تصور ضعف الحواجز بطانية والدبقيه نيوروفاسكولار وحدة خلال النخاع الذاتية التجريبية في فيفو

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

نقدم هنا، بروتوكولات للتحقيق في الأضرار بوحدة neurovascular خلال النخاع الذاتية التجريبية المجراة. ونحن على وجه التحديد معالجة كيفية تحديد نفاذية حاجز الدم في الدماغ والنشاط جيلاتيناسي المعنية بالهجرة الكريات البيض عبر ليميتانس إطلاق.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. J. Vis. Exp. (145), e59249, doi:10.3791/59249 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وحدة neurovascular (NVU) تتألف من خلايا بطانية microvascular تشكيل حاجز الدم في الدماغ (BBB)، غشاء بطانية مع جزءا لا يتجزأ من بيريسيتيس، وليميتانس إطلاق تتألف من الغشاء الطابق السفلي متني وأستروسيتيك نهاية-تغذية تبني الجانب أبلومينال من ميكروفيسيلس الجهاز العصبي المركزي (CNS). بالإضافة إلى الحفاظ على الجهاز العصبي المركزي يتحكم التوازن NVU الاتجار بالخلايا المناعية في الجهاز العصبي المركزي. أثناء إيمونوسورفيلانسي للجهاز العصبي المركزي العدد المنخفض لتنشيط الخلايا الليمفاوية يمكن عبور حاجز غشائي دون التسبب في اختلال وظيفي BBB أو الأمراض السريرية. على النقيض من ذلك، أثناء نيوروينفلاميشن كما هو الحال في التصلب المتعدد أو نموذجها الحيواني النخاع الذاتية التجريبية (إي) عددا كبيرا من الخلايا المناعية يمكن أن يعبر بي بي بي، وبعد ذلك إطلاق ليميتانس في نهاية المطاف التوصل إلى حمة الجهاز العصبي المركزي وتؤدي إلى الأمراض السريرية. هجرة الخلايا المناعية إلى حمة الجهاز العصبي المركزي وبالتالي عملية من خطوتين ينطوي هجرة متسلسلة عبر حاجز غشائي والدبقيه NVU توظيف الآليات الجزيئية المتميزة. إذا بعد مرورهم عبر حاجز غشائي، خلايا تي اللقاء بهم مستضد المشابهة في ارتشاح خلايا مستضد تقديم ستبدأ إعادة تنشيط المحلية اللاحقة آليات تؤدي إلى تفعيل التنسيق جيلاتيناسيس، الذي سيتم تمكين الخلايا T لعبور الحاجز الدبقية وأدخل حمة الجهاز العصبي المركزي. وهكذا، تقييم BBB النفاذية ونشاط نظام التمثيل التناسبي المختلط في العلاقة المكانية لتراكم الخلايا المناعية في الجهاز العصبي المركزي خلال ع على حد سواء، يسمح بتحديد فقدان سلامة حواجز NVU بطانية والدبقيه. نعرض هنا كيفية حمل ع في الفئران C57BL/6 بالتحصين النشط وكيفية تحليل في وقت لاحق نفاذية BBB المجراة باستخدام مزيج من تتبع الفلورسنت خارجية. نحن تظهر كذلك، كيفية تصور وتعريب جيلاتيناسي النشاط في أدمغة ع حسب زيموجافي في الموقع بالإضافة إلى ستينينجس إيمونوفلوريسسينت BBB الطابق السفلي الأغشية والخلايا CD45 + الغازية المناعية.

Introduction

الجهاز العصبي المركزي (CNS) وينسق جميع الجسم والوظائف العقلية في الفقاريات، والتوازن في الجهاز العصبي المركزي ضروري لاتصال سليم للخلايا العصبية. التوازن CNS تبرره وحدة neurovascular (NVU)، الذي يحمي في الجهاز العصبي المركزي من الوسط تغير من مجرى الدم. NVU يتكون من خلايا بطانية ميكروفاسكولار الجهاز العصبي المركزي، وهي فريدة من نوعها المتحلل وإقامة حاجز الدم في الدماغ (بي بي بي) في الحديث المتبادل المستمر مع بيريسيتيس، أستروسيتيس، والخلايا العصبية، ومكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM)، إنشاء متميزة الطابق السفلي الأغشية1. الغشاء بطانية انشيثيس هذا الجانب أبلومينال لخلايا بطانية BBB تؤوي عددا كبيرا من بيريسيتيس، وهي تتألف من α4 لامينين و α5 لامينين، بالإضافة إلى أخرى بروتينات ECM2. على النقيض من ذلك، الغشاء متني يتكون من laminin α1 و laminin α2 وهو تبني بإقدام نهاية أستروسيتيك. الغشاء الطابق السفلي متني جنبا إلى جنب مع النهاية astrocyte-الأقدام يؤلف ليميتانس إطلاق يعزل شبكة الخلايا العصبية الجهاز العصبي المركزي من ارتشاح السائل الدماغي النخاعي شغلها أو تحت العنكبوتية ممنوع3. سبب بنية فريدة من نوعها NVU، خلية محصنة ضد الاتجار بالأشخاص إلى الجهاز العصبي المركزي متميزة من أن في الأنسجة المحيطية كما أنها تتطلب عملية من خطوتين مع الخلايا المناعية، أولاً خرق BBB بطانية، وبعد ذلك إطلاق ليميتانس من أجل الوصول إلى حمة الجهاز العصبي المركزي.

التصلب المتعدد (MS) هو مرض نيوروينفلاماتوري مشتركة للجهاز العصبي المركزي، فيها عدد كبير من الخلايا المناعية بتعميم أدخل الجهاز العصبي المركزي ويسبب نيوروينفلاميشن، demyelination، وفقدان التنسيق BBB سلامة4. فقدان سلامة BBB أوائل مميزة لمرض التصلب العصبي المتعدد، كما أشارت إلى وجود تباين غادولينيوم تعزيز آفات في الجهاز العصبي المركزي كتصور بالتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي)5. التسرب الكريات البيض في الجهاز العصبي المركزي تحدث على مستوى الأوردة بوستكابيلاري؛ ومع ذلك، تظل الآليات الدقيقة التي تشارك في ديابيديسيس الخلايا المناعية عبر غشاء الطابق السفلي BBB وحاجز الدبقية في وقت لاحق إلى استكشاف. النخاع الذاتية التجريبية (ع) بمثابة نموذج لحيوانات لمرض التصلب العصبي المتعدد، وقد ساهم مساهمة كبيرة في معرفتنا الحالية حول مرض التصلب العصبي المتعدد المرضية. على سبيل المثال، باستخدام نموذج إي أنه تم اكتشاف أن يحدث التسرب الكريات البيض في عملية متعددة الخطوات، بما في ذلك التقاط أولى والمتداول خطوة بوساطة سيليكتينس وجزيئات الميوسين الشبيهة مثل سيليكتين ف بروتين سكري [ليغند] (بسجل)-1، تليها إنتغرين-تعتمد على اعتقال الراسخ والزحف من خلايا تي على BBB خلايا بطانية للجانبين المتساهلة ديابيديسيس6.

مرة واحدة قد عبروا خلايا تي بي بي بي بطانية والغشاء بطانية، يحتاجون إلى اللقاء بهم مستضد المشابهة في الضامة أو الخلايا الجذعية استراتيجيا في المسافات ليبتومينينجيل أو ارتشاح مترجمة. يدفع هذا التفاعل إنتاج المحورية من الوسطاء المحترفين التحريضية الزناد تلك الآليات التالية اللازمة لغزو أنسجة الجهاز العصبي المركزي من الخلايا المناعية عبر إطلاق ليميتانس7،،من89. تفعيل التنسيق مصفوفة-ميتالوبروتيناسيس (MMP)-2 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-9 يغير التنشيط تشيموكيني ويؤدي إلى تدهور مستقبلات مصفوفة خارج الخلية في نهاية أستروسيتي-أقدام، وشرط مسبق للمناعة الخليوي الهجرة عبر ليميتانس إطلاق في حمة الجهاز العصبي المركزي، والحث على ظهور الأعراض السريرية من ع10،11.

الجمع بين الكشف عن الجهاز العصبي المركزي التسلل إلى الخلايا المناعية مع بي بي بي نشاط التسرب وجيلاتيناسي في مقاطع أنسجة الجهاز العصبي المركزي يوفر معلومات قيمة حول سلامة وظيفية حاجز غشائي والدبقيه في سياق neuroinflammation. على سبيل المثال، نحن مؤخرا التحقيق فقدان التأسيسي للجزيء الالتصاق هالة جزيء مفرق ضيق غشائي (جام)-ب في الاتجار بالخلايا المناعية في الجهاز العصبي المركزي في سياق إي. بالمقارنة مع صحية البرية من نوع C57BL/6 الفئران، أظهرت صحي المربي-ب-ناقص ليتيرماتيس ليس الأضرار بسلامة BBB كما هو موضح بتقييم نفاذية المجراة باستخدام تتبع الذاتية فضلا عن الخارجية12. في سياق ع، أظهرت الفئران جام-ب-ناقص C57BL/6 أعراض المرض يحسن، الذي ارتبط بمحاصرة الخلايا الملتهبة في ليبتومينينجيل وارتشاح ممنوع12. لدراسة هذه الظاهرة طبقنا في الموقع زيموجرافي، يسمح تحديد النشاط جيلاتيناسي لاختبار ما إذا كان انعدام النشاط جيلاتيناسي في جام-ب-ناقص الفئران قد تكون مسؤولة عن انخفاض عدد الخلايا المناعية قادرة على خرق إطلاق ليميتانس12.

نظراً للتوفر مختلف وراثيا الماوس النماذج التي تفتقر إلى مثل الجزيئات مفرق ضيق BBB المختلفة التي قد تتسبب في تغييرات في وظيفة بي بي بي، والمنهجيات اللازمة للتحقيق في سلامة BBB مهمان. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤثر الأدوية المطورة حديثا على الحواجز NVU. هنا نعرض كيفية حمل ع في الفئران C57BL/6 بالتحصين النشط مع بروتين سكري oligodendrocyte المايلين (موج)-الببتيد aa35-55 في مأمونية كاملة فروند. ثم نشرح كيفية تعريب تسلل الخلايا المناعية عبر حواجز بطانية والدبقيه NVU وكيفية دراسة سلامة المجراة في حاجز غشائي والدبقيه بالكشف في الموقع تتبع الخارجية والنشاط جيلاتيناسي، على التوالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع الدراسات أجريت في إطار المبادئ التوجيهية وفقا للتشريعات السويسرية لحماية الحيوانات، وقد وافق عليها "مكتب الطب البيطري" في كانتون برن، سويسرا (أرقام إذن: يكون 31/17 وأن 77/18).

1-الإسكان في الفئران C57BL/6 في الممرض محددة مجاناً (منتدى جنوب المحيط الهادئ) الشروط

  1. دورة البيت الفئران في أقفاص التهوية الفردية مع ح 12/12 الضوء الظلام. توفير الغذاء والمياه ليبيدوم الإعلانية. مراقبة الجودة الميكروبيولوجية للفئران، خضع الفوج التجريبية المراقبة الصحية الفصلية بالفراش قذرة الحراس بعد فيلاسا التوصيات13.
  2. استخدام اللكمات الإذن بمناسبة الأسبوع 8-12 القديمة الإناث C57BL/6 الفئران فردياً.

2-تحصين الفئران C57BL/6

  1. إعداد حلول14:
    1. ل Adjuvant (CFA إكمال فروند)، مزيج 30 مل Adjuvant "ناقصة فروند" مع 120 ملغ حرارة بيستليد طازجة إبطال بكتريا السل (H37RA) تحت غطاء دخان. حل تخزين المخزون عند 4 درجة مئوية.
    2. لحل الأسهم MOGaa35-55-الببتيد، حل MOGaa35-55-الببتيد في برنامج تلفزيوني العقيمة (4 مغ/مل) وتخزينها في-80 درجة مئوية.
    3. إعداد موج-المستحلب:
      1. تمييع 1:2 مع الحل الببتيد موج الأسهم في microtube 2 مل فرنكات الجماعة المالية الأفريقية.
      2. ختم microtube مع ختم الفيلم وإصلاحها في دوامة خلاط بالكامل الذي يغطي الأنبوب بشريط لاصق. مستحلب دوامة ح 4 في 4 درجات مئوية.
    4. إعداد المحاقن مع مستحلب ستابل:
      1. تأخذ microtube وتدور بسرعة إلى أسفل الطبقة الحساسة طاولة صغيرة للطرد مركزي باستخدام. جمع مستحلب في محقن باستخدام إبرة حقن 18 × 1 '' (1.2 ملم × 40 ملم).
      2. وفقا لعدد الفئران ضبط حجم مستحلب في المحاقن (100 ميليلتر في الماوس) واستبدال الإبرة ز 18 بإبرة حقن 27 × ¾ '' (0.4 مم × 19 مم). ختم إبرة حقن المرفقة للمحاقن مع ختم الفيلم.
    5. للسعال الديكي السمية (PTx) الأسهم الحل، حل 50 ميكروغرام من PTx المجففة بالتبريد في 500 ميليلتر من PBS العقيمة (100 نانوغرام/ميليلتر). حل تخزين المخزون عند 4 درجة مئوية.
    6. لحل العامل PTx، مزيج ميليلتر 97 من برنامج تلفزيوني العقيمة مع 3 ميليلتر PTx حل الأسهم (300 نانوغرام/100 ميليلتر) للماوس (لاستخدام الحقن داخل إبرة 30 x ½ '' (0.3 مم × 13 مم)).
  2. ع التعريفي
    1. تخدير الفئران C57BL/6 مع إيسوفلوراني باستخدام نظام المبخر. للحث على التخدير في الفئران، الكشف عن الماوس إلى 4.5% إيسوفلوراني في الأوكسجين في غرفة حضانة صغيرة قبل نقل الماوس إلى فاسيماسك مع إيسوفلوراني 2.1%. استخدم وحدة تخدير مجهزة بالتدفئة لوحة لمنع انخفاض حرارة الجسم الماوس.
    2. إصلاح الماوس أنيسثيتيزيد في يد واحدة وأول مرة حقن 30 ميليلتر من MOG35-55/CFA-مستحلب تحت الجلد في الساق الخلفية سطوح السفوح (الشكل 1:1 + 2؛ من مجموع 60 ميليلتر؛ والجناح الأيسر 30 ميليلتر والجناح الأيمن 30 ميليلتر) القرب من العقد اللمفية الاربية.
    3. ضع الماوس على البطن، وضخ 20 ميليلتر من MOGaa35-55/CFA-مستحلب في اليسار واليمين لينة الأنسجة الدهنية في جذر الذيل (الشكل 1:3 + 4؛ في مجموع 40 ميليلتر؛ والجانب الأيمن والجانب الأيسر ذيل الجذر 20 ميليلتر ذيل الجذر 20 ميليلتر) ومعالجة تجميعية قليلاً من MOGaa35-55/CFA-مستحلب int o رقبة الماوس (الشكل 1: 5).
    4. حقن 100 ميليلتر من حل PTx إينترابيريتونيلي في الماوس. عقد رئيس الماوس أسفل وسط الجسم تجنب حقن في الأمعاء.
    5. محل صيانة النظام الغذائي (المغذيات الرئيسية اكستروداتي: البروتين الخام 18.5% النفط الخام من الدهون 4.5% ألياف خام 4.5%؛ والرماد الخام 6.5 في المائة؛ والنشا 35%; الطاقة الأيضية: 13.1 مللي جول/كغ) إلى تربية النظام الغذائي (المغذيات الرئيسية اكستروداتي: البروتين الخام 23.5 في المائة؛ الدهون الخام 5.5% والألياف الخام 3%؛ الرماد الخام 5.7 في المائة؛ نشأ 36%؛ الطاقة الاستقلابية: 14.3 مللي جول/كغ) بغية تزويد الفئران بارتفاع محتوى الطاقة في الغذاء قبل وأثناء المرض السريرية المتوقعة.
    6. إزالة قناع الوجه ونقل الماوس إلى قفصة المنزل مع لوحة الاحترار. تأكد من أن الماوس مستيقظا تماما ومتحركة بعد 10 دقائق.
    7. كرر PTx الحقن (2.2.4) 48 ساعة بعد العلاج الأولى.

3-سجل من الفئران ع

  1. فحص الحالة الصحية للفئران ع كل صباح بإلقاء نظرة داخل الأقفاص.
  2. نقاط EAE الفئران بعد ظهر كل يوم.
  3. تستغرق كل الفأرة الفردية المدرجة في التجربة ع الخروج من القفص والاختيار ما إذا كان الذيل وقد تبطئ بتحريكه إلى الأعلى بواسطة إصبع. ماوس صحية سوف يتمادى ذيله (الذيل قد تبطئ). إذا كانت قد بدأت ع السريرية، سوف تبطئ الذيل السفلي، مرئية بانخفاض تدريجي من الذيل. في نهاية المطاف الماوس لن تكون قادرة على رفع ذيله على الإطلاق.
  4. ضع كل الماوس الفردية المدرجة في التجربة ع على مقاعد البدلاء نظيفة ومراقبة وتوثيق سلوك سيرا على الأقدام. انظر الجدول 115 للتهديف معايير لتقييم شدة المرض (ع نقاط).
  5. تقييم وتوثيق وزن الماوس كل المدرجة في هذه التجربة.
  6. لتأمين الغذاء الكافي، وامتصاص المياه من الفئران عرض ع سريرية النتيجة 1 الإمدادات الغذائية ترطب في صحن بلاستيك على الجزء السفلي من القفص وتحديث يوميا.

4. فحص نفاذية في الحية

  1. الأعمال التحضيرية للحلول:
    1. لحلول ديكستران المخزون، وحل 10 ملغ 10 كاتشين ديكستران أليكسا فلور 488، فضلا عن 3 كاتشين "ديكستران تكساس الأحمر" في 500 ميليلتر من محلول كلوريد الصوديوم 0.9% (20 ملغ/مل).
    2. لحل العامل ديكستران، فقط قبل الحقن بيبيت 55 ميليلتر من 10 كاتشين ديكستران أليكسا فلور 488 الأسهم الحل (20 ملغ/مل) على قطعة من ختم الفيلم وإضافة 55 ميليلتر من 3 كاتشين ديكستران حل الأسهم "الحمراء تكساس" (20 ملغ/مل). خلط وجمع 100 ميليلتر في محقن غرامة المتاح (تركيز نهائي 2 مغ/100 ميليلتر).
    3. لحل الأسهم 10% فورمالدهايد (PFA)، تجمع بين 10 غم من مسحوق إضافية نقية و 100 مل من برنامج تلفزيوني 200 ميليلتر من 1N هيدروكسيد الصوديوم في الكأس الزجاجية النظيفة والحرارة تصل إلى دقة 56 درجة مئوية تحت التحريك باستخدام محرض مغناطيسي؛ منهاج عمل بيجين الحفاظ على 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حتى يذوب تماما منهاج عمل بيجين؛ يبرد لدرجة حرارة الغرفة؛ ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.4؛ والتصفية من خلال عامل تصفية ورق. مخزن في-20 درجة مئوية. الحل الأسهم يمكن أن تضعف زيادة استخدام برنامج تلفزيوني.
  2. قريبا تخدير صحية C57BL/6 الفئران أو الفئران C57BL/6 يعانون من ع إيسوفلوراني (الماوس سيتم مخدراً حوالي 1 دقيقة). استخدام نظام الآلي كما هو الحال في خطوة 2.2.1 (الفئران سوف يتعرض إلى 4.5% isoflurane في الأوكسجين في دائرة التعريفي وثم نقل إلى فاسيماسك مع إيسوفلوراني 2.1%).
  3. ضع الماوس أنيسثيتيزيد في الموضع الأفقي في الجدول، ثم عن طريق الوريد (مثل الرجعية-أوربيتالي) بحقن 100 ميليلتر من الفلورسنت تتبع الماوس قبل أن يستيقظ الماوس.
  4. فورا إزالة facemask وتأكد من الفأر مستيقظا تماما ومتحركة بعد التخدير قصيرة. واسمحوا الراسم تعميم لمدة 15 دقيقة.
  5. المضي قدما في الخطوة 5، 1.

5-نضح فئران

  1. لتقييم نفاذية المجراة:
    1. بدء الإجراء 15 دقيقة بعد حقن الراسم الفلورسنت بتحريض التخدير isoflurane العميق. للحث على استخدام التخدير العميق في الفئران 2.3% إيسوفلوراني في الأوكسجين. استخدام مخلب انسحاب المعاكسة للحكم على عمق التخدير (قرصه الجلد بين أصابع القدم؛ والافتقار إلى الانحناء يشير إلى عمق كاف)، والتحقيق في ردود الفعل فوريليمب واللكتات في الفئران التي تعرضت إلى ع.
    2. إصلاح الماوس على ظهرها والرش البطن مع الإيثانول. فتح الصدر باستخدام مقص وإزالة الحاجز. فتح الاذين الأيمن من قلب ينبض باستخدام مقص ونتخلل الماوس عن طريق البطين الأيسر للقلب مع 10 مل من برنامج تلفزيوني تليها مل 10% 4 منهاج العمل في برنامج تلفزيوني.
      تنبيه: لتجنب استنشاق منهاج عمل بيجين، نتخلل الماوس في غطاء دخان.
    3. انتقل إلى القسم 6.
  2. زيموجرافي في الموقع :
    1. حمل التخدير العميق isoflurane استخدام isoflurane 2.3% في الأوكسجين في ماوس يعاني من ع، وتحقق من عمق التخدير كما في الخطوة 5.1.1.
    2. بعد ذلك، إصلاح الماوس على ظهرها والرش البطن مع الإيثانول. فتح الصدر باستخدام مقص وإزالة الحاجز. فتح الاذين الأيمن من قلب ينبض باستخدام مقص ونتخلل الماوس عن طريق البطين الأيسر للقلب مع 20 مل من برنامج تلفزيوني.
    3. انتقل إلى القسم 6.

6-تشريح وتجميد العقول

  1. إعداد حمام التبريد:
    1. ملء حاوية ديوار مسطحة مع الثلج الجاف المجروش وإضافة 2-ميثيلبوتاني (إيسوبينتاني) حتى يصل السائل إلى حوالي 1 سم فوق حزمة الجليد الجاف. تغطية مع غطاء فضفاض--مثلاً، تغطية دلو الجليد.
  2. مقطع قبالة رأس الماوس perfused مع مقص حاد وإزالة الجلد والاذنين باستخدام مجموعة أصغر من المقص.
  3. تشريح بعناية في قلنسوة بقطع من ماغنوم ثقبة نحو جبهة اليسار والجانب الأيمن يسمح ابفولد قلنسوة على الدماغ. ثم، بعناية انتشال الدماغ سليمة من قاعدة الجمجمة بينما قطع الأعصاب البصرية باستخدام ملعقة مسطحة معدنية.
  4. وضع الدماغ على رقائق الألومنيوم وقطع الدماغ في ثلاثة أجزاء (أمامي الدماغ، المخ الأوسط، والمخيخ + جذع الدماغ) بوضع تخفيضات الاكليلية اثنين.
  5. ملء كريومولد (25 مم × 20 مم × 5 مم) للربع الأول مع مصفوفة قطع (O.C.T.) ودرجة الحرارة المثلى ووضع شرائح المخ مع الجانب الأمامي من كل قطعة الدماغ التي تواجه هبوطاً في كريومولد وتغطي الأنسجة تماما مع مصفوفة O.C.T..
  6. ضع كريومولد مع الأنسجة في اتجاه أفقي في الحمام 2-ميثيلبوتاني وتأكد من أن الأنسجة يتجمد من الأسفل إلى الأعلى داخل 1 دقيقة عن طريق تجنب غمس كتلة الأنسجة كامل في الحمام.
  7. نقل الأنسجة المجمدة إلى-80 درجة مئوية للتخزين، والمضي قدما في الباب 7.

7-إعداد مقاطع الأنسجة المجمدة

  1. توازن درجة الحرارة من الأنسجة المجمدة من-80 درجة مئوية إلى-20 درجة مئوية في كريوستات لمدة 30 دقيقة.
  2. إزالة كتلة الأنسجة من كريومولد وجبل على حامل مناديل كريوستات (تعيين إلى-15 درجة مئوية) باستخدام مصفوفة O.C.T..
  3. تقليم حواف كتلة الأنسجة على الحامل كريوستات مشرط حاد، والبدء في قطع إلى كتلة الأنسجة عن طريق إزالة 20 ميكرومتر الأقسام مع السكين كريوستات حتى الأنسجة مرئياً.
  4. لتحليل المجراة في BBB النفاذية:
    1. قص 6-10 ميكرون أقسام الأنسجة وجمعها على الشرائح الزجاجية الالتصاق فورا صورة الأجزاء مغطاة بغطاء زلة استخدام مجهر الأسفار.
    2. تقييم ظهور الأوعية الدموية في الدماغ (إيلاء الاهتمام إلى حادة الحدود غير راشح الأوعية الدموية مقارنة بنشر أنماط الأسفار التي لوحظت بالنسبة للأوعية الدموية راشح). كمراقبة إيجابية، التحقق من تسرب التتبع إلى ستروما من أجهزة سيركومفينتريكولار أو الضفيرة شرويد التي تفتقر بي بي بي.
  5. زيموجرافي في الموقع :
    1. قص 6 أقسام الأنسجة ميكرومتر استخدام كريوستات وجمعها على الشرائح الزجاجية الالتصاق وتجميد أقسام الأنسجة في-20 درجة مئوية في صندوق تجميد يحتوي على هلام السليكا في الغطاء.

8-زيموجرافي في الموقع جنبا إلى جنب مع تلطيخ الفلورة laminin/CD45

  1. إعداد الحلول:
    1. إعداد الحل التضمين:
      1. مزيج ز 6 من الجلسرين (الصف التحليلية) ز 2.4 من بولي (الفينيل الكحول)، 6 مل من ddH2O ومل 12 0.2 M تريس المخزن المؤقت، درجة الحموضة 8، وآثاره (محرض المغناطيسية) الحل بالنسبة ح 4 في الرايت
      2. نقل الحل إلى أنبوب الطرد مركزي 50 مل والسماح لها بالراحة ح 2 في الرايت وفي وقت لاحق احتضان الحل لمدة 10 دقائق عند 50 درجة مئوية (حوض ماء) وجهاز الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 2,700 س ز في درجة حرارة الغرفة.
      3. تأخذ المادة طافية وتجميد في مختبرين في-20 درجة مئوية.
    2. إعداد الحل الجيلاتين البارد:
      1. حل 0.1 غرام جيلاتين البارد من الجلد البقري في 10 مل ddH2O.
      2. وليكن نقع لمدة يوم واحد على الأقل وتخزين مختبرين في 4 درجات مئوية.
    3. تحضير الميثانول المثلج (-20 درجة مئوية):
      1. وضع 100 ٪ الميثانول في جرة كوبلين وباردة إلى أسفل إلى-20 درجة مئوية.
    4. إعداد أزيد الصوديوم 10% محلول المخزون:
      1. ز 1 من أزيد الصوديوم بإضافة إلى 10 مل ddH2O وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
    5. إعداد حل عملي أزيد الصوديوم 0.1%:
      1. ميكس 99 ميليلتر من ddH2O مع 1 ميليلتر من أزيد الصوديوم 10% محلول الأسهم.
    6. حل 1 ملغ fluorescein مترافق تطفئ صبغ (DQ) الجيلاتين من جلد الخنزير في 1 مل أزيد الصوديوم تعمل 100 مختبرين ميليلتر الشمالية البالغة حل وتخزين محمية من الضوء في 4 درجات مئوية.
    7. حل 30 ملغ مونوهيدرات 1,10-فينانثروليني في 76 ميليلتر من الإيثانول ومخزن في-20 درجة مئوية.
    8. إعداد 25 × الحل مثبط البروتياز:
      1. إضافة قرص 1 من مثبطات البروتياز الحرة يدتا إلى 2 مل ddH2O. مخزن في-20 درجة مئوية.
    9. قبل الاستخدام، إعداد رد فعل الحل (150 ميليلتر في القسم):
      1. الطرد المركزي الحل الجيلاتين دي كيو 1 ملغ/مل لمدة 5 دقائق في 13,300 س ز.
      2. مزيج 127.2 ميليلتر ddH2O، 15 ميليلتر من 10 س رد فعل المخزن المؤقت (جيلاتيناسي/كولاجيناز "المقايسة طقم"؛ انظر الجدول للمواد)، 0.3 ميليلتر من الجيلاتين البارد 20 ملغ/مل، 1.5 ميليلتر من الجيلاتين دي كيو 1 ملغ/مل وميليلتر 6 من 25 × الحل مثبط البروتياز.
    10. قبل استخدام إعداد حل رد فعل سلبي السيطرة فينانتروليني (150 ميليلتر في القسم):
      1. ميليلتر 125.2 مزيج من ddH2O وميليلتر 15 من 10 x رد فعل المخزن المؤقت, ميليلتر 0.3 الجيلاتين البارد 20 ملغ/مل، 1.5 ميليلتر من الجيلاتين دي كيو 1 ملغ/مل، ميليلتر 6 من 25 x مثبط البروتياز يدتا الحرة 2 ميليلتر من م 2 1,10-فينانتروليني (MMP المانع).
    11. قبل الاستخدام، إعداد حل رد فعل السيطرة السلبية (غير الفلورية) الجيلاتين البارد (150 ميليلتر في القسم):
      1. 128.7 مزيج ميليلتر ddH2O، 15 ميليلتر من 10 س رد فعل المخزن المؤقت، 0.3 ميليلتر من الجيلاتين البارد 20 ملغ/مل وميليلتر 6 من مثبط البروتياز 25 x يدتا خالية.
    12. إعداد جسم الابتدائي كوكتيل كونتيرستاينينج، على سبيل المثال، 0.95 ميكروغرام/مل أرنب [بولكلونل] مكافحة لامينين جسم وجسم CD45 مكافحة الفئران [بولكلونل] 10 ميكروغرام/مل في جيش صرب البوسنة 1% في برنامج تلفزيوني، وإعداد التحكم المناسبة ايستب الكوكتيل جسم الأولية.
    13. إعداد حل جسم الثانوي، على سبيل المثال، 7.5 ميكروغرام/مل Cy3 الماعز لمكافحة الفئران + 15 ميكروغرام/مل AMCA أرنب المضادة في جيش صرب البوسنة 1% في برنامج تلفزيوني (حماية من الضوء).
  2. ذوبان الجليد 6 ميكرومتر الدماغ غير ثابت الأنسجة المقاطع من الفئران ع داخل مربع تجميد بلاستيكية تحتوي على هلام السليكا في الغطاء بغطاء دخان تجنب الاحتفاظ بالماء للأنسجة وفصل 2 أقسام الأنسجة على شريحة واحدة عن طريق رسم خطوط مع مياه صد القلم
  3. إعداد رد فعل الحلول (الخطوات 8.1.9-8.1.11)، والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في س 13,400 ز في درجة حرارة الغرفة، وقبل الحارة إلى 37 درجة مئوية باستخدام حمام مائي.
  4. ترطيب أقسام الأنسجة لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية باستخدام 1 س رد فعل المخزن المؤقت. ثم، من أجل إيقاف 1 س رد فعل المخزن المؤقت وإضافة حل رد فعل على قطاعات النسيج واحتضانها ح 4 في 37 درجة مئوية. تغسل شرائح 5 مرات في ddH2O.
  5. إصلاح الأبواب لمدة 5 دقائق مع الميثانول المثلج في-20 درجة مئوية وبعد ذلك يغسل المقاطع مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة.
  6. إضافة 1% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني للمقاطع واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (حماية من الضوء). ثم تجاهل جيش صرب البوسنة 1% في برنامج تلفزيوني من الفروع بواسطة التقليب الشرائح على الأنسجة وإضافة كوكتيل جسم الأولية واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة (حماية من الضوء).
  7. تغسل الأجزاء مرتين مع برنامج تلفزيوني وإضافة كوكتيل جسم الثانوية واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة (حماية من الضوء).
  8. تغسل الأجزاء مرتين مع برنامج تلفزيوني، جبل الشرائح مع تضمين الحل، اسمحوا المقاطع المحملة جاف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (حماية من الضوء). وأخيراً، تحليل المقاطع الأنسجة الملطخة باستخدام مجهر فلوري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ينبغي أن يؤدي تقييم لمسار السريرية إي في الفئران C57BL/6 في منحنى مرض كما هو مبين في الشكل 2 ألف والتغيرات في وزن الجسم الماوس النحو المبين في الشكل 2. الفئران C57BL/6 تحصين مع MOGaa35-55 وعادة ما تبدأ أعراض المرض حوالي 10-12 يوم بعد التحصين النشط (الشكل 1A). عادة، تظهر الفئران المحصنين قطره عابرة من وزن الجسم في اليوم التالي لحقن المستحلب والجرعة الأولى من السم السعال الديكي (الشكل 1B). من يوم 2 بعد التعريفي ع، من وزن الجسم الفئران المحصنين ثم يزيد تدريجيا حتى يبدأ المرض، عند وزن الجسم عادة يسقط يوم واحد قبل وضع الأعراض السريرية، وتواصل انخفاض مضاهاة لزيادة أعراض المرض (الشكل 1 أ،ب). يزيد من شدة المرض ع حتى ذروة المرض، يمكن أن يتوقع منه بين يومي 16 و 20 بعد التعريفي ع (الشكل 2A). في ذروة ع السريرية، تظهر الفئران أيضا أدنى وزن الجسم (الشكل 2)، مما يزيد في ارتباط بتحسين ع في مرحلة مغفرة المرض (الشكل 2 أ،ب). ع التعريفي في الفئران C57BL/6 استخدام نتائج MOGaa35-55 في علم أمراض أمراض مزمنة، والفئران عادة ما لم يتعافى تماما (الشكل 1A).

يظهر الشكل 3 ألف صورة تمثيلية الضفيرة تشورويد ولحمة الدماغ المتاخمة لماوس C57BL/6 يعانون من إي التي تم حقن الوريد مع كاتشين 3 نيون ديكستران (أحمر) و 10 كاتشين ديكستران (الأخضر) 15 دقيقة قبل التضحية ; تغيير حجم شريط 50 ميكرومتر. كما وقد أثبتنا سابقا، تتبع سهولة منتشر عبر ميكروفيسيلس فينيستراتيد إلى ستوما الضفيرة شرويد (الصورة اليسرى والأوسط)، بينما BBB لا تسمح بنشر تعميم تتبع إلى حمة الدماغ، بينت بخط متقطع (الصورة اليمنى)، وهو هكذا خاليا من أي إشارة الفلورسنت. ويبين الشكل 3B الأوعية الدموية راشح الممثل في المخيخ بالماوس C57BL/6 يعانون من ع التي تم حقن الوريد مع كاتشين 3 نيون ديكستران (أحمر) و 10 كاتشين ديكستران (الأخضر) 15 دقيقة قبل التضحية. رؤساء الأسهم تشير إلى تتبع تنتشر عبر ميكروفيسيلس الدماغ في حمة الجهاز العصبي المركزي (الصورة اليسرى والأوسط)، مما يوحي بأن الدالة BBB هو ضعف في هذه السفن. في حمة الجهاز العصبي المركزي، مرئياً إشارة الفلورية الخضراء والحمراء خارج جدران الأوعية الدموية، التي يشار إليها بخطوط متقطعة. في ع، في المخيخ حيث تظهر الأصفاد التحريضية تتبع يمكن أيضا العثور على ارتشاح مساحة بين الغشاء بطانية وليميتانس إطلاق تشير إلى فقدان الوظيفية غشائي BBB السلامة. إذا وجد الراسم منتشر في حمة الدماغ، ويبين الخلل إضافية من الجدار الدبقية12.

ويبين الشكل 4 صور الممثل لتحليل النشاط جيلاتيناسي (MMP) في دماغ إي الماوس C57BL/6 تصور زيموجرافي في الموقع والمترجمة إلى المقصورات حاجز الدماغ الخاصة بمكافحة البلدان laminin (أزرق)، وإلى وجود التهاب الخلايا تلطيخ الفلورة المضادة-CD45 (أحمر). انشقاق proteolytic تطفئ صبغ الجيلاتين (DQ) أونكوينتشيس إشارة فلوريسسين، والذي يسمح لتعريب نشاط جيلاتيناسي في قسم الأنسجة. عندما هو المحتضنة الجيلاتين البارد (عنصر تحكم غير الفلورية)، الأخضر لا يمكن الكشف عن إشارة مضيئة في أقسام الدماغ من الفئران ع (الصف العلوي) وكذلك في الأجزاء التي قد تم المحتضنة مع دي كيو-الجيلاتين جنبا إلى جنب مع فينانتروليني، الزنك قوية +- إلى عامل ونظام التمثيل التناسبي المختلط المانع (الصف الأوسط). في الصف السفلي، مرئياً الاتصال جيلاتيناسي/MMP النشاط كإشارة نموذجية fluorescence الأخضر الساطع الحبيبية، كما أبرزت رؤوس الأسهم. في الأصفاد التحريضية في المخيخ الماوس ع، يحدث نشاط محدد في نظام التمثيل التناسبي المختلط وراء إطلاق ليميتانس (الأزرق) في مواقع تسلل خلية التحريضية (أحمر).

Figure 1
الشكل 1 : تمثيل رسومي لمواقع حقن لتحريض ع. 1) موقع الحقن ل 30 ميليلتر موج-مستحلب في الجناح الأيمن، وموقع 2) حقن 30 ميليلتر موج-مستحلب في الجناح الأيسر، وموقع 3) حقن 20 ميليلتر موج-مستحلب إلى جذر ذيل الأيسر، 4) الحقن ل 30 ميليلتر موج-مستحلب إلى جذر ذيل الحق ، 5) الحقن لمعالجة تجميعية قليل من مستحلب موج في الرقبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : دورة الممثل من ع. (أ) أعراض المرض ع في الفئران C57BL/6 على مر الزمن. ويبين متوسط +/--ووزارة شؤون المرأة. (ب) تغيير وزن الجسم خلال ع على مر الزمن. ويبين متوسط +/--ووزارة شؤون المرأة.  الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : صورة تمثيلية من نفاذية المجراة في. (أ) الصورة اليسرى: أخضر نيون ديكستران كاتشين 10 على مستوى ضفيرة شرويد. منتصف الصورة: ديكستران كاتشين 3 الفلورسنت الأحمر على مستوى ضفيرة شرويد. الصورة الصحيحة: دمج الصور الأيمن والأيسر. مقياس بار 50 ميكرومتر. (ب) يسار الصورة: أخضر نيون ديكستران كاتشين 10 في المخيخ الماوس. منتصف الصورة: ديكستران كاتشين 3 الأحمر نيون في المخيخ الماوس. الصورة الصحيحة: دمج الصور الأيمن والأيسر. خطوط متقطعة إرشادية لجدران الأوعية الدموية؛ رؤساء السهم أشر إلى تتبع الفلورسنت في حمة الجهاز العصبي المركزي. مقياس بار 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : صور الممثل في الموقع زيموجرافي. العمود الأول: قناة الفلورية الخضراء (إشارة ملح تطفئ صبغ الجيلاتين (DQ)). العمود الثاني: القناة الفلورية الزرقاء (لامينين). العمود الثالث: قناة الأحمر نيون (CD45). العمود الرابع: دمج القنوات الفلورسنت. الصف العلوي: الرقابة السلبية الجيلاتين البارد (غير الفلورية). الصف الأوسط: الرقابة السلبية فينانتروليني (MMP-المانع). صف أدنى: الجيلاتين DQ. مقياس بار 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

النقطة 0 إلى 3 نقاط معايير تغيير الوزن
0 لا توجد علامات الوزن الطبيعي
~ ضعف الذيل (تبطئ ضعيفة)-معايير inhouse: لم تدرج في سجل موثق فقدان الوزن (الإرشادية للاختيار الثاني)
0.5 يعرج الذيل (ذيل قطرات) فقدان الوزن
1 ضعف هيندليج، مشيه متقلب (الماوس يمشي على مقاعد البدلاء مثل بطة) فقدان الوزن
2 هيندليج الشلل النصفي (لا يتحرك الماوس به هيندليمبس) فقدان الوزن الشديد (الإرشادية للاختيار الثاني)
3 هيندليج الشلل النصفيوفقدان سلس البول أقل هيئة الرقابة (شلالات الماوس إلى أحد جانبية ولكن يمكن أن تتحرك في القفص باستخدام فرونتليجس الخاصة العراقية + سلس؛ تحتضر) وزن الجسم منخفضة جداً (الإرشادية للاختيار الثاني)

الجدول 1: سجل معايير لتقييم شدة المرض ع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نقدم هنا، بروتوكولا للحث ورصد ع الإناث C57BL/6 الفئران. الإناث ويتم اختيار تفضيلي، وهناك نسبة نساء: الرجال 3:1 في مرض التصلب العصبي المتعدد. لتقييم مدى خطورة EAE، قدمنا استخدام ورقة سجل 3 نقاط. وسجل خطورة ع هو عموما فيما يتعلق بخطورة الاختلالات الحركية. الفئران مع تقدم مراحل ع، نستعرض أي نقاط أعلاه 2 ينبغي التضحية بها لتجنب المعاناة غير الضرورية للحيوانات. وبالتالي، فمن المستحسن نقاط الفئران في فترات إغلاق مثلاً مرتين يوميا كما هو موضح في البروتوكول.  وهناك عدة التهديف الروتينية المستخدمة، وردت إلى من 0-3 يشير إلى 0-616،17،،من1819 أو أكثر حتى سوببوينتس20نقطة. ومع ذلك، أننا أظهرنا سابقا أن سجل ع المكرر يفترض أن لا تؤدي إلى أي تحسن في تحديد فروق معتد بها إحصائيا المحتملة في عشرات المرض بين المجموعات، عند النظر في مدى خطورة المرض عموما15. استناداً إلى هذه الملاحظة أننا باستخدام الجدول 3 نقاط لتقييم تطور المرض في ع بغية الحد من الماوس وقت المعالجة والضائقة وهكذا للفئران تنفيذ القواعد 3R. هو إعداد نقطة حرجة أخرى استخدام طراز ع إلى دراسة الفروق بين خروج المغلوب والفئران البرية من نوع أو الاختلافات بين المجموعات المعالجة التجريبية التخطيط الدقيق. عند مقارنة الفئران البرية من نوع للفئران خروج المغلوب، من الضروري مقارنة ليتيرماتيس التي تنشأ من ماتينجس متخالف لضمان مطابقة الخلفيات الوراثية للفئران البرية من نوع والضربة القاضية بالمقارنة بالتجربة ع. من المهم أيضا للحفاظ على نفس الشروط لجميع الفئران المدرجة في تجربة، مثل التغييرات في قفص، وإدارة الغذاء الرطب، ولا سيما الماوس (الحالة الصحية) ظروف السكن. بغية تجنب قفص على حدة الظواهر الناجمة عن المحقق، ينبغي أن تجري عبر التحصين. أكثر دقة، إذا كانت هناك حاجة إلى حقنه واحدة أو أكثر لتحصين عدد معين من الفئران، ينبغي عشوائياً تكليفهم بالحقن المختلفة المستخدمة. هذا الأخير وبالمثل ينبغي أن تطبق للقيام بدراسات العلاج. أخيرا وليس آخراً، قد تؤثر على الحالة الصحية للفئران في مختلف مرافق الحيوانات في الإصابة بالمرض وشدتها وهكذا أكثر21 أو أقل متفطره22 قد تكون مطلوبة لحمل سليم السريرية المرض. وعلاوة على ذلك، قد تؤثر موقع الحقن في التنمية المرض. ونقترح في هذا البروتوكول لضخ كميات صغيرة نسبيا في خمسة مواقع مختلفة تحت الجلد: 30 ميليلتر في هذين الجناحين، 20 ميليلتر في اليسار واليمين ذيل الجذر، ومعالجة تجميعية قليلاً في الرقبة. في البروتوكولات الأخرى، يتم وضع 50 ميليلتر مستودعات تحت الجلد في ذيل الجذر فقط23 أو أربعة سطوح السفوح21. حقن مستودعات أصغر، بيد تقليل خطر التسبب في تهيج الجلد، قد حاول فيها الفئران إلى نقطة الصفر.

قد يتم تنفيذ نفاذية المجراة في تقييم BBB التسرب خلال ع ولكن أيضا لتقييم ما إذا كان حذف محددة الوراثية جزيء أو علاج من تعاطي المخدرات يؤثر على سلامة BBB المجراة. يمكن أن يكون هذا التغييب يقوم أما بالكشف عن تتبع البلازما الذاتية مثل الودائع مفتش12 أو الخارجية التي يتم تطبيقها في تداول الماوس على قيد الحياة24. قدمنا في هذا البروتوكول استخدام اثنين مختلفة خارجية تتبع (كاتشين 3 و 10 كاتشين ديكستران) التي تم حقن في وقت واحد والسماح بالتنقل لفترة محددة من 15 دقيقة باستخدام تتبع اثنين مع أحجام مختلفة تسمح لتحديد شدة بي بي بي الخلل، وقد تسمح لتعريف قطع لأحجام الراسم أنه منتشر أو لا عبر بي بي بي. ديكسترانس نيون السكريات ماء تتميز بقابلية الذوبان في المياه الصالحة للشرب والمنخفضة السمية، والمنخفضة نسبيا الاستمناع. وعلاوة على ذلك، ديكسترانس تتألف من بولي-(α-د-1.6 السكر)، ومقاومة للانقسام قبل جليكوسيداسيس الخلوية الذاتية. هنا استخدمنا ديكستران المتغيرات التي تحتوي على مخلفات يسين تدمج المتقارن ديكستران. ديكسترانس ليسيناتيد هي ألدهيد يمكن حلها، مما يسمح لإصلاح التتبع في الأنسجة. إلى جانب ديكسترانس المسمى فلوريسسينتلي، يمكن استخدام المواد الكيميائية الأخرى لتقييم المجراة في النفاذية، مثل هويشت صبغ في تركيبة مع الأزرق إيفان، الذي يربط جزء كبير ألبومين المصل. هويشت بقع نواة الخلية غشائي BBB بطانة ميكروفيسيلس الجهاز العصبي المركزي، والأزرق لايفان يمكن كشفها في الفضاء ارتشاح على الخلل بي بي بي وينشر كذلك عندما يكون ليميتانس إطلاق الانزعاج25،26. وفي المقابل، تقييم نفاذية المجراة في طريق تلطيخ إيمونوفلوريسسينت علامات الذاتية يوفر نظرة ثاقبة تراكم، مثل جزيئات ال IgG أو الفيبرينوجين، وبروتين سكري الذي يدور في الدم، ومع مرور الوقت. في ظروف صحية، الفضاء ارتشاح ضيقة جداً والغشاء بطانية وليميتانس إطلاق ترتبط ارتباطاً وثيقا و، وهكذا تصور حواجز ECM اثنين NVU يتطلب جسم محددة isoform laminin تلطيخ27 .

الذاتية مفتش الجزيئات حاضرا أثناء الصحة والمرض داخل الأوعية الدموية، وكذلك كما هو الحال في أنسجة أجهزة سيركومفينتريكولار، حيث هو لا بي بي بي ثابتة12. في الجينات بتعديل الفئران بعيوب الحاجز المخ، أثناء العلاج من تعاطي المخدرات، أو أثناء neuroinflammation الجزيئات الذاتية التي توزع عادة في الدم قد تودع في حمة الجهاز العصبي المركزي، التي يمكن تصور طريق كونتيرستينينج مع laminin مكافحة أما الاعتراف بجميع لامينين إيسوفورمس (laminin عموم الأجسام المضادة) أو الأجسام المضادة الخاصة isoform laminin مما يسمح بالتفريق بين لامينينس و α4 لامينين و α5 من الغشاء بطانية و laminin α1 و α2 laminin من إطلاق الأجسام المضادة ليميتانس. أثناء الظروف نيوروينفلاماتوري قد اتسعت مساحة ارتشاح بالتسلل إلى الخلايا المناعية مما يسمح بالتعرف على حد سواء، الغشاء بطانية وليميتانس إطلاق استخدام جسم laminin عموم. كونتيرستينينج من لامينينس الحاضرة في NVU يسمح بتقييم ما إذا كانت الذاتية ولكن أيضا تتبع الخارجية تودع في حمة الجهاز العصبي المركزي وكونتيرستينينج من CD45 يسمح بتقييم ما إذا كان التسرب المحورية من BBB يرتبط بالخلايا المناعية عمليات التسلل.

هجرة الخلايا المناعية إلى حمة CNS يتطلب عبور الحواجز مميزة اثنين داخل في NVU، BBB بطانية، وبعد ذلك ليميتانس إطلاق28متسلسلة. عبور بإطلاق ليميتانس ودخول الجهاز العصبي المركزي من الخلايا المناعية تتلازم مع بداية السريرية ع29، بينما الجهاز العصبي المركزي تسلل خلايا المحاصرين في ليبتومينينجيل وممنوع ارتشاح لا تؤدي ع السريرية. محاصرة الخلايا المناعية في الأماكن ليبتومينينجيل وارتشاح بين الأغشية الطابق السفلي وقد لوحظ في العديد من النماذج المعدلة وراثيا الماوس مثل سيليكتين ل خروج المغلوب الفئران30، تنف خروج المغلوب الفئران23، فئران مزدوج بالضربة القاضية MMP2/MMP910 ، و الفئران خروج المغلوب جام-ب12. تؤكد النتائج التي توصلت إليها هذه أن الافتقار إلى هذه الجزيئات لا تؤثر الهجرة الخلية المناعية عبر بي بي بي، ولكن بدلاً من ذلك عبر ليميتانس إطلاق، مما يؤكد وجود الجزيئية آليات وساطة الهجرة الخلية المناعية عبر بي بي بي وليميتانس إطلاق متميزة. الدماغ في الموقع زيموجرافي منهجية للتحقيق لنشاط gelatinase المحورية في قسم أنسجة بدقة العلاقة المكانية لأمراض الجهاز العصبي المركزي. الكشف عن المجراة في نفاذية BBB جنبا إلى جنب مع أداء زيموجرافي في الموقع للكشف عن النشاط MMP2/MMP9 مما يسمح لترسيم غشائي مقابل إطلاق الحاجز اضطراب في ارتباط بتسلل الخلايا المناعية. جنبا إلى جنب مع عموم laminin و CD45 الفلورة تلطيخ في أقسام الدماغ إي، فإنه يسمح التعريب لنشاط جيلاتيناسي أونقوينتشينج دي كيو-الجيلاتين وإضفاء الطابع المحلي على التسلل إلى الخلايا المناعية في نفس الوقت. أونكوينتشينج من فلوريسسين من النتائج دي كيو-الجيلاتين في إشارة نموذجية fluorescence أخضر الساطع حبيبية، بينما يعتبر بمثابة إشارة غير محدد12المناطق الفلورية الخضراء الخافتة غير مكتمل في أقسام الأنسجة. وهكذا، إجراء تقييم دقيق لأقسام الأنسجة والضوابط السليمة لا غنى عنها عند تنفيذ في الموقع زيموجرافي. في هذا البروتوكول، أجرينا في الموقع زيموجرافي في تركيبة مع CD45 وتلطيخ لامينين. كانت المحتضنة الابتدائي أضداد CD45 و laminin كمزيج في نفس الوقت. وبالمثل، كانت المحتضنة الأجسام المضادة الثانوية كمزيج في خطوة ثانية المصبوغة. مثل هذا الجمع من الأجسام المضادة يحتاج إلى اختبار للتأكد من أن تستوعب الأجسام المضادة المرحلة الثانية ضد IgGs الأخرى بغية تجنب ه.

أخذت معا، توفر البروتوكولات المقدمة هنا أدوات للتحقيق في تفاصيل أي عنصر NVU هو ضعف في ظروف نيوروينفلاماتوري ع. تقييم نفاذية المجراة في تتبع الخارجية يسمح لتحديد الأضرار الحالية بسلامة الخلية البطانية microvascular أو الأضرار الحالية NVU. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الأخذ بتتبع ذات أحجام مختلفة تقدير شدة ضعف بي بي بي. زيموجرافي في الموقع الإضافي يكشف النشاط gelatinase المحورية في astrocytes والخلايا يحتمل أن تكون تحريضية، الذي هو بحاجة إلى خرق ليميتانس إطلاق كحاجز آخر قبل الحصول على الوصول إلى الجهاز العصبي المركزي حمة10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وأعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ونعترف مع الامتنان Sorokin ليديا، الذي قد يشارك في بلدها الأصلي في الموقع زيموجرافي البروتوكول10 معنا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AMCA anti-rabbit antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-045 Store at 4 °C; protect from light
Anti-CD45 Antibody (30F11) Pharmingen 07-1401 Store at 4 °C
Anti-Laminin Antibody DAKO Z0097 Store at 4 °C
Breeding food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3336
Individually ventilated cages, Blue line Type II or III e.g. Tecniplast 1145T, 1285L
BSA fraction V Applichem A1391 Store at 4 °C
Cold gelatine Sigma-Aldrich G 9391
Coplin jar + rack e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG H554.1; H552.1
Cy3 anti-rat antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-144 Store at 4 °C; protect from light
Cover slips 24 x 40 mm # 1 e.g. Thermo Scientific 85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) e.g. Molecular probes D22910 Store at -20 °C; protect from light
Dextran Texas Red (3000 MW) Invitrogen D3328 Store at -20 °C; protect from light
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit  Thermo Fisher Scientific; EnzCheck E12055 Store at -20 °C; protect form light
Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) e.g. Janvier Labs Females, 8-12 weeks
Freezing box for histology slides e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 2285.1
18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304622
27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 302200
30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304000
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Santa Cruz Biotechnology sc-24648 Store at 4°C
Maintenance food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3436
MOGaa35-55 peptide e.g. GenScript Store at -80 °C
microscope slides (Superfrost Plus ) Thermo Scientific J1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA e.g. BD 231141 Store at 4 °C 
NaCl 0.9 % B. Braun 3535789
O.C.T. compound (Tissue-Tek ) Sakura 4583
Omnican 50 30G x ½’’ B. Braun 9151125S
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4
Pertussis toxin e.g. List biological laboratories, Inc. 180 Store at 4 °C
poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) Sigma-Aldrich 81381
Protease Inhibitor EDTA free (Roche) Sigma-Aldrich 4693132001 Store at 4 °C
repelling pen e.g. DAKO Pen e.g. DAKO S2002
sealing film e.g. Parafilm M e.g Sigma-Aldrich P7793
Silica gel e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 9351.1
Stitch scissor F.S.T 15012-12
syringe 1 ml e.g. PRIMO 62.1002
syringe 10 ml e.g. CODAN Medical ApS 2022-05
vaporizer system Univentor 400 UNO.BV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  2. Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
  3. Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
  4. Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113, (Pt 5), 1477-1489 (1990).
  5. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. (2017).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
  7. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
  8. Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
  9. Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
  10. Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
  11. Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
  12. Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
  13. Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48, (3), 178-192 (2014).
  14. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. (2014).
  15. Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
  16. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  17. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, Chapter 15 Unit 14 (2007).
  18. Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
  19. Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
  20. Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
  21. Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363 (2014).
  22. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
  23. Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
  24. Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
  25. Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
  26. Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
  27. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
  28. Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
  29. Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
  30. Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics