Ein präklinisches Porcine-Modell der orthotopischen Herztransplantation

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Summary

Hier beschreiben wir ein präklinisches Großtiermodell (Schweine) der orthotopischen Herztransplantation, das fest etabliert und zur Untersuchung neuartiger kardioprotektive Strategien genutzt wurde.

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Ribeiro, R. V. P., Alvarez, J. S., Yu, F., Adamson, M. B., Fukunaga, N., Serrick, C., Bissoondath, V., Meineri, M., Badiwala, M. V., Rao, V. A Pre-Clinical Porcine Model of Orthotopic Heart Transplantation. J. Vis. Exp. (146), e59197, doi:10.3791/59197 (2019).

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Abstract

Fünfzig Jahre nach dem ersten erfolgreichen Bericht bleibt die Herztransplantation die Gold-Standard-Behandlung für berechtigte Patienten mit fortgeschrittener Herzinsuffizienz. Mehrere Kleintiermodelle der Herztransplantation wurden verwendet, um die akuten und langfristigen Auswirkungen neuartiger Therapien zu untersuchen. Allerdings werden nur wenige in klinischen Studien getestet und erfolgreich nachgewiesen. Es ist von entscheidender Bedeutung, neue Therapien in einem klinisch relevanten Großtiermodell für eine effiziente und zuverlässige Umsetzung der Ergebnisse basiswissenschaftlicher Studien zu bewerten. Hier beschreiben wir ein präklinisches Großtiermodell (Schweine) der orthotopischen Herztransplantation, das fest etabliert ist und zuvor zur Untersuchung neuartiger kardioprotektive Strategien verwendet wurde. Dieses Verfahren konzentriert sich auf akute Ischämie-Reperfusionsverletzungen und ist eine zuverlässige Methode, um neuartige Interventionen zu untersuchen, die in kleineren experimentellen Modellen wie dem murinen Modell getestet und validiert wurden. Wir zeigen, wie nützlich es ist, die Herzleistung während der frühen Nachtransplantationsphase und andere mögliche Möglichkeiten, die das Modell ermöglicht, zu bewerten.

Introduction

Fünfzig Jahre nach dem ersten erfolgreichen Bericht bleibt die Herztransplantation die Gold-Standard-Behandlung für berechtigte Patienten mit fortgeschrittener Herzinsuffizienz1. Obwohl ischämische Zeiten von bis zu vier Stunden angemessen toleriert werden, ist eine ischämische Zeit von mehr als sechs Stunden mit schlechteren Ergebnissen verbunden2. Primäre Transplantatdysfunktion bleibt die Hauptursache für frühe Morbidität und Mortalität nach Transplantation2,3. Die Ursachen der primären Transplantatdysfunktion sind multifaktoriell und umfassen die Verwendung von Randorganen, Empfänger pulmonale Gefäßerkrankungen, hyperakute Abstoßung, und Ischämie-Reperfusionsverletzung zum Zeitpunkt der Transplantation3erlitten.

Mehrere Studien haben neuartige Methoden zur Erhaltung des Spenderherzens untersucht, um die Inzidenz von Primärtransplantat-Dysfunktion4,5,6,7zu reduzieren. Es ist gängige Praxis, neue Techniken und Behandlungen in murinen Modellen von Ischämie-Reperfusionsverletzungen oder heterotopischer Herztransplantation zu bewerten. Darüber hinaus ermöglichen Kleintiermodelle Überlebensmodelle und langfristige Nachbeobachtungen, um die Entwicklung von Abstoßung und Herz-Allograft-Vaskulopathie11,12,13zu untersuchen. Die meisten dieser Strategien scheitern jedoch an ersten klinischen Pilotversuchen oder erreichen dieses Stadium nie. Es ist von größter Bedeutung, neue Therapien in einem klinisch relevanten Großtiermodell für eine effiziente und zuverlässige Umsetzung der Ergebnisse basiswissenschaftlicher Studien zu bewerten.

Das Schweineherz wird oft als das anatomischähnlich dem menschlichen Herzen betrachtet, wenn großtierliche Modelle verwendet werden. Als solche, Es ist eine ideale Plattform, um Herzchirurgie Forschung durchzuführen. Bei der Verwendung eines Schweinemodells sind jedoch einige wichtige Faktoren zu berücksichtigen. Erstens wird das Gewebe in der Regel als zerbrechlich und zerbrechlich beschrieben, vor allem im rechten Vorhof und der Lungenarterie, anfällig für Tränen14. Darüber hinaus gilt das Schweineherz als empfindlich gegen Manipulation und anfällig für Arrhythmien, weshalb man zu Beginn des Experiments routinemäßig jedem Tier eine Antiarrythmetik verabreichen sollte. Ein wichtiger anatomischer Unterschied zwischen dem Schweinemodell und der klinischen Herztransplantation ist die linke hämiazygote Vene in den Schweinen, die direkt in die koronare Sinus abfließt. Dies muss während des Empfängerverfahrens geligiert werden, um kontinuierliche Blutungen zu vermeiden. Schließlich ist das Schweinemodell sehr empfindlich gegenüber Ischämie, aber es ist immer noch geeignet für akute Studien in Herztransplantation15.

Dieses Manuskript beschreibt ein präklinisches Großtiermodell (Schweinen) der orthotopischen Herztransplantation, das festetabliert und zur Untersuchung neuartiger kardioprotektive Strategien 5,6,8 ,9.

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Protocol

Der institutionelle Tierpflegeausschuss genehmigte alle Versuchsprotokolle und Tiere wurden im Anschluss an den "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" behandelt, der vom Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council, 1996 erstellt wurde. Männliche Yorkshire-Schweine (40–50 kg) wurden verwendet, um die orthotopischen Herztransplantationen durchzuführen (Die Tiergröße kann je nach Ermessen der Forscher und experimentellen Zielen variieren).

1. Spenderverfahren

  1. Anästhesieinduktion und Tierzubereitung:
    1. Prämedizipation des Tieres mit einer intramuskulären Injektion von Ketamin (20 mg/kg), Midazolam (0,3 mg/kg) und Atropin (0,04 mg/kg). Durchführen von Anästhesieind und Wartung mit inhalationsalen Isofluran (Endgezeitenkonzentration: 1%–3%) + 3 L/min O2 über Gesichtsmaske.
    2. Bestätigen Sie die anästhetische Angemessenheit, indem Sie einen entspannten Kieferton und schmerzende Schmerzen während der Zehenklemmung gewährleisten. Die angemessenistische Angemessenheit muss den institutionellen Leitlinien folgen.
    3. Sobald die anästhetische Angemessenheit bestätigt ist, führen Sie eine orotracheale Intubation mit einem Endotrachealrohr der Größe 6,5–8 mm durch.
    4. Legen Sie einen Sauerstoffsättigungsmonitor auf das Ohr oder die Unterlippe für eine kontinuierliche Überwachung. Legen Sie das Kauter-Elektrodenpad auf den Rücken des Tieres.
    5. Setzen Sie einen peripheren intravenösen Zugang über Ohrvene ein (z. B. 20 g Angiocath). Starten Sie eine Wartungsinfusion (z.B. 0,9% NaCl). 2 g Magnesiumsulfat verabreichen, um Arrhythmien vorzubeugen.
    6. Setzen Sie einen perkutanen zentralen Venenmantel-Einführer mit der Seldinger-Technik in die rechte Jugularvene ein, wenn rechtsseitige Herzkatheterisierungs- und Herzleistungsmessungen durchgeführt werden sollen. Platzieren Sie das Tier in Trendelenburg Position, um venösen Zugang zu erleichtern. Alternativ kann dies in der linken inneren Jugularvene erfolgen. Wenn der Zugriff nicht hergestellt werden kann, kann dieser Schritt nach der Mittelliniensternotomie durchgeführt werden, indem die innere Jugularvene (links oder rechts) seziert und der Mantel direkt eingefügt wird.
  2. Beschaffung von Spenderherzen:
    1. Führen Sie eine Mittellinien-Sternotomie vom mittleren Zervixbereich bis unterhalb des xiphoiden Prozesses mit einem Kautery-Stift durch. Öffnen Sie das Brustbein mit einer Knochensäge. Sorgen Sie während des gesamten Verfahrens (z. B. Kauterize-Brustbein und/oder Anwendung von Knochenwachs) für eine angemessene Hämostase.
    2. Ziehen Sie im Zervixbereich den Sternocleidomastoidenmuskel in die Mitte zurück und sezieren Sie die rechte Halsschlagader (alternativ kann dies mit der linken Halsschlagader erfolgen). Legen Sie eine arterielle Zugangslinie (z.B. 20 g Angiocath) in die rechte Halsschlagader für die invasive arterielle Drucküberwachung.
    3. Sezieren und entfernen Sie den Thymus über dem Perikard. Heben Sie den Thymus vorsichtig aus dem Perikard, indem Sie die Kautery verwenden, und sezieren Sie die Struktur vom Perikard. Um Blutungen zu verhindern, kauterisieren Sie die kleinen Gefäße, die aus der Aorta und der überlegenen Vena cava (SVC) stammen, um den Thymus zu bewässern.
    4. Öffnen Sie das Perikard. Sezieren Sie den aortopulmonären Raum mit der Kauterie. Dazu lassen Sie den Assistenten die rechte ventrikuläre Abflussspur minderwertig und die Lungenarterie nach links zurückziehen und den Chirurgen die Aorta nach rechts zurückziehen lassen. Tun Sie dies sorgfältig, um direkte Läsionen auf die Lungenarterie zu vermeiden.
    5. Löschen Sie den vorderen Aspekt der aufsteigenden Aorta aus dem Bindegewebe. Ziehen Sie vorsichtig den rechten ventrikulären Abflusstrakt zurück und legen Sie eine Geldbörsen-Saitennaht mit einem 4-0-Prolen auf die proximal aufsteigende Aorta adventitia (vermeiden Sie volle Dicke Nähte). Sichern Sie sich diese Naht mit einem Tourniquet.
    6. Verabreichen Sie 30.000 Einheiten Heparin (>300 U/Kg), um eine systemische Antikoagulation zu erreichen. Setzen Sie die Cardioplegia-Lieferkanüle (z.B. DLP-Aortenwurzelkanüle) in die aufsteigende Aorta zwischen der zuvor platzierten Geldbörsen-Saiten-Nähte ein und sichern Sie sie durch Anziehen des Tourniquets. Bereiten Sie die kardioplegische Lösung vor, die verwendet wird, und verbinden Sie sich mit der Lieferkanüle.
    7. Öffnen Sie den SVC und die untere Vena cava (IVC) und die linke untere Lungenvene, um eine ausreichende Herzentlüftung zu gewährleisten. Legen Sie die Aorten-Kreuzklemme auf die distal aufsteigende Aorta (über der Cardioplegia-Kanüle). Alternativ kann der linke Ventrikel durch Öffnen des linken Vorhofanhängs und Absaugen entlüftet werden.
    8. Initiieren Sie eine Kardioplegie-Infusion, die auf einen Aortenwurzeldruck von 80 bis 100 mmHg abzielt.
      HINWEIS: Die Autoren wendeten ein Modell mit 1,5 l einer standard extrakalemmischen kardiolepmischen Lösung bei 4 °C an. Je nach Versuchsaufbau können unterschiedliche Lösungen und Volumina eingesetzt werden.
    9. Eisschlamm (0,9% NaCl) in die Brusthöhle und über das Organ zur Abkühlung nach Beginn der Kardioplegie legen. Nachdem die Cardioplegie-Infusion abgeschlossen ist, gehen Sie mit der Kardiektomie in einer traditionellen Weise fort. Abschnitt der Aorta und der Lungenarterie nach der innomischen Arterie bzw. bei der Bifurkation, um eine ausreichende Länge für das Implantat zu gewährleisten.
    10. Nach der Entfernung das Organ in einen Organbeutel mit mindestens 500 ml Konservierungslösung (Standard extrazelluläre hyperkalemische Lösung) legen. Legen Sie diese auf Eis und halten Sie bei 4 °C. Dieser Schritt kann entsprechend dem experimentellen Design und Ziel geändert werden.

2. Empfängerverfahren:

  1. Anästhesieinduktion und Tierzubereitung:
    1. Anästhesie und Überwachung wie im Spenderverfahren beschrieben durchführen (Schritte 1.1.1 bis 1.1.6).
    2. Nach dem Einsetzen des perkutanen zentralen Venenmantels in die rechte Jugularvene, legen Sie mit der Seldinger-Technik einen zentralen Venenkatheter (z.B. Doppellumen) in die linke Jugularvene ein. Alternativ kann dies nach der Mittellinien-Sternotomie wie oben beschrieben erfolgen.
  2. Herz-Lungen-Bypass (CPB):
    1. Führen Sie die Mittelliniensternotomie durch und entlarven Sie das Herz und die großen Gefäße, wie im Spenderverfahren beschrieben (Schritte 1.2.1 bis 1.2.4).
    2. Sezieren Sie zwischen dem SVC und der innominierten Arterie und dem IVC und Perikard mit den Metzenbaum und "Rechtwinkel" Zange. Umkreisen Sie die SVC und IVC mit einem Nabelband (alternativ kann eine einfache O-Seidennaht verwendet werden). Sichern Sie jedes Band/jede Naht mit einem Tourniquet.
    3. Platzieren Sie 2 konzentrische Geldbörsen-String-Nähte mit einer 4-0 Prolen-Nähte auf der distal enzierenden aorta adventitia (vermeiden Sie volle Dicke Nähte). Legen Sie Geldbörsen-String-Nähte mit 4-0-Prolen auf dem IVC und dem SVC auf der Ebene der Perikardreflexion. Sichern Sie diese Nähte mit Tourniquets.
    4. Während der CPB-Vorbereitung, haben sie einen Assistenten, der das System entsprechend den Bedürfnissen der Prüfer und Experimentellen eingerichtet und grundaufbereitet. Das aktuelle Verfahren verwendet die gleiche Einrichtung wie die Abteilung für Herz-Kreislauf-Chirurgie der Institution und verwendet die Hilfe eines ausgebildeten Perfusionisten. Das Bypass-System wird mit 2 Litern Kristalloidlösung (z.B. Plasmalyt) mit 500 mg Solumedrol grundiert.
    5. Verabreichen Sie 30.000 Einheiten Heparin (>300 U/Kg), um eine systemische Antikoagulation zu erreichen. Die aktivierte Gerinnungszeit (ACT) sollte über 300 s liegen, wenn der Test verfügbar ist.
    6. Kanülieren Sie die Aorta mit einer 17 bis 21 F arteriellen Kanüle. Verwenden Sie eine extrakorporale Membransauerstoffator (ECMO) Kanüle (z.B. EOPA Arterienkanüle), die mit der Seldinger-Technik eingesetzt wird, um diesen Schritt zu erleichtern und Blutverlust zu vermeiden. Alternativ kann eine Standard-Bypass-Arterienkanüle verwendet werden.
    7. Schließen Sie die Kanüle über einen 3/8-3/8-Anschluss an die arterielle Leitung der Bypass-Schaltung an. Stellen Sie eine vollständige Deairing, um Luftembolie zu vermeiden.
    8. Führen Sie eine bizivaven cannulation durch. Dazu kann der SVC und dann der IVC mit 24 bis 28 F rechtwinkligen venösen Kanülen (z.B. DLP-Einzellumen- venöse Kanülen) verwendet werden.
      1. Machen Sie zunächst einen kleinen Schnitt (5 mm) in der Mitte der Geldbörsen-String-Nähte. Deisieren Sie den Schnitt mit einem kleinen abgewinkelten Instrument (z. B. rechter Winkel oder ein Schnapp). Setzen Sie die Kanüle, die den Winkel in der SVC überlegen und minderwertig in der IVC (weg vom Herzen) zu lenken. Sichern Sie sich, indem Sie das Tourniquet anziehen, das die Geldbörsen-String-Nähte hält.
      2. Zwischen jedem Schritt, decken Sie den Schnitt mit einem Finger, um übermäßige Blutungen zu vermeiden. Schließen Sie die Kanülen mit einem 3/8-3/8-1/2 Y-Anschluss an die venöse Leitung der Bypass-Schaltung an. Stellen Sie die Deairing, um eine Luftschleuse im System zu vermeiden.
    9. Initiieren Sie CPB. Passen Sie die Durchflussraten an, um einen Arteriendruck über 50 mmHg (ca. 4 L/min) aufrechtzuerhalten. Halten Sie Normothermie während des gesamten Verfahrens.
      HINWEIS: Diese Einstellungen können entsprechend dem experimentellen Design geändert werden. Vasoaktive Medikamente sollten nur während cpB verabreicht werden, wenn dies zur Unterstützung der Druckregulierung (z. B. Adrenalininfusion) erforderlich ist.
  3. Spenderherzimplantation:
    1. Nach der Initiierung von CPB öffnen Sie die linke Pleura und ziehen Sie das einheimische Herz nach rechts. Sezieren und umschließen Sie die linke hämiazygote Ader mit einem scharfen Sezierinstrument (z.B. Metzenbaum) bzw. einem rechten Winkel. Ligate distally mit einem O Silk Krawatte. Es wird nur eine Ligatur benötigt, da das einheimische Herz entfernt wird.
    2. Kreuzklemmen Sie die Empfängera proximal an die arterielle Kanüle. Snare beide vena cava mit den Tourniquets zuvor mit O Seidenkrawatten platziert. Entfernen Sie das muttersprachliche Herz des Empfängers. Alternativ kann das Herz mit standard hypothermischer Blut-basierte Kardioplegie verhaftet werden.
    3. Während der Kardiektomie, stellen Sie sicher, große Manschetten im Empfänger zu halten, um Spender Herzimplantat zu erleichtern. Dazu abschnitt die Aorta und Lungenarterie proximal, nahe an ihren Wurzeln. Ebenso müssen die linken und rechten Vorhöfe mit großen Manschetten gehalten werden. Lassen Sie die rechten und linken Vorhofanhänge in den Empfängermanschetten, die während der Anastomosen benötigt werden können.
    4. Bereiten Sie das Spenderherz auf das Implantat vor.
      1. Sezieren Sie die Lungenarterie vom linken Vorhof und trennen Sie die Lungenarterie vollständig von der Aorta. Lassen Sie mindestens 2-3 cm von jedem Gefäß während des Implantats nach Bedarf getrimmt werden. Ligate beide Vena cava mit einer O Seidenkrawatte. Vereinen Sie alle Lungenvenen, so dass eine einzelne linke Vorhofmanschette anastomosed werden.
      2. Vergleichen Sie die Linken-Vorhofmanschettengrößen (Spender und Empfänger) und trimmen Sie sie nach Bedarf, um ähnliche Größen zu erhalten. Das linke Vorhof-Anhängsel des Empfängers kann gekürzt werden, oder das linke Vorhofdach und das Anhängsweite des Spenders können dafür geöffnet werden.
    5. Geben Sie die erste Kardioplegie-Dosis an das Spenderherz mit der zuvor platzierten Kardioplegie-Kanüle, wie in Schritt 1.2.6 beschrieben. Kardionlegische Schutzlösung besteht aus 500 ml einer 2:1-Mischung aus Blut: Kristalloid mit 24 mEq Kalium und wird bei 10°C abgegeben. Erreichen Sie die gewünschte Kaliumkonzentration, indem Sie der kardiopdiogischen Mischung Kaliumchlorid zufügt.
    6. Nach Abschluss jeder Anastomose eine zusätzliche Dosis von 300 ml Kardioplegie bei 10 °C mit 8 mEq Kalium abgeben.
    7. Nach allen Anastomosen und vor der Entfernung der Aortenkreuzklemme, eine zusätzliche Dosis von 500 ml warme (37 °C) Blutkardioplegie mit 8 mEq Kalium.
    8. Entfernen Sie das Spenderherz aus der Lagerung und implantatieren Sie mit der standardbiatrialen anastomotischen Technik in der folgenden Reihenfolge: linkes Atrium, rechtes Atrium, Lungenarterie und Aorta. Verwenden Sie eine 4-0 Prolen Naht mit einer SH-Nadel für das linke und rechte Atrium, und die Aorta und eine 5-0 Prolen-Naht mit einer BB-Nadel für die Lungenarterie.
      1. Linkes Atrium: Legen Sie eine 4-0 Prolen-Naht an der Kreuzung zwischen dem linken Atrium und dem IVC (rechts untere Rand) und eine weitere bei 180° vom ersten, die die Spender-und Empfängermanschetten verbindet. Vervollständigen Sie die hintere Wandanastomose. Vervollständigen Sie die vordere Wandanastomose. Dies wird von der überlegenen Naht bis zur unteren Naht durchgeführt.
      2. Rechtes Vorhof: Öffnen Sie das Spender-Rechts-Atrium vom Anhängsel zum IVC und erstellen Sie eine Spendermanschette, die der Empfängermanschettengröße entspricht. Beginnend im unteren Winkel (Kreuzung zwischen IVC und rechtem Vorhof), vervollständigen Sie die Innenwand Anastomose und dann die Seitenwand.
      3. Lungenarterie: Trimmen Sie die Ränder der Empfänger- und Spenderpulmonarterien, um passende Größen zu erstellen. Legen Sie eine 5-0 Prolen-Nähte an der linken Seitenwand, die Spender- und Empfängergefäße und eine weitere am rechten Seitenrand vereint. Vervollständigen Sie die minderwertige Wandanastomose und dann die vordere Wand anastomosis.
      4. Aorta: Trimmen, wie mit der Lungenarterie beschrieben. Legen Sie eine Naht an die linke Seitenwand, die Spender- und Empfängergefäße verbindet. Vervollständigen Sie die untere Wand und dann die vordere Wand Anastomose.
      5. Führen Sie einschichtige Anastomosen durch, mit Ausnahme der Lungenarterie, wo eine doppelschichtige Anastomose erforderlich ist. Das Schweinegewebe ist extrem zerbrechlich und sollte sorgfältig behandelt werden, um Risse zu vermeiden. Wichtig ist, dass die Lungenarterienanastomose der empfindlichste Schritt des Implantats ist und mit äußerster Sorgfalt erfolgen muss. Die Implantattechnik kann nach den Vorlieben der Chirurgen und dem experimentellen Design modifiziert werden.
    9. Nach Abschluss aller Anastomosen und warme Kardioplegie Dosis Lieferung wie oben beschrieben, entfernen Sie die Aortenkreuzklemme. Alle Anastomosen auf Blutungsstellen untersuchen, sollten sie an dieser Stelle korrigiert werden.
    10. Reperfuse das Spenderherz für 60 min auf CPB. Ventrikuläre Arrhythmien können mit interner Defibrillation (20-50 J) behandelt werden. Bei Bedarf kann ventrikuläres Tempo verwendet werden, um eine Herzfrequenz von 100 Schlägen pro Min. aufrechtzuerhalten. Antiarrhythmika (z. B. Amiodaron, Lidocain oder Magnesiumsulfat) können bei Bedarf nach Ermessen verwendet werden.
    11. Nach 60 min Reperfusion 1 g Calciumchlorid verabreichen. Initiieren Sie die Entwöhnung von CPB, indem Sie den Fluss auf die Hälfte, dann ein Viertel und dann aus. Die zentrale Venenlinie kann zur Überwachung des zentralen Venendrucks mit einer Ausrichtung auf 10 mmHg verwendet werden. Initiieren Sie die Infusion von vasoaktiven und inotropen Medikamenten (z. B. Dobutamin, Adrenalin, Noradrenalin und Vasopressin) nach dem experimentellen Design oder der Diskretion der Forscher.
    12. Die Entwöhnung gilt als erfolgreich, wenn das Tier nach Absetzen von CPB einen systolischen Arteriendruck über 60 mmHg über 30 min aufrechterhält. Da dies kein Überlebensmodell ist, kehren Sie das Heparin nicht um; durch Nadellöcher und sezierte Strukturen (z.B. Brustbein) können kontinuierliche Blutungen auftreten. Spenderherzen reagieren gut auf kleine und wiederholte Dosen von Volumenersatz mit dem CPB-System. Darüber hinaus reagiert das Schweinemodell gut auf Dobutamin.
      HINWEIS: Die Empfängerverwaltung sollte auf die Erfahrungen der Prüfer und das experimentelle Design zugeschnitten sein. Ein Herzanästhesist kann auf diese Weise helfen.

3. Graft-Bewertung:

  1. Funktionelle Bewertung:
    1. Dieses große Tiermodell hat den Vorteil, dass es jederzeit einen offenen Brustansatz hat, der eine direkte funktionelle Beurteilung erleichtert. Um die Kardialkontraktilität zu messen, verwenden Sie Druck-Volumen-Schleifenanalysen (PV), Echokardiographie und/oder rechtsseitige Katheterisierung.
    2. Druck-Volumen-Schleifen10: Legen Sie ein Nabelband um das IVC, und legen Sie einen PV-Leitfähigkeitskatheter in den linken Ventrikel durch eine kleine apikale Ventrikulotomie, um kontinuierliche Messungen der linksventrikulären PV-Beziehungen zu ermöglichen. Erhalten Sie stationäre Aufzeichnungen, um volumenabhängige Parameter zu erzeugen (z. B. entwickelte Druck- und Hubarbeit) und erhalten Sie dann Okklusionsaufzeichnungen in Dreifacharbeit, indem Sie das IVC zur Erzeugung volumenunabhängiger Parameter (z.B. vorladfähig rekrutierbare Schlaganfall).
    3. Echokardiographie: Herzanästhesisten erhalten Epikardialbilder mit einer Standard-Transösophagealsonde.
    4. Rechtsseitige Katheterisierung: Legen Sie einen Swans-Ganz-Katheter durch die venöse Hülle, die zu Beginn des Verfahrens platziert wird, und guid in Richtung der Lungenarterie. Dies ermöglicht die Messung des zentralen Venendrucks, des rechten ventrikulären Drucks, der Lungenarteriendrücke, des pulmonalen Kapillarkeildrucks und der Herzleistung mit der Thermoverdünnungstechnik.
    5. Durchführung einer kontraktilen Bewertung zu Beginn und nach 2 und 3 h nach der Reperfusion des Spenderherzens beim Empfänger. Dies kann von den Forschern nach dem experimentellen Design geändert werden.
  2. Metabolische Bewertung:
    1. Für metabolische Beurteilungen, sammeln arterielle und venöse (alternativ: gemischte venöse) Blutproben und speichern Sie das Plasma für nachfolgende Analysen. Echtzeit-Blutgasanalysen und Laktatspiegel sollten ebenfalls ermittelt werden.
    2. Sammeln Sie diese Proben zu Beginn des Spenders, vor der Beschaffung beim Spender, zu Basiswert beim Empfänger und bei 15, 30 und 60 min Reperfusion des Spenderherzens (nach Entfernen der Kreuzklemme). Dies kann entsprechend dem experimentellen Design geändert werden.
  3. Experimentierung und Euthanasie:
    1. Sobald alle Bewertungen abgeschlossen sind, exsanguinate das Empfängertier in das venöse Reservoir des CPB-Kreislaufs, indem sie die venöse Leitungsklemme öffnen. Alternativ kann eine Exsangination erreicht werden, indem das Herzalograft geerntet wird, um Proben (d. h. Myokardbiopsien) zu sammeln.

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Representative Results

Dieses präklinische Modell wird seit 1994 erfolgreich 5,6,8,9eingesetzt. Tabelle 1 zeigt repräsentative Ergebnisse aus Druck-Volumen-Beziehungen und echokardiographischen Parametern, die zu Beginn genommen wurden, und 3 h nach der Transplantation in einer Reihe von 5 Experimenten. Obwohl wir einen Rückgang der myokadialen Kontraktilität nach der Transplantation sehen, war dies statistisch nicht signifikant.

Abbildung 1 zeigt repräsentative Druck-Volumen-Schleifen, die aus einem Experiment zu gleichen Zeitpunkten gesammelt werden. Bei "Steady-State"-Bewertungen (Abbildung1, obere Zeile). volumenabhängige Parameter aufgezeichnet werden, wie z. B. maximale und minimale Rate des entwickelten Drucks. Volumenunabhängige Parameter werden durch intermittierende Okklusion des IVC ermittelt. Damit nimmt das Volumen des linken Ventrikels allmählich ab und verschiedene Beziehungen können berechnet werden. In der mittleren Zeile von Abbildung 1werden die endsystolischen und enddiastolischen Druck-Volumen-Beziehungen aufgezeichnet, die die Beziehung zwischen dem endsystolischen bzw. enddiastolischen Druck mit den entsprechenden enddiastolisches Volumen. In der unteren Zeile od Abbildung 1sehen wir die Aufzeichnung der vorladrekierbaren Hubarbeit, d. h. die Beziehung zwischen der Schlaganfallarbeit und dem entsprechenden enddiastolischen Volumen.

Schließlich können, wie in Abbildung 2dargestellt, verschiedene andere metabolische (z. B. Laktatspiegel und pH) und funktionelle Parameter (z. B. Herzleistung) mit diesem Modell gemessen werden, um verschiedene Hypothesen zu testen.

Figure 1
Abbildung 1 . Repräsentative Druck-Volumen-Schleifen in einem stabilen Zustand, während Interior Vena Cava (IVC) Okklusion, und Beziehungen (Preload rekrutierbare Schlaganfallarbeit). (A) Ein Experiment zu Beginn. (B) Ein Experiment nach 3 h Reperfusion. PRSW = rekrutierbare Hubarbeit vorladen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2 . Laktat- und pH-Trends während des Herztransplantationsprotokolls. Nach der Reperfusion gibt es eine signifikante Zunahme von Laktat und eine Abnahme des pH-Werts. Dies kann durch aufrechterhaltung eines angemessenen Perfusionsdrucks mit ordnungsgemäßem Volumenersatz und vasoaktivem Drogenkonsum bewältigt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

verbindungslinie zwischen zwei malen 3 Stunden nach der Transplantation p-Wert
Lungenarterienkatheter
Herzindex (L/min) 3,7 x 0,8 2,8 x 0,3 0,485
Druck-Volumen-Analyse
PRSW (erg-cm-3x 103)
Max. dP/dt (mmHg es-1)
Min dP/dt (mmHg es-1)
62,1 x 7
2500 bei 425
-1537 bei 238
53,8 x 10
1815 bei 410
-1427 bei 317
0,841
0,309
0,547
Echokardiographie
LV EF (%)
LV FAC (%)
RV FAC (%)
47,3 x 3,0
53,8 x 3,6
39,2 x 1,3
37,0 x 4,2
46,4 x 2,9
32,8 x 3,6
0,095
0,222
0,309

Tabelle 1. Repräsentative Druck-Volumen-Beziehungen und echokardiographische Parameter aus einer Reihe von 5 Transplantationen, die zu Beginn und nach 3 h Reperfusion durchgeführt wurden. Daten, die als mittlerer Standardfehler dargestellt und mit dem Wilcoxon Signed Rank Test verglichen werden. EF = Auswurffraktion. FAC = Bruchflächenänderung. LV = linker Ventrikel. Max. dP/dt = maximale Druckänderungsrate im linken Ventrikel. Min dP/dt = Mindestrate pf Druckänderung im linken Ventricule. PRSW = rekrutierbare Hubarbeit vorladen. RV = rechter Ventrikel.

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Discussion

Dieses Manuskript beschreibt ein großtiergroßes präklinisches Modell der orthotopischen Herztransplantation. Verschiedene Kleintiermodelle der heterotopischen Herztransplantation wurden erfolgreich eingesetzt, um die Auswirkungen neuartiger Behandlungen zu untersuchen, um die Organkonservierung zu verbessern und die Ischämie-Reperfusionsverletzung zu verringern11,12, 13. Darüber hinaus ermöglichen Kleintiermodelle Überlebensmodelle und langfristige Nachsorge, um die Entwicklung von Abstoßung und Herz-Allograft-Vaskulopathie11,12,13zu untersuchen. Die meisten dieser neuartigen Therapien scheitern jedoch an klinischen Studien oder schaffen es nie. Um die klinische Übersetzung zu erleichtern und zu rationalisieren, ist ein zuverlässiges und klinisch relevantes Großtiermodell erforderlich.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um verschiedene Behandlungs- und Organkonservierungsstrategien zu untersuchen, um primäre Transplantatfunktionsstörungen und Ischämie-Reperfusionsverletzungen zu verhindern oder zu verringern. Wie bereits erwähnt, wird dieses Modell seit 1994 verwendet. Die Autoren hatten zuvor die positiven Wirkungen einer hypertonischen Kochsäureinfusion beim Spender8 bzw. Empfänger9 vor der Organbeschaffung bzw. im Implantat nachgewiesen. Darüber hinaus untersuchten die Autoren verschiedene Konservierungsprotokolle und -strategien, wie die Verwendung von Spendervergießen Blutinfusionen während der Kaltlagerung6 und die Wirkung der Insulinsupplementierung in die kardiopfiedische Lösung5.

Die hauptbeschränkung der hier beschriebenen Technik ist die kurzfristige Nachbeobachtung. Ein langfristiges Überlebensmodell für Diesameinasen wäre ressourcenintensiv und mit hohen Kosten verbunden. Das hier beschriebene Verfahren konzentriert sich auf akute Ischämie-Reperfusionsverletzungen und ist eine zuverlässige präklinische Methode zur Untersuchung neuartiger Interventionen, die in kleineren experimentellen Modellen wie dem murinen Modell getestet und validiert wurden. Darüber hinaus kann diese Technik leicht für längerfristige Folgeexperimente angepasst werden. Dies würde eine angemessene Heparin-Umkehr, Tierdekannierung, ausreichende Hämostase und Brustverschluss beinhalten.

Das Schweineherz wird oft als das anatomischähnlich dem menschlichen Herzen betrachtet, wenn großtierliche Modelle verwendet werden. Als solche, Es ist eine ideale Plattform, um Herzchirurgie Forschung durchzuführen. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass das Gewebe in der Regel als zerbrechlich und zerbrechlich beschrieben wird, vor allem im rechten Vorhof und der Lungenarterie, anfällig für Tränen14. Darüber hinaus gilt das Schweineherz als empfindlich gegen Manipulation enthoben und anfällig für Arrhythmien, weshalb Magnesiumsulfat zu Beginn des Experiments routinemäßig jedem Tier verabreicht werden muss. Ein wichtiger Unterschied zwischen dem Schweinemodell und der klinischen Herztransplantation ist die linke hämiazygote Vene in der Schweine, die direkt in die koronare Sinus abfließt. Dies muss während des Empfängerverfahrens geligiert werden, um kontinuierliche Blutungen zu vermeiden. Schließlich ist das Schweinemodell sehr empfindlich gegenüber Ischämie, was für akute Studien bei Herztransplantationen geeignet erscheint15.

Das Empfängermanagement nach der Transplantation kann manchmal eine Herausforderung sein. Es ist wichtig, alle Anastomosen zu überarbeiten und keine Blutungen zu gewährleisten. Ein besonders lästiger Bereich ist rund um die hintere Lungenarterie. Wie oben erwähnt, das Schweinegewebe und zerbrechlich und kann leicht reißen; Wenn dies geschieht, kann der Chirurg schnell wieder auf CPB gehen, um das Problem zu beheben und versuchen, wieder zu entwöhnen. Ventrikuläres Vorhofflimmern tritt in der Regel während der anfänglichen Reperfusion auf; Wenn dies nicht mit einfacher Defibrillation auflöst, können pharmakologische Eingriffe, wie 2 g Magnesiumsulfat oder 1 mg/kg Lidocain, verabreicht werden und eine anschließende Defibrillation angewendet werden. Normaler Sinusrhythmus kann leicht in weniger als 3 min erreicht werden.

Bei diesem Eingriff muss mindestens ein ausgebildeter Chirurg durchgeführt werden; darüber hinaus sind 3 bis 5 Experimente erforderlich, um das Protokoll innerhalb jeder Forschungsgruppe zu optimieren. Darüber hinaus sollte das Team ein Mitglied für die ausschließliche Durchführung von Tieranästhesie und Empfängermanagement bei Bedarf (z. B. inotrope Unterstützung) zuweisen. Aufgrund der wichtigen Überlegungen zum oben beschriebenen Schweinemodell sind bei diesem Verfahren folgende Schritte von entscheidender Bedeutung: Anästhesieind und Intubation (wichtig, um eine Verlängerung hypoxämischer Perioden zu vermeiden), Herzmanipulation enthoben, Kannulation für herzkarmonale Bypass, und rechte Vorhof und Lungenarterie Nery Manipulation und Anastomose. Da es sich jedoch um Routineschritte handelt, die in der klinischen Praxis durchgeführt werden, sollten sie mit Sorgfalt und Liebe zum Detail durchgeführt werden. Konsistenz und Wiederholung führen zu einem optimierten und zuverlässigen Modell für verschiedene Anwendungen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren haben keine Bestätigungen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amiodarone Purchased from institutional pharmacy
Angiocath 20G BD 381704
Calcium Chloride 1g/10ml Purchased from institutional pharmacy
Cardioplegia solution This should be chosen at the investigators discretion. 
Cautery Pencil Covidien E2515H
Central Venous Catheter double-lumen Cook Medical C-UDLM-501J-LSC
CPB pack Medtronic Custom-made cardiopulmonary bypass perfusion circuit.
D5W 5% 250ml Baxter JB1064
DLP Aortic Root Cannula/stabber Medtronic 12218
DLP single-lumen venous cannula (24F or 28F) This should be chosen at the investigators discretion. 
Dobutamine Purchased from institutional pharmacy
Electrode Polyhesive Covidien E7507
EOPA arterial cannula (17F or 21F) This should be chosen at the investigators discretion. 
Epinephrine Purchased from institutional pharmacy
Eppendorf Tubes, 1.5 mL Sarstedt  72.690.001
Gloves, nitrile, medium Fischer 27-058-52
Heparin 1000 IU/ml Purchased from institutional pharmacy
Ketalean (Ketamine) inj. 100mg/ml, 50ml/vial Health Canada Requires health canada approval
Lidocaine/Xylocaine 1% Purchased from institutional pharmacy
Magnesium Sulfate 5g/10ml Purchased from institutional pharmacy
Midazolam inj. USP 5mg/ml vial/10ml Health Canada Requires Health canada approval
MPS Quest delivery disposable pack Quest medical 5001102-AS
NACL 0.9% 1L Baxter JB1324
Organ Bag CardioMed 2990
Pipette Tips, 1 mL Fisherbrand 02-707-405
Propofol 1mg/ml Purchased from institutional pharmacy
Rocuronium Purchased from institutional pharmacy
Set Admin Prim NF PB W/Checkvalve Smith Medical 21-0442-25 Intravenous infusion pump line. Researchers should choose infusion lines compatible with the infusion pump available at their facilities
Set Intro Sheath 8.5FRx 10CM Arrow SI-09880
Sofsilk 0 wax coated Covidien S316
Solumedrol 500mg/5ml Purchased from institutional pharmacy
Suction tip Covidien 8888501023
Suction Tubing 1/4" x 120" Med-Rx 70-8120
Suture 5.0 Prolene BB Ethicon 8580H
Suture Prolene Blum 4-0 SH 36 Ethicon 8521H
Sutures 2.0 Prolene Blu M SH Ethicon 8523H
Sutures BB 4.0 Prolene  Ethicon 8881H
Tracheal Tube, 6.5mm Mallinckrodt 86449

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References

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