركة الاتصالات الباكستانية < ='، واستخدام حق انقر على النقطة الأخيرة لإدخال رقم. هذا الأمر سيتم تجميع إطارات شركة الاتصالات الباكستانية النشطة المحددة في الخطوة 4، 28 إلى كتل وكتل تستند إلى عدد الإطارات التي تفصل بتكلس النشطة. للتسجيلات من 33 إطارا في الثانية على سبيل المثال، قيمة 10 يعمل بشكل جيد. إذا بتكلس النشطة أقل من 10 إطارات أربا (330 مللي ثانية) يتم تجميعها في كتلة واحدة للتحليل (الكتل ثم تظهر كمستطيلات الوردي عبر خطوط زرقاء عمودي في الجزء السفلي من "إطار الفيلم"، مع كل مستطيل وردي الآن تشير إلى لجنة مكافحة الإرهاب).
  30. الحق النقر فوق استخدام في "إطار الفيلم" الوصول إلى 'شركة الاتصالات الباكستانية التدبير-شركة الاتصالات الباكستانية"الحدث غالباً"'. سيؤدي هذا إلى إنشاء ملف نصي التي يمكن استيرادها إلى برنامج جدول بيانات. وسيوفر هذا الملف النصي كميات هائلة من البيانات على الطبيعة للشروع في المواقع التي تم تعريفها من الخطوات 4.16 – 4.23 ومساهمتها إلى ريادية.
    ملاحظة: ملف النص سوف تظهر عدد مواقع البدء (يشار إليها على أنها 'المجالات')، حجم الموقع بكسل وميكرو2، الاحتمال لكل موقع بدء إطلاق النار أما مرة واحدة أو عدة مرات خلال كل لجنة مكافحة الإرهاب (يعطي كنسبة مئوية)، أن متوسط مدة وحجم بتكلس التي تحدث في ذلك الشروع في الموقع والعدد من دورات لجنة مكافحة الإرهاب (كما هو معرف في الخطوة 4.23) والنسبة المئوية لمواقع إطلاق النيران التي أطلقت خلال كل دورة من دورات اللجنة. يتم جمع هذه المعلومات والموضح في رسوم بيانية أو تمثيلات رسومية أخرى مناسبة (4F الشكل).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدام الفئران كيت-لجنة المساواة العرقية-GCaMP6F (الشكل 1)، دينامية Ca2 + إشارات السلوكيات للمحكمة الجنائية الدولية في الجهاز الهضمي يمكن تصويرها في الموقع. مع الفحص المجهري [كنفوكل]، يمكن الحصول على صور عالية الاستبانة لفئات معينة من السكان للمحكمة الجنائية الدولية دون تلويث إشارات من السكان الآخرين للمحكمة الجنائية الدولية داخل النسيج نفسه ولكن في طائرات متميزة تشريحيا للتركيز (الشكل 2A)37 , 39 , 40 , 41. من الممكن أن سجل موجز (< 100 مللي ثانية)، المترجمة Ca2 + الأحداث التي لم يكن بالإمكان مع غشاء نفاذية Ca2 + المؤشرات. يمكن استخدام الخرائط الزمانية مع برنامج فولوميتري أو إيماجيج لتوليد STMs جميع Ca2 + الأحداث داخل الخلايا في الموقع. باستخدام هذا النهج، يمكن تصور Ca2 + الأحداث في فوف كامل والمعينة (الشكل 2، ج)، بدلاً من مجرد تسجيل النشاط المحدود من عائد واحد. هذه الطرق يمكن أن تمتد إلى كل خلية داخل إعطاء FOV، وضمان جمع بيانات تمثيلية من جميع الخلايا وتوفير معلومات كمية عن الاتساع النسبي، مدد عابرة، ومعدل الارتفاع وسقوط من العابرين، وما إلى ذلك (الشكل 2E وو). تحليل تحقيق الاستقرار والانتساب، بدلاً من قطع كثافة على أساس العائد على الاستثمار، أيضا توفر القدرة على رصد وتسجيل الخصائص المكانية من Ca2 + إشارات، مثل انتشار المكاني وسرعة النشر، كما هو مبين في الشكل 2. ويمكن جمعت هذه المعلومات لتقديم صورة كاملة بدلاً من Ca2 + يشير إلى السلوكيات في الخلايا في بيئاتها الأصلية (الشكل 2 ح).

يمكن استخدام تحليل شركة الاتصالات الباكستانية لتحديد أكثر تعقيداً Ca2 + إشارات السلوكيات، مثل تلك التي تحدث داخل الشبكات الخلوية المترابطة. مثال على هذا التطبيق يتم توفيرها من قبل التحليل الذي يقوم على المحكمة الجنائية الدولية-بلدي (الشكل 3A). عادة في مثل هذه الأعمال التحضيرية المعقدة، ضجيج الخلفية وإشارة إلى الضوضاء يمكن أن يكون مسألة. ومع ذلك، يمكن إزالة استخدام برنامج فولوميتري لتطبيق عوامل التصفية التفاضلية وتجانس في أفلام Ca2 + النشاط وثم تطبيق البروتوكولات عتبة الضوضاء بتصفية ضجيج الخلفية الضوضاء (الشكل 3B) من المعقدة تسجيلات للنشاط الدينامي. استخدام تحليل شركة الاتصالات الباكستانية مثل تلك المبينة في الشكل 3E، معلومات كمية عن Ca2 + إشارات يمكن حسابها بقياس المجال شركة الاتصالات الباكستانية وشركة الاتصالات الباكستانية عدد وحجم شركة الاتصالات الباكستانية التي تشير إلى النطاقات المكانية للتنشيط من Ca2 + إشارات في FOV. يمكن تصنيف كما هو موضح في الشكل 3 ح هذه البيانات وتحليلها إحصائيا، حسب الاقتضاء. ويبين الشكل 4 كيف يسمح تحليل شركة الاتصالات الباكستانية في عمق التقدير الكمي من دون الخلوية Ca2 + إشارات بفحص الموقع وإطلاق الاحتمالات من Ca2 + إطلاق مواقع. بتخصيص بتكلس إلى إعلام مختلفة استناداً إلى خصائصها الزمانية، الشروع في بتكلس يمكن بدقة تعيين كما هو موضح في الشكل 4-E وثروة من البيانات الثابتة المكتسبة في العدد من المواقع بدء (يشار إليها ' المجالات)، حجم الموقع بكسل وميكرون2، احتمال البدء في كل موقع إطلاق النار أما مرة واحدة أو عدة مرات خلال كل لجنة مكافحة الإرهاب (يعطي كنسبة مئوية)، أن متوسط مدة وحجم بتكلس التي تحدث في الموقع، وبدء العدد من لجنة مكافحة الإرهاب دورات (ك تم تعريفها في الخطوة 4، 23)، والنسبة المئوية لمواقع إطلاق النيران التي أطلقت خلال كل دورة من دورات اللجنة. تسمح هذه التقنيات على مستوى عال من استخراج البيانات والقياس الكمي في الموقع Ca2 + الإشارات التي تحدث داخل شبكة الهاتف خلوي سليمة غير ممكنة مع التحليلات القائمة على العائد على الاستثمار.

Figure 1
رقم 1: توليد فئران KitGCaMP6f. رسم تخطيطي لكيفية Ai95 (RCL-GCaMP6f)-د (الفئران GCaMP6f) قد عبرت مع ج-كيت+ Cre-ERT2 (Cre طقم الفئران) لتوليد الفئران كيت-لجنة المساواة العرقية-GCaMP6f. يتم حقن هذه الفئران مع تاموكسيفين في الإعمار من 6-8 أسابيع لحمل Recombinase لجنة المساواة العرقية والتعبير GCaMP6f اللاحقة حصرا في المحكمة الجنائية الدولية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: تحليل Ca العشوائية2 + إشارات في المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث باستخدام رسم الخرائط الزمانية (STM). (أ) صورة تمثيلية للمحكمة الجنائية الدولية عدة-برنامج إدارة الكوارث من الأمعاء الدقيقة بالماوس كيت-لجنة المساواة العرقية-GCaMP6F في الموقع. عائد أخضر يشير إلى حجم واتجاه لعائد الاستثمار لرسم حول المحكمة الجنائية الدولية-DMP واحد داخل فوف لإنشاء تحقيق الاستقرار والانتساب في فولوميتري. (ب) تحقيق الاستقرار والانتساب من Ca2 + النشاط في المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث إبرازه في لوحة أ بعد قد تم معايرة بشكل صحيح على السعة، والمكان والزمان. (ج) تظهر في لوحة ب بعد ذلك تحقيق الاستقرار والانتساب نفس قد تم تلوينها بجدول بحث (كوبباليتي). (د) صورة الموسع للمحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث Ca2 + العابرين المعروضة على لون ترميز الموحدة، التي تشير إلى مكان لرسم خط من خلال Ca2 + حدث في محور الوقت (س) لإنشاء ملف تعريف مؤامرة من نشاطها في إيماجيج. ارسم (ه) سلط الضوء على الشخصية من Ca2 + الحدث في لوحة د، مشيراً إلى حيث تكون الخطوط الموضحة الانتباه إلى دقة قياس السعة ومدة الحدث. ارسم (F) سلط الضوء على الشخصية من Ca2 + الحدث في لوحة د، مشيراً إلى حيث تكون الخطوط الموضحة الانتباه إلى دقة قياس معدل الارتفاع ومعدل سقوط الحدث. (ز) صورة الموسع للمحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث Ca2 + العابرين المعروضة على لون ترميز الموحدة، التي تشير إلى مكان لرسم خط من خلال Ca2 + حدث عبر محورها الفضاء (y) لقياس دقة انتشارها المكاني. (ح) ممثل المدرج الإحصائي للبيانات المجمعة من المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث التي توضح كيفية عرض رسومياً السعة والمدة والمكانية انتشار القيم المكتسبة من اتباع الخطوات المذكورة أعلاه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: القياس الكمي ريادية في المحكمة الجنائية الدولية-بلدي باستخدام الجسيمات على أساس التحليل. (أ) صورة ممثل شبكة المحكمة الجنائية الدولية-بلدي من الأمعاء الدقيقة بالماوس كيت-لجنة المساواة العرقية-GCaMP6F في الموقع. (ب) صورة مأخوذة من التسجيل هو موضح في الفريق A بعد فقد شهدت عامل تصفية تفاضلية من Δt = ms ±66 – 70 وعامل تصفية غاوسي 1.5 x 1.5 ميكرومتر، الانحراف المعياري 1.0. (ج) صورة مأخوذة من شريط الفيديو في ب بعد الانتهاء من مستوى العتبة مع بتكلس فوق العتبة التي تظهر باللون الأحمر. (د) آثار لشركة الاتصالات الباكستانية العد ويعني حجم شركة الاتصالات الباكستانية في بروتوكول مستوى عتبة للقضاء على الضوضاء في الفيلم تظهر في لوحة "بتكلس باء" تم إنشاؤها باستخدام خوارزمية ملء فيضانات التي تميز هيكل كل البيكسلات المجاورة التي كانت كثافات عتبة، كاليفورنيا 2 + بتكلس عابرة كانت أكبر من الضوضاء بتكلس. يمكن استخدام العتبة التي ظهرت إعداد كبيرة من بتكلس الضوضاء الصغيرة الحجم وبدأت بتقليل حجم متوسط بتكلس كعتبة مشتركة لجميع التسجيلات. إنشاء صورة الممثل (ه) من تنسيق ملف يستند إلى Ca2 + شركة الاتصالات الباكستانية من تسجيل ثريشولديد في الصورة الممثل جيم (F) مأخوذة من ملف شركة الاتصالات الباكستانية (ه) بعد معايير فرز من > 6 ميكرومتر2 (قطر ~ 2 ميكرومتر أو أصغر) تم تطبيقها؛ بتكلس أعلاه هذا الحد علامة (علامة 1) كجسيمات الأرجواني الخفيفة وتعتبر صالحة بتكلس-(ز) الحرارة خريطة بتكلس المجموع (1 علامة) لتسجيل الفيديو سيظهر في الفريق و مع إجمالي بتكلس سوماتيد مع الألوان التي تمثل كامل التواجد في جميع أنحاء التسجيل (ألوان دافئة تشير إلى حدوث زيادة في هذا الموقع). (ح) آثار الممثل لشركة الاتصالات الباكستانية المنطقة (الأزرق) وشركة الاتصالات الباكستانية العد (أحمر) مستمدة من ملف شركة الاتصالات الباكستانية الذي تم إنشاؤه في الفريق A-غ. فيما يلي الآثار الممثل المدرج الإحصائي للبيانات المجمعة من عدة تجارب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تحليل Ca2 + إطلاق مواقع في المحكمة الجنائية الدولية-بلدي باستخدام الجسيمات على أساس التحليل. (أ) صورة تمثيلية مأخوذة من ملف شركة الاتصالات الباكستانية 3E الشكل بعد بتكلس 1 العلم مزيد من الصقل في العلم 3، مركز العلم Ca2 + إطلاق مواقع. العلامة 3 بتكلس يتم عرضها كأخضر ليموني (فقط تلك بتكلس التي لا تتداخل مع أي جزيئات في الإطار السابق ولكن التداخل مع جزيئات في ms 70 المقبل تعتبر مواقع إطلاق النار). الحرارة (ب) خريطة تبين بتكلس المجموع (3 علامة) لتسجيل الفيديو يظهر في لوحة أ، مع مجموع بتكلس قد لخص مع الألوان التي تمثل التواجد في جميع أنحاء التسجيل كامل (ألوان دافئة تشير إلى حدوث زيادة في هذا الموقع). (ج) خريطة تمثيلية من Ca2 + إطلاق المواقع التي تظهر في لوحة ب، مع كل موقع إطلاق النار مختلفة المخصصة بتحديد لون مختلف. (د) آثار الممثل لشركة الاتصالات الباكستانية المنطقة (الأزرق) وشركة الاتصالات الباكستانية العد (أحمر) مستمدة من ملف شركة الاتصالات الباكستانية الذي تم إنشاؤه في الشكل 3 ألف-ز. (ه) مخطط حدوث النشاط لمواقع إطلاق النار الفردية. يتم عرض كل موقع إطلاق النار داخل فوف ككتلة ملونة في الخاص به 'لين' مع الزمن. تظهر رسوم بيانية الممثل (F) من البيانات المجمعة من عدة تجارب توضح القيم تتراكم ل Ca2 + إطلاق احتمال إطلاق الموقع/لجنة مكافحة الإرهاب، والعدد من Ca2 + إطلاق مواقع في FOV. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ca2 + تصوير لأنواع محددة من الخلايا داخل أنسجة سليمة أو في شبكات الخلايا غالباً ما تكشف عن أنماط معقدة من Ca2 + العابرين. ويتطلب هذا النشاط تحليلات متأنية ومتعمقة، والتقدير الكمي لالتقاط قدر ممكن من المعلومات عن الأحداث الكامنة والحركية لهذه الأحداث. تحقيق الاستقرار والانتساب وتحليل شركة الاتصالات الباكستانية توفر فرصة لزيادة كمية البيانات الكمية من تسجيلات من هذا النوع.

الضيقة، مورفولوجيا المغزل تتشكل من المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث جعلها ملائمة تماما لتحليل STM المستمدة من STMs المبينة أعلاه. بيد أن هذا التحليل لا يناسب إلى المحكمة الجنائية الدولية-بلدي التي النجمية الشكل ومتصل بشبكة اتصال (الشكل 3A). وعلاوة على ذلك، أكثر تعقيداً، كما نشر ريادية من مواقع متعددة المنشأ في جميع أنحاء الشبكة المحكمة الجنائية الدولية-بلدي يظهر Ca2 + إشارات النقوش في المحكمة الجنائية الدولية-بلدي. وهكذا، بغية تحديد حجم النشاط الذي يحدث في المحكمة الجنائية الدولية جهاز شبكة الاتصال بأكملها داخل FOV، تم تنفيذ تحليل الجسيمات (شركة الاتصالات الباكستانية) باستخدام برامج مخصصة الصنع (فولوميتري، الإصدار G8d، GWH، قابلة للتشغيل على نظام التشغيل Mac OS، اتصل grant.hennig@med.uvm.edu هنيغ منحة وفيما يتعلق الاستفسارات للحصول على فولوميتري واستخدامها).

ويتيح تحليل STM جميع Ca2 + الأحداث داخل الخلايا المفردة وفي كافة الخلايا الموجودة في FOV يتم تحليلها نقديا عبر مجموعة من المعالم المكانية والزمانية. ويوضح البروتوكول وصف الكيفية التي يمكن بها تطبيق هذه التقنيات للمحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث في الأمعاء الماوس. بالتحديد الكمي الكامل Ca2 + إشارات في المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث، كما هو مبين في الشكل 2، Ca2 + مما يشير إلى أنماط اتسمت بالتفصيل37. وطبقت هذه التحليلات للتسجيلات حيث الخضوع للمحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث التدخلات دقة قياس آثار حظر أو حفز Ca2 + الإصدار/Ca2 + تدفق/كبيرة مسارات37،39 , 40 , 41-يمكن تطبيق هذه التقنيات بسهولة إلى الأعمال التحضيرية الأخرى أنسجة سليمة. على سبيل المثال، استخدمت التحليل الموحدة كما هو موضح هنا لتحديد مسارات ميكانيكية جديدة تشارك في توليد داخل الخلية Ca2 + موجات المسجلة في الاحليل العضلات الملساء في الموقع57.

يتطلب إعداد STMs في فولوميتري بعض الحذر، كالوظيفة في فولوميتري يقوم تحقيق الاستقرار والانتساب من دوروا عليه (الشكل 2A) قيمة متوسطة الشدة. وبالتالي، يحتمل أن تكون أن تضعف السعة من Ca2 + إشارات إذا كان العائد على الاستثمار ويوجه أعرض أو أطول من Ca2 + الحدث أو خلية للفائدة. وهكذا، المستخدمين يجب أن تكون حذراً رسم رويس كمحكم من المناسب قدر الإمكان إلى Ca2 + إشارات أو خلية معينة بأنها تقوم بتحليل من أجل التخفيف من حدة هذه المشكلة. وبالمثل، خلق STMS باستخدام لينيسكانس بكسل واحد في إيماجيج يعني أن دقة رسم خرائط لإحداث Ca2 + رهنا بالقرب من Ca2 + الإشارة إلى خط مرسومة. هذه الشواغل طفيفة في المغزل رقيقة على شكل الخلايا مثل المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث، ولكن أنواع الخلايا الأخرى مع مورفولوجيا أكثر النجمية أو جولة قد تجعل هذا النوع من التحليل غير مناسب لتعيين جميع Ca2 + الإشارات بدقة. عند إعداد STMs للتحليل، بغض النظر عن ما إذا كانت قدمت في فولوميتري أو مع لينيسكانس إيماجيج، وهناك عدد قليل من المناطق إلى إبرازها لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. من المهم تغيير جودة الصورة إلى 32-بت قبل تنفيذ أي المعايرة على فشل STMs. للقيام بذلك، أو القيام بذلك بعد معايرة ل F/F0 يمكن أن يؤدي إلى قياسات غير متناسقة عبر التجارب. دائماً التحقق من جودة الصورة تحقيق الاستقرار والانتساب، الذي ورد في الناحية العلوية من حدود بيضاء تحقيق الاستقرار والانتساب نفسها عندما فتحت مع إيماجيج. مجالاً آخر للتناقض هو تحديد القيمة0 و عند معايرة السعة. ومن الحيوي أن اختيار المنطقة و0، أنها تغطي مساحة الخلية التي موحدة وفي التركيز. ولهذا السبب، مجالات للخلية التي تحتوي الأسفار القاعدية غير مستقرة أو التي تتغير بسبب الحركة أو المصنوعات اليدوية الأخرى ليست مثالية وينبغي استخدام بروتوكولات استقرار الحركة صارمة في هذه الحالات.

ضمن الأعمال التحضيرية في الموقع أو مثقف تتضمن مترابطة الشبكات الخلوية، مثل المحكمة الجنائية الدولية-بلدي في تحليل شركة الاتصالات الباكستانية الأمعاء، صغير يوفر تقنية مبسطة لقياس معقدة، سوبسيلولار Ca2 + الأحداث التي وقعت في الشبكة. وعلاوة على ذلك، كما يسمح كل Ca2 + الأحداث في الشبكة ضمن إعطاء FOV تحليلها، بدلاً من استخدام رويس التعسفي، التي لا تقدم سوى معلومات في تواتر وكثافة في العائد على الاستثمار. ميزة تحليل شركة الاتصالات الباكستانية الموصوفة هنا هو أنه بتطبيق التفاضلية والضبابي تجانس مرشحات للتسجيلات، قدرا كبيرا من الضوضاء يمكن إزالتها من الأفلام التي قد تحتوي على الضوء ملوثة من الخلايا ليس من مصلحة أو سبب غير الدينامية النقاط المضيئة أو شوائب. من المهم أن نلاحظ أن مقدار التمايز المطبقة على تسجيلات سيتوقف إلى حد كبير على معدل اقتناء المستخدمة من قبل المجرب. التفريق بين الأفلام كما هو موضح في البروتوكول يوفر وسيلة لتطبيق عامل تصفية على الفيلم لإزالة الضوضاء عالية التردد من التسجيلات. تطبيق قيمة تمايز '2' عند اكتساب في الثانية 33 يعمل جيدا لإزالة الضوضاء الخلفية مع الحفاظ على إشارة جيدة للضوضاء (إذا كانت القيمة منخفضة جداً، وسوف يتم انتقاؤها من الضوضاء ولكن إشارة إلى الضوضاء سوف يتعرض للخطر إذا كانت القيمة عالية جداً). وينبغي زيادة قيمة التمايز تطبق مع معدلات اقتناء أسرع، على سبيل المثال في الثانية 100، قيمة تمايز '7' يعطي تقريبا نفس إشارة إلى نسبة الضوضاء كقيمة ل '2' لتسجيل في الثانية 33. سوف المجربون بحاجة إلى تحسين هذه الإعدادات تبعاً لذلك على الأعمال التحضيرية وشروط التسجيل.

يسمح البروتوكول العتبة المبينة في الشكل 3D إجراء يتمشى مستوى عتبة ليتم تطبيقها على تسجيلات مختلفة على أنظمة مختلفة مع اقتناء مختلف البرامج. هذه المرونة تسمح البيانات من المحققين متعددة تعمل على أنظمة مختلفة لتجميع تلك التسجيلات إلى مجموعات البيانات نفسه. ويتيح تحليل شركة الاتصالات الباكستانية باستخدام نظام العلم في فولوميتري، في التصور والتقدير الكمي لفرادى Ca2 + إطلاق مواقع داخل شبكة بالتفصيل. يمكن جمع المعلومات عن عدد المواقع بدء، حجم الموقع بكسل وميكرون2، ومتوسط مدة بتكلس التي تحدث في هذا الموقع. يسمح هذا التحليل شركة الاتصالات الباكستانية الوصف الأولى لنشاط لجنة مكافحة الإرهاب في الأمعاء الدقيقة على مستوى دون خلوية، واستخدام إشارات مختلفة في مجال البرمجيات فولوميتري، بتكلس على حد سواء بالشبكة وإطلاق النار الفردية موقع المستوى تم تحديده كمياً في أنسجة سليمة الأعمال التحضيرية من الفئران كيت-لجنة المساواة العرقية-GCaMP338. من هذه الملاحظات الأولية، هذا التحليل كذلك استخدمت لدراسة Ca رواية2 + مسارات التدفق في المحكمة الجنائية الدولية-بلدي مثل مخزن-تعمل-Ca2 +غي-دخول42 ودور المتقدرية Ca2 + إشارات على غي باسيماكينج 41-كثير مثل التحليل الموحدة المبينة أعلاه، تحليل شركة الاتصالات الباكستانية يمكن تكييفها بسهولة لاستعدادات سليمة مختلفة غير تلك الموصوفة في هذا البروتوكول. على سبيل المثال، استخدام تحليل شركة الاتصالات الباكستانية لدراسة رواية الإيقاعي Ca2 + الأحداث التي تحدث في شبكات الهاتف الخلوي سليمة بروبريا الصفيحة58،المثانة الفئران59 دراسة أجريت مؤخرا وهكذا يمكن بسهولة تطبيقها على المعقدة، وسليمة الخلوية أنظمة أخرى مثل نظم الخلايا العصبية. بينما تركز هذه الورقة على Ca2 + التصوير في أنسجة سليمة مع جيسيس، يمكن أيضا تشغيل هذه التقنيات التحليل على عزل الخلايا والأنسجة محملة التقليدية Ca2 + مؤشر الأصباغ. وقد استخدمت الموحدة على أساس التحليل لقياس نجاح المترجم Ca2 + إشارات و Ca2 + موجات من محور الدوران على شكل الخلايا الخلالي وخلايا العضلات الملساء من مجموعة متنوعة من الأعمال التحضيرية11،60 , 61 , 62 , 63-وعلاوة على ذلك، كما تم تطبيقها إجراءات تحليل شركة الاتصالات الباكستانية الموصوفة هنا إلى الأعمال التحضيرية في الموقع شبكة تصور مع 520 كال58،59. ومع ذلك، تحتفظ هذه الدراسات أيضا مساوئ هذه الصبغة تحميل البروتوكولات مثل تحديد الخلية غامضة والمشاكل مع إشارة إلى الضوضاء.

أمثلة يتضح أعلاه تبين أن تحقيق الاستقرار والانتساب وشركة الاتصالات الباكستانية تحليل طيع عالية التقنيات التي يمكن استخدامها لقياس معقدة Ca2 + إشارات في مجموعة متنوعة من الأعمال التحضيرية أنسجة سليمة. النهج التي تقدم العديد من الفوائد على عائد الاستثمار التقليدية القائمة على كثافة المؤامرات التي استخدمت بشكل روتيني سابقا وينبغي تزويد المحققين بأكثر قيمة من المعلومات الكمية عن Ca2 + إشارات مما يمكن تحقيقه سابقا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

تم توفير التمويل نيدك، عن طريق P01 DK41315.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ImageJ software NIH 1.5a ImageJ software
Volumetry GWH Volumetry 8Gd Custom made analysis software
Isoflurane Baxter, Deerfield, IL, USA NDC 10019-360-60
Tamoxifen Sigma T5648
GCaMP6F mice Jackson Laboratory Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice Gifted From Dr. Dieter Saur c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol Pharmco-Aaper SDA 2B-6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wellman, G. C., Nelson, M. T. Signaling between SR and plasmalemma in smooth muscle: Sparks and the activation of Ca2+-sensitive ion channels. Cell Calcium. 34, (3), 211-229 (2003).
  2. Mironneau, J., Arnaudeau, S., Macrez-Lepretre, N., Boittin, F. X. Ca2+sparks and Ca2+waves activate different Ca2+-dependent ion channels in single myocytes from rat portal vein. Cell Calcium. 20, (2), 153-160 (1996).
  3. Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1793, (6), 933-940 (2009).
  4. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. Calcium signalling. Current biology. 9, (5), R157-R159 (1999).
  5. Bootman, M. D., et al. Calcium signalling—an overview. Seminars in Cell & Developmental Biology. 12, (1), 3-10 (2001).
  6. Brain, K. L., Bennett, M. R. Calcium in sympathetic varicosities of mouse vas deferens during facilitation, augmentation and autoinhibition. The Journal of Physiology. 502, (3), 521-536 (1997).
  7. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1, (1), 11-21 (2000).
  8. Dupont, G., Goldbeter, A. Problems and paradigms: Oscillations and waves of cytosolic calcium: Insights from theoretical models. BioEssays. 14, (7), 485-493 (1992).
  9. Bootman, M. D., Berridge, M. J. The elemental principles of calcium signaling. Cell. 83, (5), 675-678 (1995).
  10. Berridge, M. J., Dupont, G. Spatial and temporal signalling by calcium. Current Opinion in Cell Biology. 6, (2), 267-274 (1994).
  11. Drumm, B. T., et al. The role of Ca 2+ influx in spontaneous Ca 2+ wave propagation in interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. The Journal of Physiology. 593, (15), 3333-3350 (2015).
  12. Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. Ca 2+ imaging of activity in ICC-MY during local mucosal reflexes and the colonic migrating motor complex in the murine large intestine. The Journal of Physiology. 588, (22), 4453-4474 (2010).
  13. Drumm, B. T., Sergeant, G. P., Hollywood, M. A., Thornbury, K. D., McHale, N. G., Harvey, B. J. The role of cAMP dependent protein kinase in modulating spontaneous intracellular Ca2+ waves in interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. Cell Calcium. 56, (3), 181-187 (2014).
  14. Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O’Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells. Journal of Biological Chemistry. 267, (25), 18118-18121 (1992).
  15. Straub, S. V., Giovannucci, D. R., Yule, D. I. Calcium wave propagation in pancreatic acinar cells: functional interaction of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors, ryanodine receptors, and mitochondria. The Journal of General Physiology. 116, (4), 547-560 (2000).
  16. Sneyd, J., Tsaneva-Atanasova, K., Bruce, J. I. E., Straub, S. V., Giovannucci, D. R., Yule, D. I. A model of calcium waves in pancreatic and parotid acinar cells. Biophysical Journal. 85, (3), 1392-1405 (2003).
  17. Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. Calcium sparks in smooth muscle. American Journal of Physiology. Cell. 278, (2), C235-C256 (2000).
  18. Nelson, M. T., et al. Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks. Science. 270, (5236), 633-637 (1995).
  19. Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks: Elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 262, (5134), 740-744 (1993).
  20. Parker, I., Choi, J., Yao, Y. Elementary events of InsP3-induced Ca2+ liberation in Xenopus oocytes: Hot spots, puffs and blips. Cell Calcium. 20, (2), 105-121 (1996).
  21. Diliberto, P. a, Wang, X. F., Herman, B. Confocal imaging of Ca2+ in cells. Methods in Cell Biology. 40, 243-262 (1994).
  22. Martínez-Zaguilán, R., Parnami, G., Lynch, R. M. Selection of fluorescent ion indicators for simultaneous measurements of pH and Ca2+. Cell Calcium. 19, (4), 337-349 (1996).
  23. Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. The Journal of Pharmacology & Toxicology Methods. 31, (1), 1-10 (1994).
  24. Thomas, D., Tovey, S. C., Collins, T. J., Bootman, M. D., Berridge, M. J., Lipp, P. A comparison of fluorescent Ca2+indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+signals. Cell Calcium. 28, (4), 213-223 (2000).
  25. Lock, J. T., Parker, I., Smith, I. F. A comparison of fluorescent Ca2+indicators for imaging local Ca2+signals in cultured cells. Cell Calcium. 58, (6), 638-648 (2015).
  26. Flagmeier, P., et al. Ultrasensitive Measurement of Ca 2+ Influx into Lipid Vesicles Induced by Protein Aggregates. Angewandte Chemie International Edition. 56, (27), 7750-7754 (2017).
  27. Tsutsumi, S., et al. Structure-Function Relationships between Aldolase C/Zebrin II Expression and Complex Spike Synchrony in the Cerebellum. Journal of Neuroscience. 35, (2), 843-852 (2015).
  28. Rietdorf, K., Chehab, T., Allman, S., Bootman, M. D. Novel improved Ca indicator dyes on the market - a comparative study of novel Ca indicators with Fluo-4. Calcium Signalling: The Next Generation. 590 (2014).
  29. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. Journal of Neuroscience. 32, (40), 13819-13840 (2012).
  30. Seidemann, E., et al. Calcium imaging with genetically encoded indicators in behaving primates. eLife. 5, (2016JULY), (2016).
  31. Su, S., et al. Genetically encoded calcium indicator illuminates calcium dynamics in primary cilia. Nature Methods. 10, (11), 1105-1109 (2013).
  32. Kaestner, L., et al. Genetically encoded Ca2+ indicators in cardiac myocytes. Circulation Research. 114, (10), 1623-1639 (2014).
  33. Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor design. Current Opinion in Chemical Biology. 27, 90-97 (2015).
  34. Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLoS ONE. 12, (2), 1-24 (2017).
  35. Spencer, N. J., et al. Identification of a rhythmic firing pattern in the enteric nervous system that generates rhythmic electrical activity in smooth muscle. The Journal of Neuroscience. 3489 (2018).
  36. Hibberd, T. J., et al. Synaptic Activation of Putative Sensory Neurons By Hexamethonium-Sensitive Nerve Pathways in Mouse Colon. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. (861), (2017).
  37. Baker, S. A., Drumm, B. T., Saur, D., Hennig, G. W., Ward, S. M., Sanders, K. M. Spontaneous Ca(2+) transients in interstitial cells of Cajal located within the deep muscular plexus of the murine small intestine. The Journal of Physiology. 594, (12), 3317-3338 (2016).
  38. Drumm, B. T., et al. Clustering of Ca2+ transients in interstitial cells of Cajal defines slow wave duration. The Journal of General Physiology. 149, (7), 703-725 (2017).
  39. Baker, S. A., Drumm, B. T., Cobine, C. A., Keef, K. D., Sanders, K. M. Inhibitory Neural Regulation of the Ca2+ Transients in Intramuscular Interstitial Cells of Cajal in the Small Intestine. Frontiers in Physiology. 9, (April), 1-24 (2018).
  40. Baker, S. A., et al. Excitatory Neuronal Responses of Ca 2+ Transients in Interstitial Cells of Cajal in the Small Intestine. eNeuro. 5, (2), (2018).
  41. Drumm, B. T., Sung, T. S., Zheng, H., Baker, S. A., Koh, S. D., Sanders, K. M. The effects of mitochondrial inhibitors on Ca2+signalling and electrical conductances required for pacemaking in interstitial cells of Cajal in the mouse small intestine. Cell Calcium. 72, 1-17 (2018).
  42. Zheng, H., Drumm, B. T., Earley, S., Sung, T. S., Koh, S. D., Sanders, K. M. SOCE mediated by STIM and Orai is essential for pacemaker activity in the interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. Science Signaling. 11, (June), (2018).
  43. Zhu, M. H., et al. A Ca(2+)-activated Cl(-) conductance in interstitial cells of Cajal linked to slow wave currents and pacemaker activity. The Journal of Physiology. 587, (20), 4905-4918 (2009).
  44. Zhu, M. H., Sung, T. S., O’Driscoll, K., Koh, S. D., Sanders, K. M. Intracellular Ca(2+) release from endoplasmic reticulum regulates slow wave currents and pacemaker activity of interstitial cells of Cajal. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 308, (8), C608-C620 (2015).
  45. Zhu, M. H., et al. Muscarinic activation of Ca2+-activated Cl- current in interstitial cells of Cajal. The Journal of Physiology. 589, (Pt 18), 4565-4582 (2011).
  46. Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine. The Journal of Physiology. 480, (Pt 1), 91-97 (1994).
  47. Huizinga, J. D., Thuneberg, L., Klüppel, M., Malysz, J., Mikkelsen, H. B., Bernstein, A. W/kit gene required for interstitial cells of cajal and for intestinal pacemaker activity. Nature. 373, (6512), 347-349 (1995).
  48. Ordog, T., Ward, S. M., Sanders, K. M. Interstitial cells of Cajal generate electricial slow waves in the murine stomach. The Journal of Physiology. 518, (1), 257-269 (1999).
  49. Sanders, K. M., Ward, S. M., Koh, S. D. Interstitial cells: regulators of smooth muscle function. Physiological Reviews. 94, (3), 859-907 (2014).
  50. Ward, S. M., McLaren, G. J., Sanders, K. M. Interstitial cells of Cajal in the deep muscular plexus mediate enteric motor neurotransmission in the mouse small intestine. The Journal of Physiology. 573, (1), 147-159 (2006).
  51. Komuro, T. Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. The Journal of Physiology. 576, (3), 653-658 (2006).
  52. Komuro, T. Comparative morphology of interstitial cells of Cajal: ultrastructural characterization. Microscopy Research and Technique. 47, (4), 267-285 (1999).
  53. Sanders, K. M., Ward, S. M., Koh, S. D. Interstitial Cells: Regulators of Smooth Muscle Function. Physiological Reviews. 94, (3), 859-907 (2014).
  54. Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+dynamics in the awake mouse brain. PLoS ONE. 12, (7), e0181113 (2017).
  55. Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. Preparation of PCR quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT). BioTechniques. 29, (52), 54 (2000).
  56. The Jackson Laboratory. Available from: https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:5:0::NO:5:P5_MASTER_PROTOCOL_ID,P5_JRS_CODE:27076,028865 (2017).
  57. Drumm, B. T., et al. Ca 2+ signalling in mouse urethral smooth muscle in situ role of Ca 2+ stores and Ca 2+ influx mechanisms. The Journal of Physiology. 596, (8), 1433-1466 (2018).
  58. Heppner, T. J., Hennig, G. W., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Rhythmic Calcium Events in the Lamina Propria Network of the Urinary Bladder of Rat Pups. Frontiers in Systems Neuroscience. 11, (December), 1-16 (2017).
  59. Heppner, T. J., Hennig, G. W., Nelson, M. T., May, V., Vizzard, M. A. PACAP38-Mediated Bladder Afferent Nerve Activity Hyperexcitability and Ca 2 + Activity in Urothelial Cells from Mice. Journal of Molecular Neuroscience. 1, (2018).
  60. Griffin, C. S., et al. Muscarinic Receptor Induced Contractions of the Detrusor are Mediated by Activation of TRPC4 Channels. Journal of Urology. 196, (6), 1796-1808 (2016).
  61. Sergeant, G. P., Craven, M., Hollywood, M. A., Mchale, N. G., Thornbury, K. D. Spontaneous Ca2+waves in rabbit corpus cavernosum: Modulation by nitric oxide and cGMP. Journal of Sexual Medicine. 6, (4), 958-966 (2009).
  62. Bradley, E., et al. Novel Excitatory Effects of Adenosine Triphosphate on Contractile and Pacemaker Activity in Rabbit Urethral Smooth Muscle. Journal of Urology. 183, (2), 801-811 (2010).
  63. Drumm, B. T., et al. The effect of high [K + ] o on spontaneous Ca 2+ waves in freshly isolated interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. Physiological Reports. 2, (1), e00203 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics