تسلسل أشباه الموصلات للاختبار الوراثي قبل الزرع للأنوبلويدي

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هنا، نقدم طريقة تسلسل أشباه الموصلات للاختبار الوراثي قبل الزرع لaneuploidy (PGT-A) مع مزايا وقت التحول القصير، وانخفاض التكلفة، والإنتاجية العالية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Gui, B., Zhang, Y., Liang, B., Kwok, Y. K. Y., Lui, W. T., Yeung, Q. S. Y., Kong, L., Xuan, L., Chung, J. P. W., Choy, K. W. Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy. J. Vis. Exp. (150), e59273, doi:10.3791/59273 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وقد تم توثيق داء الأوبلومات، وهو أحد الأسباب الرئيسية التي تؤدي إلى توقف النمو الجنيني، أو فشل الزرع، أو فقدان الحمل، بشكل جيد في الأجنة البشرية. الاختبار الجيني قبل الزرع للأنوبلويد (PGT-A) هو اختبار وراثي يحسن بشكل كبير النتائج الإنجابية من خلال الكشف عن تشوهات كروموسومية للأجنة. يوفر الجيل التالي من التسلسل (NGS) نهجًا عالي الإنتاجية وفعال من حيث التكلفة للتحليل الوراثي، وقد أظهر قابلية التطبيق السريري في PGT-A. هنا، نقدم طريقة سريعة ومنخفضة التكلفة لتسلسل أشباه الموصلات القائمة على تسلسل NGS لفحص الأنوبلويد في الأجنة. الخطوة الأولى من سير العمل هي تضخيم الجينوم الكامل (WGA) من عينة الأجنة biopsied، تليها بناء مكتبة التسلسل، والتسلسل اللاحق على نظام تسلسل أشباه الموصلات. بشكل عام، بالنسبة لتطبيق PGT-A، يمكن تحميل 24 عينة وتسلسلها على كل شريحة تولد 60-80 مليون قراءة بمعدل طول قراءة يبلغ 150 زوجًا أساسيًا. توفر هذه الطريقة بروتوكولًا مكررًا لتنفيذ تضخيم القالب وإثراء مكتبة التسلسل، مما يجعل اكتشاف PGT-A قابل للتكرار، وعالي الإنتاجية، وموفر للتكلفة، وموفر للوقت. وقت تشغيل جهاز التسلسل أشباه الموصلات هذا هو 2-4 ساعات فقط، مما يقلل من وقت التحول من تلقي العينات إلى إصدار التقارير في 5 أيام. كل هذه المزايا تجعل من هذا القول طريقة مثالية للكشف عن الأنيوبلويدات الكروموسومية من الأجنة، وبالتالي، تسهيل تطبيقه على نطاق واسع في PGT-A.

Introduction

اختيار الأجنة ذات النوعية الجيدة القابلة للحياة مع أرقام نسخ كروموسوم طبيعية (euploid) لنقلها في الإنجاب المساعد يساعد على تحسين نتائج الحمل. تقليديا، يستخدم نظام الدرجات المورفولوجية الراسخة على نطاق واسع لتقييم الأجنة بسبب سهولة توافرها وطبيعتها غير الغازية. ومع ذلك، فقد ثبت أن التقييم المورفولوجي لا يمكن إلا أن توفر معلومات محدودة عن نوعية الجنين1 وإمكانية زرع2. أحد الأسباب الأساسية هو عدم قدرتها على تقييم التركيب الكروموسومي للأجنة.

الأنوبلويد الكروموسومات (عدد غير طبيعي من الكروموسومات) هو واحد من الأسباب الرئيسية المؤدية إلى توقف النمو الجنيني، فشل الزرع أو فقدان الحمل. وقد تم توثيق حدوث الأنوبلويدبشكل جيد في الأجنة البشرية، مما يمثل 60٪ -70٪ في الأجنة مرحلة الانقسام3و4 و 50٪ -60٪ في الكيسات الكيسية5. وقد ساهم هذا، إلى حد ما، في الاختناق في تحسين معدل الحمل من العلاج الإخصاب في المختبر (IVF)، الذي حافظ على حوالي 35٪ - 40٪6،7. ولذلك، يعتقد أن اختيار الأجنة اللمعة لنقلها مفيد لتحسين نتائج الحمل. ولهذا الغرض، تم تطوير الاختبارات الجينية قبل الزرع للزرع اللابصي (PGT-A) للتحقيق في جدوى الأجنة باستخدام النهج الوراثية. وهناك أعداد متزايدة من التجارب المعشاة ذات الشواهد والدراسات الأترابية التي تدعم الدور الحاسم لـ PGT-A. وقد ثبت أن تطبيق PGT-A يقلل من معدل الإجهاض ويزيد من معدلالحمل السريري ومعدل الزرع 8، ومعدل الحمل المستمر ومعدل المواليد الأحياء9.

تاريخيا، تم تطبيق أساليب مختلفة في PGT-A، مثل الفلورة في الموقع التهجين (FISH)، التهجين الجينومي المقارن (CGH)، صفيف-CGH، ومتعددة الأشكال النيوكليوتيد واحد (SNP) -microarray. وقد أشارت الدراسات السابقة إلى أن PGT-A للأجنة في مرحلة الانقسام من قبل FISH تسفر عن نتائج غير متسقة بشكل جيد مع تلك التي تم الحصول عليها عن طريق الفحص الكروموسومي الشامل (CCS) من الكيسات الكيسية المقابلة باستخدام 59273array-CGH أو SNP-microarray5927310. ويمكن أن تعزى هذه الاختلافات إلى الفسيفساء الكروموسومية، والتحف التقنية FISH، أو التصحيح الذاتي الجنيني لأخطاء الفصل الكروموسومي أثناء التنمية11. وقد تم الاعتراف على نطاق واسع أن استخدام الخزعات التروبسيتالسة الكيسية (TE) لPGT-A القائم على مجموعة مثل مجموعة-CGH أو SNP-microarray فعالة لتحديد اختلال التوازن الكروموسومي في الأجنة10،12. في الآونة الأخيرة، يوفر تسلسل الجيل التالي من الخلايا الواحدة (NGS) نهجاً عالي الإنتاجية وفعالاً من حيث التكلفة للتحليل الوراثي، وقد أظهر قابلية التطبيق السريري في PGT-A13،14،15،مما يجعلها بديل واعد للأساليب المتاحة حاليا.

هنا، نقدم طريقة سريعة وقوية ومنخفضة التكلفة تستند إلى تسلسل أشباه الموصلات لـ NGS لفحص الأنوبلويد في الأجنة البشرية. الخطوة الأولى من سير العمل هي تضخيم الجينوم الكامل (WGA) من عينة الأجنة biopsied، وذلك باستخدام مجموعة WGA خلية واحدة، تليها بناء مكتبة التسلسل، والتسلسل اللاحق على نظام تسلسل أشباه الموصلات.

من خلال الكشف عن H+ الأيونات التي يتم إطلاقها من كل إدراج ثلاثي الفوسفات deoxyribonucleoside أثناء تركيب حبلا الحمض النووي، ينقل النظام الإشارات الكيميائية (تغيير الرقم الهيدروجيني) التي تم التقاطها من قبل عناصر أشباه الموصلات لتوجيه البيانات الرقمية ، والتي يتم تفسيرها بشكل أكبر في معلومات تسلسل الحمض النووي. القضاء على الحاجة إلى الكشف البصري مكلفة وردود الفعل التسلسل معقدة، وهذا الكيمياء تسلسل بسيط يقلل من التكلفة الإجمالية للكاشف وتقصير تسلسل وقت التشغيل إلى 2-4 ساعات16. والأهم من ذلك، استناداً إلى مواصفات أداء الشركة المصنعة، يمكن لمنصة تسلسل أشباه الموصلات توليد بيانات تسلسل تصل إلى 15 غيغابايت (يعتمد على جودة المكتبة) لكل تشغيل، وهو أعلى بكثير من بعض التسلسلات الأخرى إنتاج بيانات حوالي 3-4 غيغابايت فقط (مع طول قراءة 2 × 75 نقطة أساس)17. في التطبيقات السريرية من PGT-A، يمكن لهذه المنصة تحقيق 24 عينة لكل رقاقة توليد ما يصل إلى 80 مليون يقرأ17 وما لا يقل عن مليون قراءة فريدة من نوعها من كل عينة. عمق القراءة يمكن أن يضمن أن كل عينة لديها على الأقل 0.05x تغطية الجينوم كله. المزايا المذكورة أعلاه من هذه المنصة تجعل ها طريقة الفرز المثالي، وبالتالي، تسهيل تطبيقاتها واسعة في PGT-A18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد منحت الموافقة الأخلاقية من قبل الجامعة الصينية المشتركة في هونغ كونغ-الأقاليم الجديدة الشرقية مجموعة البحوث السريرية لجنة (الرقم المرجعي: 2010.432). ووافق مجلس تكنولوجيا الإنجاب البشري في هونغ كونغ على ترخيص بحثي (رقم R3004).

1- تضخيم الجينوم الكامل

  1. قبل البدء، تحقق من حجم الخرز المغناطيسي (جدول المواد) للتأكدمنأن هناك ما لا يقل عن 135 درجة مئوية (مع فائض 20٪) لكل عينة. الحفاظ على الخرز المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة على الأقل. تجهيز دورة الحرارية (جدولالمواد)مع غطاء ساخن في 105 درجة مئوية.
    ملاحظة: ينبغي استخدام الإيثانول المعدحديثا 70٪ (جدول المواد) في غضون 3 أيام.
  2. إعداد العينات
    ملاحظة: في الممارسة الروتينية، يتم biopsied 5-10 خلايا التروبسيتوديرم من الكيسة الكيسية وفقا للمبدأ التوجيهي للممارسة19.
    1. تعليق الخزعات في 2 ميكرولتر من 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) في واحد 0.2 مل بوليميراز سلسلة رد فعل (PCR) أنبوب.
    2. تدور لفترة وجيزة أنبوب على جهاز طرد مركزي صغير لمدة 3 s لجمع قطرات.
  3. اللليس الخلوي والاستخراج
    1. إذابة العازلةاستخراج الخلية (جدول المواد) واستخراج إنزيم تخفيف العازلة (جدولالمواد)على الجليد، دوامة وتدور لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي صغير لمدة 3 ق قبل الاستخدام.
    2. إضافة 3 μL من المخزن المؤقت استخراج الخلية إلى كل أنبوب من الخطوة 1.2.2.
    3. إعداد 5 ميكرولتر خلية تحليل مزيج رئيسي لكل عينة عن طريق إضافة 4.8 ميكرولتر من استخراج إنزيمتخفيف العازلة و 0.2 ميكرولتر إنزيم استخراج الخلية (جدول المواد). يُمزج جيداً ويُخلط في كل أنبوب من الخطوة 1.3.2. الوجه أنبوب بلطف ولفترة وجيزة تدور على جهاز طرد مركزي صغير لمدة 3 s.
      ملاحظة: يجب أن لا تلمس تلميحات السائل الذي يحتوي على عينات الخلية عند إضافة المزيج الرئيسي.
    4. احتضان الأنبوب من الخطوة 1.3.3 في دورة الحرارية مع غطاء ساخن. تشغيل البرنامج مع الإعدادات التالية: 10 دقيقة في 75 درجة مئوية، 4 دقيقة في 95 درجة مئوية، وعقد في 4 درجة مئوية.
  4. التضخيم المسبق
    1. إذابة العازلة preamplification (جدولالمواد)على الجليد، دوامة وتدور لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي صغير لمدة 3 ق قبل الاستخدام.
    2. إعداد مزيج رئيسي 5 μL preamplification لكل عينة عن طريق إضافة 4.8 ميكرولتر من العازلة preamplification و 0.2 ميكرولتر من إنزيم preamplification (جدولالمواد). يُمزج جيداً ويُخلط في كل أنبوب من الخطوة 1.3.4. الوجه أنبوب بلطف ولفترة وجيزة تدور على جهاز طرد مركزي صغير لمدة 3 s.
      ملاحظة: يجب أن لا تلمس تلميحات السائل الذي يحتوي على عينات الحمض النووي عند إضافة المزيج الرئيسي.
    3. احتضان الأنبوب في دورة الحرارية مع غطاء ساخن. تشغيل البرنامج مع الإعدادات المتدفقة: 2 دقيقة في 95 درجة مئوية; 12 دورات ل 15 s في 95 درجة مئوية, 50 s في 15 °C, 40 s في 25 °C, 30 s في 35 درجة مئوية, 40 s في 65 درجة مئوية, 40 s في 75 درجة مئوية; عقد في 4 درجة مئوية.
  5. التضخيم
    1. إذابة العازلة تضخيم(جدول المواد) على الجليد، دوامة وتدور لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي صغير لمدة 3 ق قبل الاستخدام.
    2. إعداد مزيج رئيسي تضخيم 60 ميكرولتر لكل عينة عن طريق إضافة 25 ميكرولتر من التضخيم العازلة،0.8 ميكرولتر من إنزيم التضخيم (جدول المواد)، و 34.2 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكلات لWGA (جدولالمواد). يُمزج جيداً ويُخلط في كل أنبوب من الخطوة 1.4.3. الوجه أنبوب بلطف ولفترة وجيزة تدور على جهاز طرد مركزي صغير لمدة 3 s.
    3. احتضان الأنبوب في دورة الحرارية مع غطاء ساخن. تشغيل البرنامج مع الإعدادات التالية: 2 دقيقة في 95 درجة مئوية; 14 دورات ل 15 s في 95 درجة مئوية, 1 دقيقة في 65 °C, 1 دقيقة في 75 °C; عقد في 4 درجة مئوية.
  6. تنقية و منتجات WGA
    1. نقل كل منتج WGA من الخطوة 1.5.3 إلى أنابيب جديدة 1.5 مل. إضافة 112.5 درجة مئوية من الخرز المغناطيسي في كل أنبوب. دوامة وحضانة في RT لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: مزيج تماما الخرز المغناطيسي قبل الاستخدام.
    2. وضع الأنابيب على موقف المغناطيسي(جدول المواد) لمدة 3 دقائق حتى supernatant واضحة. تجاهل كل supernatant دون إزعاج الخرز.
    3. إضافة 300 درجة مئوية من الإيثانول 70٪ إلى كل أنبوب. تدوير كل أنبوب 180 درجة للسماح للحبات تشغيل من خلال الإيثانول وتدوير مرة أخرى إلى الموقف الأصلي. تجاهل كل supernatant بعد أن استقر الخرز دون إزعاج الخرز. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
      ملاحظة: الحفاظ على الأنبوب على الوقوف المغناطيسي أثناء تدوير الأنبوب أفقيا.
    4. تدور لفترة وجيزة كل أنبوب على جهاز طرد مركزي صغير لمدة 3 ق. ضع الأنابيب على موقف المغناطيسي حتى supernatant المتبقية واضحة. تجاهل كل supernatant المتبقية دون إزعاج الخرز. الهواء الجاف الخرز في RT لمدة 3 دقائق تقريبا.
    5. إزالة الأنابيب من موقف المغناطيسي وإعادة تعليق الخرز المجفف عن طريق إضافة 35 درجة مئويةمن منخفضة تريس-EDTA (TE) العازلة (جدول المواد). حضانة في RT لمدة 5 دقائق.
    6. ضع الأنابيب على الحامل المغناطيسي لمدة 3 دقائق حتى يصبح السوبر ة واضحًا. نقل جميع supernatant التي تحتوي على الحمض النووي المنسوب إلى أنابيب جديدة 1.5 مل دون إزعاج الخرز.

2- مراقبة جودة منتجات الفريق العامل المعني بالمنتجات

  1. قياس كل منتج WGA تنقية من الخطوة 1.6.6بواسطة فحص مقياس الفلور (جدول المواد) وفقا لدليل الشركة المصنعة باستخدام 1 ميكرولتر من منتج WGA كمادة البداية.
    ملاحظة: التركيز المقبول لمنتج WGA هو ≥ 10 نانوغرام/ميكرولتر. ولا يوصى بأي منتج دون هذه العتبة للمتابعة إلى الخطوات التالية.

3- تجزؤ منتجات الفريق العامل المعني بالمنتجات الزراعية

  1. قبل البدء، سخني سخان كتلة جافة إلى 37 درجة مئوية. إعداد 6 ميكرولتر (مع زيادة 20٪) من 0.5 M EDTA لكل عينة. استناداً إلى التركيز، aliquot 300 نانوغرام من الحمض النووي من كل منتج WGA تنقية في الخطوة 1.6.6 إلى أنابيب PCR 0.2 مل جديدة وجلب حجم إلى 16 درجة مئوية مع المياه الخالية من nuclease لكل أنبوب.
  2. التجزئه
    1. إعداد 4 μL مزدوجة الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل (dsDNA) تجزئة مزيجالتفاعل لكل عينة عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من dsDNA الشظايا رد الفعل العازلة (جدول المواد) و 2 ميكرولتر من إنزيمات تجزئة dsDNA (جدولالمواد). يُمزج جيداً ويُخلط في كل أنبوب من الخطوة 3.1. دوامة وتدور لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي صغير لمدة 3 ق. احتضان الأنابيب لمدة 25 دقيقة في 37 درجة مئوية في دورة الحرارية مع غطاء ساخن.
    2. إضافة 5 ميكرولتر من 0.5 M EDTA على الفور إلى كل أنبوب. مزيج جيدا عن طريق الدوامة وتدور لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي صغير لمدة 3 s.
  3. التنقية وإعادة التعليق
    1. نقل كل منتج من الخطوة 3.2.2 إلى أنابيب جديدة 1.5 مل. إضافة 37.5 درجة مئوية من الخرز المغناطيسي إلى كل أنبوب. يُمزج المزيج بدوار وحضانة في RT لمدّة 5 دقائق.
    2. تنقية المنتجات كما هو موضح من الخطوة 1.6.2 إلى الخطوة 1.6.4.
    3. Elute كل منتج تنقية كما هو موضح في الخطوتين 1.6.5 و 1.6.6 عن طريق إضافة 32 μL من المخزن المؤقت منخفض TE.

4 - تشييد المكتبة

  1. غير حادة- (هـ) nd (ص) epairment، واختيار حجم وتنقية
    1. إعداد مزيج إصلاح غير حادة 20 ميكرولتر لكل عينة عن طريق إضافة 9.5 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكل، 10 ميكرولتر من 5X نهاية إصلاح العازلة (جدولالموادأنبوب من الخطوة 3.3.3. دوامة وتدور لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي صغير لمدة 3 s.
    2. إضافة 50 درجة مئوية من الخرز المغناطيسي إلى كل أنبوب من الخطوة 4.1.1. دوامة وحضانة في RT لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: مزيج تماما الخرز المغناطيسي قبل الاستخدام.
    3. ضع كل أنبوب على الحامل المغناطيسي لمدة 3 دقائق حتى يصبح السوبر ة واضحًا. نقل جميع supernatant إلى أنابيب جديدة 1.5 مل حيث يتم إضافة 25 ميكرولتر الخرز المغناطيسي لكل. دوامة الأنابيب مع supernatant المنقولة وحضانة في RT لمدة 5 دقائق.
    4. تنقية المنتجات في الأنابيب الحاضنة كما هو موضح من الخطوة 1.6.2 إلى الخطوة 1.6.4.
    5. Elute كل منتج تنقية كما هو موضح في الخطوتين 1.6.5 و 1.6.6 عن طريق إضافة 32 μL من المخزن المؤقت منخفض TE.
      ملاحظة: هذه نقطة توقف آمنة; الحمض النووي النقي من هذه الخطوة مستقر عند 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 24 ساعة.
  2. محول (ل) الigation و ع محمد محمد
    1. إعداد مزيج ربط محول 17 درجة مئوية لكل عينة عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من المياه الخاليةمن nuclease، 5 ميكرولتر من 10X المخزن المؤقت الرباطي (جدول المواد)، 1 ميكرولتر من محول P1 (جدولالمواد)،و 1 ميكرولتر من الحمض النووي ligase (جدولالمواد). مزيج جيدا عن طريق دوامة لمدة 5 ليالي وتدور على جهاز طرد مركزي صغير لمدة 15 ث، وaliquot في كل أنبوب من الخطوة 4.1.5.
    2. إضافة 1 μL منالمحولات (جدول المواد) إلى كل أنبوب من الخطوة 4.2.1 وفقا لورقة عينة (ملف تكميلي: ورقة عينة لربط محول). دوامة وتدور لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي صغير لمدة 3 s. احتضان الأنابيب في RT (20-25 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة.
    3. إضافة 75 درجة مئوية من الخرز المغناطيسي إلى كل أنبوب من الخطوة 4.2.2. يُمزج المزيج بدوار وحضانة في RT لمدّة 5 دقائق. ثم قم بتنقية المنتجات كما هو موضح من الخطوة 1.6.2 إلى الخطوة 1.6.4.
    4. Elute كل منتج تنقية كما هو موضح في الخطوتين 1.6.5 و 1.6.6 عن طريق إضافة 15 μL من المخزن المؤقت منخفض TE. نقل جميع supernatant التي تحتوي على الحمض النووي المنسوب إلى شرائط جديدة 0.2 مل 8 أنبوب.
      ملاحظة: هذه نقطة توقف آمنة; الحمض النووي النقي من هذه الخطوة مستقر عند 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 24 ساعة.
  3. التضخيم والتنقية
    1. إعداد مزيج ماجستير تضخيم 50 درجة مئوية لكل عينة عن طريق إضافة 47.5 ميكرولتر من مزيج السوبر (جدولالمواد)و 2.5 ميكرولتر من مزيج التمهيدي (جدولالمواد). مزيج جيدا عن طريق دوامة وتدور لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي صغير، وaliquot في شرائط 0.2 مل 8 أنبوب من الخطوة 4.2.4.
    2. دوامة شرائط لمدة 30 s وتدور لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي صغير لمدة 3 s. احتضان شرائط في دورة الحرارية مع غطاء ساخن. تشغيل البرنامج مع الإعدادات التالية: 20 دقيقة في 72 درجة مئوية; 5 دقائق عند 95 درجة مئوية؛ 10 دورات ل 15 s في 95 درجة مئوية, 15 s في 62 °C, 1 دقيقة في 70 °C; 5 دقائق عند 70 درجة مئوية؛ عقد في 4 درجة مئوية.
    3. نقل كل منتج من الخطوة 4.3.2 إلى أنابيب جديدة 1.5 مل. إضافة 97.5 درجة مئوية من الخرز المغناطيسي إلى كل أنبوب. يُمزج المزيج بواسطة اللمعة والحضانة في RT لمدة 5 دقائق.
    4. تنقية المنتجات كما هو موضح من الخطوة 1.6.2 إلى الخطوة 1.6.4.
    5. Elute كل منتج تنقية كما هو موضح في الخطوتين 1.6.5 و 1.6.6 عن طريق إضافة 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت منخفض TE.

5- مراقبة الجودة والتخفيف من مكتبة الحمض النووي

  1. قياس كل مكتبة الحمض النووي المعدة من الخطوة 4.3.5 بواسطة فحص مقياس الفلورمتر وفقا لدليل الشركة المصنعة باستخدام 2 μL من مكتبة الحمض النووي كمادة البداية.
  2. التركيز المقبول لمكتبة الحمض النووي هو ≥ 0.5 نانوغرام/ميكرولتر وتركيز السيطرة الإيجابية (جدولالمواد)≤ 15 ng/μL. إذا كان تركيز السيطرة الإيجابية يختلف كثيرا ً من 15 نانوغرام/ميكرولتر، كرر التحديد الكمي للتحكم الإيجابي حتى يقترب التركيز من 15 نانوغرام/ميكرولتر. إذا كان تركيز المكتبة أقل من 0.5 نانوغرام/ميكرولتر، أعد تشغيله من التجزئة (القسم 3).
    ملاحظة: تأكد من أن تركيز التحكم الإيجابي يصل إلى القيمة المقبولة قبل قياس مكتبة الحمض النووي.
  3. تمييع كل مكتبة إلى 100 pmol عن طريق إضافة المياه الخالية من nuclease. إضافة 1 ميكرولتر من المكتبة إلى n μL من المياه الخالية من nuclease؛ حساب n باستخدام المعادلة أدناه:
    Equation
    حيث Q هو تركيز كل مكتبة تقاس باختبار مقياس الفلور و C هو تركيز السيطرة الإيجابية التي تقاس باختبار مقياس الفلور.

6- التسلسل

  1. قبل البدء، إعداد 48 درجة مئوية (مع فائض 20٪) من 1 M هيدروكسيد الصوديوم لكل عينة وأنبوب واحد خالية من النوكليس 1.5 مل. إذابة المزيج الرئيسيPCR العازلة (جدول المواد) (2000 € L في الحجم) في RT. جلب جزيئات المجال (جدولالمواد)إلى RT.
  2. تجميع المكتبات
    1. دوامة كل مكتبة مخففة من الخطوة 5.3 وتدور لفترة وجيزة 4X على جهاز طرد مركزي صغير لمدة 3 s في كل مرة. خذ 5 ميكرولتر من كل مكتبة لتجمع في أنبوب خالية من النوكليس 1.5 مل. دوامة مكتبة مختلطة وتدور لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي صغير لمدة 3 s.
  3. مستحلب PCR باستخدام نظام مستحلب
    1. إضافة 150 درجة مئوية من كسر الحلإلى 2 أنابيب الانتعاش الجديدة (جدول المواد). تثبيت أنابيب الاسترداد الجديدة، جهاز التوجيه الانتعاش ولوحة تضخيم.
    2. مزيج عن طريق عكس زجاجةالنفط (جدول المواد) 3 مرات. تأكد من أن كل منالنفط والانتعاش الحل (جدول المواد) على الأقل 2/3 كامل.
    3. دوامة الرئيسي مزيج PCR العازلة لمدة 30 ق وتدور لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي صغير لمدة 3 ق. دوامة جزيئات المجال والمكتبة المختلطة من الخطوة 6.2.1 لمدة 1 دقيقة وتدور لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي صغير لمدة 3 ق.
    4. إعداد مزيج الربط 2400 درجة مئوية عن طريق إضافة 172 ميكرولتر من المياه الخالية من nuclease، 8 ميكرولتر منمكتبة مختلطة من الخطوة 6.3.3، 120 ميكرولتر من مزيج الإنزيم (جدول المواد)، و 100 ميكرولتر من جزيئات المجال إلى الأنبوب الذي يحتوي على 2000 ميكرولتر الرئيسي مزيج PCR العازلة.
    5. تعيين ماصة إلى 800 درجة مئوية. استخدام ماصة 1000P لإضافة 200 درجة مئوية من زيت التفاعل إلى مرشح رد الفعل.
    6. حدد برنامج Proton: Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit، ثم حدد الزر المساعد للتأكد من أن الجهاز قد تم إعداده بشكل صحيح باتباع الإرشادات الموجودة على الشاشة. ثم انقر فوق التالي لبدء تشغيل البرنامج.
  4. التخصيب بواسطة نظام إثراء تلقائي
    1. عند اكتمال برنامج PCR مستحلب، انقر فوق التالي، ثم انقر فوق تدور النهائي لتدور لمدة 10 دقائق. إخراج أنابيب الاسترداد 2 بعد النقر فوق فتح الغطاء.
    2. تجاهل supernatant من أنابيب الانتعاش 2 حتى 100 ميكرولتر لا يزال في كل أنبوب، والتسمية وفقا لذلك. خلط الحل بشكل جيد ونقل إلى أنبوب جديد 1.5 مل.
    3. إضافة 200 درجة مئوية من المياه الخالية من nuclease إلى كل أنبوب الانتعاش، وغسل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات، ونقل كل حل إلى أنبوب 1.5 مل في الخطوة 6.4.2. كرر خطوة الغسيل مرة واحدة.
    4. إضافة 200 درجة مئوية من المياه الخالية من nuclease إلى واحد من أنابيب الانتعاش وغسل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات. نقل كل الحل إلى أنبوب الانتعاش الأخرى وغسل عن طريق pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. ثم نقل كل الحل إلى نفس أنبوب 1.5 مل من الخطوة 6.4.3. دوامة أنبوب 1.5 مل ل 30 s والطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 15500 × ز.
      ملاحظة: يجب أن يكون الحجم الإجمالي النهائي للمنتج PCR مستحلب في هذه الخطوة تقريباً 1200 μL.
    5. تجاهل supernatant في الأنبوب والحفاظ على 20 درجة مئوية من المنتج PCR مستحلب. إضافة 80 درجة مئوية منحل إعادة تعليق (جدول المواد) إلى الأنبوب. مزيج من الأنابيب صعودا وهبوطا.
    6. إعداد حل ذوبان 320 درجة مئوية لكل رقاقة عن طريق إضافة 280 ميكرولتر من البوليايثيلين غليكول السوربيتان حل مونولوريت (جدول المواد) و 40 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم.
      ملاحظة: ينبغي تخزين 1 M هيدروكسيد الصوديوم عند 4 درجة مئوية أو إعدادها حديثا. دوامة قبل الاستخدام.
    7. دوامة أنبوب يحتوي علىالخرز C1 (جدول المواد) لمدة 30 ق. خذ 100 ميكرو لتر من الخرز C1 إلى أنبوب جديد 1.5 مل. وضع أنبوب 1.5 مل على موقف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة في RT. تجاهل كل supernatant بعد أن استقر الخرز دون إزعاج الخرز.
    8. إضافة 1 مل من محلولالغسيل C1 (جدول المواد) إلى الأنبوب من الخطوة 6.4.7. دوامة لمدة 30 ق. وضع الأنبوب على موقف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة في RT. تجاهل كل supernatant بعد أن استقر الخرز دون إزعاج الخرز. إعادة تعليق الخرز عن طريق إضافة 130درجة مئوية من محلول التقاط حبة (جدول المواد).
    9. نظام التخصيب (ES) الإعداد
      1. تحميل العينة (100 ميكرولتر مستحلب PCR المنتج) من الخطوة 6.4.5، والخرز غسلها (130 درجة مئوية) منالخطوة 6.4.8، ES حل غسل (300 درجة مئوية) (جدول المواد)، وحل ذوبان قبالة (300 درجة مئوية) من الخطوة 6.4.6 في قطاع 8 أنبوب. ترتيب التخطيط هو: عينة (أنبوب 1)، والخرز غسلها (أنبوب 2)، ES حل الغسيل (أنابيب 3، 4، 5)، وحل ذوبان قبالة (أنبوب 7). إبقاء أنابيب 6 و 8 فارغة.
      2. ضع شريط 8 أنابيب من الخطوة 6.4.9.1 على ES. تثبيت طرف ماصة وأنبوب جديد 0.2 مل وبدء البرنامج.
        ملاحظة: تأكد من أن pipetting يعمل بشكل طبيعي.
    10. غسل جزيئات الكرة بعد الانتهاء من الإثراء.
      1. الطرد المركزي أنبوب 0.2 مل من الخطوة 6.4.9.2 لمدة 5 دقائق في 15500 × ز. تخلص من الـ supernatant وحافظ على 10 ميكرولتر من منتج التخصيب. إضافة 200 درجة مئوية من المياه الخالية من النوكل إلى الأنبوب. مزيج من دوامة.
      2. الطرد المركزي أنبوب 0.2 مل من لمدة 5 دقائق في 15500 × ز. تخلص من الـ supernatant وحافظ على 10 ميكرولتر من منتج التخصيب. إضافة 90 درجة مئوية من المياه الخالية من النوكل إلى الأنبوب. مزيج من دوامة.
  5. إعداد القالب
    1. دوامة السيطرة الإيجابية وتدور لفترة وجيزة. إضافة 5 ميكرولتر من التحكم الإيجابي إلى قالب 100 ميكرولتر (منتج الإثراء من الخطوة 6.4.10.2). دوامة والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 15500 × ز. تجاهل supernatant والحفاظ على 10 μL من القالب.
    2. إضافة 20 درجة مئوية منالتمهيدي التسلسل (جدول المواد) و 15 ميكرولتر من العازلة الصلب (جدولالمواد)إلى أنبوب قالب من الخطوة 6.5.1. دوامة أنبوب وتدور لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي صغير لمدة 3 s.
    3. احتضان الأنبوب من الخطوة 6.5.2 في دورة الحرارية مع غطاء ساخن. تشغيل البرنامج مع الإعدادات التالية: 2 دقيقة في 95 درجة مئوية، 2 دقيقة في 37 درجة مئوية، وعقد في 4 درجة مئوية.
    4. إضافة 10 μL منالمخزن المؤقت التحميل (جدول المواد) إلى الأنبوب من الخطوة 6.5.3. مزيج من الأنابيب صعودا وهبوطا.
  6. تهيئة جهاز التسلسل
    1. تحقق من ضغط خزان غاز النيتروجين (مجموع الضغط ≥ 500 رطل لكل بوصة مربعة، ضغط الإخراج ≥ 10 رطل لكل بوصة مربعة، الأمثل 20-30 رطل لكل بوصة مربعة). أعلى المتابعة 100 مل المياه منزوعة الأيونات (18.2 MΩ)إلى C1 و C2 أنابيب (جدول المواد) وتثبيتها على المراكز C1 و C2 المقابلة على المنظم.
    2. إعداد W1 (32 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم) وW3 (40-50 مل من W3 العازلة [جدول المواد]) الحلول. إعداد حل W2 عن طريق إضافة 1920 مل من المياه منزوعة الأيونات (18.2 MΩ)، وزجاجة كاملة من العازل W2 (جدولالمواد)و8−12 درجة مئوية من 1 M NaOH، وعكس 4−8 مرات للخلط.
      ملاحظة: لأن نوعية المياه تختلف جيولوجيا، وضبط حجم 1 M هيدروكسيد الصوديوم حسب الحاجة. درجة الحموضة الأولية من W2 هي 5.9−6.1، والنطاق الأمثل بعد التعديل هو 7.4-7.6. تغيير وتركيب أنابيب كاشف جديدة واستخدام رقاقة تستخدم في الآونة الأخيرة لغسل.
    3. إعداد 4 أنابيب فارغة جديدة من سلسلةملحق التسلسل (جدول المواد). تسمية الأنابيب الأربعة على أنها dGTP، dCTP، dATP، وdTTP، وإضافة 70 ميكرولتر من dGTP، dCTP، dATP، أو dTTP (جدولالمواد)إلى الأنبوب المقابل (أي 70 ميكرولتر dGTP إلى الأنبوب المسمى dGTP، وما إلى ذلك). دوامة الأنابيب قبل الاستخدام. تثبيت الأنابيب إلى المراكز المقابلة المعينة على المنظم (جدولالمواد).
  7. رقاقة غسل
    1. غسل رقاقة(جدولالمواد) مرة واحدة عن طريق حقن 100 درجة مئوية من isopropanol في بئر التحميل من رقاقة. إزالة السائل المطرود من البئر المعاكس.
    2. اغسل الرقاقة مرتين عن طريق حقن 100 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكلفيفي في بئر التحميل للرقاقة. إزالة السائل المطرود من البئر المعاكس.
    3. غسل رقاقة مرة واحدة عن طريق حقن 100 درجة مئوية من 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم في بئر التحميل من رقاقة. إزالة السائل المطرود من البئر المعاكس. حضانة في RT لمدة 1 دقيقة.
    4. اغسل الرقاقة مرة واحدة عن طريق حقن 100 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكلفيفي في بئر التحميل للرقاقة. إزالة السائل المطرود من البئر المعاكس.
    5. غسل رقاقة مرتين عن طريق حقن 100 درجة مئوية من isopropanol في بئر التحميل من رقاقة. إزالة السائل المطرود من البئر المعاكس. تجف عن طريق تهب النيتروجين على رقاقة. ابتعد عن الضوء
  8. تحميل العينات وتسلسلها
    1. خلط عينة 55 درجة مئوية من الخطوة 6.5.4 عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا وتحميل العينة إلى بئر التحميل من رقاقة.
      ملاحظة: الحفاظ على طرف ماصة وأنبوب PCR 0.2 مل المستخدمة في هذه الخطوة.
    2. وضع رقاقة على رقاقة الطردالمركزي مصغرة (جدول المواد) عندما
    3. إعداد اثنين من أنابيب جديدة 1.5 مل للحاجز الصلب ومحلول التنظيف. إعداد 50٪ حاجز الصلب عن طريق إضافة 500 درجة مئوية من العازلة الصلب و 500 درجة مئوية من المياه الخالية من nuclease. إعداد حل التنظيف عن طريق إضافة 500 درجة مئوية من العازلة الصلب و 500 درجة مئوية من 100 ٪ 2-بروبانول.
    4. إعداد اثنين من أنابيب جديدة 1.5 مل وإعداد خليط رغوة عن طريق خلط 49 درجة مئوية من50٪ العازلة الصلب و 1 ميكرولتر من محلول رغوة (جدول المواد) في كلا الأنابيب.
    5. تعيين ماصة إلى 100 درجة مئوية. جعل > 120 درجة مئوية من فقاعات والحفاظ على pipetting حتى لا يمكن رؤية فقاعات مرئية المعلقة. تحميل 120 درجة مئوية من الفقاعات في بئر التحميل.
      ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات مرئية المعلقة. وإلا، ابدأ من جديد.
    6. نقل السائل المطرود المفرط من الخروج جيدا من الخطوة 6.8.5 إلى بئر التحميل عن طريق الأنابيب. لا فقاعات ماصة. الطرد المركزي رقاقة لمدة 30 ق على رقاقة الطرد المركزي مصغرة.
    7. كرر الخطوة 6.8.5 باستخدام الأنبوب الثاني الذي يحتوي على خليط الرغوة من الخطوة 6.8.4.
    8. إضافة 55 μL من المخزن المؤقت الصلب 50% إلى أنبوب 0.2 مل الاحتفاظ بها في الخطوة 6.8.1. استخدم طرف الماصات المحتفظ به في الخطوة 6.8.1 للماصة صعودا وهبوطا. قم بتحميل كل المخزن المؤقت للصلب سعة 55 ميكرولتر إلى بئر التحميل. الطرد المركزي رقاقة لمدة 30 ق على جهاز الطرد المركزي رقاقة صغيرة معينة.
    9. تحميل 100 € L من حل دافق في رقاقة تحميل جيدا وتجاهل السائل طرد من الخروج جيدا. كرر خطوة التحميل هذه مرة واحدة.
      ملاحظة: إذا كان هناك فقاعات في رقاقة، طرد فقاعات صغيرة من فقاعات كبيرة وتدفق عن طريق مسح الحل. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق الأنابيب 100 درجة مئوية من محلول التنظيف وترك 5 ميكرولتر من الهواء تحت محلول التنظيف. لذلك، عند الأنابيب 105 € L في رقاقة، والهواء تشكيل فقاعة كبيرة التي يمكن طرد فقاعات صغيرة، وبعد ذلك، يمكن طرد فقاعة كبيرة من قبل الحل التنظيف التالية.
    10. قم بتحميل 100 ميكرو لتر من المخزن المؤقت للصلب بنسبة 50% في شحن الرقاقة بشكل جيد. كرر خطوة التحميل هذه لما مجموعه 3 مرات.
    11. إضافة 6 ميكرولتر من إنزيم التسلسل في 60 درجة مئوية من المخزن المؤقت الصلب 50٪ في أنبوب جديد 1.5 مل. مزيج من الأنابيب صعودا وهبوطا. تحميل 65 € L من هذا الحل مختلطة في رقاقة تحميل جيدا. ماصة ببطء لتجنب رغوة.
    12. إبقاء رقاقة بعيدا عن الضوء وحضانة في RT لمدة 5 دقائق.
    13. بعد الحضانة، قم بتحميل الشريحة على جهاز التسلسل مباشرةً وانقر فوق بدء تشغيل التسلسل على الشاشة لبدء التسلسل.
      ملاحظة: سيتم تحميل البيانات الأولية التسلسل وملفات مراقبة الجودة تلقائياً إلى الشركة لتحليل البيانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

واستناداً إلى هذا البروتوكول المعدل، كانت منصة تسلسل أشباه الموصلات تطبق لأول مرة على PGT-A. لقد اختبرنا الخزعات من كل من النازورات في مرحلة الانقسام والأجنة في مرحلة الكيسة الكيسية. ويقترح أن تخضع الخلايا الخزعية لـ WGA في أقرب وقت ممكن لمنع أي تحلل للحمض النووي. قارنت دراسة سابقة أداء أساليب WGA المختلفة وأشارت إلى أن الطريقة التي وصفناها هنا كان أفضل توحيد في حجم سلة من 100 كيلو بايت20. وبالنظر إلى أداء كل من التوحيد والفرق الثنائي المطلق الوسيط (MAPD)21، تم اختيار طريقة WGA هذه لPGT-A باستخدام جهاز التسلسل أشباه الموصلات. من خلال تحليل إحصائي بأثر رجعي على 186 مرحلة الانقسام و 1135 أجنة مرحلة الكيسة الكيسية، لاحظنا أن معدلات نجاح WGAكانت 95.4٪ في عينات البلاسطومير و 96.9٪ في عينات الكيسة الكيسية (الشكل 1). كانت خطوة التنقية قبل بناء المكتبة كإجراء اختيار الحجم حاسمة لتسلسل الجودة من خلال التقاط أجزاء الحمض النووي الكبيرة. وبالإضافة إلى ذلك، يسّر ذلك مبلغ المدخلات البالغ 300 نانوغرام لبناء المكتبة. مكّن أسلوب التجزئة الأنزيمي من القص الفعال لمنتجات WGA إلى حوالي 160 نقطة أساس.

وأُجري تحليل للبيانات باستخدام نظام تحليل المسافة والتقسيم الثنائي الدائري . تم إجراء التحقق من الصحة في المنزل لتقييم قوة خوارزمية المعلوماتية الحيوية هذه. أنشأنا قاعدة بيانات مرجعية حصرية لPGT-A من خلال تسلسل 379 منتجات WGA من 66 خطوط الخلايا مع أنواع الكاريوتايب المعروفة عن طريق تحليل حجم سلة من 100 كيلو بايت. من قاعدة البيانات هذه، تم تحديد نطاق مرجعي كعتبة استدعاء متغير رقم النسخ (CNV) وتم تعيين 10 ميغابايت كقطع لمستوى الكشف. وبلغت الحساسية والخصوصية أكثر من 99في المائة عند هذه العتبة (الجدول 1). في تطبيق PGT-A على الخزعات الجنين، تم تعيين حجم النافذة إلى 400 كيلو بايت مع نهج نافذة منزلقة للوصول إلى ما يكفي من القراءات. تم تحديد مراقبة الجودة (QC) لكل عينة من خلال قراءات فريدة من نوعها، MAPD والانحراف المعياري للمتغير رقم نسخة (CNV∙SD). تم تعريف عينة تتجاوز أحد الفهارس الثلاثة بأنها فشل مراقبة الجودة (الشكل2C). تم تفسير قطع الكروموسوم المبعثرة (الشكل2AأوB,D) من قبل علماء الوراثة المؤهلين بعد سير العمل من خلال مقارنة CNV المحدد بقواعد بيانات DECIPHER أو DGV أو ClinGen. وتمت السيطرة على الاختلافات الفردية من خلال إجراء علاج الخبراء. تم تجميع تشوهات الكروموسومات في الأنوبلويدوووية والفسيفساء في عينات الكيسة الكيسية. تم تصنيف كسب أو خسارة رقم نسخة في حدود 30% - 70% على أنها تحمل تركيبة كروموسومية فسيفساء؛ وإلا، فإن النتيجة سوف تفسر إما على أنها euploidy أو aneuploidy. في هذه الدراسة، كانت معدلات euploid 45.2٪ في blastomeres و 52.3٪ في الكيسات الكيسية، والتي ترددت للبيانات المنشورة22،23.

Figure 1
الشكل 1: الإحصاءات الديمغرافية لـ 1321 من الخزعات الجنينية التي تم اختبارها بواسطة هذه الطريقة. (أ) بيانات من 186 جنيناً في مرحلة الانقسام. (ب) بيانات من 1135 أجنة في مرحلة الكيسة الكيسية. معدلات نجاح WGA هي أكثر من 95٪ في كلا النوعين من العينات. تسلسل معدلات فشل مراقبة الجودة هي 3.4٪ في مجموعة مرحلة الانقسام و1.9٪ فقط في مجموعة المرحلة الكيسية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: النتائج التمثيلية للتطبيق السريري للجنين PGT-A لأزواج 23 من الكروموسومات. النتائج التمثيليةلـ (A) euploidy; (ب) أنوبلويدي (seq[GRCh37] (2)x3، (21)x3)؛ (C) فشل تسلسل مراقبة الجودة عينة بسبب CNV∙SD في 0.6571 (قبول ≤ 0.4)؛ (د) حذف الفسيفساء القطاعية (55%) من 4p16.3p15.1 (29.50 ميغابايت). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

قيمة عتبة CNV
(-0.23, 0.20) (-0.32, 0.26) (-0.41, 0.32) (-0.51, 0.37) (-0.62, 0.43) (-0.73, 0.48)
حساسيه 100.00% 100.00% 100.00% 100.00% 98.30% 96.02%
خصوصيه 72.41% 81.03% 91.38% 99.10% 99.54% 100.00%

الجدول 1: الحساسية والتحديد بين مختلف نسب تسجيل R بواسطة جهاز التسلسل شبه الموصلات. تم اختبار ما مجموعه 240 عينة مع نتائج نوع الكاريوتايد euploid المعروفة بواسطة هذا الأسلوب ودعا في نسب تسجيل R مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مختلفة من أخرى تسلسل كيمياء, يستعمل ال [سّرّل] يوصف هنا شبه موصّل للكشف من [نوكليوتيدس]. الرقاقة نفسها هي جهاز إلكتروني يكشف أيونات الهيدروجين عن طريق تأسيس قاعدة17التي يحركها البوليمرات ، والتي تمكن 2-4 ساعة وقت التسلسل من برنامج بروتون. إلى جانب ذلك، رقاقة هو رقاقة microwell التي تسمح توطين جزيء هدف واحد، والذي يختلف عن خلية تدفق تسلسل الكيمياء من قبل مقدمي التسلسل الأخرى. هذا البروتوكول هو بروتوكول معدل الأمثل لتطبيق PGT-A. ويشمل التحسين تجزئة الحمض النووي المتضخم من خلال الطريقة الأنزيمية بدلا من sonication للحد من فرصة التلوث، فضلا عن اختيار حجم ونظام PCR لأداء أفضل مع انخفاض التكاليف. بالإضافة إلى ذلك، في الإعداد السريري، استخدمنا خط أنابيب في المنزل التحقق من صحة لاستدعاء البديل.

وهناك خطوات حاسمة يجب أن تكون على علم بها أثناء هذه الممارسة. ويحتاج الإيثانول لأغراض التنقية إلى أن يُعد َّ طازجاً قبل التجربة، لأن التركيز العالي من الإيثانول من شأنه أن يسبب غسلاً غير كافٍ للحمض النووي الملوث في حين أن التركيز المنخفض من شأنه أن يتسبب في فقدان الحمض النووي المستهدف. يجب معايرة مقياس الفلورومتر بواسطة التحكم الإيجابي مع تركيز معروف لضمان الدقة. إلى جانب ذلك، تحميل كاف من القالب أمر بالغ الأهمية للتسلسل. فقاعات من الحجم الصحيح تساعد على دفع الكرة قالب لتقع في microwells، ولكن فقاعات كبيرة جدا قد يسبب التحميل غير كافية. يمكن للمستخدمين تعديل عدد العينات (وليس بالضرورة 24) ليتم تسلسلها لكل تشغيل. هناك 96 فهارس مصممة لهذه الشريحة. ولكن تسلسل عمق القراءة سوف ينخفض مع زيادة العينات لكل رقاقة. واحدة من المشاكل الأكثر شيوعا هو تركيز المكتبة منخفضة، والتي يمكن أن تعزى إلى انخفاض أو رديئة نوعية إنتاج الحمض النووي من تنقية بسبب الإيثانول المتبقية أو الخرز المغناطيسي، أو تكسير الخرز كما ذكر سابقا. كما قد ينتج ناتج الحمض النووي دون المستوى الأمثل عن انخفاض كفاءة الـ PCR، الذي يمكن تصحيحه عن طريق الإعداد الحذر للمزيج الرئيسي مع مدخلات عينة دقيقة وفحص درجة الحرارة للدراجات الحرارية. بالنسبة لتسلسل العينات الفاشلة في مراقبة الجودة، مثل تلك التي تحتوي على قيم عالية في النفثالينات (الشكل2C)،يوصى بتشغيل العينات على محلل حيوي لتحليل توزيع الحجم.

واحدة من القيود من هذا الأسلوب هو أعلى كاذبة واحد النيوكليوتيد معدل الدعوة بالمقارنة مع منصات أخرى. معدل الخطأ هو 1٪ مقارنة فقط 0.1٪ indel معدل إيجابي كاذبة من قبل التسلسلات الأخرى17. ومع ذلك، هذا ليس عاملا حاسما لاستدعاء CNV أو تحليل PGT-A. بالمقارنة مع منصات أخرى، وتطبيق نظام مستحلب يقلل من الاختلافات المنطوق وأخطاء الأنابيب، وزيادة جودة المكتبة. هذا هو ميزة كبيرة من طريقتنا بالمقارنة مع منصات أخرى لأن تركيز dsDNA منخفضة جداً ومطلوب تحديد كمية دقيقة لتجميع المكتبة التالية. أدخلت طريقتنا معايرة القياس الكمي الفلورمتر باستخدام التحكم الإيجابي القياسية للسيطرة على خطأ الكشف.

كمنصة الإنتاجية عالية مع وقت تحول قصيرة، وتسلسل أشباه الموصلات مثالية لPGT-A ويمكن تطبيقها على نطاق واسع لمرضى التلقيح الاصطناعي مع مؤشرات سريرية PGT-A مثل سن الأمومة المتقدمة24. أجرى Deleye وآخرون تسلسل متوازي من الكيسات الكيسية البشرية لمقارنة أداء المنظم أشباه الموصلات مع غيرها من التسلسلات25. وعلاوة على ذلك، حصلت مجموعة PGT-A هذه على "إجراء الموافقة الخاصة على الأجهزة الطبية المبتكرة" من إدارة الغذاء والدواء الصينية، وقد استخدمت سريريا لآلاف الأجنة. من حيث التكلفة، فإن سعر هذه المنصة هو نصف السعر لكل قواعد جيجا مقارنة مع منصة أخرى شائعة الاستخدام في سوق PGT-A. الخلايا التروبيكتوديرم يمكن أن تمثل بشكل موثوق الدستور الوراثي للجنين26. ويمكن تطوير هذه الطريقة لPGT لأمراض الجينات الأحادية/أحادية (PGT-M) كما أظهرت Treff وآخرون27. في نموذجها، أنها سهلت 300 ميغابايت إلى 1 غيغابايت الإنتاجية على PGT-M من 16 الخزعات الجنين ومقارنة النتائج إلى طريقتين PGT-M التقليدية. من خلال التقاط وتحميل 16 عينة، وصلت طريقتها إلى ما لا يقل عن 100X عمق القراءة من المنطقة المستهدفة وأدى إلى موثوقية 100٪ وreproducibility27. الإنتاجية من التسلسل أشباه الموصلات من قبل بروتوكول لدينا يمكن أن تصل إلى 15 GB وهناك 96 الباركود مصممة; لذلك، إذا طبقت على PGT-M المستهدفة، يمكن تسلسل عدد كبير من الخزعات الجنينية بواسطة رقاقة واحدة في عمق قراءة عالية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد حظيت هذه الدراسة بدعم من الصندوق العام للبحوث (المرجع رقم 14162417) من هونغ كونغ، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المرجع رقم 81860272)، وهي خطة البحوث الرئيسية لمؤسسة العلم والتكنولوجيا الإقليمية في غوانغشي (المرجع رقم 81860272). AB16380219)، ومنحة مؤسسة ما بعد الدكتوراه الصينية (المرجع رقم 2018M630993) من الصين.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PCR tubes, 0.2 mL Axygen PCR-02D-C
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 ThermoFisher 15575020
PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free ThermoFisher 10010023
1.0 M NaOH (1.0N) solution SIGMA-ALDRICH S2567 For Melt-off solution. Molecular grade
Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL Fisher Scientific 13-698-791
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or
Equivalent 18 MΩ water system
ThermoFisher 4474524
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
PicoPLEX WGA Amplification buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
PicoPLEX WGA Amplification enzyme Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion OneTouch Amplification Plate In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5
Ion PI Annealing Buffer
MyOne Beads Capture Solution
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939AA
Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) In kit: Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 ThermoFisher 65001
PicoPLEX WGA Cell extraction buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00.
PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion PI Chip Kit v3 ThermoFisher A26771
Ion Chip Minifuge, 230 V ThermoFisher 4479673
Ion PI dATP ThermoFisher A26772
Ion PI dCTP ThermoFisher A26772
Ion PI dGTP ThermoFisher A26772
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
ThermoQ–Temperature Dry Bath TAMAR HB-T2-A
NEBNext dsDNA Fragmentase New England Biolabs M0348L
NEBNext dsDNA Fragmentase New England Biolabs M0348L
Ion PI dTTP ThermoFisher A26772
Ion OneTouch 2 Instrument ThermoFisher INS1005527 ThermoFisher Catalog number: 4474778.
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
Ion One Touch ES ThermoFisher 8441-22 ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5
Ethanol SIGMA-ALDRICH 51976 This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol.
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01.
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02.
Qubit 3.0 Fluorometer ThermoFisher Q33216 This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226.
Qubit ds DNA HS Assay kit ThermoFisher M2002-02
Qubit Assay Tubes ThermoFisher Q32856
Ion PI Foaming Solution ThermoFisher A26772
Index for barcoding of libraries BaseCare this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517)
Ion PI Loading Buffer ThermoFisher A26772
Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer ThermoFisher 4389764
Agencour AMPure XP Kit Beckman Coulter A63880
DynaMag-2 magnet (magnetic rack) ThermoFisher 12321D
Ion PI Master Mix PCR buffer
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge Micro 17 75002430
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
Nuclease-free water ThermoFisher AM9922 This can be replaced by other brand.
PicoPLEX WGA Nuclease-free water Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion OneTouch Oil bottle Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252 Extended kit component in Sheet 3
double-strand DNA standard This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library.
PicoPLEX WGA Preamplification buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
PicoPLEX WGA Preamplification enzyme Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Library Amplification Primer Mix ThermoFisher 4471252 Extended kit component in Sheet 3
Ion OneTouch Reaction Filter Extended kit component in Sheet 5
Recovery Router Extended kit component in Sheet 5
Recovery Tubes Extended kit component in Sheet 5
ISP Resuspension Solution
Ion Proton ThermoFisher DA8600 This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610.
Ion PI Hi?Q Sequencing Polymerase ThermoFisher A26772
Ion PI Sequencing Primer
server for sequencer Lenovo T260
Ion PI Sphere Particles
Platinum PCR SuperMix High Fidelity ThermoFisher 4471252
Nalgene 25mm Syringe Filters ThermoFisher 724-2045 Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids.
Ion PI Hi?Q W2 Solution ThermoFisher A26772
Ion PI 1X W3 Solution ThermoFisher A26772
Ion OneTouch Wash Solution C1
The Ion PGM Hi?Q View Sequencing Kit ThermoFisher A30044 Extended kit component in Sheet 2
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252 Extended kit component in Sheet 3
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) ThermoFisher A26772 Extended kit component in Sheet 4
Ion PI Hi?Q OT2 200 Kit ThermoFisher A26434 Extended kit component in Sheet 5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balaban, B., Urman, B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reproductive BioMedicine Online. 12, (5), 608-615 (2006).
  2. Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: An observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29, (6), 1173-1181 (2014).
  3. Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A. P. Chromosomal abnormalities in embryos. Molecular and Cellular Endocrinology. 183, 29-34 (2001).
  4. Trussler, J. L., Pickering, S. J., Ogilvie, C. M. Investigation of chromosomal imbalance in human embryos using comparative genomic hybridization. Reproductive BioMedicine Online. 8, (6), 701-711 (2004).
  5. Fragouli, E., et al. Cytogenetic analysis of human blastocysts with the use of FISH, CGH and aCGH: Scientific data and technical evaluation. Human Reproduction. 26, (2), 480-490 (2011).
  6. Calhaz-Jorge, C., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2013: Results generated from European registers by ESHRE. Human Reproduction. 32, (10), 1957-1973 (2017).
  7. Dyer, S., et al. International committee for monitoring assisted reproductive technologies world report: Assisted reproductive technology 2008, 2009 and 2010. Human Reproduction. 31, (7), 1588-1609 (2008).
  8. Dahdouh, E. M., Balayla, J., García-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: A meta-analysis. Fertility and Sterility. 104, (6), 1503-1512 (2015).
  9. Chen, M., Wei, S., Hu, J., Quan, S. Can Comprehensive Chromosome Screening Technology Improve IVF/ICSI Outcomes? A Meta-Analysis. PloS One. 10, (10), e0140779 (2015).
  10. Northrop, L. E., Treff, N. R., Levy, B., Scott, J. T. SNP microarray-based 24 chromosome aneuploidy screening demonstrates that cleavage-stage FISH poorly predicts aneuploidy in embryos that develop to morphologically normal blastocysts. Molecular Human Reproduction. 16, (8), 590-600 (2010).
  11. Barbash-Hazan, S., et al. Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential. Fertility and Sterility. 92, (3), 890-896 (2009).
  12. Fragouli, E., et al. Comprehensive cytogenetic analysis of the human blastocyst stage. Fertility and Sterility. 90, (11), S36 (2008).
  13. Fiorentino, F., et al. Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos. Fertility and Sterility. 101, (5), 1375-1382 (2014).
  14. Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29, (12), 2802-2813 (2014).
  15. Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51, (8), 553-562 (2014).
  16. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencingplatforms: comparison of Ion Torrent, PacificBiosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, (1), 1-13 (2012).
  17. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17, (6), 333-351 (2016).
  18. Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for preimplantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35, (10), 938-944 (2015).
  19. Harton, G. L., et al. ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS). Human Reproduction. 26, (1), 41-46 (2011).
  20. Liu, W. Q., et al. The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 32, (2), 1-8 (2018).
  21. Zhang, X., et al. The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection. Bioscience Reports. 37, (4), BSR20170252 (2017).
  22. Munné, S., Grifo, J., Wells, D. Mosaicism: “survival of the fittest” versus “no embryo left behind”. Fertility and Sterility. 105, (5), 1146-1149 (2016).
  23. Del Carmen Nogales, M., et al. Type of chromosome abnormality affects embryo morphology dynamics. Fertility and Sterility. 107, (1), 229-235 (2017).
  24. Harton, G. L., et al. ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD. Human Reproduction. 26, (1), 33-40 (2011).
  25. Deleye, L., et al. Shallow whole genome sequencing is well suited for the detection of chromosomal aberrations in human blastocysts. Fertility and Sterility. 104, (5), 1276-1285 (2015).
  26. Bielanska, M., Tan, S. L., Ao, A. Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome. Human Reproduction. 17, (2), Oxford, England. 413-419 (2002).
  27. Treff, N. R., et al. Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease. Fertility and Sterility. 99, (5), 1377-1384 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics