Longitudinale morphologiques et physiologiques surveillance des sphéroïdes de tumeur en trois dimensions à l’aide de la tomographie à cohérence optique

Cancer Research

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Summary

Tomographie par cohérence optique (OCT), une technologie d’imagerie en trois dimensions, a été utilisé pour surveiller et caractériser la cinétique de croissance des sphéroïdes multicellulaires de tumeur. Une quantification volumétrique précise des sphéroïdes de tumeur à l’aide d’un voxel comptage approche et la détection de tissu mort exempte d’étiquette dans les sphéroïdes basé sur contraste intrinsèque d’atténuation optique, ont été démontrées.

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Huang, Y., Zou, J., Badar, M., Liu, J., Shi, W., Wang, S., Guo, Q., Wang, X., Kessel, S., Chan, L. L., Li, P., Liu, Y., Qiu, J., Zhou, C. Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (144), e59020, doi:10.3791/59020 (2019).

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Abstract

Sphéroïdes de tumeur ont été développées comme un modèle de culture en trois dimensions (3D) cellule en découverte de médicaments contre le cancer et de recherche de cancer. Cependant, actuellement, haut-débit, modalités d’imagerie utilisant la détection de champ ou de la fluorescence lumineuse, sont incapables de résoudre la structure 3D dans l’ensemble de l’ellipsoïde de la tumeur en raison de la pénétration de la lumière limitée, diffusion des colorants fluorescents et profondeur-être. Récemment, notre laboratoire a démontré l’utilisation de la tomographie par cohérence optique (OCT), un sans étiquette et non destructifs en 3D imagerie modalité, pour effectuer la caractérisation longitudinale des sphéroïdes multicellulaires tumeur dans une plaque à 96 puits. OCT a été capable d’obtenir des informations morphologiques et physiologiques 3D des sphéroïdes de tumeur de plus en plus jusqu'à environ 600 µm de hauteur. Dans cet article, nous démontrons un système d’imagerie de OCT (HT-OCT) haut débit qui balaye la plaque multipuite ensemble et obtient automatiquement les données 3D de OCT des sphéroïdes de tumeur. Les auteurs décrivent les détails des HT-OCT système et construction établies dans le protocole. Partir des données 3D de OCT, on peut visualiser la structure globale de l’ellipsoïde avec 3D rendu et tranches orthogonaux, caractériser la courbe de croissance longitudinale de l’ellipsoïde de tumeur basée sur l’information morphologique de la taille et le volume et surveiller la croissance des les régions de cellules mortes dans la sphéroïde de tumeur basé sur contraste optique atténuation intrinsèque. Nous montrons que HT-OCT est utilisable comme une modalité d’imagerie haut débit pour médicament dépistage mais aussi caractériser biofabricated échantillons.

Introduction

Le cancer est la deuxième cause de décès dans le monde1. Développement de médicaments ciblant le cancer est d’une importance cruciale pour les patients. Toutefois, on estime que plus de 90 % des nouveaux médicaments anticancéreux échouent dans la phase de développement en raison du manque d’efficacité et de toxicité imprévue dans les essais cliniques2. Une partie de la raison peut être attribuée à l’utilisation de modèles de culture cellulaire (2D) deux dimensions simples d’inspection/filtrage composé qui fournissent des résultats avec des valeurs prédictives limités composée efficacité et la toxicité pour les étapes suivantes de la drogue découverte2 , 3 , 4. récemment, en trois dimensions (3D) tumeur sphéroïde modèles ont été développés pour fournir des données physiologiques et pharmacologiques cliniquement pertinentes pour médicament anticancéreux découverte3,4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Puisque ces sphéroïdes peuvent imiter les propriétés spécifiques des tissus de tumeurs in vivo, comme des éléments nutritifs et l’oxygène gradient, hypoxique de base comme drogue résistance19, l’utilisation de ces modèles potentiellement peut raccourcir chronologies de découverte de drogue, réduire les coûts d’investissement et offrir de nouveaux médicaments aux patients plus efficacement. Une approche critique de l’évaluation efficacité composée en développement de sphéroïde de tumeurs 3D consiste à surveiller la croissance de sphéroïde et réapparition sous traitements9,26. Pour ce faire, la caractérisation quantitative de la morphologie de la tumeur, mettant en cause son diamètre et en volume, avec des modalités d’imagerie à haute résolution, est indispensable.

Modalités d’imagerie conventionnelles, comme champ lumineux, contraste de phase7,9,22,24et9,de8,de la microscopie de fluorescence16, 18,22 peut fournir une mesure du diamètre de l’ellipsoïde, mais ne peut pas résoudre la structure globale de l’ellipsoïde dans l’espace 3D. Plusieurs facteurs contribuent à ces limitations, y compris la pénétration de la lumière poussée dans la sphéroïde ; diffusion des colorants fluorescents dans la sphéroïde ; émettant des signaux fluorescents de fluorochromes excités à l’intérieur ou sur la surface opposée de l’ellipsoïde en raison de la forte absorption et de diffusion ; et profondeur-être de ces modalités d’imagerie. Cela conduit souvent à une volumétrie inexactes. Développement du noyau nécrotique en sphéroïdes imite la nécrose dans in vivo des tumeurs6,10,15,19,25. Cette caractéristique pathologique est peu probable que reproduit en 2D cell cultures19,25,27,28. Avec une taille de sphéroïde plue de 500 µm de diamètre, une structure de trois couches concentrique, dont une couche externe de cellules en prolifération, une couche intermédiaire de cellules quiescentes et un noyau nécrotique, peut être observée dans le sphéroïde6,10 ,15,19,25, à raison d’un manque d’oxygène et de nutriments. Imagerie de fluorescence des cellules vivantes et mortes est l’approche standard pour marquer la limite du noyau nécrotique. Cependant, encore une fois, pénétrations de ces colorants fluorescents et de la lumière visible entravent le potentiel de la sonde dans le noyau nécrotique pour suivre son évolution dans sa forme actuelle.

Une modalité d’imagerie de la 3D alternatif, tomographie à cohérence optique (OCT) est introduite afin de caractériser les sphéroïdes de tumeur. OCT est une technique d’imagerie biomédicale qui est capable d’acquérir des données 3D sans étiquette et non destructif de jusqu'à 1-2 mm de profondeur dans les tissus biologiques29,30,31,32,33 ,34. OCT emploie l’interférométrie faible cohérence pour détecter les signaux dos diffusée de différentes profondeurs de l’échantillon et fournit des images reconstruites résolue en profondeur au niveau du micron résolutions spatiales dans le sens latéral et vertical. OCT a été largement adoptée en ophtalmologie35,36,37 et angiographie38,39. Des études antérieures ont utilisé OCT pour observer la morphologie du in vitro sphéroïdes de tumeur dans la matrice de la membrane basale (p. ex., Matrigel) et évaluer leurs réponses à la thérapie photodynamique40,41. Récemment, notre groupe a créé une plate-forme d’imagerie OCT haut débit pour systématiquement surveiller et mesurer la cinétique de croissance des sphéroïdes tumeur 3D en plaques multipuits42. Une quantification volumétrique précise des sphéroïdes de tumeur 3D à l’aide d’un voxel approche et détection des tissus nécrosés exempte d’étiquette dans les sphéroïdes basée sur le contraste de l’atténuation optique intrinsèque de comptage ont été démontrées. Cet article décrit les détails de comment la plate-forme d’imagerie OCT a été construite et utilisée pour obtenir des images 3D à haute résolution des sphéroïdes de tumeur. Les analyses quantitatives détaillées de la cinétique de croissance des sphéroïdes tumeur 3D, y compris des mesures précises du diamètre de sphéroïde et de volumes, est décrite. En outre, la méthode de la détection non destructive des régions de tissus nécrosés aide OPO, basé sur le contraste de l’atténuation optique intrinsèque est présentée.

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Protocol

1. préparation des cellules

  1. Obtenir des lignées cellulaires d’un fournisseur qualifié.
    Remarque : Vérifiez que les cellules des lignées de cellules d’intérêt peuvent former sphéroïde dans les milieux de culture ou à l’aide d’un substrat (membrane basale matrice comme Matrigel). Regarder dans la littérature9 ou effectuer une ronde d’une expérience préalable pour une vérification.
  2. Décongeler les cellules congelées suivant la procédure spécifique prévue par le fournisseur de la lignée cellulaire. Une procédure générale peut être trouvée ailleurs43.
  3. La culture des cellules pour 1 à 2 passages dans des flacons de culture 25 cm2 . Les cellules sont alors prêts à l’emploi pour la culture cellulaire 3D.
  4. Surveiller l’état de santé des cellules tous les jours et de les entretenir dans un incubateur dans des conditions normalisées (37 ° C, 5 % de CO2, 95 % d’humidité). Actualiser les médias selon les besoins.
    Remarque : Le milieu de culture se compose de DMEM (4,5 g/L de glucose), 1 % antibiotique-antimycosiques, sérum de veau fœtal 10 %. Cellules de sous-culture avant qu’ils atteignent la confluence dans le flacon de culture. Suivez les directives de culture de cellule fourni par le fournisseur. On trouvera un mode opératoire général elsehwhere44.
  5. Effectuer la culture cellulaire 3D en plaques multipuits basés sur le protocole général suivant les9.
    1. Retirez le support de culture du flacon de culture et le laver avec du sérum physiologique stérile tamponnée au phosphate (PBS, chauffé à 37 ° C).
    2. Remettre en suspension les cellules en ajoutant 1 mL de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA, 0,5 %) de la trypsine dans le ballon pendant 3 min. Ensuite, ajoutez des milieux de culture pour diluer la trypsine.
    3. Transférer la suspension de cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL et centrifuger pendant 5 min à 500 x g et à température ambiante.
    4. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 4 mL de milieu de culture pré chauffé. Déposer une goutte d’échantillon sur un hémocytomètre pour le comptage des cellules afin de déterminer la concentration cellulaire. Diluer les cellules à une concentration appropriée pour l’amorçage (par exemple, 3 000 cellules/mL).
      NOTE : Optimiser la concentration de la cellule initiale de l’ellipsoïde pour chaque lignée cellulaire et chaque type de plaque multipuit (96 puits, 384 puits et 1536 puits).
    5. Cellules de graines dans une plaque multipuits à fond rond d’ultra faible attachement (ULA). Ajouter 200 µL de suspension de cellules dans chaque puits à une concentration de 3 000 cellules/mL pour que chacun ait bien environ 600 cellules.
    6. À ta, centrifuger la plaque entière à l’aide d’un adaptateur de plaque pendant 7 min, juste après le semis, à une vitesse de 350 x g ou la vitesse la plus basse disponible.
      Remarque : La centrifugeuse permet de recueillir des cellules au centre du puits pour faciliter formant un sphéroïde unique et uniform. L’étape de la centrifugeuse est exécutée une seule fois au début pour former les sphéroïdes de tumeur. Il ne sera pas répétée lorsque les sphéroïdes tumeur commencent de plus en plus.
    7. Maintenir la plaque multipuite à 37 ° C et 5 % de CO2 dans un incubateur de culture et actualiser les milieux de culture tous les 3 jours.
      Remarque : Le temps de croissance peut varier pour des conditions de culture 3D différente. Dans notre étude, 3 000 cellules/mL est utilisé pour les U-87 MG et HCT 116 lignées cellulaires dans des plaques de 96 puits, pour que l’ellipsoïde peut atteindre ~ 500 μm en 4\u20127 jours pour cellules HCT 116. Envisagez l’ajout de suppléments de médias et de facteurs de croissance pour les modèles différents de sphéroïde, basé sur le général protocole culture 3D.
    8. Effectuer l’imagerie OCT des sphéroïdes tumeur tous jours 3\u20124 pour une étude longitudinale de leur croissance.
      Remarque : Les points dans le temps recommandé pour l’imagerie OCT serait jour 4, jour 7, jour 11, jour 14, jour 18 et 21 jours.

2. high-throughput OCT plateforme d’imagerie

Remarque : Voir référencé travail29,30,31,32,33,34 pour un examen approfondi des principes et des applications d’OCT. Voir Figure 1 et Huang et al. 42 pour plus de détails des PTOM personnalisé d’imagerie utilisées dans cette étude.

  1. Choisissez une source lumineuse à large bande appropriée pour le système OCT pour l’imagerie tumorale sphéroïde.
    NOTE : Ici, une diode superluminescents (SLD, Figure 1 a,B) avec une longueur d’onde centrale de ~ 1 320 nm et 110 ~ bande passante nm a été utilisée comme une source lumineuse à large bande.
  2. Construire le bras de référence et le bras de l’échantillon du système OCT suivant les schémas (voir Figure 1 a,B pour plus de détails). Voir la Table des matières pour obtenir une liste de composants optiques pour construire le système d’OCT. Veiller à ce que la longueur du trajet optique du bras de référence et de bras de l’échantillon sont étroitement assortis.
  3. Construire le spectromètre, y compris un collimateur, un grillage, une lentille F-theta et un appareil de balayage linéaire (voir Figure 1 pour le programme d’installation34) pour les détails de la conception du spectromètre d’octobre ou en sélectionnant un spectromètre commercial correspondant à la longueur d’onde centrale de la source lumineuse. Assurez-vous que le spectromètre est correctement aligné pour couvrir la largeur de bande entière laser, pour atteindre l’efficacité de collecte des photons de haute et de fournir lente de wash-out de la figure d’interférence.
  4. Caractériser la performance du système OCT, y compris les métriques suivantes comme l’énergie de bras échantillon, total imagerie profondeur dépendant de la profondeur sensibilité, résolution axiale, profondeur de la résolution mise au point et latérale. Placer un réflecteur faible (par exemple, un miroir avec un filtre de densité neutre) comme un échantillon pour mesurer la profondeur dépendant sensibilité, résolution axiale et profondeur de champ. Placez une USAF résolution test graphique cible comme échantillon pour vérifier la résolution latérale.
    Remarque : Voir références34,45 pour les définitions des métriques de performances de l’OCT et protocoles pour caractériser ces métriques45. Voir le tableau 1 pour une liste des paramètres mesurés pour le système OCT personnalisé utilisés dans notre étude.
  5. Sélectionnez une étape de translation motorisée pour un glissement horizontal de la plaque multipuite pour sphéroïdes tumeur image dans différents puits (voir Figure 1 b). Utilisez un stade avec une gamme de voyage plue de 108 mm x 72 mm pour garantir une analyse complète de tous les puits de la plaque multipuite. Utiliser une étape de traduction motorisé en 2D ou en 3D avec le logiciel de contrôle pour permettre une localisation précise de chaque puits et automatisation du système du OCT pour l’imagerie haut débit.
  6. Utilisez un adaptateur de plaque ou concevoir un support de plaque (par impression 3D) pour maintenir la plaque multipuite en position fixe.
  7. Corriger l’inclinaison et la rotation de la plaque multipuite en utilisant un 2D inclinable stade et une platine de rotation monté sur la scène translationnelle (voir Figure 1 D), avant d’effectuer toute imagerie OCT pour réduire au minimum la variation de l’avion de mise au point des différents puits. Utiliser D2, D11, B6, D6, G6 comme les puits directeurs lors du contrôle de leurs positions relatives dans les images OCT (Figure 1 a).
  8. Régler la rotation de la plaque pour s’assurer que les bords de la plaque sont parallèles à la direction du mouvement de la scène afin que les puits restent aux mêmes positions horizontales dans les images OCT (Figure 1E). Réglez l’inclinaison de la plaque pour être parallèle à la table optique afin que les puits restent aux mêmes endroits verticales pour les PTOM imaging (Figure 1F).
    NOTE : Ajustement de l’angle inclinable et la mise au point aider à optimiser la qualité d’image OCT pour tous les puits. Toutefois, les variations de la hauteur du milieu de culture dans les différents puits peuvent provoquer des changements dans des chemins optiques pouvant conduire à la défocalisation de l’image de sphéroïde. Auto-focus peut être mis en œuvre pour contrôler le plan focal de l’OCT imaging pour obtenir une qualité d’image optimisée. L’étape de réglage ne résout pas la mauvaise qualité d’image de OCT de l’ellipsoïde de la tumeur en raison des problèmes suivants : le sphéroïde décentrement en raison de l’emplacement initial de semis ; élévation de sphéroïde lorsqu’ils sont incorporés dans les matrices extracellulaires de biofabricated ; qualité de plaque pauvres avec de grandes variations de la hauteur du fond bien. Contrôle des logiciels supplémentaires avec fonctions autofocus ou individu-alignement peut être implémentée pour optimiser les performances de l’outil OPO, système d’imagerie.
  9. Utiliser un programme informatique personnalisé pour contrôler l’acquisition d’images OCT et le mouvement de la scène pour collecter les données de chaque bien dans l’ordre.

3. OCT numérisation et le traitement des tumeurs sphéroïdes

  1. Le jour de l’imagerie OCT des sphéroïdes de tumeur, prenons la plaque multipuite de l’incubateur. Transférer la plaque multipuite sous l’outil OPO, système d’imagerie. Placez-le sur le dessus de l’adaptateur de plaque.
    Remarque : L’imagerie OCT des sphéroïdes de tumeur peut être réalisé avec le couvercle de plaque de polystyrène ou désactiver. Toutefois, les condensations d’eau sur le couvercle en raison de l’évaporation à partir des puits peuvent influent sur la transmission de la lumière et déformer le parcours lumineux, ce qui donne moins optimales images OCT les sphéroïdes.
  2. Régler la hauteur de la plaque en se déplaçant le long de l’axe z de l’étape de traduction. Maintenir la position du plan focal à ~ 100 – 200 μm au-dessous de la surface supérieure de chaque ellipsoïde, pour minimiser les conséquences de la non uniforme échauffement focal profil.
  3. Définir une plage de balayage correcte OCT (p. ex., 1 x 1 mm) dans le logiciel personnalisé pour couvrir la sphéroïde de toute tumeur selon ses stades de développement. Cliquez sur Enregistrer les paramètres pour enregistrer le réglage.
  4. Utiliser le logiciel personnalisé pour acquérir des images 3D de OCT des sphéroïdes de tumeur un par un pour tous les puits de la plaque contenant les sphéroïdes. Cliquez sur le bouton aperçu pour visualiser l’image d’aperçu et cliquez sur le bouton acquérir afin d’acquérir l’image d’OCT.
    Remarque : S’assurer que les données de sphéroïde OCT sont recueillies lors de l’étape n’est pas en mouvement. L’ellipsoïde est habituellement situé bien au centre du U-bas. Toutefois, l’ellipsoïde peut être transféré dans les milieux de culture lorsque la scène est accélère ou décélère en raison de l’inertie de l’ellipsoïde dans les milieux de culture.
  5. Datasets OCT processus 3D des sphéroïdes de tumeur pour générer des images OCT structurelles avec un code de traitement personnalisé de C++. Voir Figure 2 a pour un diagramme de flux de post-traitement de données OCT.
    Remarque : Voir la Figure 4 a pour 3D OCT structurels images générées.
    1. Voir le chapitre 5 de Drexler et Fujimoto34 et Jian et al. 46 pour obtenir une description détaillée des étapes de post-traitement de données OCT. Calibrer la taille en pixels dans les trois dimensions. Re-échelle les images structurales OCT sur échelles corrigés.
      Remarque : La distance dans la direction axiale (axe z) des images de l’OCT est une mesure de la différence de chemin optique entre les bras de référence et le bras de l’échantillon. Ainsi, l’indice de réfraction de l’échantillon (n) doit être pris en considération lors de l’étalonnage de la taille en pixels dans le sens axial pour mise à l’échelle. Dans notre étude, nous utilisons n = 1,37 comme l’indice de réfraction de la tumeur sphéroïde42.
  6. Générer le collage d’images de sphéroïde en utilisant des Images 2D OCT dans trois plans XY, XZ et YZ transversales à travers le centre de gravité de l’ellipsoïde. Voir Figure 3-E pour la sortie représentative de collages d’images de sphéroïde. Effectuer d’image pour tous les sphéroïdes, utilisant le MATLAB fonction dftregistration47, afin d’assurer que le centre de gravité de tous l’ellipsoïde se trouvent approximativement au même endroit.
  7. Obtenir un rendu 3D de l’ellipsoïde à l’aide d’un logiciel commercial ou personnalisé.
    Remarque : Les étapes suivantes indiquent comment obtenir le rendu 3D des sphéroïdes de tumeur à l’aide d’un logiciel commercial.
    1. Charger les données de OCT 3D dans le logiciel.
    2. Cliquez sur le panneau de Surpass . Puis, cliquez sur Ajouter un nouveau Volume. Choisissez le mode de fusion à utiliser pour le rendu 3D.
    3. Ajustez l’angle de vision en faisant glisser l’image avec le pointeur de la souris.

4. Quantification morphologique des sphéroïdes tumeur 3D

NOTE : Un code personnalisé écrit dans MATLAB traite cette quantification. Cliquez sur le bouton exécuter pour lancer le processus. Voir Figure 2 b de l’organigramme des étapes de quantification morphologique des sphéroïdes.

  1. Quantifier le sphéroïde diamètre, hauteur et diamètre base volume.
    1. Sélectionnez des Images 2D OCT dans trois plans XY, XZ et YZ transversales qui traversent le centre de gravité de l’ellipsoïde.
    2. Mesurer le diamètre et la hauteur de l’ellipsoïde dans les plans XY et XZ, respectivement.
    3. Calculer le volume de sphéroïde axée sur le diamètre à l’aide : Equation 1 , avec une présomption de la forme sphérique de la tumeur.
  2. Quantifier le volume de l’ellipsoïde voxel-basé.
    1. Appliquer un filtre moyenneur 3D sur les données structurales de l’OCT de sphéroïde pour enlever les taches.
    2. Segmenter les sphéroïdes de tumeur en utilisant le filtre de Canny bord détection48 , image par image, avec un seuil approprié qui sépare la région de sphéroïde de tumeur du fond du puits.
    3. Groupe des voxels pour données 3D (voir fonction intégrée : bwconncomp).
    4. Calculer la distance moyenne entre chaque voxel conjonctif dans le groupe et le centroïde de sphéroïde (choisis manuellement), pour chaque groupe. Indiquez la région de sphéroïde comme le groupe avec la distance moyenne minimale.
    5. Compter le nombre de voxels dans la région de sphéroïde et puis multiplier par le volume réel d’un voxel individuel (volume/voxel), ce qui donne le volume total de l’ellipsoïde.

5. dead-cellule région détection des sphéroïdes tumeur 3D

Remarque : Dans un milieu homogène, intensité de dos diffusée OCT détectée en fonction de la profondeur (j’ai(z)) peut être décrite par la loi de Beer-Lambert49: Equation 2 , où z représente la profondeur, μ est l’atténuation optique coefficient, et j’ai0 est l’intensité incidente à l’échantillon. Par conséquent, le coefficient d’atténuation optique dérivée peut être exprimé comme : Equation 3 . Étant donné que les images OCT sont souvent tracées sur une échelle logarithmique, la pente du profil d’intensité de l’OCT peut être récupérée pour calculer le coefficient d’atténuation optique. Voir la Figure 2 pour un organigramme de la génération des cartes atténuation optique.

  1. Effectuer la segmentation pour supprimer les zones indésirables à l’extérieur de l’ellipsoïde. Réaliser 3D filtre moyen pour supprimer le bruit speckle inhérente à images OCT.
  2. Obtenir pixel-wise coefficient d’atténuation optique par linéaire pose le profil d’intensité OCT échelle logarithmique sur une certaine plage de profondeur (fenêtre mobile), extraire sa pente et multiplier la pente par -1/2.
    Remarque : Le coefficient d’atténuation à chaque voxel dans la région de sphéroïde segmentée est calculé selon la pente du profil d’intensité OCT dans une fenêtre de profondeur 10-voxel (~ 40 μm en profondeur), avec le voxel situé au milieu de la fenêtre.
  3. Appliquer les méthodes ci-dessus (points 5.1 et 5.2) à chaque balayage axial dans un cadre et chaque cadre dans un groupe de données 3D contenant la région segmentée sphéroïde jusqu'à ce que le coefficient d’atténuation optique pour tous les voxels de la région de sphéroïde segmentés est calculés.
  4. Effectuer le seuillage binaire pour mettre en évidence la région haute atténuation.
    Remarque : Voir Huang et al. 42 pour la détermination du seuil de la région de haute atténuation en utilisant l’analyse de l’histogramme.
  5. Mettre en évidence le plan d’atténuation optique binarisées sur l’image originale d’étiqueter la région de cellules mortes (mélange). Générer l’image 3D-rendu de la carte d’atténuation mélangé de visualiser la distribution 3D de la région de cellules mortes.

6. histologie et l’immunohistochimie

Remarque : L’histologie et l’immunohistochimie (IHC) colorées des images des sphéroïdes de tumeur sont obtenues pour mettre en corrélation avec les résultats correspondants du OCT.

  1. À certains moments, sélectionnez sphéroïdes de tumeur de 1-2 de la plaque multipuite pour histologie et IHC coloration. Utiliser une pipette avec les pointes de pipette de 1 mL pour transférer l’ellipsoïde du puits dans un tube à centrifuger 1,5 mL.
    NOTE : Couper la pointe de pipette 1 mL avant transfert pour s’assurer que l’ouverture de l’embout est supérieure à la taille de l’ellipsoïde de la tumeur pour éviter d’endommager la structure de l’ellipsoïde.
  2. Collecter chaque sphéroïde de tumeur dans un tube de microcentrifuge unique 1,5 mL rempli de 10 % de formaldéhyde et fix pendant 48 h.
  3. Effectuer l’histologie et le processus de l’IHC pour chaque ellipsoïde, à l’aide de paraffine standard incorporant des techniques.
    NOTE : Tache 5 μm de coupes épaisses des sphéroïdes de tumeur à l’hématoxyline et éosine (H & E) et terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling détection d’apoptosis (TUNEL). Une contre-coloration de l’hématoxyline est appliquée au TUNEL. Un scanner de diapositives numériques a été utilisé pour analyser l’échantillon coloré et obtenir haute résolution histologiques et images IHC.

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Representative Results

Haut débit Optical Coherence Tomography imagerie des sphéroïdes dans une plaque à 96 puits

La figure 3 présente la suite de l’analyse de HT-OCT d’une plaque 96 puits à sphéroïde tumeur HCT 116 le jour 3. L’analyse séquentielle d’une plaque entière commence à partir du puits de bas-droite (H12). Figure 3 b montre l’organigramme de l’implémentation du logiciel du système HT-OCT. Après un sphéroïde données ont été collectées et traitées, la plaque déménagerait à ensuite Eh bien, attendez environ 2 s pour permettre l’ellipsoïde se reposer et de collecter les données de sphéroïde prochaines. Chaque PTOM données se composent de 400 x 400 x 1024 voxels, qui correspond à un volume réel de 1,0 x 0,84 x 2,3 mm3. La figure 3 montre un collage de FR-face OCT images des sphéroïdes HCT 116 générés à partir des données traitées. Le résultat est comparable avec des images d’autres système d’imagerie haut débit 2D22. Compte tenu de la capacité d’imagerie 3D de l’OPO, nous pourrions également générer le collage d’images 2D sphéroïde transversale de 96 puits (Figure 3D) pour surveiller les hauteurs de sphéroïde et de visualiser inhomogénéité sphéroïde dans le sens vertical. Un collage d’images 3D-rendu sphéroïde est également possible de n’importe quel angle prédéfini (Figure 3E) de visualiser la forme 3D dans l’ensemble et d’évaluer la rondeur de l’ellipsoïde. Notez que le processus et l’imagerie OCT globale du temps pour la plaque à 96 puits ensemble serait min 21 ~ et ~ 25 min lorsque la caméra à balayage linéaire tourne à une vitesse de 92 et 47 kHz, respectivement. Voir la vidéo 1 pour obtenir un exemple.

La surveillance morphologiques et physiologiques longitudinale de l’ellipsoïde de la tumeur

Après que nous avons obtenu les images structurales OCT des sphéroïdes de tumeur de la plaque pour plusieurs points dans le temps, nous pourrions poursuivre l’analyse ces données en quantifiant les informations morphologiques et physiologiques des sphéroïdes de tumeur. La figure 4 illustre les différentes approches pour caractériser les sphéroïdes de tumeur et obtenir d’eux des données morphologiques et physiologiques longitudinales.

Figure 4 b montre différentes manières de visualiser la sphéroïde de la tumeur. À l’aide d’un logiciel commercial ou libre, nous pourrions charger les données 3D dans le logiciel et créer un « volume » de l’ellipsoïde de la tumeur (rendu 3D), qui montre la structure globale du sphéroïde de tumeur dans l’espace 3D. Avec seuil approprié, nous pourrions générer un surface terrain de sphéroïde de tumeur (Figure 4 b), qui pourrait servir de segmenter l’ellipsoïde et mesurer le volume. Nous pourrions également générer les diapositives orthogonales (ortho diapositives) des plans de coupe différents dans des orientations différentes (Figure 4 b, XZ, YZ et XY) et mesurer le diamètre et la hauteur de l’ellipsoïde de tumeur de ces diapositives ortho.

Collecte des données de l’OCT de l’ellipsoïde même de plusieurs point de temps, nous pourrions quantifier l’information morphologique et générer la courbe de croissance de l’ellipsoïde de montrer ses changements longitudinaux. La figure 4 montre des données représentatives d’un sphéroïde de tumeur HCT 116 surveillé pendant 21 jours. Des données segmentées et diapositives ortho, nous avons mesuré le diamètre, la hauteur et la base voxel volume de l’ellipsoïde pour toutes le point dans le temps qui ont été répertoriées dans le tableau. Nous avons également calculé le volume axée sur le diamètre pour une comparaison. Les courbes de croissance en taille et en volume ont été tracées, respectivement. Partir des courbes de croissance, nous avons pu voir que cette sphéroïde de tumeur HCT 116 suivi un modèle de croissance linéaire du volume avant le jour 11. Avant ce point dans le temps, l’ellipsoïde maintenus en croissance et maintenu une forme relativement uniforme. Cependant, après jour 11, l’ellipsoïde est devenue perturbée, aplatie et complètement replié sur 21 jours. La courbe de croissance des volumes de voxel-basé montre clairement la tendance, avec un volume progressivement diminué après jour 11.

Selon les données de l’OCT, nous pouvons également obtenir les informations physiologiques de la distribution de cellules mortes dans les sphéroïdes de tumeur en analysant l’atténuation optique pixel par pixel des images 2D en coupe transversale. Après les méthodes illustrées dans la Figure 2 et 5 du protocole, nous pourrions quantitativement déterminer les régions de cellules mortes et surveiller la croissance de ces régions en fonction du temps. La figure 4 montre un résultat représentatif du suivi longitudinal de l’augmentation des zones de cellules mortes dans la sphéroïde de la tumeur. Les zones surlignées en rouge, qui avait la haute atténuation optique, montrent les zones nécrotiques étiquetées. De la 3D rendu carte d’atténuation optique lors de l’élaboration de 14 jours, nous pouvions voir le secteur rouge en pleine expansion, indiquant l’augmentation des régions nécrotiques. Comme le pourcentage des zones nécrotiques a augmenté, l’ellipsoïde de la tumeur ne pouvait maintenir son sa forme parfaite. Par conséquent, ils auraient tendance à perturber et l’effondrement, qui ont été vus dans le suivi longitudinal de la morphologie de la tumeur dans la Figure 4.

La technique de détection de région proposée des tissus morts non destructif a été vérifiée en comparant la carte d’atténuation optique OCT de sphéroïde de tumeur HCT 116 avec les images correspondantes obtenues par histologie et IHC. La figure 4 présente une telle comparaison avec un sphéroïde de jour 14 HCT 116. Une bonne adéquation entre l’atténuation OCT carte et correspondant H & E et TUNEL tranches ont été trouvés, qui a été indiqué en analysant les caractéristiques au sein des régions en tranches H & E et TUNEL, marqués par des lignes de tableau de bord dérivés du contour de haute atténuation des parasites OCT régions. En tranches H & E, les régions de tissus morts étaient indiquées par moins dense et agrégée structure située dans la région de la ligne pointillée. Dans des tranches TUNEL, un bon match a été observé entre région haute atténuation des parasites et marqués au TUNEL apoptotique cellulaire.

Figure 1
Figure 1 : Construction d’un système de tomographie par HT-cohérence optique haut débit pour l’imagerie tumorale sphéroïde. (A) schémas du système HT-OCT. Un diagramme de la plaque à 96 puits est tracé à côté du système d’OCT. Cinq puits (D2, D11, B6, D6, G6) marqués en jaune sont utilisés pour le réglage fin des étapes en (D). (B) la configuration actuelle du système HT-OCT. Voir Table des matières pour les composants optiques utilisés pour chaque partie du système. (C) spectromètre de conception pour le système HT-OCT. (D) étape d’installation pour le système HT-OCT. L’alignement correct de l’étape 6 axes et la synchronisation entre l’acquisition de OCT et le mouvement de la scène sont nécessaires pour l’imagerie du haut débit. (E) et (F) montrent les effets de la rotation et l’inclinaison sur l’image finale des différents puits. Rotation entraîne le OCT des images des différents puits de déplacer horizontalement tout en inclinant conduira à déplacement vertical des différents puits. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : traitement des données pour les images des sphéroïdes tumeur OCT. Organigramme (A) des principales étapes de post-traitement pour les données de l’OCT. (B) organigramme de quantification morphologique de l’ellipsoïde de la tumeur. (C) organigramme de détection de région de cellules mortes de l’ellipsoïde de la tumeur. Echelle : 100 µm pour tous les subfigures. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : High-throughput OCT numérisation d’un 96 puits plaque contenant U-87 MG tumeur sphéroïdes. (A) l’installation réelle avec les 96-plaque bien au titre de l’objectif. (B) organigramme de l’implémentation du logiciel du système HT-OCT. Collages de 96 en face (C), projection 3D rendu intensité maximale (MIP) (E) et transversale (D) OCT images du jour 3 HCT 116 sphéroïdes ont généré à partir des données traitées. Barre d’échelle : 200 µm pour tous les subfigures. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : longitudinale morphologiques et physiologiques Quantification des sphéroïdes de tumeur avec des données 3D OCT. (A) 3D obtenu OCT structurelle des images d’un sphéroïde de la tumeur après traitement post général OCT. Partir des données de l’OCT, nous pouvons générer un terrain de surface 3D et tranches orthogonales XZ et YZ, XY pour visualiser la structure de l’ellipsoïde de tumeur dans n’importe quelle direction (B). Nous pouvons effectuer un suivi longitudinal d’un sphéroïde de tumeur unique (C), caractérisant son diamètre, la hauteur et le volume de voxel-basé (énumérés dans la Table des matières) et tracer les courbes de croissance en taille et en volume pendant les 21 jours développement. Dans l’exemple, comme l’ellipsoïde mis au point, il est devenu perturbé le jour 11 et complètement replié sur 21 jours. Nous pouvons également surveiller l’état physiologique d’un sphéroïde de tumeur longitudinalement basé sur le contraste optique atténuation intrinsèque (D). 3D, rendu des images d’un sphéroïde de tumeur a montré l’apparence et la croissance de régions de cellules mortes de jour 7 à 14 jours. Les zones de cellules mortes haute atténuation-marqué en rouge ont été appariés avec histologique et immunohistochimie (IHC) des résultats. Carte d’atténuation OCT, H & E et TUNEL résultat dans Figure 4 sont modifiés de réf. 42. Barreaux de l’échelle : 100 µm pour tous les subfigures. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Video 1
Vidéo 1 : imagerie OCT haut débit des sphéroïdes tumeur. Un flux de travail de l’imagerie 3D OCT, transformation de base OCT et mouvement de la scène a été présenté dans la vidéo avec une vitesse de 5 x. Aperçus des images de structures traitées OCT des sphéroïdes sont aussi présentées. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

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Discussion

Activité antitumorale est très importante pour sa structure morphologique. Semblable à la courbe de croissance caractéristique pour cultures cellulaires 2D de surveillance, suivi de la courbe de croissance pour les sphéroïdes tumeur 3D est également une approche conventionnelle de caractériser le comportement de la croissance à long terme sphéroïde pour différentes lignées cellulaires. En particulier, nous pouvons caractériser la réaction aux médicaments en analysant la dégradation de la tumeur ou tumeur repousse directement reflétés dans la courbe de croissance. Par conséquent, l’évaluation quantitative des sphéroïdes tumeur 3D, y compris la taille et le volume, pour calculer la courbe de croissance, est d’une grande importance pour la caractérisation des sphéroïdes de tumeur et l’évaluation de l’effet composé. Actuellement, les plates-formes d’imagerie basée sur champ lumineux, contraste de phase ou imagerie fluorescente ont été établies pour l’imagerie systématique et analyse de la morphologie ou les fonctions de la tumeur 3D sphéroïdes8,9,18, 22. Cependant, ils sont incapables de résoudre la structure entière, grande tumeur due à la pénétration de profondeur limitée, mais aussi profondeur-resolvability basse résolution. Dans les résultats représentatifs, nous avons démontré OCT pour visualiser l’ensemble de la structure 3D de l’ellipsoïde de tumeur développer au fil du temps. L’imagerie 3D OCT pourrait fournir l’avis de l’ellipsoïde dans n’importe quelle orientation et toute section transversale avec haute-être, qui n’était pas disponible dans les modalités d’imagerie conventionnelles qui n’ont pas la résolution selon la profondeur. En outre, quantification de voxel-basé de volume basée sur les données 3D de OCT a donné une quantification précise des volumes de sphéroïde sans assumer leurs formes originales. Par conséquent, nous avons démontré que l’OCT est une modalité d’imagerie robuste pour la caractérisation de la morphologie 3D des sphéroïdes de tumeur, qui garantit des mesures précises, caractéristique des modèles de croissance des lignées cellulaires différentes et peut potentiellement servir un alternative pour l’évaluation des médicaments réponse.

Tests de viabilité à l’aide de coloration fluorescente restent une approche populaire pour des analyses fonctionnelles des sphéroïdes de tumeur, surtout pour18de dépistage de drogue. Toutefois, le caractère perturbateur de colorants fluorescents indique que ces tests ne sont pas adaptés aux études de point final. Dans nos résultats représentatifs (Figure 4), nous avons démontré une méthode alternative qui peut caractériser la viabilité des cellules au sein de l’ellipsoïde ensemble. Nos résultats ont montré que l’OCT pouvait distinguer la région de cellules mortes de la région viable dans l’ellipsoïde basée sur le contraste de l’atténuation optique intrinsèque. En outre, avec la capacité d’imagerie 3D et de la nature non destructif du système OCT, évaluation quantitative de la distribution des cellules mortes et in situ , suivi de la progression des cellules mortes des régions au sein de l’ellipsoïde sont possibles, qui potentiellement fournir des information plus utile du modèle de croissance de sphéroïde. Toutefois, il convient de noter que, dans nos résultats représentatifs, nous ne sommes pas en mesure de différencier les différents types de modes de mort cellulaire, tels que l’apoptose et nécrose, dans le plan d’atténuation OCT binaire.

Depuis un médicament composé bibliothèque peut s’avérer longue (> 10 000), un système de haut-débit et robuste pour caractériser des sphéroïdes de tumeur en plaques multipuits lors de dépistage des drogues est impératif. Le système d’imagerie à haut débit actuel peut réaliser une projection de la plaque à 96 puits tout en < 5 min en 2D scan mode22. OCT peut être adaptée à des fin de criblage à haut débit, à l’aide d’une platine motorisée. On peut également obtenir un système disponible dans le commerce de l’OCT (voir Table des matières pour obtenir une liste de systèmes commerciaux de OCT) avec un rendement similaire à notre système personnalisé de OCT et incorporer une platine motorisée dans le système. Cependant, il faut des efforts pour modifier le système commercial de OCT pour intégrer la platine motorisée. Mise en œuvre de logiciels sur mesure pour réaliser la synchronisation entre le déclencheur acquisition OCT et déclencheur de mouvement de scène est également requis. Pour notre prototype de système HT-OCT, il a fallu 2-18 secondes pour acquérir une donnée d’OCT 3D d’un sphéroïde de tumeur unique, selon le choix de la vitesse de l’appareil photo. Ainsi, le temps d’acquisition total peut être aussi court que ~3.2 min pour une plaque de 96 puits en utilisant le système HT-OCT. Toutefois, les étapes intermédiaires pour le système HT-OCT actuel, y compris le traitement des données, lire et écrire des données sur disques durs et les mouvements de la scène, est resté beaucoup de temps. Il faudrait sur le dessus le temps d’acquisition des données minimales ~3.2 min supplémentaire environ 18 min. Le total d’imagerie temps peut être réduit davantage sous plusieurs aspects : utiliser state-of-the-art OCT systèmes équipés d’un laser accordable à grande vitesse source50,51; optimisé le flux de travail en organisant les étapes critiques (acquisition de données, informatique, écriture, mouvement étape) travaillant en parallèle ; employer une imagerie OCT parallèle avec un espace-division multiplexage configuration52. Avec l’optimisation du système, le système OCT haut débit peut être utilisé dans la découverte de médicaments du cancer ainsi que caractérisation d’autres échantillons fabriqués en bio-3D (e.g., tissu 3D organoïdes) pour diverses applications biomédicales.

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Disclosures

Les auteurs ne divulguer aucun intérêt concurrent.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la NSF accorde IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (PII-1640707), fonds de démarrage de subventions R21EY026380, R15EB019704 et R01EB025209 et l’Université Lehigh NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom Spectral Domain OCT imaging system Developed in our lab
Superluminescent Diode (SLD) Thorlabs SLD1325 light source
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio AC Photonics WP13500202B201
Reference Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Focusing Lens Thorlabs
Kinematic Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
1D Translational Stage Thorlabs
Continuous neutral density filter Thorlabs
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Sample Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Galvanometer Thorlabs
Relay Lens Thorlabs AC254-100-C two Relay lens to make a telescope setup
Triangle Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
Objective Mitutoyo
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Polarization Controller Thorlabs
30mm Cage Mount Thorlabs
Cage Rod Thorlabs
Stage
3D motorized translation stage Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. JTH360XY
2D Tilting Stage
Rotation Stage
Plate Holder 3D printed
Spectrometer
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Grating Wasatch G = 1145 lpmm
F-theta Lens Thorlabs FTH-1064-100
InGaAs Line-scan Camera Sensor Unlimited SU1024-LDH2
Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Component
HCT 116 Cell line ATCC CCL-247
Cell Culture Flask SPL Life Sciences 70025
Pipette Fisherbrand 14388100
Pipette tips Sorenson Bioscience 10340
Gibco GlutaMax DMEM Thermo Fisher Scientific 10569044
Fetal Bovine Serum, certified, US origin Thermo Fisher Scientific 16000044
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
Gibco PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) Thermo Fisher Scientific 15400054
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators Thermo Fisher Scientific 3120
Gloves VWR 89428-750
Parafilm Sigma-Aldrich P7793
Transfer pipets Globe Scientific 138080
Centrifuge Eppendorf 5702 R To centrifuge the 15 mL tube
Centrifuge NUAIRE AWEL CF 48-R To centrifuge the 96-well plate
Microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Histology & IHC
Digital slide scanner Leica Aperio AT2 Obtain high-resolution histological images
Histology Service Histowiz Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid
Name Company Catalog Number Comments
List of Commerical OCTs
SD-OCT system Thorlabs Telesto Series
SD-OCT system Wasatch Photonics WP OCT 1300 nm
Name Company Catalog Number Comments
Software for Data Analyses
Basic Image Analysis NIH ImageJ Fiji also works.
3D Rendering Thermo Fisher Scientific Amira Commercial software. Option 1
3D Rendering Bitplane Imaris Commercial software. Option 2. Used in the protocol
OCT acquisition software custom developed in C++.
Stage Control Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. MRC_3 Incorporated into the custom OCT acquisition code
OCT processing software custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code.
Morphological and Physiological Analysis custom developed in MATLAB

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