वुडबोरिंग बीटल के परिशिष्ट के लिए स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का नमूना तैयारी विधि

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Summary

अध्ययन में कीट सेंसिला, स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम और टीईएम, क्रमशः) नमूना तैयारी प्रोटोकॉल के अल्ट्रास्ट्रक्चर का निरीक्षण करने के लिए प्रस्तुत किया गया था। Tween 20 को सेम में नमूना विरूपण से बचने के लिए फिक्सेटिव में जोड़ा गया था । फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी TEM में टुकड़ा करने की क्रिया सटीकता में सुधार के लिए मददगार था ।

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Zhang, Y. R., Qiao, H. L., Ren, L. L., Wang, R., Lu, P. F. Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle. J. Vis. Exp. (156), e59251, doi:10.3791/59251 (2020).

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Abstract

इस रिपोर्ट में नमूना तैयारी विधियों का वर्णन किया गया है कि स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप टिप्पणियों, वुडबोरिंग बीटल, क्लोरोफोरस कैरागण Xie और वांग (२०१२) के उपांग तैयार करके प्रदर्शन किया, दोनों प्रकार के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए । स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) नमूना तैयारी प्रोटोकॉल नमूना रासायनिक निर्धारण, इथेनॉल स्नान, सुखाने और स्पंदन-कोटिंग की एक श्रृंखला में निर्जलीकरण पर आधारित था। स्थिर और वॉश समाधान में ट्वीन 20 (पॉलीऑक्सीएथिलीन सोर्बियन लॉरेट) जोड़कर, सेम में वुडबोरिंग बीटल की कीट शरीर की सतह को अधिक सफाई से धोया गया था। इस अध्ययन के ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) नमूना तैयार करने में निर्धारण, इथेनॉल निर्जलीकरण, राल में एम्बेडिंग, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, सेक्शनिंग और धुंधला होने सहित कई कदम शामिल थे। ट्वीन 20 सक्षम के साथ फिक्स्टिव वुडबोरिंग बीटल की कीट शरीर की दीवार को अधिक आसानी से प्रवेश करता है, जो ट्वीन 20 के बिना होता था, और बाद में बेहतर निश्चित ऊतकों और शरीर में अंगों को, इस प्रकार कीट सेंसिला अल्ट्रास्ट्रक्चर के स्पष्ट ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप अवलोकन मिले। इस तैयारी का अगला कदम लक्ष्य सेंसिला पोजिशनिंग की सटीकता बढ़ाने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके राल ब्लॉक में एम्बेडेड नमूने में कीट सेंसिला की स्थिति का निर्धारण करना था। यह टुकड़ा करने की क्रिया सटीकता में सुधार हुआ ।

Introduction

स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी कई आकृति विज्ञान अध्ययनों में एक महत्वपूर्ण उपकरण है, जो एसईएम सतह संरचनाओंको दिखाताहै1,2। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की अपील यह है कि इसका उपयोग नैनोमीटर पैमाने पर जैविक संरचनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, कोशिकाओं की वास्तुकला और ऑर्गेनेल्स के अल्ट्रास्ट्रक्चर से, मैक्रोमॉलिक्यूलर कॉम्प्लेक्स और प्रोटीन की संरचना तक। टेम आंतरिक संरचनाओं3,4,5दिखाता है ।

कोलोप्टेरा कीड़ों का सबसे बड़ा समूह है, जिसमें लगभग 182 परिवार और 350,000 प्रजातियां शामिल हैं। विशेष रूप से वुडबोरिंग बीटल में अधिकांश कोलोप्टरन कीड़े पौधों को खिलाते हैं, जिनमें से कई जंगलों और फलों के पेड़ों की महत्वपूर्ण कीट हैं, जिससे6पेड़ों को विनाशकारी नुकसान होता है। वर्तमान में, रासायनिक पारिस्थितिकी सिद्धांत पर आधारित कीटों की रोकथाम और नियंत्रण आबादी को बढ़ते ध्यान7प्राप्त हुए हैं । कुशल, कम विषैले, प्रदूषण मुक्त फेरोमोन नियंत्रण विधियां 8 का एक प्रभावीतरीकाबन गई हैं । सेंसिला आकृति विज्ञान और कीड़ों के अल्ट्रास्ट्रक्चर का अध्ययन कीट रासायनिक पारिस्थितिकी अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम और टीईएम, क्रमशः) का उपयोग उनकी आकृति विज्ञान और आंतरिक शरीर रचना विज्ञान का अध्ययन करने के लिए काफी प्रभाव के लिए किया जाता है। हालांकि, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) के लिए कीट के नमूने तैयार करने के दौरान, अवलोकन स्थल की वस्तुनिष्ठता और प्रामाणिकता9प्रभावित हो सकती है। सामान्य तौर पर, कीड़ों के एसईएम नमूना तैयार करने के लिए सफाई, ऊतक निर्धारण, निर्जलीकरण, मेटाथेसिस, सुखाने और स्पटर-कोटिंग10की आवश्यकता होती है। जटिल वातावरण के कारण जिसमें वुडबोरिंग बीटल रहते हैं, शरीर की सतह में अक्सर विभिन्न प्रदूषक होते हैं और उनके उपांगों में अक्सर कई ठीक लंबे सेंसिला या ब्रिस्टल होते हैं। विशेष रूप से, कुछ वुडबोरप्रयोगशाला स्थापना से उपलब्ध नहीं हैं, जो सीधे क्षेत्र में एकत्र होते हैं, और फिर ताजगी सुनिश्चित करने के लिए तरल पदार्थ को ठीक करने में डालते हैं और बाद में प्रयोगशाला में धोए जाते हैं। यदि नमूना पहले तय किया जाता है और फिर धोया जाता है, तो जाहिर है कि मलबे को हटाना बहुत अधिक कठिन है क्योंकि ग्लूटाराल्डिहाइड दृढ़ता से इसे नमूने में ठीक करता है। ट्वीन 20 एक सर्फेक्टेंट11,12,13,14है, जो धोने की प्रक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जिसमें पानी की सतह के तनाव को कम करना और कपड़े धोने की सतह पर पानी की गीलाता में सुधार करना शामिल है। इस अध्ययन में, ट्वीन 20 को तरल की सतह तनाव को कम करने के लिए फिक्सिंग समाधान और पीबीएस सफाई समाधान में जोड़ा गया था, और गंदगी को वुडबोरिंग बीटल के शरीर की सतह पर जमा करने से रोकता था, जिसने एसईएम में शरीर की सतह को क्लीनर बना दिया।

TEM का उपयोग करना, कीड़ों के विभिन्न अंगों पर सेंसिला को उनके अंदर स्पष्ट संरचनाओं को प्रकट करने के लिए कटा हुआ किया जा सकता है, इस प्रकार सेंसिला कार्यों का विश्लेषण करने के लिए एक आधार प्रदान करता है। जब लकड़ी की बीटल जैसे विषय कीट बड़ी होती है, और इसके शरीर की दीवार में स्क्लेरोटाइजेशन की पर्याप्त मात्रा होती है, इसलिए फिक्सिव कीट शरीर के अंदर अंग ऊतकों को पूरी तरह से संतृप्त नहीं कर सकता है। ट्वीन 20 गंदगी के फैलाव और निलंबन क्षमता को बढ़ा सकता है। इस अध्ययन में, ट्वीन 20 को वुडबोरिंग बीटल की कीट शरीर की दीवार में फिक्सेटिव द्रव प्रवेश को बढ़ाने के लिए फिक्सेटिव में जोड़ा गया था, जो एपिडर्मी11,12,13के विरूपण और पतन से बचता था। इसके अलावा, सामान्य टुकड़ा करने की तकनीक का उपयोग करके, विशेष रूप से कुछ छोटे सेंसिला15के लिए विभिन्न प्रकार के सेंसिला का सही पता लगाना मुश्किल है। पारंपरिक टेम नमूना तैयारी के आधार पर, इस अध्ययन ने एम्बेडेड ब्लॉक में कीट सेंसिला की स्थिति निर्धारित करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और एसईएम को संयुक्त किया, इस प्रकार टुकड़ा करने की सटीकता में सुधार हुआ।

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Protocol

सावधानी: उनका उपयोग करने से पहले अभिकर्ताओं की सामग्री सुरक्षा डेटा शीट से परामर्श करें। नमूना तैयार करने के दौरान उपयोग किए जाने वाले कई रसायन जहरीले, उत्पत्ति, कैंसरजनक, और/या रिप्रोटॉक्सिक हैं। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, पूर्ण लंबाई पैंट, और बंद-टो-शूज) का उपयोग करें और नमूने को संभालते समय एक धुएं के हुड के नीचे काम करें।

1. एसईएम नमूना तैयारी और इमेजिंग

  1. नमूना निर्धारण और सफाई
    1. एक ऐसे क्षेत्र में काम करना जहां सी कैरागना होते हैं, वयस्कों को पौधे आकर्षित करने वालों के साथ चारा क्षेत्र जाल में आकर्षित करते हैं, जैसे कि आइसोफोरोन16। 0.1 मोल एल-1 फॉस्फेट-बफरेड लवण (पीबीएस, पीएच 7.2), 2.5% (wt/vol) ग्लूटाराल्डिहाइड (एनहाइड्रोस ईएम ग्रैड), और 0.06% (vol/vol) ट्वीन 20 में वयस्क सी कैरागना के साफ शरीर को संरक्षित करें। सप्ताहांत में 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना ठीक करें।
    2. शरीर को संरक्षण तरल से निकालें और फॉस्फेट बफर में कुल्ला करें। स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके, उपांगों को हटा दें और 0.1 मोल एल-1 फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीएच 7.2) में 0.06% (vol/vol) ट्वीन 20 (PBST) के साथ अल्ट्रासोनिक रूप से (40 किलोहर्ट्ज) साफ करें। 100 एस के लिए सफाई के बाद, नमूना माइक्रोस्कोप को स्थानांतरित करने के लिए जांच अगर यह साफ था। सामान्य परिस्थितियों में, 400 के दशक के लिए साफ यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूना निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त साफ था और क्षतिग्रस्त नहीं था।
  2. नमूना निर्जलीकरण, बढ़ते और सुखाने
    1. 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, और 100% (सभी vol/vol) इथेनॉल में 20 मिन लगातार उपचार का उपयोग करके नमूनों को निर्जलित करें। एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, स्टब्स पर 3 अवलोकन सतहों (पृष्ठीय वेंट्रल और पार्श्व) को अलग से ठीक करने के लिए कार्बन डबल-तरफा चिपकने वाले टेप का उपयोग करें। ध्यान दें कि सभी देखने की सतहों को साफ और संदूषण से मुक्त रखा जाना चाहिए। 48 एच के लिए सिलिका जेल डेसिकेंट युक्त पेट्री डिश में नमूना चरण रखें।
  3. स्पंदन-कोट और नमूना प्रविष्टि
    1. हिताची कोकी (ई-1010) आयन स्पंदन उपकरण का उपयोग करना, मुख्य वाल्व को खुली स्थिति में घुमाएं, नमूना कक्ष कवर को हटा दें, और नमूना कक्ष में रखें। पावर स्विच चालू रखें, और तैयार प्रकाश चालू था। 45 सेकंड के रूप में बड़बड़ा समय सेट, और 70.875 Å के रूप में मोटाई कोटिंग। एक बार मैकेनिकल पंप वैक्यूम डायल इंडेक्स 7 से नीचे गिरा, डिस्चार्ज प्रेस और प्लेटिनम छिड़काव शुरू करते हैं । प्रयोग के अंत में, बिजली की आपूर्ति बंद कर दें और नमूना कक्ष से बाहर ले जाएं। स्प्रे फिल्म मोटाई: डी = KIVt ("डी" की इकाई में फिल्म की मोटाई है "Å"; कश्मीर "एक निरंतर है, स्पंदित धातु और गैस के आधार पर । उदाहरण के लिए, हवा का कश्मीर 0.07 है; "मैं" प्लाज्मा प्रवाह की इकाई एमए है; "वी" "केवी" की इकाई में लागू वोल्टेज है। "टी" सेकंड में समय है ।
    2. SEM के चरण पर नमूना युक्त स्टब डालें । सुनिश्चित करें कि नमूना स्टब के साथ नमूना चरण में एक अच्छी छवि की अनुमति देने के लिए पर्याप्त ऊंचाई थी। एसईएम सॉफ्टवेयर खोलें और 20 केवी से शुरू होने वाले एक वांछित ऑपरेटिंग वोल्टेज का चयन करें।

2. टेम नमूना तैयारी और इमेजिंग

  1. 1.1.1 और 1.1.2 चरणों में नमूना प्राप्त करें और ठीक करें।
  2. सफाई, माध्यमिक निर्धारण और निर्जलीकरण
    1. संरक्षण तरल से वयस्क सी कैरागण निकालें। स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके, उपांगों को हटादें, 3 घंटे के लिए पीएसटी में नमूनों को धोएं, और फिर उन्हें पीबीएस में 1% (wt/vol) ओस्मियम टेट्राऑक्साइड में 25 डिग्री सेल्सियस पर 1h के लिए ठीक करें । कमरे के तापमान पर 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, और 100% (सभी vol/vol) इथेनॉल में 20 न्यूनतम लगातार उपचार का उपयोग करके नमूनों को निर्जलित करें।
  3. रेसिन एम्बेडिंग और पॉलीमराइजेशन
    1. एक फ्लैट एम्बेडिंग मोल्ड्स में रेसिन में नमूनों को एम्बेड करें। नमूना थाली के तल पर था और अवकाश नाली के किनारे के रूप में संभव के रूप में बंद रखा गया था । लेबल को ब्लैंक में रखें फिर 72 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सैंपल वाली प्लेट को इनक्यूबेट करें। - इनक्यूबेटर से कैप्सूल निकालें और वेरिफाई करें कि रेसिन पॉलीमर हो गया था।
  4. नमूना धाराबाजी और धुंधला
    1. एक बार यह सुनिश्चित करने के बाद कि नमूना जम गया था, प्रत्येक रेसिन ब्लॉक को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और उन्हें नीली रोशनी के नीचे फोटोग्राफ करें। माइक्रोस्कोप के फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत को स्थानांतरित करें ताकि यह ऊपर से नमूना विकिरणित हो। रेसिन ब्लॉक में सेंसिला को स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। फोटो खिंचवाने और सेंसिला को लक्षित करने के लिए दूरी को मापने(चित्रा 1)
    2. पाल्प्स(चित्रा 2ए)की एसईएम छवि को देखें, और लक्ष्य रिसेप्टर(चित्रा 2बी)को बंद करने के लिए रेजर ब्लेड के साथ लगभग रेसिन ब्लॉक में कटौती करें।
    3. इसके बाद, नीली-हल्की फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, मोटे तौर पर कट राल ब्लॉक की तस्वीर, ऊपर से प्रकाश स्रोत को समायोजित करना ताकि सेंसिला को स्पष्ट रूप से मनाया जा सके। नीली रोशनी से उत्साहित हरी बत्ती ने अनुकूल अवलोकन बनाया। इमेजिंग करते समय, ऑब्जेक्टिव माइक्रोमीटर (DIV 0.01mm) को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप चरण में जोड़ा गया था, और फिर लक्ष्य की दूरी इमेजजे सॉफ्टवेयर (अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान)(चित्र ा 2सी)द्वारा मापी गई थी। छवि शासक एडोब फोटोशॉप CS5 (एडोब सिस्टम्स, इंक, सैन जोस, सीए, यूएसए) द्वारा बनाया गया था। फिर, अल्ट्रामाइक्रोटोम टुकड़ा करने की क्रिया के लिए, 50-60 एनएम स्लाइस मोटाई का उपयोग करके काटने की दूरी निर्धारित करें, जब तक कि लक्ष्य की स्थिति तक पहुंच नहीं गया था। लक्ष्य रिसेप्टर को इंगित करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें।
    4. फॉर्मवर-लेपित, 100-मेश कॉपर ग्रिड पर वर्गों को माउंट करें, यूरेनल एसीटेट और लीड साइट्रेट के साथ डबल-दाग।
      1. सबसे पहले, 50% मेथनॉल के 50 मीटर में 3.75 ग्राम यूरिनल एसीटेट जोड़ें। 10 मिन के लिए कमरे के तापमान पर मूत्र एसीटेट के संतृप्त समाधान की फ़िल्टर (0.45 माइक्रोन) सिरिंज के साथ दाग ग्रिड। प्रकाश प्रेरित उपजी को ब्लॉक करने के लिए धुंधला के दौरान कवर वर्ग। 50% मेथनॉल में 2x कुल्ला; 2x फ़िल्टर किया गया पानी।
      2. दूसरा, सेंट्रलाइज ट्यूब में डिगास्ड आसुत पानी के 10 मिलीग्राम में 0.02 ग्राम लेड साइटरेट जोड़ें। भंग करने के लिए 10 एन सोडियम हाइड्रोक्साइड, सील और शेक के 0.1 mL जोड़ें। उपयोग से पहले 8 मिन. सेंट्रलाइज के लिए सीसा साइट्रेट के समाधान के साथ दाग ग्रिड। सीसा कार्बोनेट उपजी के गठन को रोकने के लिए कार्बन डाइऑक्साइड मुक्त वातावरण में धुंधला किया जाना चाहिए। प्लास्टिक पेट्री व्यंजनों के वर्गों पर दाग की बूंदें रखें। डिगास ्ड फिल्टर किए गए पानी और सूखनेवाले 17में कुल्ला करें । उन्हें 80 केवी पर काम कर तेम के माध्यम से निरीक्षण करें।

Figure 1
चित्रा 1: एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप ने क्लोरोफोरस कैरागनाके उपांग को संलग्न करने वाले रेसिन ब्लॉक की फोटो खींची । (A)एंटीना रेसिन ब्लॉक; (ख)ओविपोसिटर के अंत में रेसिन ब्लॉक । तीर ने रेसिन ब्लॉक के किनारे का संकेत दिया; बिंदीदार सर्कल लक्ष्य सेंसिला को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सटीक सेंसिला स्थान विधि की प्रक्रियाएं। (क) क्लोरोफोरस कैरागनाके एक मैक्सिलरी पालप के चौथे उप-खंड, बिंदीदार सर्कल ने एसईएम द्वारा लक्षित सेंसिला को दिखाया ।(B)फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे गए सी कैरागना के एक मैक्सिलरी पालप का चौथा उप-खंड । सफेद तीर ने रेसिन ब्लॉक के मोटे तौर पर कट एज दिखाया और बिंदीदार सर्कल ने सटीक स्थान दिखाया । (ग)रेसिन ब्लॉक के किनारे से अधिकतम पालप लक्ष्य स्थान (इस नमूने में 28 माइक्रोन) तक चिह्नित दूरी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Representative Results

ट्वीन 20 के साथ सफाई और फिक्सिव समाधान का उपयोग करते हुए, क्लीनर एसईएम छवि ट्वीन 20(चित्रा 3)के बिना देखी गई थी। ट्वीन 20 फिक्सिंग समाधान ऊतक में ग्लूटाराल्डिहाइड फिक्सिंग समाधान में प्रवेश किया। माइक्रोट्यूबुल संरचना स्पष्ट रूप से देखी गई थी। नमूना की आंतरिक संरचना की TEM छवि ट्वीन 20(चित्रा 4)के बिना धुंधला हो गया था।

Figure 3
चित्रा 3: सेम के तहत क्लोरोफोरस कैरागण के एंटीना पर स्थित सेंसिला। ट्वीन 20(ए)और ट्वीन 20(बी)के बिना एसईएम छवि की तुलना, जिसने दिखाया कि तस्वीर ए सामान्य रूप से चित्र बी की तुलना में क्लीनर है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: क्लोरोफोरस कैरागना को लैबियल पाल्स पर सेंसिला टहनी बेसिकोनिका की ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा जाता है। ट्वीन 20(ए)और ट्वीन 20(बी)के बिना टेम छवि की तुलना। चित्र ए की माइक्रोट्यूबुल संरचना स्पष्ट है, जबकि तस्वीर बी की धुंधली है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

हमने सी के पाल्स पर सेंसिला के प्रकारों और अल्ट्रास्ट्रक्चर का अध्ययन करने के लिए एसईएम का उपयोग किया। कैरागण,10 उप-प्रकारों सहित 4 प्रकार के सेंसिला ढूंढना: 1 बोह्म के ब्रिस्टल (बीबी.), 3 सेंसिला चैटिका (Ch.1-Ch.3), 1 डिजिफॉर्म सेंसिला (डीआइजी), और 5 सेंसिला टहनी बेसिकोनिका (एस.टीबी.1-एस टीबी.5)(टेबल 1)। सेंसिला पहचान और अल्ट्रास्ट्रक्चर उनकी आकृति विज्ञान और आकार18,19,20,21,22,23पर आधारित था . हमारे नमूना तैयारी विधियों ने कीट सेंसिला की सतहों और आंतरिक अल्ट्रास्ट्रक्चर की स्पष्ट छवियां प्रदान कीं।

संख्या प्रकार लंबाई (μm)एक बेस पर व्यास (μm)एक दीवार टिप सॉकेट क्यूटिकुलर छिद्र वितरण
1 Bb. 5.18 ± 1.25 1.70 ± 0.47 चिकनी तेज विस्तृत नहीं मैक्सिलरी पालप, लैबियल पालप
2 चौधरी 1 38.59 ± 8.20 3.15 ± 0.84 ग्रूव तेज विस्तृत नहीं मैक्सिलरी पालप, लैबियल पालप
3 चौधरी 81.54 ± 18.07 3.75 ± 0.88 ग्रूव तेज विस्तृत नहीं मैक्सिलरी पालप, लैबियल पालप
4 चौधरी 3 282.06 ± 22.60 6.10 ± 0.70 ग्रूव तेज विस्तृत नहीं लैबियल पालप
5 खुदाई. 24.77 ± 2.98 1.24 ± 0.32 चिकनी कुंद विस्तृत नहीं मैक्सिलरी पालप
6 एस.टीबी.1 6.51 ± 1.01 2.31 ± 0.25 ग्रूव फलाव के साथ उठाया और तंग टिप पोर मैक्सिलरी पालप, लैबियल पालप
7 एस.टीबी.2 5.91 ± 0.90 2.24 ± 0.30 चिकनी कुंद उठाया और तंग टिप पोर मैक्सिलरी पालप, लैबियल पालप
8 एस.टीबी.3 6.84 ± 0.98 1.96 ± 0.35 चिकनी फलाव के साथ उठाया और तंग टिप पोर मैक्सिलरी पालप, लैबियल पालप
9 एस.टीबी.4 2.21 ± 0.59 2.86 ± 0.46 ग्रूव फलाव के साथ उठाया टिप पोर मैक्सिलरी पालप, लैबियल पालप
10 एस.टीबी.5 1.16 ± 0.29 1.05 ± 0.19 चिकनी कुंद उठाया और चौड़ा टिप पोर मैक्सिलरी पालप, लैबियल पालप

तालिका 1: सी कैरागानाके पाल्प्स पर सेंसिला के प्रकार।

सी कैरागाना पाल्प्स पर सेंसिला के अंदर अल्ट्रास्ट्रक्चर की जांच करने के लिए हमने टीएम का इस्तेमाल किया । इन अध्ययनों का एक उदाहरण मैक्सिलरी पाल्स पर एस टीबी.1 के खूंटी के निरंतर क्रॉस-सेक्शनल विचार थे। विचारों से पता चला है कि डेंड्रिटिक म्यान ने बाहरी डेंड्रिटिक सेगमेंट को घेर लिया और टिप पोर(चित्रा 5ए-डी)तक विस्तारित किया। सात अनब्रांच्ड बाहरी डेंड्रिटिक सेगमेंट आंतरिक रिसेप्टर लिम्फ गुहा के अंदर मौजूद थे, जो बाहरी गुहा(चित्रा 5डी)से घिरा हुआ था। ट्यूबलर शरीर को प्रत्येक सेंसिलर सॉकेट बेस(चित्रा 5ई)पर अन्य बाहरी डेंड्रिटिक सेगमेंट से एक डेंड्रिटिक म्यान द्वारा अलग किया गया था। सिलियरी क्षेत्र में, हमने विभिन्न व्यासों के 8 dendrites को नोट किया, जो 8 द्विध्रुवी न्यूरॉन्स की उपस्थिति का संकेत देता है। अंत में, सिलियरी सेगमेंट में 9 पेरिफेरल माइक्रोट्यूबबुल डबल्स(चित्रा 5एफ)शामिल थे।

Figure 5
चित्रा 5: एक क्लोरोफोरस कैरागना मैक्सिलरी पाल30पर सेंसिला प्रकार 1 टहनी बेसिकोनिका (S.tb.1) के TEM दृश्य । (A)एस टीबी.1 में अंजीर के लिए लिए लिए गए क्रॉस-सेक्शन के करीब बिंदीदार लाइनों के साथ। बी-ई। (ख)उंगली के आकार के फलाव का क्रॉस-सेक्शन बिखरे हुए क्यूटीकुला दिखा रहा है । (ग)उंगली के आकार के फलाव के बेसल क्षेत्र का क्रॉस-सेक्शन बाहरी डेंड्रिटिक खंडों के बिना आंतरिक रिसेप्टर लिम्फ गुहाओं को दिखाता है। (घ)खूंटी के मध्य क्षेत्र का क्रॉस-सेक्शन, जिसमें सेंड्रिटिक म्यान को आंतरिक गुहा में 7 बाहरी डेंड्रिटिक खंडों के साथ आंतरिक और बाहरी गुहा दोनों में विभाजित किया गया है। (ई)खूंटी का बेसल क्षेत्र एक डेंड्रिटिक म्यान से घिरा हुआ ट्यूबलर शरीर दिखाता है और बाहरी डेंड्रिटिक खंडों से अलग हो जाता है। एक टॉरमोजन सेल डेंड्रिटिक म्यान के बाहर बनाता है। (एफ)सिलियरी क्षेत्र का क्रॉस-सेक्शन जिसमें विभिन्न व्यासों के 8 dendrites दिखाई देते हैं । संक्षिप्त: बीबी, बेसल शरीर; सीएस, सिलियरी सेगमेंट; CW, क्यूनिकुलर दीवार; डीएस, डेंड्रिटिक म्यान; आईआरएल, आंतरिक रिसेप्टर लिम्फ गुहा; एम, माइक्रोट्यूब्यूल; एमआई, माइक्रोविली; ओडी, बाहरी डेंड्रिटिक सेगमेंट; ओआरएल, बाहरी रिसेप्टर लिम्फ गुहा; एस टीबी.1, टाइप 1 सेंसिला टहनी बेसिकिका; टीबी, ट्यूबलर शरीर; TH, thecogen सेल; करने के लिए, टॉरमोजन सेल; टीआर, ट्राइकोजन सेल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस लेख में, हमने वुडबोरिंग बीटल के लिए स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए एक नमूना तैयारी योजना प्रस्तुत की। एक प्रतिनिधि अध्ययन विषय के रूप में कीट उपांग का उपयोग करना, हमने पारंपरिक नमूना तैयारी विधियों पर कई सुधारों का प्रदर्शन किया।

ठोस सतह से अलग तरल तेल को छोटी बूंदों में पायस किया जाता है, जिसे वस्तु की सतह पर पुनर्जमा करने को कम करने के लिए धोने के माध्यम में अच्छी तरह से फैलाया और निलंबित किया जा सकता है। सर्फेक्टेंट के धोने के प्रदर्शन में सभी बुनियादी विशेषताएं शामिल हैं जैसे कि गीलापन, स्थायित्व, संपत्ति का पायस, फैलाव, घुलनशीलता11,12,13,14। गोल्डन नेमाटोड के इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म नमूनों की तैयारी पर विभिन्न डिटर्जेंट के प्रभाव से पता चला कि ट्वीन 20 में सबसे अच्छा सफाई प्रभाव था, इसके बाद सोडियम बाइकार्बोनेट, और आसुत पानी24था। इस अध्ययन में, हमने पाया कि ट्वीन 20 का उपयोग तरल की सतह के तनाव को कम करने के लिए किया जा सकता है, और गंदगी को कीट के शरीर की सतह पर जमा करने से रोका जा सकता है, विशेष रूप से खेत में सीधे एकत्र वुडबोरिंग बीटल के लिए। सेम में कीट शरीर की सतह को अधिक सफाई से धोया गया था। ट्वीन 20 के साथ फिक्सेटिव ने कीट शरीर की दीवार को अधिक आसानी से प्रवेश किया, और बाद में टीईएम में शरीर में बेहतर निश्चित ऊतकऔर अंग। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी नमूने तैयार करने में सर्फेक्टेंट का लाभ24, 25 ,26,27,28,29,30,31का व्यापक अध्ययन किया गया है .

इसके अलावा, हमने एसईएम नमूना तैयार करने के लिए एक संशोधित हवा-सुखाने की विधि अपनाई, जिसमें निर्जलित नमूना को एक पेट्री डिश में रखा गया था जिसमें सिलिका जेल डिसिडेंट होता है जो धीरे-धीरे निर्जलीकरण एजेंट को वाष्पित करता है। इस विधि का सबसे बड़ा लाभ यह है कि यह सरल है, आसानी से बनाए रखा है, और यह माइक्रोएनवायरमेंट हवा को सूखा रखता है और कोई विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं होती है। प्राकृतिक सुखाने की विधि बीज, अखरोट और कीट नमूनों के दीर्घकालिक संरक्षण के लिए एक सरल, व्यावहारिक और प्रभावी विधि है। हालांकि प्राकृतिक सुखाने की प्रक्रिया के दौरान नमूना मात्रा सिकुड़ती है, नमूना की बुनियादी आकृति विज्ञान32बनाए रखा जाता है। सामान्य तौर पर, कोलोप्टेरा कीड़ों में अपेक्षाकृत कम पानी की मात्रा होती है, और उनकी सतह हार्ड चिटिन दीवारों से घिरी होती है। एयर-ड्राई आवश्यकताओं को पूरा करने में सक्षम है। हालांकि, यह सुखाने की विधि एक बड़ी पानी की सामग्री के साथ ऊतकों के सूखने के लिए उपयुक्त नहीं है, जैसे कि लाउंज, पतंग और लार्वा, क्योंकि सतह तनाव सुखाने की प्रक्रिया के दौरान नमूना विकृत कर देगा।

उपांग की सतह पर वितरित सेंसिला के प्रकार और संख्या का निरीक्षण करने और गणना करने के लिए, उपांग के पृष्ठीय, वेंट्रल और पार्श्व पर विचार किया जाना चाहिए। कुछ सेंसिला कुछ, छोटे थे, और कभी-कभी सभी कोणों से ध्यान से कवर, स्कैन और निरीक्षण करते थे ताकि उन सेंसिला को पूरी तरह से एपिडर्मिस या अवसाद से उत्पन्न होने वाला पता चल सके। चूंकि कई सेंसिला अपेक्षाकृत लंबे और बाल थे, इसलिए टिप प्रभाव महत्वपूर्ण हो सकता है। इसलिए, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप त्वरण वोल्टेज बहुत अधिक नहीं होना चाहिए, 5-20kV सबसे अच्छा था और हमने 20kV का उपयोग किया।

टेम नमूना एम्बेडिंग में, नमूना बेहतर फ्लैट एम्बेडिंग मोल्ड्स खांचे के किनारे के करीब था ताकि जब पुनः उत्पादन ब्लॉक खुरदरा समय बचाने के लिए। पारंपरिक टेम विधि लगातार राल को काटने व्यापक है, और यह आमतौर पर ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप17,33का उपयोग करके आंख मूंदकर काट दिया जाता है। इस पर सुधार करने के लिए, हमने सबसे पहले कटौती के लिए लक्ष्य दूरी को देखने और मापने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके राल-एम्बेडेड ब्लॉकों में एक कीट सेंसिला स्थानीयकरण तकनीक का पता लगाया। पारंपरिक TEM ट्रिमिंग विधि के साथ तुलना में, यह तकनीक नमूना तैयारी समय बचा सकती है और लक्ष्य सेंसर का अधिक सटीक पता लगा सकती है। माप सॉफ्टवेयर के अभाव में, लक्ष्य दूरी को लगभग मापने के लिए देखने के क्षेत्र में एक छोटा शासक रखा जा सकता है। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ एक अल्ट्रामाइक्रोटोम का संयोजन काटने की प्रक्रिया की स्पष्ट टिप्पणियां प्रदान करता है, जो लक्ष्य सेंसिला और अन्य उपयुक्त विषयों की सटीक कटौती करता है।

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Disclosures

हमारे पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम बीजिंग वोकेशनल कॉलेज ऑफ एग्रीकल्चर की उदार सहायता की सराहना करते हैं, परमाणु ऊर्जा के आवेदन के लिए संस्थान (कृषि विज्ञान की चीनी अकादमी), बीजिंग वानिकी विश्वविद्यालय के जैव अनुसंधान केंद्र और प्रोफेसर शान-गन जूलॉजी संस्थान, चाइनीज एकेडमी ऑफ साइंसेज की झांग । इस शोध को चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2017YFD0600103), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 31570643, 81774015), चीन के लोक कल्याण में वन वैज्ञानिक अनुसंधान (201504304), इनर मंगोलिया द्वारा समर्थित किया गया था कृषि विश्वविद्यालय उच्च स्तरीय प्रतिभा अनुसंधान स्टार्टअप योजना (203206038), और इनर मंगोलिया स्वायत्त क्षेत्र उच्च शिक्षा अनुसंधान परियोजना (NJZZ18047), इनर मंगोलिया स्वायत्त क्षेत्र Linxue "डबल प्रथम श्रेणी" निर्माण परियोजना (170001)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anatomical lens Chongqing Auto Optical
limited liability company
1425277
Carbon adhesive tape SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc. 7311
Carbon tetrachloride Sigma 56-23-5
Copper grids GilderGrids G300
Disodium hydrogen phosphate Sinopharm group chemical reagent co., LTD 10039-32-4
Ethanol J.T. Baker 64-17-5
Flat embedding molds Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. 70900
Fluorescence microscope LEICA DM2500
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich 111-30-8 Anhydrous EM Grade
Isophorone Sigma 78-59-1
Lead citrate Sigma 512-26-5
Methanol Sigma 67-56-1
Monobasic sodium phosphate Its group chemical reagent co., LTD 7558-80-7
Objective micrometer Olympus 0-001-034
Osmium tetroxide Sigma 541-09-3
Petri dish Aldrich 1998
Razor blade Gillette
Resin Spurr ERL4221
Scalpel Lianhui GB/T19001-2008
SEM Hitachi S-3400
Silica gel desiccant Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd. 112926-00-8
Small brush Martol G1220
Sodium hydroxide Sigma 1310-73-2
Sputter ion instrument Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan E-1010
Stereo microscope Leica EZ4 HD
TEM Hitachi H-7500
Tween 20 Tianjin Damao Chemical Reagent 9005-64-5
Ultramicrotome Leica UC6
Ultrasonic cleaner GT Sonic GT-X1
Uranyl acetate Sigma 6159-44-0

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