Lck:eGFP 제 브라에서에서 Malignant 및 비 Malignant B 세포 분리

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

유전자 변형 lck:eGFP zebrafish T 림프 톨에 GFP를 높게 표현 하 고 T 세포 개발 및 급성 림프 구성 백혈병을 연구 하는 데 사용 되었습니다. 이 선 낮은 수준에서 lck 표현 연구 B 셀에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜 lck:eGFP 제 브라에서 악성 및 비 악성 B 세포의 정화를 설명합니다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Burroughs-Garcia, J., Hasan, A., Park, G., Borga, C., Frazer, J. K. Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish. J. Vis. Exp. (144), e59191, doi:10.3791/59191 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Zebrafish (Danio rerio)는 림프 구 개발을 공부 하는 강력한 모델입니다. 포유류 처럼, D. rerio B와 T 림프 톨을 포함 하는 적합 한 면역 계통을 소유. D. rerio 세포 표면 마커를 인식 하는 항 체는 일반적으로 분리 및 B 계보를 포함 하 여 다른 림프 구 인구의 특성을 복잡 하 게 사용할 수 없습니다 때문에 제 브라 lymphopoiesis의 연구는 어려운 셀입니다. 계보 특정 fluorophore 식 유전자 변형 라인 자주이 문제를 우회 하는 데 사용 됩니다. 유전자 변형 lck:eGFP 라인 D. rerio T 셀 개발, 연구 하는 데 사용 되었습니다 그리고 또한 모델 T 세포 개발 및 급성 림프 구성 백혈병 (T-모든) 활용 되었습니다. Lck:eGFP 물고기 널리 사용 되었습니다 T-계보를 분석, 하지만 그들은 하지 B 세포 연구에 사용 되었습니다. 최근, 우리가 발견 lck을 표현 하는 많은 zebrafish B 셀 낮은 수준에 쓰 신. 따라서, lck:eGFP B 세포는 마찬가지로 GFP의 저급을 표현 한다. 이에 따라, 우리 lck:eGFP zebrafish, 우리가 보고 여기에서 B 계보 세포를 정화 하는 프로토콜을 개발 했다. 우리의 방법은 정화 lck:eGFP 물고기 또는 이중 유전자 변형 rag2:hMYC; 등 관련된 라인에서 B 세포 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)를 활용 하는 방법을 설명 합니다. lck:eGFP 물고기입니다. 에이 라인, B 세포, 특히 미 성숙한 B 세포, 낮은 하지만 감지 수준 급행 GFP 그들 고유 높은 GFP를 표현 하는 T 세포에서 허용. B 세포는 골 수, 흉 선, 비장, 혈액, 또는 다른 조직 으로부터 격리 될 수 있습니다. 이 프로토콜에는 정화 D. rerio B 세포, B 세포 개발 및 B 림프 구 악성 같은 주제에 초점을 맞춘 연구를 활성화 하는 새로운 방법을 제공 합니다.

Introduction

Zebrafish는 강력한 특성, 유전자 manipulability, 높은 통치, 광학 반투명, 급속 한 발전 등 유전자 방법을 사용 하 여 공부 척추 개발을 용이 하 게 제공 합니다. Teleost 및 포유류 조의 공유 기능과 함께 이러한 장점을 D. rerio 애벌레 성인 기 동안에 그들의 가장 이른 외관에서 lymphopoiesis 및 림프 구 기능 vivo에서 분석에 적합 확인합니다. Zebrafish에 혈액 개발, 포유류와 공유 하는 잘 보존 유전 프로세스에 의존 하 고 이러한 적응형 면역 체계에 확장. 또한, 림프 개발을 경 세 하는 분자 메커니즘은 너무나 zebrafish 및 포유류1사이 보존 하 고.

지난 2 년간 유전자 변형 D. rerio 라인 그 레이블 특정 혈액 계보 그리고 돌연변이 라인 결핍이 계보에 생성 된2,3,,45. 이 lck:eGFP 유전자 변형 라인 중 하나 GFP 식6드라이브 zebrafish 림프 구 단백질 티로신 키 니 아 제 (lck) 발기인을 사용 하 여. 높은 T-혈통 선구자와 성숙한 T 세포에 의해 표현,이 유전자 vivo FACS7thymic T 세포 개발의 및 T-계보 세포의 생체 내 정화 전 추적에서 있습니다. 이전에 우리 사용이 줄 앞으로 유전 ENU mutagenesis 화면에 T-모든 경향이 생식 돌연변이 식별 하 고 somatically 인수 유전자 T 셀 발암8,9에 연결 된 이벤트를 공부 하.

최근, 우리 연구소는 더 lck:eGFP zebrafish의 유틸리티 확장. 이중 유전자 변형 rag2:hMYC (인간 MYC), T-모든 10, 개발 된 lck:eGFP D. rerio 에서 우리가 발견 B 계보도11를 발생 하는 모든. T-모든 높은 GFP 식 인해 밝은 형광,이 모델에서와 달리 B-모든은 어렴풋이 형광 수준 때문에 낮은 GFP, B-모든 구별 될 조잡 한 그 T-모든 형광 현미경 검사 법에 의해를 가진 물고기를 수 있도록. 이 차동 GFP 식 또한 허용 GFP로 B-모든 세포의 분리에서 GFP안녕하세요 FACS11를 사용 하 여 T-모든 셀. 또한, 낮은 lck 식 고유 하지 않습니다 제 B-전체, 브라를 LCK11,12의 인간의 B-모든 익스프레스 또한 낮은 수준으로. 마찬가지로, D. rerio, 쥐, 및 인간의 정상적인 B 계보 세포는 또한 lck의 저급을 표현 /LckLCK, 미 성숙한 B 세포와 데 높은 식11,13. 셀 당 기준 lckeGFP zebrafish 또는 파생 라인에 B 계보 세포 표현 1-10% 만큼 GFP T 림프 톨으로. 이러한 GFP 표현 특성 등 pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighz, B 세포 mRNAs 세포와 골 수, 흉 선, 비장, 또는 주변에서 순화 될 수 있다 피11. 따라서, 둘 다 B-및 T-계보 세포 수 격리 lckeGFP zebrafish, 그리고 rag2hMYC, lckeGFP 동물, 뿐만 아니라 B 및 T 모든 셀의 경우11.

여기, 우리가 현재 우리의 프로토콜 효율적으로 FACS 정화 비 악성 B 세포에 lck:eGFP zebrafish, 및 rag2hMYC;의 비 악성 또는 악성 B 세포에서 lck:eGFP 물고기, 다양 한 소스 티슈를 사용 하 여. 원하는 경우 이러한 셀 마찬가지로 FACS 격리 없이 cytometry에 의해 측정할 수 수 있습니다. 낮은 lck 식의 발견-GFP 식 결과, 낮은-b 셀 비보 B 세포 발달 연구와 같은 lckeGFP zebrafish에 대 한 실험 가능성의 새로운 문의 엽니다. 따라서, 2004 년에 처음 보고 된이 유전자 변형 라인 우리가 추구 zebrafish 적응 면역에 관한 신선한 통찰력을 수집에 그것을 활용 새로운 생명이 있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

제 브라와 관련 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 오클라호마 대학 건강 과학 센터에 의해 승인 되었다.

1. 유전자 변형 lck:eGFP 생선 에서 비 악성 B 및 T 림프 구 분리

  1. 물고기 물고기 시스템 물에 0.02 %tricaine (MS-222)를 사용 하 여 anesthetize
  2. 제 브라와 다른 teleosts14의 아가미 구멍의 dorsomedial 측면에 있는 형광 thymi에 대 한 2-6 달 오래 된 물고기를 검사 합니다. (470/40 여기 파장과 525/50 방출 필터) GFP를 감지 하는 epifluorescence 현미경을 사용 합니다.
  3. 로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI) 포함 1% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린-스 (정렬 미디어) x 필터 살 균 1의 50 mL를 사전에 준비 합니다. 사용 하지 않는 정렬 미디어 4 ° C에서 최대 2 개월까지 저장할 수 있습니다.
  4. 0.2% 들어 있는 비 커에 그것을 배치 하 여 물고기를 안락사 약 5 분, Tricaine 뒤에 얼음 목욕 침수. Opercular (길) 움직임의 정지에 의해 죽음을 확인 합니다.
  5. 안락사 물고기를 페 트리 접시에 놓고 GFP+ thymi14, 그리고 밝은 분야 현미경 검사 법 설정을 신장 골 수, 비장15를 해 부 해 부에 형광 현미경을 사용 하 여 관심사의 림프 기관 해 부 합니다. 여기에 제시 된 결과 3 개월 된 물고기를 사용 하 여 얻은 했다. 림프 구 비율과 절대 수 나이 및 유전자 형 (추가 세부 사항에 대 한 토론 참조) 마다 다릅니다.
  6. 각의 해 부 기관 미디어 정렬 감기 500 µ L을 포함 하는 1.5 mL 튜브에 배치 합니다.
  7. 유 봉 마이크로 튜브 균질 화기를 사용 하 여 얼음에 조직 균질
  8. 무 균된 조직 단일 세포 현 탁 액을 생성 하는 35 µ m 메쉬 필터를 통해 전달 합니다. 분석까지 얼음에 셀을 계속.

2. 이중 유전자 변형 rag2:hMYC; lck:eGFP 제 브라 에서 악성 세포 분리

  1. 2-4 개월에 시작에 불과합니다, 미세 스크린 rag2:hMYC; 비정상적인 GFP 패턴에 대 한 lck:eGFP 물고기.
    참고:
    B 세포는 GFPlo lck:eGFP 배경에서 그래서 B-모든 필요 인식; 연습 T-모든 때문에, T 세포는 GFP안녕하세요. 결과적으로는 rag2:hMYC, lck:eGFP 듀얼-유전자 변형 라인은 두 개의 고기: 밝은 형광 T-모두, 일반적으로 thymus에서 발생 하 고 몸과 어렴풋이 형광 B-모든으로 확장.
    1. 형광 현미경을 사용 하 여 화면 (200 ms, 2.4 x 이득) 밝은 T-모든 (그림 1A) 및 "높은 노출" 파악 "낮은 노출" 설정을 사용 하 여 물고기 (1.5 s, 3.4 x 이득) dim B-모든 (그림 1A)를 식별. WT 컨트롤 및 사전 leukemic 물고기 GFP thymus (그림 1B)에 있다.
  2. Anesthetize 고 1.1-1.2 단계에서 설명한 대로 물고기를 검사 하십시오.
  3. 간단한 3 카테고리 시스템을 사용 하 여 GFP 형광의 정도에 따라 생선을 분류:
    참고: 레벨 1: 형광만 제한 지역 확산 thymic 종양으로 나타납니다.
    레벨 2: thymus, 관련 된 넘어 형광 표시 < 신체의 50%.
    레벨 3: 형광 신체의 50% 넘어 확장 됩니다.
  4. 암 없는 그 모든 물고기를 구분 합니다. 모니터링 미리 leukemic 물고기 (GFP+ 종양 즉, 생선) 한 번 매달의 새로운 개발에 대 한. ~ 9 개월, 모든 rag2:hMYC, lck:eGFP 물고기 개발 T-모든, B-전체, 또는 둘 다.
  5. T 또는 B 모든 세포 격리를 위한 선택 레벨 3 물고기 (모든 관련 > 본문의 50%)는 항복 2 x 10 이상6 셀을 모두, 그리고 더 일반적으로 많은.
  6. 1.4 단계 에서처럼 물고기 안락사
    참고: 모든 세포를 얻기 위해 두 가지 방법이 있다: 균질 및 복 막 세척 기술16몸 전체. 따라서, FACS 양의 시간이 필요 하 고 비용과 방법 셀 정렬, 수집된의 절대 수에 다 (더 자세한 내용 참조).
  7. 두 메서드 중 하나에 대 한 먼저 안락사 물고기 페 트리 접시에 놓고 thymic 지역을 포함 한 머리 제거 면도칼 블레이드를 사용 하 여. 이 수는 별도로 처리, 원하는, 또는 조직학 얼룩에 사용 하는 경우.
  8. 복 막 세척 방법
    1. P1000 피 펫을 사용 하 여 씻어 감기 미디어, 세포와 미디어 5 mL 튜브에 수집을 정렬의 500 µ L로 생선 복 막 구멍.
    2. 신선한 피 펫 팁을 사용 하 여, 신체 구멍으로 차가운 정렬 미디어의 추가 200-300 µ L를 주사. 다음, 신체 구멍에서 세포를 돌출 시킬 물고기 몸에 부드러운 압력을 적용는 피 펫의 끝을 사용 하 여. 이 미디어를 수집 하 고 5 mL 튜브에 추가.
    3. 2.8.2 단계 2-3 회 반복 합니다. 얼음에 미디어를 정렬에 수집 된 셀을 계속.
    4. 35 µ m 메쉬 흐름 cytometry/FACS 전에 필터링 하 고 분석까지 얼음에 셀을 계속 세포 현 탁 액을 필터링 합니다.
  9. 몸 전체 균질
    1. 생선 머리를 제거 후 미디어 정렬의 200 µ L을 포함 하는 1.5 mL 튜브에 시체를 놓습니다.
    2. 유 봉 마이크로 튜브 균질 화기를 사용 하 여 본문 균질
    3. 감기 미디어 정렬의 추가 300 µ L를 추가 합니다. 하지만 35 µ m 메쉬 필터 세포 현 탁 액을 필터링 합니다. 필터에 조직 파편만 남아 때까지 필터를 통해 모든 셀을 세척 하는 데 필요한 정렬 미디어를 추가 합니다. 분석까지 얼음에 셀을 계속.

3. Cytometric 분석 정상 또는 악성 B 세포의

  1. 흐름 cytometric 분석 및/또는 제조 업체의 설명서에 따라 FACS 매개 변수를 설정 합니다.
  2. 처음 샘플을 특성화 하는 이벤트의 원하는 번호를 취득 합니다. 1 x 104 5 x 10 후속 정렬 단계에 대 한 특정 게이트 결정을 정렬 하기 전에4 이벤트를 분석 합니다.
    1. 결정 문: 림프 구 및 조상 세포 게이트 앞으로 산포 (FSC) 및 세포질 파편 (그림 2A-C)17제외 측면 살포 (SSC) 매개 변수를 사용 하 여 정의. FSC 그리고 SSC 셀 크기/직경 및 세분성에 각각 해당합니다.
      참고: GFP-, GFP소호, 그리고 GFP안녕하세요 셀이이 인구 간단 합니다 (그림 2-5)의 분리를 만드는 10-에-100-배 그들의 GFP 형광 강도 측면에서 다릅니다. 살고 죽은 차별이 시점에서 propidium 요오드 (PI) 또는 7-aminoactinomycin D (7-AAAD) 생존 얼룩을 사용 하 여 평가 될 수 있다. 이전 실험 PI와 일반적으로 입증 > FACS 후 GFP+ 세포의 생존 능력 95%.
    2. 사용 중인 FACS 기계의 매개 변수에 따라 셀 남자를 제외 합니다.
    3. 림프 및/또는 전조 게이츠 내 수 및 GFP+ 세포의 백분율을 결정 합니다.
  3. GFPlo GFP안녕하세요 셀 대 대 게이트 GFP- 에 대 한 정의 phycoerythrin (PE) 및 GFP 농도 사용 합니다.
    참고: Dim GFP 형광을 전시 하는 B 세포와 T 세포 lck:eGFP 라인에 밝은 GFP를 표시. 많은 림프 기관 또는 종양 샘플 포함 모두 GFP+ 인구. B 계보 세포/B-모든 GFPlo 와 T-계보 세포/T-모든은 GFP안녕하세요. GFP-, GFPlo및 GFP안녕하세요 셀, 사이 구별 하는 게이트를 정의 하 고 이러한 인구를 별도로 수집(그림 2A-C, 그림 3A-C, 그림 4A그림 5A).
  4. 미디어, 정렬의 2 개 mL를 포함 하는 다른 15 mL 폴 리 프로필 렌 튜브 또는 추가 분석 (예를 들어, RNA, DNA, 또는 단백질 추출, 여 보세요-이식 등)에 대 한 적절 한 버퍼를 포함 하는 다른 1.5 mL 튜브에 직접 각 세포 인구를 정렬 합니다.
  5. 얼음 추가 분석 이전에 순화 된 셀을 유지.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

우리 사용 분석 cytometry FACS GFP소호 및 GFP안녕하세요 세포 thymus, 신장 골 수, 및 lck:eGFP 유전자 변형 zebrafish의 비장 으로부터 분리. 3 개월 된 물고기의 분석 thymus 포함 GFP+ 세포 주로 밝혔다. GFP+ 세포 림프 게이트 이전 Traver 외.17에 의해 설명에 주로 국한 되었다. 두 가지 GFP+ 인구, GFPlo와 GFP안녕하세요, thymus에서 관찰할 수있습니다 . GFP안녕하세요 세포 GFP로 셀은 덜 풍부 하 고, 총 thymic 세포 (표 1)의 40% ~ 60%, 더 높은 백분율 표현. 달리 포유류, 물고기 조 혈 골 수 대신 뼈 안에 신장 내에서 지역화 됩니다. 우리는 B 세포 신장 골 수 또한 익스프레스의 저급 GFP (그림 2B그림 3B)에서 결정. GFP안녕하세요 셀 부족 동안 GFP로 세포 골 수에서 풍부, 했다 (그림 2B그림 3B)), T 림프 톨의 단지 작은 비율을 나타내는 3 개월의 나이에 골 수에 존재 했다. 비장 샘플 마찬가지로 GFP 의 GFP안녕하세요 셀 (그림 2C그림 3C) 보다 높은 비율을 보였다. 우리는 또한 두 B 및 T 모든11. 경향이 thymus, 골 수, 이중 유전자 변형 lck:eGFP; rag2:hMYC zebrafish의 비장에서 비 악성 세포 분석 모두 아직 개발 하지 했다 물고기, 흉 선, 골 수, 비장에서 결과 단일 유전자 변형 lck:eGFP 물고기에 유사 했다. 그러나, 기관 당 세포의 숫자는 아마도 활성화 rag2 발기인이 되어 미 숙 B와 T 세포 인구의 MYC 기반 확장 때문 (그림 3)를 증가.

우리는 또한 B-또는 T-모든 6 개월에 의해 형광 암 개발 했다 이중 유전자 변형 물고기 분석. 예상 대로, B-모든 생선 어렴풋이 형광 암 주로 GFP로 셀 (그림 4A) 포함. 대조적으로, 밝은 형광 물고기는 격리 된 T-모두 항구 수 또는 혼합 인구와 모두의 GFP B-모든 GFP안녕하세요 T-모든 세포 (그림 5). 예 혼합으로 뚜렷한 B 및 T 모두 포함, 여기 (그림 5)에 표시 됩니다. 각각 GFPlo 와 GFP안녕하세요 셀의 정체성으로 B-및 T-혈통, 확인, 우리는 양적 실시간 PCR (qRT-PCR) 녹취 록 B 및 T-세포-관련 분석. 우리의 결과 보여 GFP 세포 B 세포 성적 높은 수준의 표현 GFP안녕하세요 세포 T 세포 유전자 (그림 2D,3D 그림, 그림4B그림 의 상부를 표현 5B). 또한, lck 그리고 GFP 에 GFP B-모든 dim vivo에서 GFP 형광에 해당 하는 모든 표현 (그림 2D,3D 그림 그림4B 그림5B; qRT-PCR 조건 및 뇌관 시퀀스 이전 Borga 외 설명.) 11.

Figure 1
그림 1: 독특한 형광 패턴 lck:eGFP 유전자 변형 물고기에. 밝은 형광 T-모든 (왼쪽) 또는 어렴풋이 형광 rag2:hMYC, lck:eGFP 물고기의 (A) 형광 현미경 이미지 B-모든 (오른쪽). T-모든 낮은 노출 설정; 표시 됩니다. B-모든만 높은 노출을 사용 하 여 볼 수 있습니다. (B) 높은 노출 설정을 야생-타입 lck:eGFP 물고기 (왼쪽)와 모든 (오른쪽) 없이 rag2:hMYC; lck:eGFP 이중 유전자 변형 물고기에 희미 한 thymic 형광 (노란색 동그라미)를 표시 합니다. 바 규모 = 20 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: lck:eGFP 제 브라에서 림프 구 인구. 상단에 이미지 표시 3 개월 WT, lck:eGFP 물고기 높은 노출 설정 또는 컴퓨터 향상 (시각화를 촉진). 바 규모 = 20 mm. thymus (A), (B), 골 수 및 비장 (C)의 흐름 cytometric 분석. 왼쪽된 패널 표시 FSC (x 축) 및 SSC (y 축), 림프 구 게이트를 나타내는 검은 타원형. 가운데 패널 GFP (x 축)와 PE (y 축) 게이팅 형광 기반 묘사. GFP안녕 (파란색 사각형), GFPlo (녹색 사각형)과 GFP- (블랙 타원) 인구 표시 됩니다. 오른쪽 패널 GFP안녕 과 GFP로 셀의 막대 그래프를 표시합니다. 파선 중간 패널에 제어 조건을 나타냅니다. (D) WT lck:eGFP thymi GFP안녕 (파란색) 및 GFPlo (녹색)에 대 한 정렬. B 세포 유전자 (pax5), T (cd4) 세포 관련 유전자의 표현)lck 그리고 GFP. 결과 내부 관리 유전자를 정규화 (β-말라eef1a1l1)으로 배 변화 ± 표준 오차 (S.E) 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 미리 leukemic rag2:hMYC; lck:eGFP 제 브라에서 림프 구 인구. 상단에 이미지 표시 3-달-오래 된 rag2:hMYC, lck:eGFP 물고기 높고 컴퓨터 강화 된 노출으로. 눈금 막대 = 20 m m. 패널 부품 A-D의 그림 2에 동일한 형태로 묘사 된다. Pax5, cd4, lck및 FACS 정화에 GFP 의 (D) 식 thymic GFPlo (녹색) GFP안녕 (블루) 세포 인구 lck:eGFP 물고기의. qRT-PCR 결과 표시 배 변화 ± 남동 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
B 모든 rag2:hMYC, lck:eGFP 유전자 변형 물고기의 그림 4: 분석. (A) 가기: B-모두가 높은 노출 설정을 사용 하 여 6 개월 rag2:hMYC; lck:eGFP 물고기. 물고기의 시체에서 분리 하는 종양 세포의 흐름 cytometric 분석은 그림 2에 동일한 형식입니다. (B) B-모든 GFP로 셀 ( 그림 4A에서 녹색 게이트), rag2:hMYC; lck:eGFP GFP안녕하세요 thymocytes ( 그림 3A에서 파란색 게이트), 및 T-모든 GFP안녕하세요 셀 ( 그림 5A에서에서 파란색 게이트에 유전자 발현 ). B (pax5, cd79a) 및 T (cd4) 세포 관련 유전자, lck, GFP의 식입니다. 결과 내부 관리 유전자를 정규화 (β-말라eef1a1l1)으로 배 변화 ± 남동 규모 표시 바 = 20 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 분석의 혼합 모든 rag2:hMYC, lck:eGFP 유전자 변형 물고기. (A) 탑: 6 개월 rag2:hMYC; lck:eGFP 물고기 혼합 모든 높은 노출 설정을 사용 하 여. 물고기의 시체에서 분리 하는 종양 세포의 흐름 cytometric 분석은 그림 2에 동일한 형식입니다. (B) GFP안녕 (파란색)와 GFPlo (녹색) FACS 게이츠. B (pax5, cd79a) 및 T (cd4) 세포 관련 유전자, lck, GFP의 식입니다. 결과 내부 관리 유전자를 정규화 (β-말라eef1a1l1)으로 배 변화 ± 남동 규모 표시 바 = 20 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

우리가 개발 하 고이 B 계보 레이블3,4다른 D. rerio 모델에 추가 하는 것은 lck:eGFP 유전자 변형 zebrafish에서 B 세포 격리 프로토콜을 제공. 약간 의외로, GFP B 셀이이 라인의 식별이 갔다 2004 년에 그것의 설명부터 주목. 일반적으로, lck 는 T 세포 관련6, 간주 됩니다 하지만 최근 연구 발견 예기치 않은 lck 식 자연 킬러에 의해 및 골수성 세포, 또한 같이18,19B 세포에서. 우리의 발견 zebrafish B 세포 GFPlo, 사전-B, 순진한, 그리고 성숙 B와 인간에서 세포 또한 LCK11,13의 저급을 표현 한다.

이 물고기의 B와 T 세포의 다른 GFP 수준 때문에 두 계보의 세포 이제이 라인 분리 수 있습니다. 비록 이러한 동물 고전적인 thymic T 림프 구 개발 및 추적 연구에 사용 된, 유사한 연구는 또한 B 세포와 가능한 설명 합니다. 이 위해, 우리 여기, 말 초 혈액에서 있고 다른 사전 작업11B 세포 thymus, 신장 골 수, 비장 식별합니다.

Rag2:hMYC;에 B-모든 인식 lck:eGFP 물고기 예리한 관찰력을 필요로 하지만 연습, 간단 합니다. 그런 다음 모든 셀 정화를 사용 하는 방법은 중요 한 선택. 여기, 우리는 두 가지 방법 제시: 복 막 세척 및 몸 전체 균질. 복 막 세척 GFP+ 세포의 매우 높은 비율로 하지만 총 셀의 훨씬 더 낮은 수를 생성합니다. 따라서, 작은 FACS 시간 비용을 최소화 하는 데 필요한입니다. 총 수익률은 덜 중요 한 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 (예를 들어,: qRT-PCR),이 더 효율적입니다. 또는 몸 전체 균질 결과 많은 포함 하는 큰 단일 셀 정지 셀, 하지만 셀의 낮은 비율 GFP+됩니다. 따라서, 더 많은 FACS 시간은 셀 순화 될 수 있다 복 막 세척, 하지만 수백만 GFP+ 세포의 동일한 수를 수집 합니다. 다운스트림 연구, 높은 수익률이 중요 (예: 서쪽 오 점),이 추가 비용을 상쇄 수 있습니다. 또한, 모든 연구에 대 한 총 몸 균질 캡처, 암 세포의 다양성 더 정확 하 게 종양이 대표. 비록 우리의 프로토콜에 나열 되지 않은, 따라서 감소 하는 총 FACS 시간 및 비용, 복 막 세척 유사 페 트리 접시에 닦지에 의해 유일한 GFP+ 신체 영역/기관에서 균질에 대 한 모든 물고기 해 부 수 이기도 합니다.

Lck:eGFP 물고기에서 thymic GFP 식 GFP 빠르면 5 dpf6감지는 보여주었다. 여기에 우리의 연구 성인 물고기에서 3 개월 이상, 수행 했다 그리고이 나이에, B 세포는 신장 골 수, 비장, 풍부 하지만 T 세포 드물다. 다양 한 연령대의 물고기와 후속 연구 T 세포 더 널리 다른 시간 지점에서 확인 하는 데 필요한 것입니다. 마찬가지로, 3 개월, T 세포, thymus에서 풍성 하 게 하지만 thymic B 세포의 상당수 존재. 이러한 림프 구 인구에 변화 하는 경우 다른 연령대는 현재 알려진 하지만 전반적으로, thymic 형광 페이드 그래서 그것은 T 세포 수 나이 증가 함께 감소 하 고 B 세포 수 성적 성숙 (3 개월)에서 시작 하는 lck:eGFP 물고기 또한. 마찬가지로, GFP B 셀 식민지 zebrafish thymus 현재 알려진 되지 않습니다. Lck:eGFP 물고기를 사용 하 여, 이제 가능 하다 thymic B와 T 세포 개발, 유입, 경과, 및 이러한 이벤트의 특정 활동을 모니터링. 또한, 같은 질문 B 셀이 있는, 신장 골 수, 비장, 혈액, 소장 (데이터 표시 되지 않음) 등 다른 해부학 사이트에 있습니다.

B 세포 발달 연구, 게다가 우리 최근 B 모두에서에서 발견 lck:eGFP; rag2:hMYC 이중 유전자 변형 물고기11. 유전자 변형 rag2:hMYC T-모든10 를 유도 하는 것으로 알려졌다 하지만 B-모든 알 수 없는 사라 했다. 이 oncogene의 높은 penetrance, 인해 두 종류 모두의이 물고기에는 및 많은 물고기는 실제로 둘 다 개발 모든 유형 동시에11. 때문에 B-모든 GFP, T-모두는 GFP안녕하세요, GFP 표정 변화 (그림 5A) 같은 동물에서 발생 하는 경우에, FACS에 의해 고립 될이 두 가지 엔터티를 수 있습니다. 결정적인 정상 및 악성 세포 qRT-PCRresults는 GFPlo 와 GFP안녕하세요 셀 일관 되 게 해당 하는 B-및 T-계보, 각각 (그림 2그림 3) 보여 줍니다.

Lck:eGFP 물고기의 숨은 잠재력 사실 많은 기존의 유전자 변형 라인 가능성이 그들의 의도 된 목적을 넘어 유틸리티를 강조 하는이 작품의 중심 이었다. 여기, 우리는 정상 및 악성 B 세포에 관한 새로운 조사 가능한도 문을 여 유전자 변형 lck:eGFP, D. rerio 에서 B 및 T 세포를 분리 하는 새로운 프로토콜 제시. 이러한 연구의 결과 다시 무슨 조, lymphopoiesis, 및 암 생물학 분야에 귀중 한 자원을 이미 활력 의심할 여 지 없이 것입니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 관심의 충돌을 선언합니다.

Acknowledgments

우리는 메 간 말론-페레즈 zebrafish 관리, 그리고 OUHSC 흐름 cytometry 코어를 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 현대 바퀴, 오클라호마 센터 발전의 과학 기술 (HRP-067), NIH/NIGMS INBRE 파일럿 프로젝트 수상 (P20 GM103447)에 대 한 희망에서 교부 금에 의해 지원 되었다. JKF 일정 & 델 마 게이 부여의 자에서 소아 혈액학-종양학 어린이 병원 재단의 보유합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 µm mesh Sefar Filter technology 7050-1220-000-13
5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap Falcon Corning Brand 352235
50 mL conical tube VWR international 525-0448
AZ APO 100 Fluorescent microscope Nikon
Cytoflex Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara Nikon
Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 Sigma E-10521
FACSJazz BD Biosciences
Fetal bovine Serum Thermo Fisher 10437028
FlowJo v10.2 FlowJo, LLC
lck:eGFP See Langeneu et al., 2004
NIS Elements software Nikon Version 4.13
Penicilin-Streptomycin Sigma P4333
Pestle micro-tube homogenizers Electron Microscopy Sciences 64788-20
Plastic Transfer pippetes
rag2:hMYC-ER See Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x Life Technologies 11835-030

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paik, E. J., Zon, L. I. Hematopoietic development in the zebrafish. International Journal of Developmental Biology. 54, (6-7), 1127-1137 (2010).
  2. Kasheta, M., et al. Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 214, (12), 3519-3530 (2017).
  3. Liu, X., et al. Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes. Journal of Immunology. 199, (5), 1706-1715 (2017).
  4. Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, (8), e1-e11 (2013).
  5. Schorpp, M., et al. Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish. Journal of Immunology. 177, (4), 2463-2476 (2006).
  6. Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101, (19), 7369-7374 (2004).
  7. Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20, (4), 367-379 (2004).
  8. Frazer, J. K., et al. Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen. Leukemia. 23, (10), 1825-1835 (2009).
  9. Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30, (41), 4289-4296 (2011).
  10. Gutierrez, A., et al. Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia. Journal of Experimental Medicine. 208, (8), 1595-1603 (2011).
  11. Borga, C., et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. (2018).
  12. Haferlach, T., et al. Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group. Journal of Clinical Oncology. 28, (15), 2529-2537 (2010).
  13. Novershtern, N., et al. Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis. Cell. 144, (2), 296-309 (2011).
  14. Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicology Pathology. 39, (5), 759-775 (2011).
  15. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (2010).
  16. Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).
  17. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4, (12), 1238-1246 (2003).
  18. Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27, (3), 451-461 (2017).
  19. Tang, Q., et al. Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing. Journal of Experimental Medicine. 214, (10), 2875-2887 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics