Produksjon av Pseudotyped partikler for å studere svært patogene Coronaviruses i en Biosafety nivå 2

Immunology and Infection
 

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å generere pseudotyped partikler i BSL-2 omgivelser omfatter spike protein svært patogene virus Midtøsten åndedretts syndrom og alvorlig akutt åndedretts syndrom coronaviruses. Disse pseudotyped partikler inneholder et luciferase reporter gen slik at kvantifisering av viruset inn i vert målcellene.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Millet, J. K., Tang, T., Nathan, L., Jaimes, J. A., Hsu, H. L., Daniel, S., Whittaker, G. R. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. J. Vis. Exp. (145), e59010, doi:10.3791/59010 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protokollen skal generere coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped partikler med murine leukemi virus (MLV) core og luciferase reporter, med en enkel transfection prosedyre tilgjengelig HEK-293T celle linje. Når dannet og løslatt fra produsent celler, innlemme disse pseudovirions en luciferase reporter genet. Siden de bare inneholde heterologous coronavirus pigge protein på overflaten deres, partikler oppfører seg som sine opprinnelige coronavirus kolleger for oppføringen trinn. Som sådan, er de gode privat bruk av opprinnelige virions for å studere viral inn i verten cellene. Vellykkede innreise og infeksjon i målcellene, luciferase reporteren blir integrert i vert celle genomet og uttrykkes. Bruker en enkel luciferase analysen, kan transduced celler lett kvantifiseres. En viktig fordel av prosedyren er at det kan utføres i biosikkerhet nivå 2 (BSL-2) fasiliteter i stedet for BSL-3 fasiliteter som kreves for arbeid med svært patogene coronaviruses som Midtøsten åndedretts syndrome coronavirus (MERS-CoV) og alvorlig akutte åndedretts syndrome coronavirus (SARS-CoV). En annen fordel kommer fra allsidigheten som det kan brukes på konvolutt proteiner tilhører alle tre klasser av viral fusion proteiner, som klassen jeg influensa hemagglutinin (HA) og Ebola-viruset glykoprotein (GP), klasse II Semliki skog viruset E1 protein eller klasse III vesicular stomatitt virus G glykoprotein. En begrensning av metodikken er at det bare kan recapitulate virus oppføring trinnene formidles av konvolutten protein etterforsket. For å studere andre viral livssyklus trinn, kreves andre metoder. Eksempler på disse pseudotype partikler kan brukes i mange programmer er verten celle mottakelighet og tropism og testing av virus oppføring hemmere å dissekere viral oppføring stier brukt.

Introduction

Verten celleoppføring utgjør forbokstaven skritt av viral smittsomme levetid. Innhyllet virus involverer dette binding til en enkelt vert celle reseptor eller flere reseptorer, etterfulgt av sammensmelting av viral og mobilnettet membraner. Disse viktige funksjoner utføres av viral konvolutten glykoproteiner1,2. Coronavirus konvolutt glykoprotein heter spike (S) protein og er medlem av klassen jeg viral fusion proteiner2,3,4,5,6. Studere viral konvolutten glykoproteiner er avgjørende for å forstå mange kjennetegn til et gitt virus, som: lifecycle innvielsen, sin vert og mobilnettet tropism, Inter overføring, viral patogenesen, samt verten celle oppføring veier. Viral pseudotyped partikler, også kalt pseudovirions, er kraftige verktøy som enkelt studere funksjonen av viral fusion proteiner. Pseudotyped partikler eller pseudovirions er chimeric virions som består av en surrogat viral kjerne med en heterologous viral konvolutten protein på overflaten deres. Protokollen Hovedformålet er å vise hvordan å oppnå coronavirus spiker pseudotyped partikler som er basert på en murine leukemi virus (MLV) kjerne og inneholder en luciferase reporter genet. Som eksempler, metoden å produsere pseudotyped partikler med spike proteiner av svært patogene alvorlig akutt åndedretts syndrom (SARS) og Midtøsten åndedretts syndrom (MERS) coronaviruses presenteres. Protokollen beskriver hva prosedyren involvert, hvordan å infisere utsatt målet celler, og infectivity kvantifisering av luciferase analysen.

Siden oppføringen trinnene i pseudovirions er underlagt coronavirus S på overflaten deres, angi de cellene på en lignende måte til innfødte kolleger. Som sådan, er de gode surrogater av funksjonelle infectivity analyser. Pseudotyped partikler er vanligvis avledet fra foreldrenes modell virus som retroviruses (MLV7,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 og lentivirus humant immunsviktvirus-HIV23,24,25,26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35) eller rhabdoviruses (vesicular stomatitt virus-VSV36,39,40,41,42,43,44 , 45 , 46 , 47). når den brukes i pseudotyping, foreldrenes virus genomer er endret for å fjerne viktig gener, gjør dem defekt for å utføre en fullstendig replikering syklus. Denne funksjonen tillater dem å brukes i mellomliggende biosikkerhet nivå fasiliteter (BSL-2) og er en viktig fordel over bruker svært patogene innfødt virus som krever høyere biosikkerhet fasiliteter (BSL-3, BSL-4 som ikke er så lett tilgjengelig) når gjennomfører virus oppføring studier. Her, S proteiner risiko gruppe 3 patogener SARS-CoV og MERS-CoV brukes som eksempler på viral konvolutt proteiner blir innlemmet i MLV pseudotyped partikler, genererer SARS-CoV S og MERS-CoV S pseudovirions (SARS-Spp og MERS-Spp, henholdsvis). Disse pseudovirions har blitt brukt i studier med fokus på oppføring hendelsene i disse virus48,49,50,51. En annen fordel er at teknikken beskrevet her ikke er begrenset til pseudotyping coronavirus S proteiner: det er svært fleksibelt og kan brukes å innlemme representanter for alle tre klasser av viral fusion proteiner. Eksempler inkluderer influensa hemagglutinin (HA, klasse I)52, Ebola-viruset glykoprotein (GP klasse I), E1 protein alphavirus Semliki skog virus (SFV, klasse II) og VSV glykoprotein (G, klasse III)53. I tillegg flere slags viral glykoprotein kan være co bygget inn en pseudotyped partikkel, som i tilfelle av influensa HA- og NA - pseudotyped partikler51.

Basert på arbeidet som utføres av Bartosch et al.20, denne protokollen beskriver generering av MLV pseudotyped partikler med en tre-plasmider co hva bruker de allment tilgjengelig og høyt transfection kompetente HEK-293T celle linje 54. de første plasmider koder MLV kjernen gener kneble og pol men mangler MLV konvolutt konv genet. Den andre plasmider er en overføring vektor som koder et firefly luciferase reporter gen, et MLV Ψ-RNA emballasje signal, sammen med 5'- og 3-flankert MLV lenge terminal gjenta (VTH) regioner. Den tredje plasmider koder fusion protein av interesse, i dette tilfellet enten SARS-CoV S eller MERS-CoV S protein. På co transfection av tre plasmider bruker en transfection reagens, bli viral RNA og proteiner uttrykt i transfekterte celler slik at generasjon av pseudotyped partikler. Siden MLV brukes som pseudovirion ryggraden, dette skjer i plasma membranen: RNAs inneholder luciferase gene reporter og emballasje signal få innkapslet i begynnende partikler som også innlemme plasma membran-uttrykt coronavirus spike proteiner. Partikler som bud ut fra cellene inneholder coronavirus S protein på overflaten deres og høstes for bruk i infectivity analyser. Fordi pseudotyped partikler havn coronavirus S protein og ikke MLV konvolutt proteiner, når den brukes for å infisere celler, oppfører de seg som sin opprinnelige coronavirus kolleger for oppføringen trinn. Viral RNA inneholder luciferase reporter og flankert LTRs er så ut i cellen og retroviral utvalg aktiviteter gir sin omvendt transkripsjon inn DNA og integrering i verten celle genomet. Kvantifisering infectivity viral pseudotyped partikler i infiserte celler blir da utført med en enkel luciferase aktivitet analysen. Fordi DNA sekvensen som blir integrert i vert celle genomet bare inneholder luciferase genet og ingen av MLV eller coronavirus protein-koding gener, er de iboende tryggere å bruke enn replikering kompetente innfødt virus.

Er tryggere surrogater og svært tilpasningsdyktige tillate innlemmelse av ulike typer konvolutten glykoproteiner, pseudotyped partikler beskrevet her er også svært allsidig og kan brukes til å studere mange aspekter av viruset oppføringen. Dette inkluderer men er ikke begrenset til: testing verten celle mottakelighet for virusinfeksjon, analysere mobilnettet oppføring veier en innhyllet virus bruker, studerer effekten av farmakologiske hemmere og narkotika screenings, gjennomføre nøytralisering antistoff analyser, karakteriserer verten celleoppføring av innhyllet virus som ikke kan kultivert og generere viral vektorer for gen levering, stabil mobilnettet uttrykket av gener severdigheter, eller slå av genet.

Protocol

1. celle Seeding for Pseudotyped partikkel produksjon

Merk: Utføre dette trinnet i biosikkerhet kabinett.

  1. Ved standard celle kultur teknikker, får en 80-90% confluent 75 cm2 kolbe av HEK-293T-17 celler passaged i hele Dulbecco er endret Eagle's Medium (DMEM-C) som inneholder 10% (vol/vol) fetal bovin serum (FBS), 10 mM 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic syre (HEPES), 100 IU/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin. Forberede DMEM-T middels transfections (komposisjonen er det samme som DMEM-C men uten antibiotika).
  2. Vask celler med 10 mL av forvarmes (37 ° C) Dulbecco fosfat bufret saltvann (DPBS) to ganger.
    Merk: Håndter HEK293T/17 celler med forsiktighet ettersom de lett koble.
  3. Sug opp nedbryting og koble celler med 1 mL 0,25% trypsin pre varmet på 37 ° C. Plass kolbe celleområde ved 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 3−5 min eller til celler starte frakobling.
    Merk: Unngå rugende celler med trypsin for mer enn 5 min som dette fører vanligvis til celle clumping.
  4. Deaktivere trypsin ved å legge 4 mL av DMEM-C medium og antall celler ved hjelp av en celle telling lysbilde og lys mikroskop.
    Merk: For å unngå å måtte telle for mange celler, kan et ekstra fortynning trinn være nødvendig på forhånd. Husk å faktor i denne fortynning ved selve cellen tettheten av trypsinized celler.
  5. Fortynne celler til 5 x 105 celler/mL med DMEM-C.
  6. Frø 6-og vev kultur plate med 2 mL celle per brønn og forsiktig flytte platen frem og tilbake og side til side for å jevnt distribuere celler, unngå sirkelbevegelse.
    Merk: Dette er avgjørende. Jevnt fordelte celler sikrer at cellene ikke klumpen i sentrum av brønner. Igjen, Dette sikrer god transfection effektivitet og pseudotyped partikkel produksjon.
  7. Inkuber platen over natten (16 til 18 h) i en 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator.

2. tre-plasmider co transfection

Merk: Utføre dette trinnet i biosikkerhet kabinett.

  1. Merke celler under en invertert lys mikroskop etter de celle morfologi og tetthet.
    Merk: Ideelt sett bør celle tetthet være i 40-60% confluency området. Det er viktig at cellene er verken for confluent (80−90% confluent) eller for tynt distribuert (20−30% confluent) i hver brønn. En celle tetthet av 40−60% confluency sikrer god pseudotyped partikler produksjon.
  2. Plasmider blanding
    1. Beregne en plasmider miks for hver konvolutt glykoprotein etter antall for en godt en 6-vel plate vist i tabell 1. Multiplisere antall hvis transfecting flere brønner og inkluderer en ekstra godt for å unngå kjører ut av blandingen.
      Merk: Sammen med SARS-CoV S og MERS-CoV S koding plasmider, inkluderer tom vektor kontroll for generering av negativ kontroll partikler som mangler viral konvolutten glykoproteiner (Δenv partikler) sammen med en positiv kontroll glykoprotein som vesicula stomatitt virus (VSV) G glykoprotein som kan infisere robust et svært bredt spekter av celler (VSV-Gpp). Plasmider er tilgjengelig på forespørsel.
    2. Blanding beregnet mengder plasmider og redusert serum celle kultur medium (se Tabell for materiale) i et microcentrifuge rør.
  3. Lipid-baserte transfection reagens blande (se Tabell for materiale)
    1. Beregne volumene for transfection reagens blanding fra antallene som vist i tabell 2 for en godt (1:3 hva forholdet, multiplisere antall behov). Inkluder ekstra brønner for å unngå kjører ut av hva reagens blanding.
    2. Blanding beregnet av lipid-baserte transfection reagens (3 µL per brønn) og redusert serum celle kultur medium (47 µL per brønn) i et microcentrifuge rør, og pass på å legge til hva reagensen i redusert serum celle kultur medium og ikke omvendt rundt.
  4. Inkuber både mikser (for en godt: 50 µL av plasmider bland og 50 µL av lipid-baserte transfection reagensen mix) separat for 5 min ved romtemperatur.
  5. Legge til innholdet i transfection reagens blandingen i plasmider blandingen på en 1:1 ratio (for 1 godt: 50 µL av hver mix)
  6. Utfør grundig opp og ned pipettering av den resulterende blandingen.
  7. Inkuber en miks for minst 20 min ved romtemperatur.
  8. Sug opp den brukte mediet av celler.
  9. Legge til forsiktig 1 mL av forvarmes (37 ° C) redusert serum celle kultur medium per brønn.
  10. Legg dropwise 100 µL av hva hver brønn.
    Merk: Vær forsiktig når du legge transfection mix brønner av HEK-293T som de løsner lett.
  11. Inkuber celler i en 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator for 4-6 h.
  12. Legge 1 mL per brønn forvarmes (37 ° C) DMEM-T medium, som ikke inneholder antibiotika
    Merk: Dette er avgjørende. Hva reagenser øke celle permeabilitet og øke følsomhet for antibiotika. For å sikre god transfection effektivitet og pseudotyped partikkel produksjon, er det viktig å unngå å bruke celle kultur medium som inneholder antibiotika
  13. Inkuber celler i en 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator for 48 timer.

3. pseudotyped partikler samling

Merk: Utføre dette trinnet i biosikkerhet kabinett.

  1. Merke celler under invertert lys mikroskop for å se etter celle morfologi og generelle tilstand. Også sjekke fargen på medium som skal være lys rosa/litt oransje.
    Merk: Dette er et viktig skritt. Hvis det er for mye celledød knyttet til transfection eller middels fargen slått orange/gul (surt pH), vil dette vanligvis være knyttet til lavere avkastning i smittsomme pseudotyped partikler
  2. Overføre supernatants av transfekterte celler til 50 mL konisk sentrifuge rør.
  3. Sentrifuge rør på 290 x g i 7 min fjerne celle rusk.
  4. Filtrer avklart supernatants gjennom et sterilt 0,45 µm pore-størrelse filter.
  5. Gjøre små dele (f.eks., 500 µL eller 1 mL) pseudotyped virus løsning i cryovials.
  6. Butikken på-80 ° C.
    Merk: Protokollen kan pauses her. Pseudotyped partikler er stabile-80 ° c i mange måneder, men når tint, unngå å fryse dem som de vil miste infectivity

4. pseudotyped partikkel infeksjon utsatt celler

Merk: Utføre dette trinnet i biosikkerhet kabinett.

  1. Cellen seeding utsatt celler i 24-vel plate
    1. Få av standard celle kultur teknikker 80−90% confluent 75 cm2 kolbe utsatt celler: Vero-E6 celler for SARS-CoV pseudotyped partikler (SARS-Spp) og Huh-7 celler for MERS-CoV S pseudotyped partikler (MERS-Spp).
      Merk: For å bekrefte om pseudotyped partikler som har blitt produsert er smittsomme, er det viktig å nøye velge en passende utsatt cellen linje for pseudovirion infectivity analyser. Bruke dårlig ettergivende celler vil føre til lav infectivity.
    2. Vask celler to ganger med 10 mL forvarmes (37 ° C) DPBS.
    3. Sug opp nedbryting og koble celler med 1 mL 0,25% trypsin pre varmet på 37 ° C. Plass kolbe celleområde ved 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 3−5 min eller til celler starte frakobling.
      Merk: Unngå rugende celler med trypsin i mer enn 5 minutter som dette fører vanligvis til celle clumping. He-7 celler er spesielt følsomme for denne effekten.
    4. Deaktivere trypsin ved å legge DMEM-C medium og antall celler ved hjelp av en celle telling lysbilde og lys mikroskop.
    5. Fortynne celler til 5 x 105 celler/mL med DMEM-C.
    6. Frø av en 24-godt plate med 0,5 mL celle per brønn og forsiktig flytte platen frem og tilbake og side til side for å jevnt distribuere celler, unngå sirkelbevegelse
      Merk: Dette er avgjørende. Jevnt fordelte celler sikrer at cellene ikke klumpen i sentrum av brønner. Igjen, sikrer dette god infectivity analyser. For hver pseudotyped partikkel (SARS-Spp, MERS-Spp) og tilstand, forberede tre brønner for tre eksperimentelle gjentak. Inkluder brønner for ikke-infisert (ni), tom vektor Δenv partikler og positiv kontroll partikler som VSV-Gpp
    7. Inkuber platen over natten (16−18 h) i en 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator
  2. Pseudotyped partikkel infeksjon
    1. Observere celler under lys mikroskop og visuelt Bekreft at det er et confluent teppe av celler.
    2. Ta cryovials av pseudotyped virus å tine på is.
    3. Vask celler tre ganger med 0,5 mL pre varmet (37 ° C) DPBS
      Merk: Dette er avgjørende. Celler som ikke skal skylles før infeksjon vanligvis føre til dårlig infectivity readouts
    4. Sug opp supernatants celler.
    5. Vaksinere celler med 200 µL tinte pseudotyped partikkel løsning.
    6. Inkuber celler i en 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator 1−2 h.
    7. Legge til 300 µL av forvarmes (37 ° C) DMEM-C medium.
    8. Inkuber celler i en 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator 72 h.

5. infectivity kvantifisering av Luciferase analysen avlesning

Merk: Utføre innledende skritt i biosikkerhet kabinett.

  1. Tin luciferin substrat (lagret på-80 ° C) og 5 x luciferase analysen lyseringsbuffer (lagret på 20 ° C) før de når romtemperatur.
  2. Fortynn luciferase analysen lyseringsbuffer til 1 x med sterilt vann.
  3. Sug opp supernatants celler som er infisert med pseudotyped partikler.
  4. Legg 100 µL av 1 x luciferase lysis analysebuffer i hver brønn.
  5. Plasser platen på en rocker og ruge i 15 min med rock ved romtemperatur (herfra måles arb videre platen kan behandles utenfor en biosafety kabinett).
  6. Forberede microcentrifuge rør for hver brønn ved å legge til 20 µL av luciferin underlaget i hver retning.
  7. Slå på luminometer.
  8. Utføre luciferase Aktivitetemåling en godt samtidig ved å overføre 10 µL av lysate til en tube med 20 µL av luciferin substrat.
  9. Sveip røret forsiktig å blande innholdet, men unngå fortrenge væske på veggene av rør.
  10. Sett røret i enheten og Lukk lokket.
  11. Måle luminescence verdien av røret ved hjelp av luminometer.
  12. Registrere relativt lett enhetens måling.
  13. Gjenta trinn 5.8-5,12 til alle brønnene er analysert.
    Merk: Med riktig utstyr for eksempel en plate lese luminometer, kan denne prosessen utføres automatisk. Analysen må skaleres til plate format (f.eks, 96-brønns plate format).

6. dataanalyse

  1. Beregning og inntegning av relativ luciferase enheter gjennomsnitt og standardavvik
    1. Bruke en graf plotting programvare for å beregne luciferase analysen måling gjennomsnitt og standardavvik av eksperimentelle og biologiske replikerer.
    2. Tegne inn dataene som liggende stolpediagram med standardavvik.
      Merk: Når utføre statistiske analyser på data, må du ta minst tre biologiske replikat i datasett.

Representative Results

Representant resultatene av infectivity analyser av SARS-CoV S og MERS-CoV S pseudotyped partikler er vist i figur 1. Som forventet, både figur 1A og 1B, VSV G pseudotyped positive kontroll partikler (VSV-Gpp) ga svært høy gjennomsnittlig infectivity i 106 til 107 relativ luciferase enheter (RLU) varierer henholdsvis. For SARS-CoV S pseudotyped partikler (figur 1A) infeksjon utsatt Vero-E6 celler, en sterk gjennomsnittlig infectivity ble målt på rundt 9.8 x 104 RLU. Denne verdien er nesten 3 størrelsesordener høyere enn verdiene til kontrollen uten (1.1 x 102 RLU), eller Δenv partikler (1,5 x 102 RLU), som ikke havn noen viral konvolutten glykoproteiner på overflaten deres. Tilsvarende for MERS-CoV S pseudotyped partikler (figur 1B) infeksjon celleområde Huh-7, en høy gjennomsnittlig infectivity ble målt på rundt 1.0 x 106 RLU. Dette er nesten 4 størrelsesordener høyere enn verdiene til kontrollen uten (0.8 x 102 RLU), eller Δenv partikler (2.0 x 102 RLU). En ekstra infectivity analysen ble utført der den SARS-Spp og MERS-Spp ble serielt utvannet og brukes å infisere Vero-E6 celler (figur 2A). Denne analysen bekrefter at luciferase aktivitet målt er avhengig av konsentrasjonen av partikler brukes til å infisere celler. For å bekrefte rollen av angiotensin-konvertering enzym 2 (ACE2) og dipeptidyl peptidase 4 (DPP4), receptors SARS-CoV og MERS-CoV, henholdsvis på formidling vedlegg og oppføring av pseudotyped partikler, vi brukte dårlig-ettergivende HEK-293T-celler og transfected dem å uttrykke enten ACE2 eller DPP4 (figur 2B). Transfekterte cellene ble deretter brukt for infectivity analysen. Denne analysen viser at på overuttrykte ACE2 og DPP4, det er en ~ 4-logg og ~ 2-Logg økning for SARS-Spp og MERS-Spp infectivity, henholdsvis bekrefter at reseptor bruk av pseudovirions er lik den opprinnelige virus.

Eksemplene vises her viser betydningen av inkludert negative (ikke-smittet, Δenv partikler) samt positiv kontroll (VSV-Gpp) forhold ved produksjon pseudotyped partikler. Faktisk tillater positiv kontroll VSV-Gpp partikler oss å vurdere om en bestemt bunke av pseudotyped partikler var vellykket i gir funksjonelle og infeksiøs pseudovirions. Forventede resultater av typisk infeksjon av VSV-Gpp partikler i mest pattedyr cellen er i 106−107 RLU området. Problemer med HEK-293T-17 produsent celler (høy passasje nummer, problemer med cellen tettheter) eller dårlig transfection effektivitet kan påvirke samlede pseudotyped partikkel produksjon og infectivity. Videre er negativ kontroll forholdene også viktig å vurdere etter grunnlinjen for RLU-målinger i en bestemt celle linje (uten tilstand) og ikke-spesifikk internalisering av partikler (Δenv infeksjon) som ikke er formidlet av en viral konvolutten protein. Ideelt for en gitt type partikkel pseudotyped med en viral konvolutten protein av interesse anbefales det å få verdier som noen størrelsesordener høyere enn negative kontrollverdiene, som vist her i figur 1A, B. Men hvis for en gitt celle en pseudotyped virusinfeksjon gir lite infectivity (dvs., nær til negative kontroller slik som i figur 2B i ikke-transfekterte N.T. forhold) det betyr ikke nødvendigvis at den pseudotyped partikkel produksjon var feil. Det kan godt være at bestemt celle linjen brukes er ikke eller dårlig ettergivende til infeksjon. Det anbefales å sjekke om en gitt celle type er forventet å være mottagelig å infeksjon av viruset etterforsket. Transfecting dårlig ettergivende celler med plasmid(s) uttrykke viral receptor(s) kan tillate mer effektiv viral oppføringen og infeksjon oppstår, som vist i figur 2B, hvor på transfection av ACE2 og DPP4 reseptorer i målrette HEK-293T celler, det er en ~ 4- og ~ 2-Logg økning i infectivity, henholdsvis.

Plasmider/reagensen Antall
pCMV-MLVgagpol MLV gag og pol koding plasmider 300 ng
pTG-Luc overføring vektor med luciferase reporter 400 ng
pcDNA-SARS-S, pcDNA-MERS-S eller tom vektor 300 ng
Redusert serum celle kultur medium Til 50 µL

Tabell 1: mengder plasmider og redusert serum celle kultur medium må transfect en brønn av en 6-vel plate av HEK-293T-17 celler for pseudotyped partikkel produksjon. Fra konsentrasjonen av plasmider forberedelser, beregne et bestemt volum for å oppnå den nødvendige mengden av plasmider DNA. Hvis mer enn en brønn er transfekterte med samme plasmider, multiplisere volumer ved antall brønner til transfect, og inkluderer en ekstra godt i beregninger for å unngå å kjøre av blandingen i senere trinn. Den totale mengden av DNA som transfekterte er 1 µg/godt. Plasmider er tilgjengelig på forespørsel til forfattere.

Reagens Antall
Hva reagens 3 ΜL
Redusert serum celle kultur medium 47 ΜL

Tabell 2: mengder transfection reagens og redusert serum celle kultur medium må transfect en brønn av en 6-vel plate av HEK-293T-17 celler for pseudotyped partikkel produksjon. Multiplisere volumer ved antall brønner transfect og inkludere ekstra brønner i beregninger for å unngå å kjøre av blandingen i senere trinn. Hva reagensen: plasmider DNA forholdet brukes er 3:1.

Figure 1
Figur 1 : Coronavirus S-pseudotyped partikkel infectivity analyser i utsatt vertsceller med et murint leukemi virus (MLV) ryggrad og luciferase reporter gen. (A) SARS-CoV S pseudotyped partikkel infectivity analysen i Vero-E6 celler. (B) MERS-CoV S pseudotyped partikkel infectivity analysen i Huh-7 celler. Både (A) og (B) plottede dataene tilsvarer gjennomsnittlig relativ luciferase enhetene fra tre uavhengige eksperimenter, feil barer tilsvarer standardavviket (SD). Dataene tegnes i logaritmisk10 skala på y-aksen. Ni: uten kontroll. Δenv: infeksjon med pseudotyped partikler mangler viral konvolutten glykoproteiner og VSV-Gpp: infeksjon med pseudotyped partikler bærer positiv kontroll VSV G konvolutt glykoprotein. Andre forkortelsen brukes, SARS-Spp: infeksjon med SARS-CoV S pseudotyped partikler, MERS-Spp: infeksjon med MERS-CoV S pseudotyped partikler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Konsentrasjon-avhengighet av CoV S-pseudovirion infectivity og rollen til ACE2 og DPP4 reseptorer i SARS-Spp og MERS-Spp. (A) konsentrasjon-avhengighet SARS-Spp og MERS-Spp infectivity målt ved luciferase aktivitet analysen. Pseudovirions var serielt utvannet og brukes til å infisere Vero-E6 celler. (B) Infectivity analysen av SARS-Spp og MERS-Spp i dårlig ettergivende HEK-293T målet celler transfekterte å uttrykke ACE2, og DPP4 reseptorer, henholdsvis. Dataene tegnes inn i logaritmisk10 skala på y-aksen i figur 1 fra like eksperimenter, med feilfelt tilsvarer standardavviket (SD). N.T.: ikke-transfekterte kontroll HEK-293T celler. ACE2: angiotensin-konvertering enzym 2 (SARS-CoV reseptor) og DPP4: dipeptidyl peptidase 4 (MERS-CoV reseptor). Andre forkortelser som brukes er de samme som i figur 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne protokollen beskriver en metode for å effektivt produsere pseudotyped partikler bærer S protein av risiko gruppe 3 coronaviruses, SARS-CoV og MERS-CoV, i BSL-2 omgivelser. Disse partiklene, som inneholder en luciferase reporter genet, tillate oss å lett kvantifisere coronavirus S-mediert oppføring hendelser av en relativt enkel luciferase analysen48,49,50,51. I infectivity analyser bruke ettergivende celler, bekrefte vi at luciferase aktivitet målt er avhengig av konsentrasjonen av partikler. I tillegg gir ACE2 og DPP4 reseptor transfection mer effektiv oppføring i dårlig ettergivende celler linjer, for eksempel HEK-293T celler. Metoden er svært tilpasses andre viral konvolutten glykoproteiner og har vært brukt mye48,49,50,51,52,53, 55,56,57,58,59, ofte å utfylle andre analyser som biokjemiske analyser eller innfødt virusinfeksjoner.

Protokollen som beskrives her er basert på retrovirus MLV som inkorporerer en luciferase reporter. Det er imidlertid viktig å understreke at det er et svært bredt spekter av andre pseudotyping systemer som har blitt utviklet for emballasje coronavirus S12,13,25,26, 30 , 31 , 32 og andre viral konvolutten glykoproteiner10,11,14,16,17,23,24, 29 , 33 , 38 , 40 , 42 , 44 , 46. noen av disse andre systemer er basert på brukte MLV retroviral kjernen7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20, eller basert på brukte lentiviral HIV-1 pseudotyping systemet ved hjelp av ulike strategier23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,32,33,34,35, eller med rhabdovirus vesicular stomatitt viruset (VSV) som kjernen, som kan inkludere en rekke konvolutten glykoproteiner og igjen med forskjellige ansatt strategier37,38,39,40,41,42,43 ,44,45,46,47. I tillegg andre journalister som fluorescerende proteiner som GFP11,13 og RFP36eller enzymer enn luciferase som β-galactosidase16,17 og utskilles alkalisk fosfatase (SEAP)42 har vært vellykket ansatt for målinger. Videre i analysen presentert i denne protokollen, ble en forbigående transfection brukt til å uttrykke MLV og CoV S gener og proteiner. Det finnes imidlertid andre strategier for uttrykk, for eksempel generering av stabil linjer for produksjon av pseudotyped virus7,14. Som hvert av disse systemene har sine fordeler og ulemper, er det viktig å vurdere følgende viktige parametere når du bestemmer hvilke pseudotyping system beste en etterforsker passer: pseudovirion kjernen (MLV, HIV-1, VSV eller andre), hvor selektiv en bestemt pseudotyping core er å inkorporere en bestemt viral konvolutten glykoprotein, reporter for analysen avlesning (GFP, luciferase, SEAP eller andre) og hva strategien (antall plasmider involvert i co transfection, forbigående Hva eller generering av stabil linjer).

Det finnes en rekke avgjørende skritt i metoden som er viktig å understreke. Cellen tetthet, spesielt av HEK-293T-17 produsent celle linjen er en kritisk faktor i å sikre vellykket transfection. En celle tetthet mellom 40-60% confluency ble funnet for å være optimalt. Høyere tettheten vanligvis føre lav transfection effektivitet og lave partikkel produksjon. Også er det viktig å huske at HEK-293T-17 celler er mindre tilhenger enn andre linjer. Forsiktighet bør utvises ved håndtering dem for å unngå koble dem unødvendig. Ett alternativ er å behandle celle kultur plast overflater med poly-D-lysine å forbedre etterlevelse. Videre resulterer høyere celle passasje ofte i dårlig transfection priser. Etter tilføyer transfection reagensen til HEK-293T-17 celler, er det også viktig å huske at cellen permeabilitet øker. Det er derfor på dette punktet er det best å unngå å bruke middels som inneholder antibiotika som de kan øke cytotoksisitet. Før samle pseudotyped partikler, sjekk fargen på transfekterte HEK-293T-17 celle supernatants. Vanligvis etter 48 timer med transfection tar kultur medium cellefargen en oransje-rosa skjær. Gul-farget medium vanligvis betyr dårlig pseudotyped partikler gir og er ofte et resultat av problemer med cellen seeding tetthet eller høy passasje tall.

I denne protokollen utføres pseudotyped partikkel produksjon i 6-vel plate format. For å øke volumet av produsert partikler, flere brønner i en 6-vel plate kan være transfected med samme plasmider mix og supernatants kan være gruppert sammen. Bassenget kan deretter avklart, filtrert og aliquoted. Alternativt, for å skalere produksjon opp, andre typer fartøy (f.eks 25 eller 75 cm2 flasker) kan brukes. I dette tilfellet skal transfection forhold skaleres tilsvarende. I denne protokollen utføres infectivity analysen med et 24-vel plate format og en luminometer som bare tillater mål en tube samtidig. For høy gjennomstrømning screenings er andre formater også mulig, for eksempel 96-brønns plate format og en plate leser luminometer. Volumer og reagensene luciferase analysen må tilpasses tilsvarende. Lagring av pseudotyped partikler i cryovials ved-80 ° C stabilt deres i flere måneder uten merkbar nedgang i infectivity. Det anbefales ikke å utsette dem for å fryse-opptining som dette vil redusere deres infectivity over tid. Dermed er det best å lagre dem i små dele som 0,5-1 mL og tiner dem før en infeksjon.

Metoden som presenteres her har flere begrensninger. En viktig en er det faktum at pseudotyped partikler recapitulate bare viral oppføring hendelser. Analysere andre trinn i livssyklusen til smittsomme, er andre analyser nødvendig. Videre som MLV partikler bud på plasma membranen, det er viktig å Husk at konvolutten glykoprotein studert trenger å også trafikk til plasma membranen for inkorporering pseudovirions under produksjon. Som sådan, er det viktig å vite hvor cellen en bestemt viral konvolutten glykoprotein uttrykkes i transfection forhold, som ved å visualisere subcellular lokalisering med immunofluorescence analysen og/eller ved å søke etter oppbevaring signaler i protein. Også, mens protokollen beskriver fremgangsmåten for å produsere og teste infectivity, det ikke detalj hvordan måle inkorporering av viral konvolutten glykoproteiner pseudotyped partikler. En metode er å utføre western blot analyser på konsentrert løsninger av partikler, som beskrevet tidligere50,51 for MERS-CoV S innlemmelse. I disse analyser, er S konvolutt glykoprotein på MERS-CoV analysert sammen med kapsid (p30) protein av MLV, som tillater oss å normalisere inkorporering av S protein partikler. Andre eksempler på slike analyser analysere viral konvolutten glykoprotein inkorporering pseudovirions er utført for SARS-CoV S innlemmelse i en HIV-1 lentiviral pseudovirion system32 , Ebola glykoprotein (GP) i en annen MLV pseudotyped partikkel system17, og influensa hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) i VSV pseudovirions38. En ny utvikling i karakteriserer pseudotyped partikkel produksjon er bruken av nyskapende bildeenheter som Nanosight: gjør det oss å visualisere, kvantifisere og størrelse virus partikler50direkte. Enheten gir detaljert informasjon om generelle partikkel produksjon; Det er imidlertid viktig å huske på at det ikke gir informasjon på konvolutten glykoprotein innlemmelse. En fremtidig retning for bruk av disse allsidige pseudovirion partiklene er å analysere individuelle viral fusion hendelser ved hjelp av én partikkel sporing, microfluidics og total intern refleksjon fluorescens mikroskopi60,61 ,62. Disse ble brukt influensavirus og feline coronavirus partikler som influensa HA - og NA-pseudotyped VSV-baserte pseudovirions63. Distribusjon av slike teknikker brukes coronavirus S-pseudotyped MLV-baserte partikler under utvikling.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi ønsker å takke alle medlemmer av Whittaker og Daniel laboratorier for nyttige kommentarer. Forskningsmidler ble levert av NIH tilskudd R21 AI111085 og R01 AI135270. T.T. anerkjenner støtte fra Presidential Life Science fellesskap i Cornell University og National Science Foundation Graduate forskning Fellowship Program under Grant nr. DGE-1650441. L.N. anerkjenner støtte fra en Samuel C. Fleming familie Graduate Fellowship og National Science Foundation Graduate forskning Fellowship Program under Grant nr. DGE-1650441. Dette arbeidet er også støttet av National Science Foundation 1504846 (å SD og G.R.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells  ATCC CRL-11268 Clone 17 cells are highly competent for transfection.
African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells ATCC CRL-1586
Human hepatic Huh-7 cells  Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition JCRB0403
Inverted light microscope with 10 × objective  Nikon TS100
Dulbecco’s modification of Eagle's medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate Corning Mediatech 10-017-CV
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Gibco 1614071
1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic acid (HEPES)  Corning Mediatech 25-060-Cl
100 × penicillin-streptomycin (PS) solution Corning Mediatech 30-002-Cl
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+  Corning Mediatech 21-030-CV
0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 × solution  Corning Mediatech 25-053-Cl
Cell counting slides with grids  Kova 87144
Opti-minimal essential medium (Opti-MEM) Thermo Fisher Scientific, Gibco 31985-070
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific, Invitrogen 11668-027
0.45 µm pore-size sterile filter  Pall 4184
10 mL syringes  BD 309604
5 × luciferase assay lysis buffer  Promega E1531
Luciferin, substrate for luciferase assay Promega E1501
Sterile water  VWR E476-1L
GloMax 20/20 luminometer  Promega 2030-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dimitrov, D. S. Virus entry: molecular mechanisms and biomedical applications. Nature Reviews Microbiology. 2, (2), 109-122 (2004).
  2. White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and Mechanisms of Viral Membrane Fusion Proteins: Multiple Variations on a Common Theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43, (3), 189-219 (2008).
  3. Bosch, B. J., van der Zee, R., de Haan, C. A. M., Rottier, P. J. M. The Coronavirus Spike Protein Is a Class I Virus Fusion Protein: Structural and Functional Characterization of the Fusion Core Complex. Journal of Virology. 77, (16), 8801-8811 (2003).
  4. Belouzard, S., Millet, J. K., Licitra, B. N., Whittaker, G. R. Mechanisms of Coronavirus Cell Entry Mediated by the Viral Spike Protein. Viruses. 4, (6), 1011-1033 (2012).
  5. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Physiological and molecular triggers for SARS-CoV membrane fusion and entry into host cells. Virology. 517, 3-8 (2018).
  6. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. Virus Research. 202, (0), 120-134 (2015).
  7. Steidl, S., et al. Coreceptor Switch of [MLV(SIVagm)] Pseudotype Vectors by V3-Loop Exchange. Virology. 300, (2), 205-216 (2002).
  8. Höhne, M., Thaler, S., Dudda, J. C., Groner, B., Schnierle, B. S. Truncation of the Human Immunodeficiency Virus-Type-2 Envelope Glycoprotein Allows Efficient Pseudotyping of Murine Leukemia Virus Retroviral Vector Particles. Virology. 261, (1), 70-78 (1999).
  9. Wang, W., et al. Establishment of retroviral pseudotypes with influenza hemagglutinins from H1, H3, and H5 subtypes for sensitive and specific detection of neutralizing antibodies. Journal of Virological Methods. 153, (2), 111-119 (2008).
  10. Wallerstrom, S., et al. Detection of antibodies against H5 and H7 strains in birds: evaluation of influenza pseudovirus particle neutralization tests. Infection Ecology, Epidemiology. 4, (2014).
  11. Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, (7131), 92-96 (2007).
  12. Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein. Virology. 326, (1), 140-149 (2004).
  13. Moore, M. J., et al. Retroviruses pseudotyped with the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein efficiently infect cells expressing angiotensin-converting enzyme 2. Journal of Virology. 78, (19), 10628-10635 (2004).
  14. Sharkey, C. M., North, C. L., Kuhn, R. J., Sanders, D. A. Ross River virus glycoprotein-pseudotyped retroviruses and stable cell lines for their production. Journal of Virology. 75, (6), 2653-2659 (2001).
  15. Bruett, L., Clements, J. E. Functional murine leukemia virus vectors pseudotyped with the visna virus envelope show expanded visna virus cell tropism. Journal of Virology. 75, (23), 11464-11473 (2001).
  16. Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64, (1), 23-32 (1999).
  17. Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72, (4), 3155-3160 (1998).
  18. Op De Beeck, A., et al. Characterization of Functional Hepatitis C Virus Envelope Glycoproteins. Journal of Virology. 78, (6), 2994-3002 (2004).
  19. Calland, N., et al. (-)-Epigallocatechin-3-gallate is a new inhibitor of hepatitis C virus entry. Hepatology. 55, (3), 720-729 (2012).
  20. Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197, (5), 633-642 (2003).
  21. Giroglou, T., et al. Retroviral vectors pseudotyped with severe acute respiratory syndrome coronavirus S protein. Journal of Virology. 78, (17), 9007-9015 (2004).
  22. Dye, C., Temperton, N., Siddell, S. G. Type I feline coronavirus spike glycoprotein fails to recognize aminopeptidase N as a functional receptor on feline cell lines. Journal of General Virology. 88, (6), 1753-1760 (2007).
  23. Kobinger, G. P., Weiner, D. J., Yu, Q. -C., Wilson, J. M. Filovirus-pseudotyped lentiviral vector can efficiently and stably transduce airway epithelia in vivo. Nature Biotechnology. 19, 225 (2001).
  24. Salvador, B., Zhou, Y., Michault, A., Muench, M. O., Simmons, G. Characterization of Chikungunya pseudotyped viruses: Identification of refractory cell lines and demonstration of cellular tropism differences mediated by mutations in E1 glycoprotein. Virology. 393, (1), 33-41 (2009).
  25. Nie, Y., et al. Highly infectious SARS-CoV pseudotyped virus reveals the cell tropism and its correlation with receptor expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 321, (4), 994-1000 (2004).
  26. Grehan, K., Ferrara, F., Temperton, N. An optimised method for the production of MERS-CoV spike expressing viral pseudotypes. MethodsX. 2, 379-384 (2015).
  27. Bakri, Y., et al. The Maturation of Dendritic Cells Results in Postintegration Inhibition of HIV-1 Replication. The Journal of Immunology. 166, (6), 3780-3788 (2001).
  28. Hsu, M., et al. Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retroviral particles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, (12), 7271-7276 (2003).
  29. Simmons, G., et al. DC-SIGN and DC-SIGNR Bind Ebola Glycoproteins and Enhance Infection of Macrophages and Endothelial Cells. Virology. 305, (1), 115-123 (2003).
  30. Simmons, G., et al. Inhibitors of cathepsin L prevent severe acute respiratory syndrome coronavirus entry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, (33), 11876-11881 (2005).
  31. Gierer, S., et al. The spike-protein of the emerging betacoronavirus EMC uses a novel coronavirus receptor for entry, can be activated by TMPRSS2 and is targeted by neutralizing antibodies. Journal of Virology. 87, (10), 5502-5511 (2013).
  32. Bertram, S., et al. Cleavage and activation of the SARS-coronavirus spike-protein by human airway trypsin-like protease. Journal of Virology. 85, (24), 13363-13372 (2011).
  33. Bertram, S., et al. TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, (19), 10016-10025 (2010).
  34. Connor, R. I., Chen, B. K., Choe, S., Landau, N. R. Vpr Is Required for Efficient Replication of Human Immunodeficiency Virus Type-1 in Mononuclear Phagocytes. Virology. 206, (2), 935-944 (1995).
  35. Evans, M. J., et al. Claudin-1 is a hepatitis C virus co-receptor required for a late step in entry. Nature. 446, (7137), 801-805 (2007).
  36. Negrete, O. A., et al. EphrinB2 is the entry receptor for Nipah virus, an emergent deadly paramyxovirus. Nature. 436, (7049), 401-405 (2005).
  37. Suda, Y., et al. Analysis of the entry mechanism of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, using a vesicular stomatitis virus pseudotyping system. Archives of Virology. 161, (6), 1447-1454 (2016).
  38. Zimmer, G., Locher, S., Berger Rentsch, M., Halbherr, S. J. Pseudotyping of vesicular stomatitis virus with the envelope glycoproteins of highly pathogenic avian influenza viruses. Journal of General Virology. 95, Pt 8 1634-1639 (2014).
  39. Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8, (9), (2016).
  40. Tong, W., Yin, X. X., Lee, B. J., Li, Y. G. Preparation of vesicular stomatitis virus pseudotype with Chikungunya virus envelope protein. Acta Virologica. 59, (02), 189-193 (2015).
  41. Tani, H., et al. Involvement of ceramide in the propagation of Japanese encephalitis virus. Journal of Virology. 84, (6), 2798-2807 (2010).
  42. Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179, (1), 226-232 (2012).
  43. Tani, H., et al. Analysis of Lujo virus cell entry using pseudotype vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 88, (13), 7317-7330 (2014).
  44. Ogino, M., et al. Use of Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes Bearing Hantaan or Seoul Virus Envelope Proteins in a Rapid and Safe Neutralization Test. Clinical and Vaccine Immunology. 10, (1), 154-160 (2003).
  45. Logan, N., et al. Efficient generation of vesicular stomatitis virus (VSV)-pseudotypes bearing morbilliviral glycoproteins and their use in quantifying virus neutralising antibodies. Vaccine. 34, (6), 814-822 (2016).
  46. Takada, A., et al. A system for functional analysis of Ebola virus glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, (26), 14764-14769 (1997).
  47. Whitt, M. A. Generation of VSV pseudotypes using recombinant DeltaG-VSV for studies on virus entry, identification of entry inhibitors, and immune responses to vaccines. Journal of Virological Methods. 169, (2), 365-374 (2010).
  48. Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429, (24), 3875-3892 (2017).
  49. Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
  50. Millet, J. K., et al. A camel-derived MERS-CoV with a variant spike protein cleavage site and distinct fusion activation properties. Emerging Microbes, Infections. 5, (12), 126 (2016).
  51. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell entry of Middle East respiratory syndrome coronavirus after two-step, furin-mediated activation of the spike protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, (42), 15214-15219 (2014).
  52. Tse, L. V., Hamilton, A. M., Friling, T., Whittaker, G. R. A Novel Activation Mechanism of Avian Influenza Virus H9N2 by Furin. Journal of Virology. 88, (3), 1673-1683 (2014).
  53. Sun, X., Belouzard, S., Whittaker, G. R. Molecular architecture of the bipartite fusion loops of vesicular stomatitis virus glycoprotein G, a class III viral fusion protein. Journal of Biological Chemistry. 283, (10), 6418-6427 (2008).
  54. Millet, J., Whittaker, G. Murine Leukemia Virus (MLV)-based Coronavirus Spike-pseudotyped Particle Production and Infection. Bio-Protocol. 6, (23), 2035 (2016).
  55. Bonnin, A., Danneels, A., Dubuisson, J., Goffard, A., Belouzard, S. HCoV-229E spike protein fusion activation by trypsin-like serine proteases is mediated by proteolytic processing in the S2' region. Journal of General Virology. (2018).
  56. Belouzard, S., Madu, I., Whittaker, G. R. Elastase-mediated activation of the SARS coronavirus spike protein at discrete sites within the S2 domain. Journal of Biological Chemistry. 285, (30), 22758-22763 (2010).
  57. Madu, I. G., Roth, S. L., Belouzard, S., Whittaker, G. R. Characterization of a Highly Conserved Domain within the Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Spike Protein S2 Domain with Characteristics of a Viral Fusion Peptide. Journal of Virology. 83, (15), 7411-7421 (2009).
  58. Madu, I. G., Belouzard, S., Whittaker, G. R. SARS-coronavirus spike S2 domain flanked by cysteine residues C822 and C833 is important for activation of membrane fusion. Virology. 393, (2), 265-271 (2009).
  59. Belouzard, S., Chu, V. C., Whittaker, G. R. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, (14), 5871-5876 (2009).
  60. Costello, D. A., Millet, J. K., Hsia, C. -Y., Whittaker, G. R., Daniel, S. Single particle assay of coronavirus membrane fusion with proteinaceous receptor-embedded supported bilayers. Biomaterials. 34, (32), 7895-7904 (2013).
  61. Costello, D. A., Hsia, C. -Y., Millet, J. K., Porri, T., Daniel, S. Membrane Fusion-Competent Virus-Like Proteoliposomes and Proteinaceous Supported Bilayers Made Directly from Cell Plasma Membranes. Langmuir. 29, (21), 6409-6419 (2013).
  62. Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, (40), 15382-15387 (2008).
  63. Hsu, H. -L., Millet, J. K., Costello, D. A., Whittaker, G. R., Daniel, S. Viral fusion efficacy of specific H3N2 influenza virus reassortant combinations at single-particle level. Scientific reports. 6, 35537 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics