Um ensaio de alta produtividade para a predição da toxicidade química por Automated Caracterização fenotípica de Caenorhabditis elegans

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Summary

Um método quantitativo foi desenvolvido para identificar e prever a toxicidade aguda de substâncias químicas, analisando automaticamente a caracterização fenotípica de Caenorhabditis elegans. Este protocolo descreve como tratar vermes com produtos químicos em uma placa de 384, capturar vídeos e quantificar toxicológicos fenótipos relacionados.

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Gao, S., Chen, W., Zhang, N., Xu, C., Jing, H., Zhang, W., Han, G., Flavel, M., Jois, M., Zeng, Y., Han, J. D., Xian, B., Li, G. A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59082, doi:10.3791/59082 (2019).

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Abstract

Aplicação de testes de toxicidade de produtos químicos em organismos superiores de ordem, tais como ratos ou ratos, é demorado e caro, devido a sua longa vida útil e problemas de manutenção. Pelo contrário, o nematódeo Caenorhabditis elegans (c. elegans) tem vantagens para torná-lo uma escolha ideal para o teste de toxicidade: uma vida curta, fácil cultivo e reprodução eficiente. Aqui, descrevemos um protocolo para a perfilação fenotípica automática de c. elegans em uma placa de 384. Os vermes nematoides são cultivados em uma placa de 384 com tratamento líquido médio e química, e vídeos são tomados de cada poço para quantificar a influência química em 33 características de worm. Resultados experimentais demonstram que as características do fenótipo quantificados podem classificar e prever a toxicidade aguda por compostos químicos e estabelecer uma lista de prioridade para mais testes de avaliação de toxicidade química tradicional em um modelo de roedor.

Introduction

Juntamente com o rápido desenvolvimento de compostos químicos aplicados à produção industrial e o cotidiano das pessoas, é importante estudar a toxicidade testando modelos para os produtos químicos. Em muitos casos, o modelo animal roedor é empregado para avaliar a toxicidade potencial de diferentes substâncias químicas na saúde. Em geral, a determinação da concentração letal (i.e., a analisado 50% dose letal [LD50] de produtos químicos diferentes) é usada como o parâmetro tradicional em um modelo de roedores (rato/mouse) in vivo que é muito caro e demorado. Além disso, devido a reduzir, refinar, ou substituir o princípio (3R) que é central à ética e ao bem-estar dos animal, novos métodos que permitem a substituição de animais superiores são valiosos para a pesquisa científica1,2,3 . C. elegans é um nemátodo de vida livre que foi isolado do solo. Ele foi amplamente utilizado como um organismo de investigação no laboratório por causa de suas características benéficas, tais como um tempo de vida curto, fácil cultivo e reprodução eficiente. Além disso, muitos caminhos biológicos fundamentais, incluindo os processos fisiológicos básicos e respostas de estresse em c. elegans, são conservados no maior mamíferos4,5,6,7 , 8. em algumas comparações que nós e os outros fizeram, há uma boa concordância entre a toxicidade de c. elegans e a toxicidade observada em roedores9. Tudo isso faz c. elegans , um bom modelo para testar os efeitos da toxicidade química in vivo.

Recentemente, alguns estudos quantificar as características fenotípicas de c. elegans. Os recursos podem ser usados para analisar a toxicidade dos produtos químicos,2,3,10 e o envelhecimento dos vermes11. Também desenvolvemos um método que combina um verme líquido cultivo sistema e um sistema de análise de imagem, na qual os vermes são cultivados em uma placa de 384 sob diferentes tratamentos químicos12. Esta técnica quantitativa foi desenvolvida para analisar automaticamente os 33 parâmetros de c. elegans após 12-24h de tratamento químico em uma placa com meio líquido de 384. Numa fase de microscópio automatizado é usada para aquisição de vídeo experimental. Os vídeos são processados por um programa de design personalizado, e 33 características relacionadas ao comportamento em movimento dos vermes são quantificadas. O método é usado para quantificar os fenótipos de worm sob o tratamento de 10 compostos. Os resultados mostram que a toxicidades diferentes podem alterar os fenótipos de c. elegans. Estes fenótipos quantificados podem ser usados para identificar e prever a toxicidade aguda de diferentes compostos químicos. O objectivo geral deste método é para facilitar a observação e quantificação fenotípica de experimentos com c. elegans em uma cultura líquida. Este método é útil para a aplicação do c. elegans em avaliações de toxicidade química e quantificações de fenótipo, que ajudam a prever a toxicidade aguda de diferentes compostos químicos e estabelecer uma lista de prioridade para mais tradicional testes de avaliação da toxicidade química em um modelo de roedor. Além disso, esse método pode ser aplicado à toxicidade de triagem e testes de novos produtos químicos ou o composto, como a poluição de agente aditivo de alimento pharmacautical compostos, compostos exógenos ambiental e assim por diante.

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Protocol

O protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais do Comitê de ética Animal, do centro de Pequim para prevenção de doenças e controle na China.

1. química preparação

  1. Obter produtos químicos (tabela 1 e Tabela de materiais).
  2. Determine a maior e menor dosagem dos produtos químicos individuais para uma concentração mínima de letalidade de 100% (LC100, 24 h) e uma concentração máxima de 100% nonlethality (LC0, 24 h) para vermes. Use pelo menos seis diluições da concentração mais elevada (tabela 1).
    Nota: Realizar um teste de letalidade worm preliminar9 para explorar LC100 e LC0 para um novo produto químico, para determinar a dosagem.
  3. Dilua cada produto químico com K-médias (Tabela de materiais) para 2 x a concentração necessária. Use K-médias como um controle para comparar as alterações do fenótipo causadas por produtos químicos.
    1. Por exemplo, preparar 7 concentrações gradientes de cloreto de cádmio (CdCl2) (tabela 1). Para preparar 2 x a maior solução concentrada aquosa (4,64) mg/mL, dissolver 92,8 mg de CdCl2 pó contínuo em 8 mL de K-médias e preencher até 10 mL após dissolver completamente o pó. Prepare os outros níveis de concentração, diluição com K-médias.
  4. Prepare oito poços paralelos para cada concentração no gradiente químico. Bem, cada um contém 50 µ l do 2 x solução química. Prepare pelo menos três grupos de oito poços paralelos de K-médias como controles (tabela 2).
    Nota: em breve, um volume de 500 µ l de solução de trabalho de 2x é necessário para uma dose única de cada produto químico.

2. worm preparação

  1. Obter o selvagem-tipo N2 worms e estirpes de Escherichia coli OP50 do centro de genética do Caenorhabditis (CGC).
  2. Obter sincronizado L4 de vermes.
    1. Escolha uma única colônia de e. coli OP50 da placa de raia. Assepticamente, inocular a colônia em 100 mL de caldo LB e cultivá-lo durante a noite a 37 ° C.
      Nota: A solução de OP50 de e. coli está agora pronta para propagação de placas de nematoides crescimento médio (NGM, Tabela de materiais).
    2. Despeje uma placa de Petri de plástico 90mm NGM. O dia depois de derramar as sementes cada placa com 300 µ l de solução de Escherichia coli OP50. Incube N2 vermes nas placas NGM com OP50 a 20 ° C por cerca de 2-3 dias até que a maioria dos vermes chegaram a fase adulta.
    3. Colheita de vermes grávidas em um tubo de centrifuga conico estéril 15 mL com estéril H2O. Deixe os vermes sossegar pelo menos 2 min, Aspire o H2O e adicionar 5 mL de tampão de lixívia (Tabela de materiais).
    4. Vórtice do tubo por 5 min, girar o tubo por 30 s (a 1.300 x g) para os ovos de pelotas e descartar o sobrenadante.
    5. Lave os ovos com 5 mL de estéril H2O e vortex o tubo para 5 s. centrifugar o tubo por 30 s (a 1.300 x g), remover o sobrenadante e lavar novamente.
    6. Pipete os ovos em um prato novo de NGM com OP50. Incube-os a 20 ° C. Monitorar os vermes L1 hachurados na manhã seguinte; os vermes atingirá o estágio de L4 em aproximadamente 40 h.
  3. Lave os vermes L4 fora as placas de Petri de 90 mm com K-médio em um tubo cônico estéril 50 mL. Ajuste a concentração de minhocas para ~ 40 animais por 100 µ l de K-médias sob um estereomicroscópio. Adicione 50 µ l (~ 20 vermes) em cada poço da placa de 384 poços. Esses vermes sincronizados (fase de L4) estão prontos para o seguinte tratamento por produtos químicos.

3. tratamento químico e captura de vídeo

Nota: Em uma placa de 384, vermes (50 µ l em cada poço) são tratados para seis a sete doses de uma substância individual (tabela 1). Prepare oito poços paralelos, cada um contendo 50 µ l do 2 x solução química para cada dosagem (oito poços são preenchidos com a mesma química e a mesma concentração, tabela 2). Todos os vídeos são coletados usando uma câmera digital conectada a um microscópio invertido (Tabela de materiais). A experiência de tratamento químico dura 24h. Não adicione alimentar bacteriana a cada poço durante o experimento de tratamento químico de 24 h.

  1. Antes de adicionar os produtos químicos, coloque a placa de 384-bem com os vermes sincronizados no palco automático e vídeos de cada poço com o procedimento de aquisição programada (7 frames por segundo para 2 s; demora ~ 25 min para fazer a varredura de cada placa).
  2. Adicione 50 µ l do 2 x ações químicas preparadas de acordo com a seção 1 para cada poço (tabela 2). Defina o tempo como o ponto 0 h.
  3. Incubar a placa de 384 a 20 ° C e agitar a 80 rpm em um shaker de incubadora.
  4. Retirar a placa da incubadora e transferi-lo para um estágio automático. Pegue vídeos de cada poço da placa inteira, às 12 h e 24 h, para verificar os fenótipos dos vermes para cada tratamento químico específico no K-médias. Aproximadamente 25 min são necessários para a tela de um prato.

4. processamento de vídeo experimento

Nota: Um programa para processamento de imagens e vídeo experimental foi escrito e embalado. Ele pode ser baixado livremente (ver Tabela de materiais). O vídeo experimental é armazenado sob a forma de uma sequência de quadros de imagem, e a sequência do quadro de cada vídeo é armazenada em um diretório específico. O programa pode reconhecer vermes e quantificar fenótipos automaticamente.

  1. Na interface de usuário gráfica (GUI, Figura 1), adicione os parâmetros, tais como o diretório de sequência do quadro, o diretório de saída, o parâmetro de tamanho de verme e o parâmetro de limite de movimento. Clique no botão Analyze para processar as imagens experimentais.
    1. Clique no botão selecionar para escolher o diretório de imagens de origem.
    2. Adicione o diretório de resultado médio na interface.
      Nota: Os resultados médios incluem as imagens segmentadas. Estes resultados médios são úteis para a observação visual das imagens processadas.
    3. Adicione o diretório de resultado final na interface.
    4. Adicione o parâmetro de tamanho médio worm na caixa de texto Tamanho do verme na interface.
      Nota: O parâmetro de tamanho utilizado nos experimentos é 2.000.
    5. Adicione o limiar da relação movida na interface.
      Nota: A proporção utilizada nos experimentos é 0,93.
    6. Clique no botão Analyze para iniciar o processamento de imagem. Clique no botão de Reset para limpar os parâmetros adicionados.
      Nota: Existem 33 recursos definidos e quantificados para vermes. Todos os fenótipos definidos são classificados por categorias (listadas na tabela 3). Estas características podem ser quantificadas de imagens experimentais. Uma comparação quantitativa entre diferentes produtos químicos, que possuem toxicidades diferentes, pode ser feita comparando esses recursos.

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Representative Results

Nós testamos os fenótipos de vermes expostos a diferentes concentrações de mais de 10 produtos químicos12. No teste, 33 características distintas foram quantificadas para cada produto químico composto em três pontos de tempo (0 h, 12 h e 24 h). Uma comparação entre um manual e uma análise automática de um ensaio de vida útil foi feita previamente,11,12. Neste ensaio, encontramos que os produtos químicos e as concentrações podem influenciar os fenótipos de verme. Uma visão geral desse método é mostrada na Figura 2.

Os resultados (Figura 3 e Figura 4,c, d) mostraram que os vermes morreram rapidamente, como a concentração química aumentada. Em altas concentrações, os vermes se tornou mais retas e menos curvada que em concentrações inferiores ou em grupos de controle (Figura 3 e Figura 4b). No início (às 0h), não houve nenhuma diferença significativa entre o controle (K-médio) e tratamentos químicos para todos os fenótipos. Após 12 h de tratamento com uma determinada dosagem química, os fenótipos de vermes mostraram diferentes graus de diferenças entre controle e concentração de diferentes grupos. Por exemplo, o comprimento do eixo maior aumento como tempo aumentado. Há também uma gradiente tendência de baixa para altas concentrações químicas. A tendência de gradiente de concentrações químicas diferentes também foi significativa do comprimento do eixo menor (Figura 4, b).

Neste ensaio, motilidade do worm foi calculada de duas formas: com base na área o verme se mudou e a relação de motilidade (Figura 4c, d). Resultados de motilidade de ambos os lados mostraram padrões similares. Não havia diferenças significativas da motilidade worm entre diferentes concentrações e grupos de controle no início (no ponto de tempo 0 h). Conforme o tempo passou, os vermes nos grupos de controle mostrou um estábulo diminuição da motilidade. A 12 h, os vermes que passaram por tratamentos químicos em diferentes concentrações mostraram diferenças significativas na motilidade em comparação com grupos de controle. Além disso, os vermes em tratamentos da maiores concentração mostraram motilidade fraca em comparação com os vermes em tratamentos de concentração mais baixos. Isso indica que vermes em tratamentos de concentração maiores se tornou menos motile e morreram mais rápido (Figura 4c, d). Estes resultados sugerem que o método projetado é útil para avaliações de toxicidade química, e os fenótipos quantificados de c. elegans são úteis marcadores para identificação de toxicidade química.

Figure 1
Figura 1 : A interface do software. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : O pipeline de um ensaio de alta produtividade para a previsão da toxicidade química pela Caracterização fenotípica automatizada das elegans de Caenorhabditis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Imagens experimentais de vermes sob 4,64 mg/mL CdCl2 (painel superior), 0,464 mg/mL CdCl2 (painel central) e K-médias (painel inferior), nos pontos de tempo diferente. As imagens mostram as alterações de status de vermes sob tratamento químico ou em um grupo de controle em um bem representativo da placa 384-bem durante todo o tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : As características quantificadas de vermes sob diferentes concentrações de CdCl2. (um) o quantificados eixo de maior comprimento. (b) o comprimento do eixo menor quantificados. (c), a motilidade quantificada pelo movido a área. tamanho de área/worm (d), a motilidade quantificada pelo movido. O bar parcelas mostram a quantificação média para cada recurso no único vermes. As barras de erro denotam ± desvio padrão (SD). A unidade de concentração mg/ml. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Table 1
Tabela 1: concentração de exposição de 10 produtos químicos para a 384--placa de C. elegans teste de toxicidade aguda

Table 2
Tabela 2: Um esquema do layout da placa 384.

Table 3
Tabela 3: Definido fenótipos de vermes.

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Discussion

As vantagens de c. elegans levaram-se a sua crescente utilização em toxicologia9, tanto para estudos mecanicistas e abordagens de seleção da elevado-produção. Um papel acrescido para c. elegans em complementando outros sistemas modelo na pesquisa toxicológica tem sido notável nos últimos anos, especialmente para a avaliação da toxicidade rápida de novas substâncias químicas. Este artigo fornece um novo ensaio de triagem elevado-throughput, quantitativo de worm fenótipos em uma placa de 384 para a identificação automática e a avaliação da toxicidade química. Este ensaio é ideal para testes de toxicidade aguda de substâncias químicas dentro de 24 h, e ele poderia ser aplicado à toxicidade subaguda testing também quando mais tempo pontos de dados são coletados e fonte de alimento (OP50) é fornecido para os vermes.

O meio utilizado para diluir as substâncias químicas pode variar; Nós escolhemos o K-médias no ensaio consultando a Sofieet al 13. worms foram cultivadas no K-médias nos grupos de tratamento o controle e a química. Uma solução de água doce artificial ou uma solução de solo com baixa força iônica pode ser alternativas para K-médias.

Produtos químicos com toxicidades diferentes podem alterar os fenótipos de c. elegans em diferentes padrões. Produtos químicos utilizados neste teste foram escolhidos a partir da terceiro ao sexto categorias do sistema global harmonizado de classificação e rotulagem de produtos químicos (GHS). C. elegans foram expostos a substâncias químicas a seis ou mais níveis de dosagem, que cobriu o intervalo de dosagem de mortalidade de 0% a 100%. Para os produtos químicos com baixa hidrossolubilidade, DMSO é recomendado para promover a dissolução química na água. Como uma alta concentração de DMSO pode afetar o desenvolvimento worm e expectativa de vida14, não mais que 0,2% DMSO deve ser usado para testes aquáticos.

Os recursos automaticamente quantificados mostram diferença significativa entre toxicidades diferentes, o que demonstra que estes fenótipos quantificados de vermes são muito úteis na identificação da toxicidade de produtos químicos. Indicou que perfis fenotípicos revelaram funções conservadas para classificar e prever a toxicidade de produtos químicos diferentes usando o nemátodo c. elegans como um organismo modelo in vivo.

O programa americano de toxicologia nacional (NTP) criou a comunidade de Tox21 através de um memorando de entendimento com os E.U. Environmental Protection Agency (EPA) e o centro de genômica do químico National Institutes of Health (NIH), agora o centro nacional de Avançando Ciências translacionais (NCATS). Tox21 usa elevado-throughput screening in vitro e in vivo modelo animal alternativo, um teste para identificar os mecanismos de toxicidade, priorizar produtos químicos para testes de toxicidade in vivo adicional e para desenvolver modelos de previsão de respostas humanas toxicológicos. Como parte desse esforço, c. elegans foi usado para a tela ToxCast fase da EPA eu e bibliotecas de fase II, que contêm produtos químicos 292 e 676, respectivamente, para os produtos químicos, levando a diminuição de desenvolvimento e crescimento larval15. A plataforma COPAS (analisador paramétrico de objeto complexo e classificador) também tem sido utilizada para a triagem toxicológica worm estuda2. No entanto, a plataforma COPAS quantifica apenas algumas características, tais como largura do worm, worm comprimento e a intensidade de fluorescência. Este método é uma melhoria para métodos actuais usa minhocas para prescreen rapidamente a toxicidade de novos produtos químicos.

Existem várias etapas críticas dentro do protocolo: a cultura de worm em uma placa de 384, o tratamento químico, a captura de imagem experimental e a quantificação de fenótipo. Em comparação com métodos de avaliação de toxicidade tradicional, este protocolo pode quantificar alguns fenótipos de vermes que são difíceis de calcular manualmente e útil para refletir as toxicidades de cada produto químico, tais como a motilidade worm, worm largura, tamanho do verme e cinza intensidade. Claramente, este ensaio de alta produtividade para a previsão da toxicidade química será uma abordagem de modelo de toxicidade valioso e poderia ser usado para o prescreening de produtos químicos antes das experiências com animais roedores.

Em resumo, esta técnica abre um caminho na avaliação de toxicidade rápida em várias áreas. Pesquisadores poderiam aplicar o método para a análise de emergência de toxicidade em intoxicação de origem alimentar, a avaliação da segurança de compostos farmacêuticos, bem como a triagem de toxicidade aguda e detecção de novas substâncias químicas e ambientais compostos exógenos.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores agradecer CGC gentilmente enviar o c. elegans. Este trabalho foi apoiado pela nacional chave de pesquisa e desenvolvimento programa de China (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705); Fundação Nacional de ciências naturais da China Grant (#31401025, #81273108, #81641184), a Capital de saúde pesquisa e desenvolvimento de projeto especial em Pequim (#2011-1013-03), o fundo da abertura do Beijing chave laboratório de toxicologia ambiental (# 2015HJDL03) e a Fundação de ciências naturais da província de Shandong, China (ZR2017BF041).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Sigma-Aldrich 59300
384-well plates Throme 142761
Agar Bacto 214010
Atropine sulfate Sigma-Aldrich PHL80892
Bleach buffer 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride Sigma-Aldrich 202908
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074
CCD camera Zeiss AxioCam HRm Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Copper(II) sulfate Sigma-Aldrich 451657
Ethanol Sigma-Aldrich 24105
Ethylene glycol Sigma-Aldrich 324558
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
K-Medium 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth  10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl 
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 63140
NGM Plate 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone Bacto 211677
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60130
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 795496
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 795488
PPB buffer 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker ZHICHENG ZWY-200D
Sodium chloride Sigma-Aldrich 71382
Sodium fluoride Sigma-Aldrich s7920
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 239305
The link of program https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625
Zeiss automatic microscope  Zeiss AXIO Observer.Z1 Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera

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References

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