רצפי מוליכים למחצה עבור השרשה בדיקה גנטית עבור אנאפלואידיה

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה לקביעת רצף מוליכים למחצה עבור בדיקה גנטית מראש עבור השרשה (PGT-A) עם היתרונות של זמן טיפול קצר, עלות נמוכה, ותפוקה גבוהה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Gui, B., Zhang, Y., Liang, B., Kwok, Y. K. Y., Lui, W. T., Yeung, Q. S. Y., Kong, L., Xuan, L., Chung, J. P. W., Choy, K. W. Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy. J. Vis. Exp. (150), e59273, doi:10.3791/59273 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

התפתחות כרומוזומלית, אחת הסיבות העיקריות המובילות למעצר הפיתוח העובריים, כשל השרשה, או אובדן הריון, הייתה מתועדת היטב בעוברים אנושיים. השרשה הגנטית בדיקות עבור אנאפלואידיה (pgt-A) הוא מבחן גנטי המשפר באופן משמעותי את תוצאות הרבייה על ידי זיהוי חריגות כרומוזומלית של עוברים. רצף הדור הבא (NGS) מספק גישה בתפוקה גבוהה וחסכונית עבור ניתוח גנטי הראו ישימות קלינית ב-PGT-A. כאן, אנו מציגים שיטה מהירה רצף מוליכים למחצה מבוססי-ngs המבוסס על הקרנת ההקרנה של אנאפלואידיה בעוברים. השלב הראשון של זרימת העבודה הוא הגברה שלמה של הגנום (WGA) של הדגימה של העובר ביופסיה, ואחריו בנייה של הספרייה ברצף, וברצף הבא של מערכת רצף המוליכים למחצה. בדרך כלל, עבור יישום PGT-A, 24 דגימות יכול להיות טעון ברצף על כל שבב מייצר 60-80 מיליון קריאות באורך לקרוא ממוצע של 150 זוגות בסיס. השיטה מספקת פרוטוקול מעודן לביצוע הגברה והעשרה של הספריה ברצף, מה שהופך את ה-PGT-A לגילוי, תפוקה גבוהה, חסכוני וחוסך זמן. זמן ריצה של ברצף זה מוליך למחצה הוא רק 2-4 שעות, קיצור זמן הטיפול מקבלת דגימות להנפיק דוחות לתוך 5 ימים. כל היתרונות הללו להפוך את הבקשה הזו לשיטה אידיאלית כדי לזהות aneuploidies כרומוזוממות מעוברים ובכך, להקל על יישום רחב שלה PGT-A.

Introduction

בחירת עוברים קיימא באיכות טובה עם מספרי עותק רגיל של כרומוזום (אאופואיד) להעברת בסיוע רבייה עוזר לשפר את תוצאות ההריון. באופן מסורתי, מערכת הדירוג מורפולוגית היטב משמשת רבות להערכת העובר בשל זמינותו הקלה והטבע הלא פולשני. עם זאת, זה הוכח כי הערכה מורפולוגית יכול רק לספק מידע מוגבל על איכות העובר1 ו השרשה פוטנציאל2. סיבה בסיסית אחת היא חוסר יכולתה להעריך את ההרכב הרומוזומאלי של העוברים.

כרומוזומלית כרומוזום (מספר עותק לא תקין של כרומוזומים) הוא אחד הגורמים העיקריים המובילים למעצר לפיתוח עובריים, כישלון השרשה או אובדן ההריון. התרחשות התוכנית הייתה מתועדת היטב בעוברים אנושיים, הנהלת חשבונות ב-60% ל-70% בעוברי-בשלב3,4 ו-50%-60% ב-blastocysts5. זה, במידה מסוימת, תרם לצוואר הבקבוק בשיפור שיעור ההריון של הפריה חוץ גופית (IVF) הטיפול, אשר החזיק בסביבות 35%-40%6,7. לכן, בחירת עוברי אאופואיד עבור העברה הוא האמין להועיל לשיפור תוצאות ההריון. לשם כך, השרשה מראש בדיקות גנטיות עבור אנאפלואידיה (pgt-A) פותחה עוד יותר כדי לחקור את הכדאיות העובר באמצעות גישות גנטיות. ישנם מספר גדל והולך של מבחנים אקראיים מבוקרים ומחקרים קוהורטים התומכים תפקיד מכריע של PGT-A. זה הוכח כי היישום של PGT-A מקטין את שיעור ההפלה ומגביר את שיעור ההריון הקליני שיעור8, שוטף שיעור ההריון ואת שיעור הלידה בחיים9.

מבחינה היסטורית, שיטות שונות הוחלו PGT-A, כגון זריחה באתרו היברידיזציה (דג), הכלאה גנומית השוואתי (CGH), מערך-CGH, ו בודד פולימורפיזם מיקרופיזם (SNP)-microarray. מחקרים קודמים הראו כי PGT-A עבור מחשוף-שלב העוברים על ידי דגים תשואות תוצאות כי הם עקביים בצורה גרועה עם אלה המתקבלים על ידי הקרנת כרומוזומלית מקיפה (סמ ק) של blastocysts המקביל באמצעות 59273array-CGH או . Microarray5927310 ניתן לייחס אי-התאמות אלה לפסיפס כרומוזום, לפריטים טכניים של דגים, או לתיקון עצמי מתחלקים בשגיאות הפרדה כרומוזומלית במהלך פיתוח11. זה הוכר באופן נרחב כי באמצעות בלסטוציסט trophectoderm עור (TE) ביופסיות עבור pgt מבוסס מערך-A כגון array-cgh או snp-microarray יעיל לזיהוי חוסר איזון כרומוזום בעוברים10,12. לאחרונה, רצף בודד של הדור הבא (ngs) מספק גישה בתפוקה גבוהה וחסכונית עבור ניתוח גנטי הראו ישימות קליני ב pgt-a13,14,15, מה שעושה את זה מ מבטיח חלופה לשיטות הזמינות כעת.

כאן, אנו מציגים מהיר, חסון, ובעלות נמוכה רצף מוליכים למחצה מבוססי-ngs שיטה להקרנה של אנאפלואידיה בעוברים אנושיים. השלב הראשון של זרימת העבודה הוא הגברה שלמה של הגנום (WGA) של הדגימה של העובר ביופסיה, שימוש בערכה של תא יחיד WGA, ואחריו בנייה של הספרייה ברצף, וברצף הבא של מערכת רצף המוליכים למחצה.

באמצעות גילוי ה-H+ יונים שפורסמו מכל התאגדות טריפוספט deאוקסיריוונאוסייד במהלך סינתזה הגדיל DNA, המערכת מעבירה את האותות הכימיים (pH שינוי) שנתפסו על ידי אלמנטים מוליכים למחצה להפנות נתונים דיגיטליים , אשר מפורשים עוד לתוך מידע רצף ה-DNA. ביטול הדרישה לזיהוי אופטי יקר ותגובות רצף מורכבות, זה כימיה פשוטה ברצף מפחית את העלות הכימית הכולל מקצר את רצף הזמן ריצה לתוך 2 עד 4 שעות16. חשוב מכך, בהתבסס על מפרטי הביצועים של היצרן, פלטפורמת רצף המוליכים למחצה יכולה ליצור עד 15 GB נתונים ברצף (תלוי באיכות הספריה) לפי הפעלה, שהיא גבוהה באופן משמעותי מכמה מהסקוונים האחרים בהפקת רק סביב 3-4 GB נתונים (עם 2 x 75 bp לקרוא אורך)17. ביישומים קליניים של PGT-A, פלטפורמה זו יכולה להשיג 24 דגימות לכל שבב לייצר עד 80,000,000 קורא17 לפחות 1,000,000 קריאות ייחודיות של כל מדגם. עומק הקריאה יכול להבטיח כי כל מדגם יש לפחות 0.05 x כיסוי הגנום כולו. היתרונות הנ ל של פלטפורמה זו להפוך אותו שיטת הקרנה אידיאלית וכך, להקל על היישומים הרחבים שלה ב-PGT-A18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

האישור האתי הוענק על ידי האוניברסיטה הסינית המשותפת של הונג קונג – ועדת האתיקה למחקרים קליניים באשכול מזרח הטריטוריות החדשות (מספר סימוכין: 2010.432). רישיון מחקר אושר על ידי המועצה על טכנולוגיית הרבייה האנושית של הונג קונג (מספר R3004).

1. הגברה שלמה של הגנום

  1. לפני תחילת, בדוק את נפח של חרוזים מגנטיים (טבלה של חומרים) כדי להבטיח כי אין פחות מ 135 μl (עם עודף של 20%) עבור כל מדגם. שמרו על החרוזים המגנטיים בטמפרטורת החדר (RT) לפחות 30 דקות. הכינו 720 μL (עם עודף של 20%) של 70% אתנול לכל מדגם. לצייד ציקלור תרמי (טבלת חומרים) עם מכסה מחומם ב 105 ° c.
    הערה: 70% אתנול שהוכן לאחרונה (טבלת חומרים) יש להשתמש בתוך 3 ימים.
  2. הכנה לדוגמא
    הערה: בתרגיל השגרתי, 5 עד 10 תאי עור של הבלסטוציסטה הם ביופסיה בהתאם לתרגול מנחה19.
    1. השעיה ביופסיות ב 2 μL של 1x פוספט מאגור באגירה (PBS) ביחידה 0.2 mL פולימראז תגובת שרשרת (PCR) צינור.
    2. בקצרה לסובב את הצינור על צנטריפוגה מיני עבור 3 s כדי לאסוף את טיפות.
  3. פירוק תאים וחילוץ
    1. הפשרת מאגר חילוץ התא (טבלה של חומרים) ואת מאגר דילול האנזים החילוץ (טבלת חומרים) על קרח, מערבולת ובקצרה ספין על צנטריפוגה מיני עבור 3 s לפני השימוש.
    2. הוסף 3 μL של מאגר חילוץ התא לכל צינורית משלב 1.2.2.
    3. להכין 5 μL תא לפירוק לערבב מאסטר עבור כל מדגם על-ידי הוספת 4.8 μL של החילוץ אנזים דילול מאגר ו 0.2 מיצוי התאים μL האנזים (טבלת חומרים). מערבבים היטב ו סדרת מחלקים לתוך כל צינור משלב 1.3.2. הפוך את הצינור בעדינות לסובב בקצרה על צנטריפוגה מיני עבור 3 s.
      הערה: אין לגעת בנוזל המכיל את דגימות התא בעת הוספת התמהיל הראשי.
    4. מודטה את הצינור משלב 1.3.3 בתוך הציקלייר תרמית עם מכסה מחומם. הפעל את התוכנית באמצעות ההגדרות הבאות: 10 דקות ב-75 ° c, 4 דקות ב-95 ° c, המתיני 4 ° c.
  4. הגברה מראש
    1. הפשרת מאגר הגברה מראש (טבלת חומרים) על קרח, מערבולת ובקצרה ספין על צנטריפוגה מיני עבור 3 s לפני השימוש.
    2. הכן 5 μL מראש מיקס מאסטר עבור כל מדגם על-ידי הוספת 4.8 μL של מאגר הגברה מראש ו 0.2 μL של אנזים מקדם הגברה (טבלת חומרים). מערבבים היטב ו סדרת מחלקים לתוך כל צינור משלב 1.3.4. הפוך את הצינור בעדינות לסובב בקצרה על צנטריפוגה מיני עבור 3 s.
      הערה: אין לגעת בנוזל המכיל את דגימות הדנ א בעת הוספת המיקס הראשי.
    3. מודאת הצינור בתוך הציקלונט תרמית עם מכסה מחומם. הפעל את התוכנית באמצעות ההגדרות הזורמות: 2 דקות ב-95 ° c; 12 מחזורים עבור 15 s ב 95 ° צ', 50 s ב 15 ° c, 40 s ב 25 ° c, 30 בשעה 35 ° צ', 40 s ב 65 ° c, 40 s ב 75 ° c; להחזיק ב -4 ° c.
  5. גברה
    1. הפשרת מאגר הגברה (טבלת חומרים) על קרח, מערבולת ובקצרה ספין על צנטריפוגה מיני עבור 3 s לפני השימוש.
    2. להכין מיקס מאסטר 60 μL הגברה עבור כל מדגם על-ידי הוספת 25 μL של מאגר הגברה, 0.8 μL של אנזים הגברה (טבלת חומרים), ו 34.2 μl של nuclease-מים ללא תשלום עבור WGA (טבלת חומרים). מערבבים היטב ו סדרת מחלקים לתוך כל צינור משלב 1.4.3. הפוך את הצינור בעדינות לסובב בקצרה על צנטריפוגה מיני עבור 3 s.
    3. מודאת הצינור בתוך הציקלונט תרמית עם מכסה מחומם. הפעל את התוכנית באמצעות ההגדרות הבאות: 2 דקות ב-95 ° c; 14 מחזורים עבור 15 s ב 95 ° c, 1 דקות ב 65 ° צ', 1 דקות ב 75 ° c; להחזיק ב -4 ° c.
  6. טיהור של את ה מוצרי WGA
    1. העבר כל מוצר WGA משלב 1.5.3 לתוך צינורות 1.5 mL חדשים. הוסף 112.5 μL של חרוזים מגנטיים לכל צינור. מערבולת ומודטה ב RT עבור 5 דקות.
      הערה: מערבבים לחלוטין את החרוזים המגנטיים לפני השימוש.
    2. מניחים את הצינורות על מעמד מגנטי (טבלת חומרים) במשך 3 דקות עד הסופרנטאנט ברור. להיפטר כל הסופרנטאנט מבלי להפריע את החרוזים.
    3. הוסף 300 μL של 70% אתנול לכל צינור. לסובב כל צינור 180 ° כדי לתת את החרוזים לרוץ דרך האתנול ולסובב בחזרה אל המיקום המקורי. להיפטר כל supernatant לאחר החרוזים התיישבו מבלי להפריע את החרוזים. . חזור על השלב הזה פעם אחת
      הערה: שמור את השפופרת על המעמד המגנטי תוך סיבוב הצינור אופקית.
    4. בקצרה לסובב כל צינור על הצנטריפוגה מיני עבור 3 s. מניחים את הצינורות על המעמד המגנטי עד שרידי הסופראנט ברור. מבלי להפריע לחרוזים. האוויר יבש את החרוזים על RT כ 3 דקות.
    5. הסר את הצינורות מן המעמד המגנטי והשהה מחדש את החרוזים מיובשים על ידי הוספת 35 μL של נמוך טריס-EDTA (TE) מאגר (טבלת חומרים). דגירה ב RT עבור 5 דקות.
    6. הניחו את הצינורות על המעמד המגנטי במשך 3 דקות עד שסופרנטאנט ברור. להעביר את כל supernatant המכיל DNA לצינורות חדשים 1.5 mL בלי להפריע את החרוזים.

2. בקרת איכות של מוצרי WGA

  1. לכמת כל מוצר WGA מטוהרים משלב 1.6.6 על ידי שיטת פלואורומטר (טבלה של חומרים) לפי המדריך של היצרן באמצעות 1 μl של מוצר WGA כחומר מתחיל.
    הערה: הריכוז המקובל של המוצר WGA הוא ≥ 10 ng/μL. כל מוצר מתחת לסף זה אינו מומלץ להמשיך לשלבים הבאים.

3. פיצול של מוצרי WGA

  1. לפני תחילת ההתחלה, מחממים תנור בלוק יבש עד 37 ° c. הכן 6 μL (עם עודף של 20%) של 0.5 M EDTA עבור כל מדגם. בהתבסס על הריכוז, סדרת מחלקים 300 ng של דנ א מכל מוצר WGA מטוהרים בשלב 1.6.6 לצינורות החדשים 0.2 mL PCR ולהביא נפח 16 μl עם מים ללא תשלום עבור כל צינור.
  2. פיצול
    1. להכין 4 μL כפול שנתקע DNA (dsDNA) תערובת התגובה ערבוב עבור כל מדגם על ידי הוספת 2 μL של מאגר התגובה פיצול של dsDNA (טבלה של חומרים) ו-2 μl של הפיצול באנזימים של dsdna (טבלת חומרים). מערבבים היטב ו סדרת מחלקים לתוך כל צינור משלב 3.1. מערבולת ובקצרה ספין על צנטריפוגה מיני עבור 3 s. מודסות את הצינורות במשך 25 דקות ב 37 ° c ב ציקלer תרמית עם מכסה מחומם.
    2. הוסף 5 μL של 0.5 M EDTA באופן מיידי לכל צינור. מערבבים היטב על ידי vortexing ובקצרה ספין על צנטריפוגה מיני עבור 3 s.
  3. טיהור והשעיית מחדש
    1. העבר כל מוצר משלב 3.2.2 לתוך צינורות 1.5 mL חדשים. הוסף 37.5 μL של חרוזים מגנטיים לכל צינור. מערבבים על ידי vertexing ו-דגירה ב RT עבור 5 דקות.
    2. טהר את המוצרים כמתואר משלב 1.6.2 לשלב 1.6.4.
    3. Elute כל מוצר מטוהרים כפי שמתואר בשלבים 1.6.5 ו 1.6.6 על ידי הוספת 32 μL של מאגר low-TE.

4. בניית ספרייה

  1. בוטה- ה nd ר eזיווגים, בחירת גודל וטיהור
    1. הכן 20 μL בוטה-סוף לערבב תיקון עבור כל מדגם על-ידי הוספת 9.5 μL של nuclease-מים ללא תשלום, 10 μL של מאגר תיקון של 5x הקצה (טבלת חומריםצינור משלב 3.3.3. מערבולת ובקצרה ספין על מיני צנטריפוגה עבור 3 s.
    2. הוסף 50 μL של חרוזים מגנטיים לכל צינורית משלב 4.1.1. מערבולת ומודטה ב RT עבור 5 דקות.
      הערה: מערבבים לחלוטין את החרוזים המגנטיים לפני השימוש.
    3. מניחים כל צינורית על המעמד המגנטי במשך 3 דקות עד שהסופרנט ברור. להעביר את כל supernatant כדי חדש 1.5 mL צינורות שבו 25 μL חרוזים מגנטיים נוספים עבור כל. מערבולת את הצינורות עם supernatant הועבר ו-דגירה ב RT עבור 5 דקות.
    4. לטהר את המוצרים בצינורות הדגירה כפי שמתואר משלב 1.6.2 לשלב 1.6.4.
    5. Elute כל מוצר מטוהרים כפי שמתואר בשלבים 1.6.5 ו 1.6.6 על ידי הוספת 32 μL של מאגר low-TE.
      הערה: זוהי נקודת עצירה בטוחה; ה-DNA מטוהרים משלב זה יציב ב 4 ° c עבור לא יותר מ 24 h.
  2. תאם ל igation ו p ליופיקציה
    1. הכינו תערובת של מתאם μl 17 עבור כל מדגם על-ידי הוספת 10 μl של המים ללא החכירה, 5 μl של מאגר ליגאז 10x (טבלת חומרים), 1 μl של מתאם P1 (טבלת חומרים), ו-1 μl של DNA ליגאז (לוח חומרים). מערבבים היטב על ידי vortexing עבור 5 s ו ספין על צנטריפוגה מיני עבור 15 s, ו-סדרת מחלקים לתוך כל צינורית משלב 4.1.5.
    2. הוסף 1 μl של מתאמים (טבלת חומרים) לכל צינורית משלב 4.2.1 בהתאם לגיליון המדגם (קובץ משלים: גיליון לדוגמה עבור הארכה של מתאם). מערבולת ובקצרה לסובב על צנטריפוגה מיני עבור 3 s. מודג את הצינורות ב-RT (20 עד 25 ° c) עבור 20 דקות.
    3. הוסף 75 μL של חרוזים מגנטיים לכל צינורית משלב 4.2.2. מערבבים על ידי vertexing ו-דגירה ב RT עבור 5 דקות. לאחר מכן, לטהר את המוצרים כמתואר משלב 1.6.2 לשלב 1.6.4.
    4. Elute כל מוצר מטוהרים כפי שמתואר בשלבים 1.6.5 ו 1.6.6 על ידי הוספת 15 μL של מאגר low-TE. להעביר את כל supernatant המכיל DNA לחדש 0.2 mL 8-שפופרת רצועות.
      הערה: זוהי נקודת עצירה בטוחה; ה-DNA מטוהרים משלב זה יציב ב 4 ° c עבור לא יותר מ 24 h.
  3. הגברה וטיהור
    1. להכין מיקס מאסטר 50 μL הגברה עבור כל מדגם על-ידי הוספת 47.5 μL של תמהיל סופר (טבלת חומרים) ו 2.5 μl של שילוב פריימר (טבלת חומרים). מערבבים היטב על ידי vortexing ובקצרה ספין על צנטריפוגה מיני, ו סדרת מחלקים לתוך 0.2 mL 8-שפופרת רצועות משלב 4.2.4.
    2. וורטקס רצועות עבור 30 s ובקצרה ספין על צנטריפוגה מיני עבור 3 s. הרצועות בתוך הציקלונט תרמית עם מכסה מחומם. הפעל את התוכנית באמצעות ההגדרות הבאות: 20 דקות ב-72 ° צ'; 5 דקות ב 95 ° c; 10 מחזורים עבור 15 s ב 95 ° צ', 15 s ב 62 ° c, 1 דקות ב 70 ° c; 5 דקות ב 70 ° c; להחזיק ב -4 ° c.
    3. העבר כל מוצר משלב 4.3.2 לתוך צינורות 1.5 mL חדשים. הוסף 97.5 μL של חרוזים מגנטיים לכל צינור. מערבבים על ידי vortexing ו-דגירה ב RT עבור 5 דקות.
    4. טהר את המוצרים כמתואר משלב 1.6.2 לשלב 1.6.4.
    5. Elute כל מוצר מטוהרים כפי שמתואר בשלבים 1.6.5 ו 1.6.6 על ידי הוספת 25 μL של מאגר low-TE.

5. בקרת איכות ודילול ספריית הדנ א

  1. לכמת כל ספריית דנ א מוכן משלב 4.3.5 על ידי שיטת פלואורומטר לפי המדריך של היצרן באמצעות 2 μL של ספריית ה-DNA כחומר מתחיל.
  2. הריכוז המקובל של ספריית ה-DNA הוא ≥ 0.5 ng/μL וזה של השליטה החיובית (טבלת חומרים) הוא ≤ 15 Ng/μl. אם הריכוז של השליטה החיובית משתנה יותר מדי מ 15 ng/μL, חזור על כימות הבקרה החיובית עד שהריכוז קרוב ל -15 ng/μL. אם ריכוז הספרייה הוא מתחת 0.5 ng/μL, הפעל מחדש מפני פיצול (סעיף 3).
    הערה: ודא שריכוז הפקד החיובי מגיע לערך המקובל לפני כימות ספריית ה-DNA.
  3. דלל כל ספריה כדי 100 pmol על ידי הוספת nuclease-מים ללא תשלום. הוסף 1 μL של ספריה ל n μl של nuclease-מים ללא תשלום; חישוב n באמצעות המשוואה שלהלן:
    Equation
    כאשר Q הוא הריכוז של כל ספריה הנמדדת על-ידי שיטת הפלואורומטרים ו-C הוא ריכוז השליטה החיובית הנמדדת על-ידי שיטת הפלואורומטרים.

6. רצפי הרצף

  1. לפני ההתחלה, להכין 48 μL (עם עודף של 20%) של 1 M NaOH עבור כל מדגם אחד nuclease-חינם 1.5 mL שפופרת. הפשרת מאגר ה-PCR הראשי (טבלת חומרים) (2000 μl באמצעי אחסון) ב-rt. הביאו את חלקיקי הספירה (טבלת חומרים) ל-rt.
  2. צירוף ספריה
    1. מערבולת כל ספריה מדולל משלב 5.3 ובקצרה ספין 4x על צנטריפוגה מיני עבור 3 s בכל פעם. לקחת 5 μL של כל ספריה לבריכה לתוך שפופרת nuclease חינם 1.5 mL. ומערבולת הספרייה מעורב ולקצר להסתובב על הצנטריפוגה מיני עבור 3 s.
  3. אמולסיה PCR באמצעות מערכת אמולסיה
    1. הוסף 150 μL של שבירת פתרון 2 צינורות שחזור חדשים (לוח חומרים). התקן את צינורות השחזור החדש, נתב השחזור לוחית הגברה.
    2. מערבבים על ידי היפוך בקבוק השמן (טבלת חומרים) 3 פעמים. ודא כי גם הנפט וגם פתרון ההתאוששות (טבלת חומרים) הם לפחות 2/3 מלא.
    3. מערבולת המאסטר לערבב מאגר PCR עבור 30 s ובקצרה ספין על צנטריפוגה מיני עבור 3 s. מערבולת את חלקיקי הספירה ואת הספרייה מעורב משלב 6.2.1 עבור 1 דקות ובקצרה ספין על צנטריפוגה מיני עבור 3 s.
    4. להכין תערובת 2400 μL ליטל על ידי הוספת 172 μL של nuclease-מים ללא תשלום, 8 μL של ספרייה מעורבת משלב 6.3.3, 120 μL של תערובת אנזימים (טבלת חומרים), ו 100 μl של חלקיקי כדור לצינור המכיל 2000 μl מאסטר מיקס PCR מאגר.
    5. הגדר את הפיפטה כדי 800 μL. טען את תערובת ה6.3.4 משלב התגובה למסנן התגובות (טבלת חומרים) דרך היציאה לדוגמה. השתמש בפיפטה 1000P כדי להוסיף 200 μL של שמן התגובה למסנן התגובה.
    6. בחר את התוכנית פרוטון: יון PI היי-Q OT2 200 Kit, ולאחר מכן, בחר בלחצן הנעזר כדי להבטיח שההתקן הוגדר כראוי על-ידי ביצוע ההוראות על הצג. לאחר מכן, לחץ על הבא כדי להפעיל את התוכנית.
  4. העשרה באמצעות מערכת העשרה אוטומטית
    1. כאשר תוכנית ה-PCR של אמולסיה הושלמה, לחץ על הבאולאחר מכן לחץ על המהדורה הסופית כדי להסתחרר עבור 10 דקות. להוציא את 2 צינורות ההתאוששות לאחר לחיצה על המכסה הפתוח.
    2. להיפטר supernatant מ 2 צינורות השחזור עד 100 μL נשאר בכל צינור, ולתייג בהתאם. מערבבים היטב את הפתרון ומעבירים לצינור 1.5 mL חדש.
    3. הוסף 200 μL של nuclease-מים חינם לכל צינור התאוששות, לשטוף ידי ליטוף למעלה ולמטה מספר פעמים, ולהעביר את כל הפתרון לצינור 1.5 mL בשלב 6.4.2. חזור על צעד השטיפה פעם אחת.
    4. הוסף 200 μL של nuclease-מים חינם לאחד מצינורות ההתאוששות ולשטוף על ידי ליטוף למעלה ולמטה מספר פעמים. העבר את כל הפתרון לצינור ההתאוששות האחר ולשטוף על ידי ליטוף למעלה ולמטה מספר פעמים. לאחר מכן, להעביר את כל הפתרון לאותו שפופרת 1.5 mL משלב 6.4.3. מערבולת 1.5 mL שפופרת עבור 30 s ו צנטריפוגה עבור 8 דקות ב 15,500 x g.
      הערה: הנפח הכולל הסופי של מוצר ה-PCR של אמולסיה בשלב זה אמור להיות כ-1200 μL.
    5. למחוק את supernatant בצינור ולשמור 20 μL של מוצר אמולסיה תחליב. הוסף 80 μL של פתרון מחדש (טבלת חומרים) לשפופרת. מערבבים על ידי ליטוף למעלה ולמטה.
    6. הכן 320 μL ממיסים את הפתרון עבור כל שבב על-ידי הוספת 280 μL של פוליאתילן גליקול ביתן monolaurate פתרון (טבלת חומרים) ו 40 μl של 1 M naoh.
      הערה: 1 מ' NaOH צריך להיות מאוחסן ב 4 ° צ' או טרי מוכן. . וורטקס לפני השימוש
    7. מערבולת הצינור המכיל חרוזי C1 (טבלת חומרים) עבור 30 s. קח 100 μL של חרוזי C1 לצינור חדש 1.5 mL. מניחים את צינור 1.5 mL על העמדה המגנטי עבור 2 דקות ב RT. להיפטר כל supernatant לאחר החרוזים התיישבו מבלי להפריע את החרוזים.
    8. Add 1 mL של כביסה פתרון C1 (טבלת חומרים) לצינור משלב 6.4.7. . מערבולת לשלושים מניחים את הצינור על המעמד המגנטי עבור 2 דקות ב RT. להיפטר כל supernatant לאחר החרוזים התיישבו מבלי להפריע את החרוזים. השהה מחדש את החרוזים על ידי הוספת 130 μL של פתרון לכידת חרוזים (טבלת חומרים).
    9. מערכת העשרה ההתקנה
      1. לטעון את המדגם (100 μL אמולסיה PCR המוצר) משלב 6.4.5, את החרוזים שנשטפו (130 μL) משלב 6.4.8, הפתרון לכבס ES (300 μL) (טבלת חומרים), ו להמיס-off פתרון (300 μl) משלב 6.4.6 לתוך הרצועה 8-tube. סדר הפריסה הוא: מדגם (tube 1), שטוף מחרוזת (צינור 2), ES לשטוף פתרון (צינורות 3, 4, 5), ו נמס-off פתרון (צינור 7). . שמרו על שפופרות 6 ו -8 ריקות
      2. מניחים את הרצועה 8-tube משלב 6.4.9.1 על ES. התקינו טיפ פיפטה ושפופרת 0.2 mL חדשה והתחילו את התוכנית.
        הערה: ודא שהליטוף עובד בצורה נורמלית.
    10. שטפו את חלקיקי הכדור לאחר השלמת ההעשרה.
      1. צנטריפוגה את שפופרת 0.2 mL משלב 6.4.9.2 עבור 5 דקות ב 15,500 x g. התעלם מהסופרנטנט ושמור 10 μL של המוצר העשרה. הוסף 200 μL של nuclease-מים ללא תשלום לצינור. מערבבים על ידי הורטקנג.
      2. צנטריפוגה את שפופרת 0.2 mL מתוך 5 דקות ב 15,500 x g. התעלם מהסופרנטנט ושמור 10 μL של המוצר העשרה. הוסף 90 μL של nuclease-מים ללא תשלום לצינור. מערבבים על ידי הורטקנג.
  5. הכנת תבנית
    1. וורטקס את השליטה החיובית. ולהסתובב בקצרה הוסף 5 μL של שליטה חיובית לתבנית 100 μL (המוצר העשרה משלב 6.4.10.2). מערבולת וצנטריפוגה עבור 5 דקות ב 15,500 x g. בטל את הסופרנטאנט ושמור 10 μL של התבנית.
    2. הוסף 20 μL של רצף פריימר (טבלה של חומרים) ו 15 μl של ריפוי מאגר (טבלת חומרים) אל שפופרת התבנית משלב 6.5.1. מערבולת הצינור ובקצרה ספין על מיני צנטריפוגה עבור 3 s.
    3. מודטה את הצינור משלב 6.5.2 בתוך הציקלייר תרמית עם מכסה מחומם. הפעל את התוכנית באמצעות ההגדרות הבאות: 2 דקות ב-95 ° c, 2 דקות ב-37 ° c, החזק את 4 ° c.
    4. הוסף 10 μL של טעינת מאגר (טבלת חומרים) לשפופרת משלב 6.5.3. מערבבים על ידי ליטוף למעלה ולמטה.
  6. אתחול ברצף
    1. בדוק את לחץ הטנק של גז חנקן (סה כ לחץ ≥ 500 psi, הלחץ פלט ≥ 10 psi, אופטימלית 20-30 psi). מעלה-up 100 mL המים המטים (18.2 MΩ) כדי C1 ו-C2 צינורות (טבלת חומרים) ולהתקין אותם מיקומים c1 ו-c2 המקביל על הרצף.
    2. הכן W1 (32 μL של 1 M NaOH) ו-W3 (40-50 מ ל של W3 מאגר [לוח חומרים]) פתרונות. הכנת פתרון W2 על-ידי הוספת 1920 mL של מים מוהים (18.2 MΩ), בקבוק שלם של מאגר W2 (טבלת חומרים) ו-8-12 ליטר μl של 1 M naoh, ולהפוך 4 שעות 8 פעמים כדי לערבב.
      הערה: מכיוון שאיכות המים משתנה באופן גאוולוגית, כוונן את עוצמת הקול של 1 מ' NaOH לפי הצורך. ה-pH המתחיל של W2 הוא 5.9-6.1, והטווח האופטימלי לאחר ההסתגלות הוא 7.4-7.6. לשנות ולהתקין צינורות מגיב חדש ולהשתמש בשבב המשמש לאחרונה לכביסה.
    3. הכינו את 4 הצינורות הריקים החדשים מערכת תוסף הרצף (טבלת חומרים). התווית את 4 הצינורות כמו dGTP, dCTP, dATP, ו-Dgtp, ולהוסיף 70 μL של dGTP, dCTP, dATP, או Dgtp (לוח חומרים) לצינור המקביל (כלומר, 70 Μl dgtp לצינור המכונה dgtp, וכו '). מערבולת את החצוצרות לפני השימוש. התקן את הצינורות לעמדות המתאימות המיועדות לרצף (טבלת חומרים).
  7. שטיפת צ'יפ
    1. שטוף את השבב (טבלת חומרים) פעם אחת על ידי הזרקת 100 μl של איזופנול לתוך מטען של השבב. הסירו את הנוזל הנפלט מבאר ההיפך.
    2. שטוף את השבב פעמיים על ידי הזרקת 100 μL של nuclease-מים חינם לתוך הטעינה היטב של השבב. הסירו את הנוזל הנפלט מבאר ההיפך.
    3. לשטוף את השבב פעם אחת על ידי הזרקת 100 μL של 0.1 M NaOH לתוך הטעינה היטב של השבב. הסירו את הנוזל הנפלט מבאר ההיפך. מודקון ב RT עבור 1 דקות.
    4. לשטוף את השבב פעם אחת על ידי הזרקת 100 μL של nuclease-מים חינם לתוך הטעינה היטב של השבב. הסירו את הנוזל הנפלט מבאר ההיפך.
    5. שטוף את השבב פעמיים על-ידי הזרקת 100 μL של איזופנול לתוך החלק הטוב של השבב. הסירו את הנוזל הנפלט מבאר ההיפך. . יבש ע י פיצוץ חנקן על השבב . התרחקי מהאור
  8. העמסה ובדיקת רצף של דוגמאות
    1. מערבבים את מדגם μL 55 משלב 6.5.4 על-ידי ליטוף למעלה ולמטה ולטעון את המדגם לטוב הטעינה של השבב.
      הערה: השאר את קצה הפיפטה ואת צינור ה-PCR 0.2 mL המשמש בשלב זה.
    2. מניחים את השבב על צנטריפוגה מיני שבב (טבלת חומרים) כאשר
    3. הכן שני צינורות 1.5 mL חדשים עבור מאגר הריפוי ותמיסת השטיפה. הכינו את מאגר הריפוי 50% על ידי הוספת 500 μL של מאגר ריפוי ו 500 μL של nuclease-מים ללא תשלום. להכין את הפתרון שטיפה על ידי הוספת 500 μL של ריפוי מאגר ו 500 μL של 100% 2-propanol.
    4. הכן שני צינורות 1.5 mL חדשים ולהכין את התערובת קצף ידי ערבוב 49 μL של 50% מאגר ריפוי 1 μL של תמיסת קצף (טבלת חומרים) בשתי הצינורות.
    5. הגדר את הצנרת כדי 100 μL. להפוך את הבועות על ידי ליטוף אוויר לתוך תערובת קצף מאחד משני הצינורות משלב 6.8.4. להפוך > 120 μL של בועות ולהמשיך ללטף עד לא מצטיינים בועות גלוי ניתן לראות. טען 120 μL של בועות לתוך הטעינה היטב.
      הערה: ודא שאין בועות גלויות מצטיינים. . אחרת, תפעיל אותו
    6. העבר את הנוזל מוגזם גורשו מהיציאה היטב משלב 6.8.5 לטעון היטב על ידי ליטוף. . אל תעשה בועות לפיפטה צנטריפוגה את השבב במשך 30. על השבב המיני
    7. חזור על שלב ה6.8.5 באמצעות הצינורית השנייה המכילה את התערובת הקצף משלב 6.8.4.
    8. הוסף 55 μL של 50% מאגר ריפוי ל 0.2 mL מוחזק בשלב 6.8.1. השתמש בקצה הצינורות השמור בשלב 6.8.1 לפיפטה למעלה ולמטה. טען את כל מאגר הריפוי מ55 μL לטעינת הבאר. צנטריפוגה את השבב במשך שלושים. על מיני צנטריפוגה השבב המיועד
    9. טען 100 μL של פתרון שטיפה לתוך השבב טעינת היטב ולהשליך את הנוזל גורשו מהיציאה היטב. חזור על שלב הטעינה הזה פעם אחת.
      הערה: אם יש בועות בשבב, לגרש בועות קטנות על ידי בועות גדולות וסומק על ידי שטיפה הפתרון. זה יכול להיות מושגת על ידי pipetting 100 μL של פתרון שטיפה ולהשאיר 5 μL של האוויר מתחת לפתרון השטיפה. לכן, בעת ליטוף 105 μL לתוך השבב, האוויר יהיה ליצור בועה גדולה שיכולה לגרש את בועות קטנות, ולאחר מכן, את הבועה הגדולה יכול להיות מגורש על ידי פתרון הריקון הבא.
    10. טען 100 μL של 50% מאגר ריפוי לשבב טעינת היטב. חזור על שלב הטעינה עבור סך של 3 פעמים.
    11. הוסף 6 μL של האנזים ברצף לתוך 60 μL של 50% מאגר ריפוי לתוך צינור החדש 1.5 mL. מערבבים על ידי ליטוף למעלה ולמטה. טען 65 μL של פתרון מעורב זה לתוך השבב טעינת היטב. . הפיפטה לאט כדי להימנע מקצף
    12. לשמור את השבב הרחק מתוך האור ו-מודטה ב RT עבור 5 דקות.
    13. לאחר הדגירה, מיד לטעון את השבב על ברצף ולחץ להתחיל את רצף לרוץ על המסך כדי להתחיל ברצף.
      הערה: הנתונים הגולמיים ברצף וקבצי בקרת האיכות ייטענו באופן אוטומטי לחברה לצורך ניתוח נתונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בהתבסס על פרוטוקול שהשתנה זה, פלטפורמת רצף המוליכים למחצה הייתה בפעם הראשונה, שהוחלה על PGT-A. בדקנו על ביופסיות משני המחשוף בשלב מחשוף ועוברי ציסטה בשלב. הוא הציע כי התאים ביופסיה לעבור WGA בהקדם האפשרי כדי למנוע כל השפלה של דנ א. מחקר קודם בהשוואה לביצועים של שיטות WGA שונות וציין כי השיטה שתיארנו כאן היתה האחידות הטובה ביותר בגודל התאים של 100 KB20. בהתחשב בביצועים של אחידות שינוי זיווגים והחציוני המוחלט (MAPD)21, זו שיטת WGA נבחר pgt-A באמצעות רצף מוליך למחצה. באמצעות ניתוח סטטיסטי רטרוספקטיבי על 186 בשלב המחשוף ו 1135 בלסטוציסט העוברים הבמה, הבחנו כי שיעורי ההצלחה של WGA היו 95.4% בדגימות בלסטוציסט ו 96.9% ב בלסטוציסטה דגימות (איור 1). צעד הטיהור לפני בניית הספרייה כנוהל בחירת גודל היה חיוני לאיכות רצף על ידי לכידת שברי DNA גדולים. בנוסף, הוא הנחה את כמות הקלט של 300 ng עבור בניית הספרייה. שיטת הפיצול האנזימטית אפשרה להטיה יעילה של מוצרי WGA לתוך כ-160 bp.

ניתוח נתונים נערך באמצעות מערכת הניתוח של המרחק האוקלידי והמעגל הבינאריות (EDCBS). בוצע אימות בתוך הבית כדי להעריך את החוסן של האלגוריתם הביומטי הזה. הקמנו מסד נתונים התייחסות בלעדית PGT-A באמצעות רצפי 379 מוצרים WGA מ 66 קווי תאים עם karyotypes ידועים על ידי ניתוח גודל של 100 KB. מתוך מסד נתונים זה, טווח התייחסות היה מתחום כמו הסף עבור משתנה עותק מספר (CNV) ו 10 MB הוגדרה כניתוק עבור רמת הזיהוי. רגישות וספציפיות הגיעו למעלה מ-99% מסף זה (טבלה 1). ביישום עבור PGT-A על ביופסיות העובר, גודל החלון הוגדר ל 400 KB עם גישה החלון הזזה כדי להגיע מספיק קריאות. בקרת איכות (QC) של כל מדגם נקבע על ידי קריאות ייחודי, MAPD ו סטיית תקן של העתק מספר משתנה (CNV ∙ SD). דוגמה מעבר לאחד משלושת האינדקסים הוגדרה ככשל QC (איור 2C). פרשנות של מגרשים לפיזור כרומוזום (איור 2A,B, D) בוצעו על ידי גנטיקאים מוסמך בעקבות זרימת עבודה על ידי השוואת cnv מזוהה כדי לפענח, dgv, או מסדי נתונים קליגן. חוסר התאמות אישיות נשלט על ידי הליך מומחה. מומים כרומוזומלית קובצו בתוך מקור ובפסיפס בדגימות בלסטוציסט. מספר העתק רווח או הפסד בטווח של 30%-70% מסווג כנושא הרכב כרומוזומפסיפס; אחרת, התוצאה תתפרש כאאופלואידיה או מאנלויידי. במחקר זה, שיעורי אאופלויד היו 45.2% ב בלסטומרים ו 52.3% ב blastomeres, אשר הדהד לפרסם נתונים22,23.

Figure 1
איור 1: הסטטיסטיקה הדמוגרפית של 1321 העובר ביופסיות שנבדקו על ידי שיטה זו. (א) נתונים מ 186 עוברים בשלב המחשוף. (ב) נתונים מ 1135 blastocyst-העוברים שלב. שיעורי ההצלחה של WGA הם מעל 95% בשני סוגי הדגימות. רצף שיעורי בקרת איכות של שליטה הם 3.4% בקבוצת בשלב המחשוף ורק 1.9% בקבוצת השלבים blastocyst. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תוצאות הנציג של PGT-יישום קליני של העובר עבור 23 זוגות של כרומוזומים. תוצאות מייצגות של (א) אאופלויידי; (ב) אנאופולודיה (Seq [GRCh37] (2) x3, (21) x3); (ג) רצף QC נכשל דגימה בשל cnv ∙ SD ב 0.6571 (קבלה ≤ 0.4); (ד) מחיקת פסיפס סנטלית (55%) של 4p 26.2 p 24.3 (29.50 MB). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ערך הסף של CNV
(-0.23, 0.20) (-0.32, 0.26) (-0.41, 0.32) (-0.51, 0.37) (-0.62, 0.43) (-0.73, 0.48)
רגישות 100.00% 100.00% 100.00% 100.00% 98.30% 96.02%
ספציפיות 72.41% 81.03% 91.38% 99.10% 99.54% 100.00%

טבלה 1: רגישות וספציפיות בין יחס שונה למערכת הרישום על ידי רצף המוליכים למחצה. סך של 240 דגימות עם התוצאות הידועות של אאופואיד קריוטיפ נבדקו על ידי שיטה זו והתקשר ביחס שונה Log R.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שונה מchemistries ברצף אחר, הרצף המתואר כאן משתמש מוליך למחצה לאיתור נוקלאוטידים. השבב עצמו הוא מכשיר אלקטרוני המזהה יוני מימן על ידי התאגדות בסיס מונחה פולימראז17, אשר מאפשר 2-4 הזמן רצף של תוכנית פרוטון. חוץ מזה, השבב הוא שבב המיקרוגל המאפשר לוקליזציה של מולקולה היעד אחד, אשר שונה הכימיה ברצף הזרימה של תא על ידי ספקי ברצף אחרים. פרוטוקול זה הוא פרוטוקול שהשתנה הממוטב ליישום PGT-A. האופטימיזציה כוללת פיצול של דנ א מוגבר על ידי השיטה אנזימטית במקום sonication כדי להפחית את הסיכוי של זיהום, כמו גם את הגודל מבחר ואת מערכת ה-PCR לביצועים טובים יותר עם עלויות נמוכות יותר. בנוסף, במסגרת הקלינית, השתמשנו בצינור מאומת בתוך הבית עבור התקשרות משתנה.

ישנם שלבים קריטיים שיש לשים לב אליהם במהלך התרגול. אתנול לטיהור צריך להיות טרי מוכן לפני הניסוי, כמו ריכוז גבוה של אתנול היה לגרום לשטוף מספיק של דנ א מזוהם בעוד ריכוז נמוך יגרום לאובדן של דנ א היעד. הפלואורומטרים צריך להיות מכויל על ידי השליטה החיובית עם ריכוז ידוע כדי להבטיח את הדיוק. חוץ מזה, טעינה נאותה של התבנית חיונית לרצף. בועות בגודל הנכון לעזור לדחוף את הספירה תבנית ליפול לתוך המיקרוגל, אבל בועות גדולות מדי עלול לגרום טעינה מספקת. משתמשים יכולים לשנות את מספר הדגימות (לא בהכרח 24) כדי להיות ברצף עבור כל הפעלה. ישנם 96 אינדקסים שתוכננו עבור שבב זה. אבל עומק הקריאה ברצף יקטן. עם הגדלת דגימות לכל שבב אחת הבעיות הנפוצות ביותר היא ריכוז הספרייה נמוך, אשר ניתן לייחס פלט DNA נמוך או באיכות ירודה מטיהור עקב אתנול שיורית או חרוזים מגנטיים, או סדיקה של חרוזים כפי שהוזכר קודם לכן. פלט DNA תת מיטבי עשוי גם לנבוע מיעילות נמוכה של ה-PCR, אשר ניתן לתקן על ידי הכנה זהירה של ערבוב מאסטר עם כניסות לדוגמה מדויקת ובדיקת טמפרטורה של הציקלנים תרמית. עבור ברצף ברצפי QC שנכשלו, כגון אלה עם ערכי CNV ∙ SD גבוהה (איור 2C), מומלץ להפעיל דגימות על bioanalyzer עבור ניתוח הפצת גודל.

אחת המגבלות של שיטה זו היא שיעור הקריאה הגבוה השקר היחיד-נוקלאוטיד לעומת פלטפורמות אחרות. שיעור השגיאה הוא 1% לעומת רק 0.1% indel שווא שיעור חיובי על-ידי הסקוונים אחרים17. עם זאת, זה לא גורם המכריע של התקשרות CNV או ניתוח PGT-A. בהשוואה לפלטפורמות אחרות, יישום של מערכת אמולסיה ממזער אי-התאמות הפעיל שגיאות ליטוף, הגדלת איכות הספרייה. זהו יתרון משמעותי של השיטה שלנו לעומת פלטפורמות אחרות, כי הריכוז dsDNA הוא נמוך מאוד וכימות מדויק נדרש עבור האגירת הספרייה הבאה. השיטה שלנו הציגה את כיול של פלואורומטר כימות באמצעות שליטה חיובית סטנדרטית כדי לשלוט על שגיאת זיהוי.

כמו פלטפורמת תפוקה גבוהה עם זמן טיפול קצר, ברצף מוליך למחצה הוא אידיאלי עבור PGT-A והוא יכול להיות נרחב להחיל על חולים IVF עם PGT-A סימנים קליניים כגון מתקדם גיל האימהי24. Deleye et al ביצעה רצף מקבילי של בלסטיציסטות האדם כדי להשוות את הביצועים של ברצף מוליך למחצה עם נצנצים אחרים25. יתר על כן, ערכת PGT-A זו השיגה את "הליך אישור מיוחד על מכשירים רפואיים חדשניים" מתוך מינהל המזון והתרופות של סין, שימש קלינית עבור אלפי עוברים. במונחים של עלות, מחיר פלטפורמה זו הוא חצי מחיר לבסיסים גיגה לעומת פלטפורמה אחרת בשימוש נפוץ בשוק pgt-A. התאים הטרופטועור יכולים לייצג באופן אמין את החוקה הגנטית של העובר26. שיטה זו יכולה להיות מפותחת עבור PGT עבור מחלות חד-גניים/גנים יחיד (PGT-M) כמו Treff et al. הפגינו27. במודל שלהם, הם הקלו 300 MB כדי התפוקה 1 GB על PGT-M של 16 ביופסיות העובר והשוו את התוצאות שני שיטות המקובלת PGT-M. על-ידי לכידת וטעינת 16 דגימות, השיטה שלהם הגיעו לפחות 100x לקרוא עומק של האזור המיועד והביא האמינות 100% והתוכסות27. התפוקה של ברצף מוליך למחצה על ידי הפרוטוקול שלנו יכול להגיע 15 GB ויש 96 ברקודים מעוצב; לכן, אם הוחל PGT-M ממוקד, מספר ניכר של ביופסיות העובר יכול להיות רצף על ידי שבב אחד בעומק לקרוא גבוה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי הקרן למחקר כללי (Ref No. 14162417) מהונג קונג, הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (Ref No. 81860272), תוכנית המחקר העיקרית של המדע המחוזי הקרן טכנולוגיה של גואנגשי (שופט לא. AB16380219), ומענק הקרן הפוסט-דוקטורט של סין (Ref No. 2018M630993) מסין.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PCR tubes, 0.2 mL Axygen PCR-02D-C
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 ThermoFisher 15575020
PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free ThermoFisher 10010023
1.0 M NaOH (1.0N) solution SIGMA-ALDRICH S2567 For Melt-off solution. Molecular grade
Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL Fisher Scientific 13-698-791
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or
Equivalent 18 MΩ water system
ThermoFisher 4474524
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
PicoPLEX WGA Amplification buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
PicoPLEX WGA Amplification enzyme Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion OneTouch Amplification Plate In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5
Ion PI Annealing Buffer
MyOne Beads Capture Solution
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939AA
Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) In kit: Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 ThermoFisher 65001
PicoPLEX WGA Cell extraction buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00.
PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion PI Chip Kit v3 ThermoFisher A26771
Ion Chip Minifuge, 230 V ThermoFisher 4479673
Ion PI dATP ThermoFisher A26772
Ion PI dCTP ThermoFisher A26772
Ion PI dGTP ThermoFisher A26772
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
ThermoQ–Temperature Dry Bath TAMAR HB-T2-A
NEBNext dsDNA Fragmentase New England Biolabs M0348L
NEBNext dsDNA Fragmentase New England Biolabs M0348L
Ion PI dTTP ThermoFisher A26772
Ion OneTouch 2 Instrument ThermoFisher INS1005527 ThermoFisher Catalog number: 4474778.
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
Ion One Touch ES ThermoFisher 8441-22 ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5
Ethanol SIGMA-ALDRICH 51976 This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol.
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01.
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02.
Qubit 3.0 Fluorometer ThermoFisher Q33216 This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226.
Qubit ds DNA HS Assay kit ThermoFisher M2002-02
Qubit Assay Tubes ThermoFisher Q32856
Ion PI Foaming Solution ThermoFisher A26772
Index for barcoding of libraries BaseCare this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517)
Ion PI Loading Buffer ThermoFisher A26772
Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer ThermoFisher 4389764
Agencour AMPure XP Kit Beckman Coulter A63880
DynaMag-2 magnet (magnetic rack) ThermoFisher 12321D
Ion PI Master Mix PCR buffer
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge Micro 17 75002430
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
Nuclease-free water ThermoFisher AM9922 This can be replaced by other brand.
PicoPLEX WGA Nuclease-free water Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion OneTouch Oil bottle Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252 Extended kit component in Sheet 3
double-strand DNA standard This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library.
PicoPLEX WGA Preamplification buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
PicoPLEX WGA Preamplification enzyme Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Library Amplification Primer Mix ThermoFisher 4471252 Extended kit component in Sheet 3
Ion OneTouch Reaction Filter Extended kit component in Sheet 5
Recovery Router Extended kit component in Sheet 5
Recovery Tubes Extended kit component in Sheet 5
ISP Resuspension Solution
Ion Proton ThermoFisher DA8600 This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610.
Ion PI Hi?Q Sequencing Polymerase ThermoFisher A26772
Ion PI Sequencing Primer
server for sequencer Lenovo T260
Ion PI Sphere Particles
Platinum PCR SuperMix High Fidelity ThermoFisher 4471252
Nalgene 25mm Syringe Filters ThermoFisher 724-2045 Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids.
Ion PI Hi?Q W2 Solution ThermoFisher A26772
Ion PI 1X W3 Solution ThermoFisher A26772
Ion OneTouch Wash Solution C1
The Ion PGM Hi?Q View Sequencing Kit ThermoFisher A30044 Extended kit component in Sheet 2
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252 Extended kit component in Sheet 3
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) ThermoFisher A26772 Extended kit component in Sheet 4
Ion PI Hi?Q OT2 200 Kit ThermoFisher A26434 Extended kit component in Sheet 5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balaban, B., Urman, B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reproductive BioMedicine Online. 12, (5), 608-615 (2006).
  2. Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: An observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29, (6), 1173-1181 (2014).
  3. Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A. P. Chromosomal abnormalities in embryos. Molecular and Cellular Endocrinology. 183, 29-34 (2001).
  4. Trussler, J. L., Pickering, S. J., Ogilvie, C. M. Investigation of chromosomal imbalance in human embryos using comparative genomic hybridization. Reproductive BioMedicine Online. 8, (6), 701-711 (2004).
  5. Fragouli, E., et al. Cytogenetic analysis of human blastocysts with the use of FISH, CGH and aCGH: Scientific data and technical evaluation. Human Reproduction. 26, (2), 480-490 (2011).
  6. Calhaz-Jorge, C., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2013: Results generated from European registers by ESHRE. Human Reproduction. 32, (10), 1957-1973 (2017).
  7. Dyer, S., et al. International committee for monitoring assisted reproductive technologies world report: Assisted reproductive technology 2008, 2009 and 2010. Human Reproduction. 31, (7), 1588-1609 (2008).
  8. Dahdouh, E. M., Balayla, J., García-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: A meta-analysis. Fertility and Sterility. 104, (6), 1503-1512 (2015).
  9. Chen, M., Wei, S., Hu, J., Quan, S. Can Comprehensive Chromosome Screening Technology Improve IVF/ICSI Outcomes? A Meta-Analysis. PloS One. 10, (10), e0140779 (2015).
  10. Northrop, L. E., Treff, N. R., Levy, B., Scott, J. T. SNP microarray-based 24 chromosome aneuploidy screening demonstrates that cleavage-stage FISH poorly predicts aneuploidy in embryos that develop to morphologically normal blastocysts. Molecular Human Reproduction. 16, (8), 590-600 (2010).
  11. Barbash-Hazan, S., et al. Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential. Fertility and Sterility. 92, (3), 890-896 (2009).
  12. Fragouli, E., et al. Comprehensive cytogenetic analysis of the human blastocyst stage. Fertility and Sterility. 90, (11), S36 (2008).
  13. Fiorentino, F., et al. Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos. Fertility and Sterility. 101, (5), 1375-1382 (2014).
  14. Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29, (12), 2802-2813 (2014).
  15. Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51, (8), 553-562 (2014).
  16. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencingplatforms: comparison of Ion Torrent, PacificBiosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, (1), 1-13 (2012).
  17. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17, (6), 333-351 (2016).
  18. Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for preimplantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35, (10), 938-944 (2015).
  19. Harton, G. L., et al. ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS). Human Reproduction. 26, (1), 41-46 (2011).
  20. Liu, W. Q., et al. The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 32, (2), 1-8 (2018).
  21. Zhang, X., et al. The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection. Bioscience Reports. 37, (4), BSR20170252 (2017).
  22. Munné, S., Grifo, J., Wells, D. Mosaicism: “survival of the fittest” versus “no embryo left behind”. Fertility and Sterility. 105, (5), 1146-1149 (2016).
  23. Del Carmen Nogales, M., et al. Type of chromosome abnormality affects embryo morphology dynamics. Fertility and Sterility. 107, (1), 229-235 (2017).
  24. Harton, G. L., et al. ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD. Human Reproduction. 26, (1), 33-40 (2011).
  25. Deleye, L., et al. Shallow whole genome sequencing is well suited for the detection of chromosomal aberrations in human blastocysts. Fertility and Sterility. 104, (5), 1276-1285 (2015).
  26. Bielanska, M., Tan, S. L., Ao, A. Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome. Human Reproduction. 17, (2), Oxford, England. 413-419 (2002).
  27. Treff, N. R., et al. Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease. Fertility and Sterility. 99, (5), 1377-1384 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics