Identification des facteurs nucléoleux pendant la réplication du VIH-1 par l'immunoprécipitation rev et la spectrométrie de masse

Immunology and Infection

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Summary

Ici nous décrivons Rev immunoprécipitation en présence de la réplication de HIV-1 pour la spectrométrie de masse. Les méthodes décrites peuvent être utilisées pour l'identification des facteurs nucléolaire impliqués dans le cycle infectieux du VIH-1 et s'appliquent à d'autres modèles de maladies pour la caractérisation des voies sous-étudiées.

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Arizala, J. A., Chomchan, P., Li, H., Moore, R., Ge, H., Ouellet, D. L., Rossi, J. J. Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (148), e59329, doi:10.3791/59329 (2019).

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Abstract

Le cycle infectieux du VIH-1 nécessite des interactions entre protéines virales et les facteurs hôtes pour faciliter la réplication, l'emballage et la libération virales. Le cycle infectieux nécessite en outre la formation de complexes protéiques viraux/hôtes avec l'ARN VIH-1 pour réguler l'épissage et permettre le transport nucléocytoplasmique. La protéine HIV-1 Rev accomplit l'exportation nucléaire des ARNm VIH-1 par la multimerisation avec des cibles introniques cis-action - l'élément de réponse Rev (RRE). Un signal de localisation nucléoliste (NoLS) existe dans le coOH-terminus du motif Rev arginine-riche (ARM), permettant l'accumulation de complexes Rev/RRE dans le nucléole. Les facteurs nucléolaux sont spéculés pour soutenir le cycle infectieux du VIH-1 par le biais de diverses autres fonctions en plus de la médiation de l'exportation nucléaire indépendante de l'ARNm et de l'épissage. Nous décrivons une méthode d'immunoprécipitation de type sauvage (WT) Rev par rapport aux mutations nucléoliennes de Rev (suppression et mutations de Rev-NoLS à point unique) en présence de la réplication de HIV-1 pour la spectrométrie de masse. Les facteurs nucléolaux impliqués dans le transport nucléocytoplasmique (nucléophosmin B23 et nucléoline C23), ainsi que les facteurs d'épissage cellulaire, perdent l'interaction avec Rev en présence de mutations Rev-NoLS. Divers autres facteurs nucléolaire, tels que la boîte C/D 58 du snoARN, sont identifiés pour perdre l'interaction avec les mutations Rev, mais leur fonction dans le cycle de réplication DU VIH-1 reste inconnue. Les résultats présentés ici démontrent l'utilisation de cette approche pour l'identification des facteurs nucléolaire viraux/hôtes qui maintiennent le cycle infectieux du VIH-1. Les concepts utilisés dans cette approche s'appliquent à d'autres modèles viraux et de maladies nécessitant la caractérisation de voies sous-étudiées.

Introduction

Le nucléole est postulé comme le terrain d'interaction de divers facteurs cellulaires et viraux nécessaires à la réplication virale. Le nucléolus est une structure complexe subdivisée en trois compartiments différents : le compartiment fibrillaire, le compartiment fibrillaire dense et le compartiment granulaire. La protéine HIV-1 Rev se localise spécifiquement dans les compartiments granulaires; cependant, la raison de ce modèle de localisation est inconnue. En présence de mutations à un seul point dans la séquence NoLS (Rev mutations 4, 5 et 6), Rev maintient un modèle nucléolif et a déjà été montré pour sauver la réplication VIH-1HXB2, cependant, avec une efficacité réduite par rapport à WT Rev1 . Toutes les mutations à un seul point sont incapables de soutenir le cycle infectieux VIH-1NL4-3. En présence de multiples mutations à un seul point dans la séquence NoLS (mutations Rev-NoLS 2 et 9), Rev a été observé pour se disperser dans le noyau et le cytoplasme et n'a pas été en mesure de sauver la réplication VIH-1HXB2 1. Le but de cette étude protéomique est de déchiffrer les facteurs cellulaires nucléolaux ainsi que non nucléolaux impliqués dans la voie infectieuse du VIH-1 médiée par le révérend. Les conditions d'immunoprécipitation de Rev sont optimisées par l'interaction avec la phosphoprotéine nucléolar B23, qui a été précédemment montrée pour perdre l'interaction avec Rev en présence des mutations nucléolaures.

Les facteurs cellulaires rev ont été largement étudiés dans le passé; cependant, ceci a été fait en l'absence de pathogénie virale. Une protéine, en particulier, qui est caractérisée dans cette étude par l'interaction Rev pendant la réplication du VIH-1 est la phosphoprotéine nucléolée B23 - également appelé nucléophosme (NPM), numatrine, ou NO38 chez les amphibiens2,3, 4. B23 est exprimé en trois isoformes (NPM1, NPM2, et NPM3) - tous les membres de la nucléophosmine/nucléoplasmin famille de chaperon nucléaire5,6. Le chaperon moléculaire NPM1 fonctionne dans l'assemblage approprié des nucléosomes, dans la formation de complexes protéiques/acides nucléiques impliqués dans les structures de chromatine d'ordre supérieur7,8, et dans la prévention de l'agrégation et dépliement des protéines cibles à travers un domaine central N-terminal (résidus 1-120)9. La fonctionnalité NPM1 s'étend à la genèse ribosome par le transport des particules préribosomal entre le noyau et le cytoplasme10,11, le traitement de l'ARN préribosomal dans la séquence d'espacer transcrit interne 12,13, et l'arrestation de l'agrégation nucléolaires de protéines au cours de l'assemblage ribosomal14,15. NPM1 est impliqué dans l'inhibition de l'apoptose16 et dans la stabilisation des suppresseurs de tumeur ARF17,18 et p5319, révélant son double rôle en tant que facteur oncogène et suppresseur de tumeur. NPM1 participe aux activités cellulaires de stabilité du génome, de réplication centrosome et de transcription. NPM1 se trouve dans les nucléoli pendant l'interphase de cycle cellulaire, le long de la périphérie chromosomique pendant la mitose, et dans les corps prenucléolaire (PNB) à la conclusion de la mitose. NPM2 et NPM3 ne sont pas aussi bien étudiés que NPM1, qui subit des niveaux d'expression altérés pendant la malignité20.

NPM1 est documenté dans l'étanchage nucléocytoplasmique de diverses protéines nucléaires/nucléolées par le biais d'un NES interne et NLS9,21 et a été précédemment signalé pour conduire l'importation nucléaire de HIV-1 Tat et Rev protéines. En présence de protéines de fusion B23-domaine-galactosidase, Tat se localise mal dans le cytoplasme et perd son activité de transactivation; cela démontre une forte affinité de Tat pour B232. Une autre étude a établi un complexe stable Rev/B23 en l'absence de RNAR contenant du RRE. En présence de l'ARNm RRE, Rev se dissocie de B23 et se lie de préférence à la RRE VIH, conduisant au déplacement de B2322. On ne sait pas où, au niveau subnucléaire, la transactivation de Tat et le processus d'échange de Rev de B23 pour l'ARNm VIH ont lieu. Les deux protéines sont postulées pour entrer dans le nucléole simultanément par l'interaction B23. On s'attend à ce que d'autres protéines cellulaires d'hôte se chez les personnes vivant dans la voie nucléolif du VIH. Les méthodes décrites dans cette enquête protéomique aideront à élucider l'interaction du nucléole avec les facteurs cellulaires d'hôte impliqués pendant la pathogénie de HIV-1.

L'enquête sur la protéomique a été lancée par l'expression de mutations à un seul point du Rev NoLS (M4, M5 et M6) et de multiples substitutions d'arginine (M2 et M9) pour la production de VIH-1HXB2. Dans ce modèle, une lignée cellulaire HeLa exprimant de façon stable le VIH-1HXB2 (HLfB) est transfectée avec des mutations nucléolaires WT Rev et Rev contenant une étiquette de drapeau à l'extrémité 3' La présence de WT Rev permettra à la réplication virale de se produire dans la culture HLfB, par rapport aux mutations Rev-NoLS qui ne sauvent pas l'insuffisance Rev (M2 et M9), ou permettent la réplication virale de se produire, mais pas aussi efficacement que WT Rev (M4, M5, et M6)1. Le lysate cellulaire est recueilli 48 h plus tard après la prolifération virale en présence de l'expression Rev et soumis à l'immunoprécipitation avec un tampon de lyse optimisé pour l'interaction Rev/B23. L'optimisation de la mémoire tampon de Lyse à l'aide de concentrations variables de sel est décrite, et les méthodes d'élution des protéines pour le VIH-1 Rev sont comparées et analysées dans des gels SDS-PAGE tachés d'argent ou de Coomassie. La première approche protéomique implique l'analyse directe d'un échantillon élucidé de WT Rev, M2, M6 et M9 exprimés par spectrométrie de masse en tandem. Une deuxième approche par laquelle les eluates de WT Rev, M4, M5, et M6 ont subi un processus d'extraction de gel est comparée à la première approche. L'affinité peptide aux mutations de Rev-NoLS par rapport à WT Rev est analysée et la probabilité d'identification de protéine affichée. Ces approches révèlent des facteurs potentiels (nucléolaure et nonnucléolaure) qui participent au transport et à l'épissage de l'ARNm 1 du VIH-1 avec Rev pendant la réplication du VIH-1. Dans l'ensemble, les conditions de lyse cellulaire, de propriété intellectuelle et d'élution décrites s'appliquent aux protéines virales d'intérêt pour la compréhension des facteurs cellulaires de l'hôte qui activent et régulent les voies infectieuses. Ceci est également applicable à l'étude des facteurs d'hôte cellulaire requis pour la persistance de divers modèles de maladie. Dans ce modèle de protéomique, HIV-1 Rev IP est optimisé pour l'interaction B23 pour élucider les facteurs nucléolaux impliqués dans l'activité de fermeture nucléocytoplasmique et la liaison de l'ARNm VIH-1. En outre, des lignées cellulaires exprimant de façon stable des modèles de maladies infectieuses déficientes pour les protéines clés d'intérêt peuvent être développées, semblables à la lignée cellulaire HLfB, pour étudier les voies infectieuses d'intérêt.

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Protocol

1. Culture cellulaire

  1. Maintenir le HLfB dans le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10% de sérum bovin foetal (FBS), 2 mM L-glutamine, et 1 mM de pyruvate de sodium dans les plaques de 100 mm traitées par la culture tissulaire. Maintenir les cultures cellulaires à 37 oC dansun incubateur humidifié fourni avec 5 % de CO 2. Passer les cellules confluentes à une densité cellulaire de 1 x 106 cellules/mL.
  2. Jetez le média de culture cellulaire. Rincer délicatement les cellules avec 10 ml de saline tamponnée par phosphate (PBS). Retirez et jetez le 1x PBS sans perturber la couche cellulaire.
  3. Ajouter 2 ml de 1x trypsine-EDTA solution aux cellules. Versons le plat pour enrober la monocouche et couver à 37 oC dans une chambre humidifiée pendant 5 min.
  4. Appuyez fermement sur le côté du plat avec la paume de la main pour détacher les cellules. Resuspendre les cellules détachées dans 8 ml de médias de culture fraîche. Faire tourner les cellules à 400 x g pendant 5 min.
  5. Jetez le support de culture sans perturber la pastille cellulaire. Resuspendre la pastille cellulaire dans 10 ml de médias de culture fraîche. Sous-culture 1 ml de cellules concentrées avec 9 ml de culture fraîche dans les plaques de 100 mm traitées par la culture des tissus.
    REMARQUE : Pour chaque mutation Rev-NoLS, les plaques de culture HLfB ou HeLa de 3x 100 mm donneront assez de lysate de protéine pour l'analyse de tache occidentale et la spectrométrie de masse. Ajoutez des plaques supplémentaires pour un contrôle positif WT Rev et un contrôle négatif. Le volume des cellules de sous-culture nécessitera une optimisation avec l'utilisation de différents types de cellules.

2. Expression des mutations Rev-NoLS-3'flag pendant la réplication du VIH-1

  1. Cultivez la culture cellulaire HLfB à une densité cellulaire de 2 x 106 cellules/mL. Préparer 4 ml de suspension phosphate-ADN de calcium pour chaque plaque de 100 mm comme suit.
    1. Étiqueter deux tubes de 15 ml de 1 et 2. Ajouter 2 mL de 2x HBS (0,05 M HEPES, 0,28 M NaCl, et 1,5 mM Na2HPO4 [pH 7.12]) au tube 1. Ajouter TE 79/10 (1 mM Tris-HCl et 0,1 mM EDTA [pH 7.9]) au tube 2. Le volume de TE 79/10 est de 1.760 ml - le volume de l'ADN.
    2. Ajouter 20 g de plasmide contenant la mutation Rev-NoLs-3'flag d'intérêt au tube 2 et mélanger son contenu par la résuspension. Ajouter 240 l de 2 M CaCl2 au tube 2 et mélanger à nouveau par la résuspension.
    3. Transférer le mélange de tube 2 dans le tube 1 dropwise, en mélangeant doucement. Laisser reposer la suspension à température ambiante pendant 30 min. Vortex les précipitations.
  2. Ajouter 1 ml de la suspension dans le sens de la chute à chacune des plaques de culture à 3 cellules de 100 mm tout en faisant tourbillonner doucement le support. Remettre les plaques dans l'incubateur et laisser le mélange de transfection pendant 6 h. Remplacer le mélange de transfection par 10 ml de culture fraîche et incuber les cellules pendant 42 h.

3. Collecte de lysate de protéine virale

  1. Jeter le support cellulaire 48 h posttransfection. Déposer chaque plaque de 100 mm sur un lit de glace. Étiquetez les tubes de 15 ml pour chaque échantillon de mutation Rev-NoLS et placez les tubes sur la glace.
  2. Rincer délicatement les cellules avec 10 ml de 1x PBS préréfrigéré sans perturber la couche cellulaire. Jeter le 1x PBS. Ajouter 3 mL de tampon de lyse (50 mM Tris-HCl [pH 8,0], 137 mM NaCl, et 1 % de détergent X-100 [voir la Table des matériaux]),traité avec un cocktail inhibiteur de la protéase, à chacune des plaques de 100 mm.
  3. Utilisez un grattoir cellulaire pour perturber la couche cellulaire. Inclinez la plaque et grattez doucement et rassemblez les cellules dans une piscine. Recueillir le lysate cellulaire à l'aide d'une micropipette de 1 000 l et mélanger les lysates cellulaires de chacune des trois plaques de 100 mm dans le tube préétiqueté de 15 ml.
  4. Incuber le lysate cellulaire sur la glace pendant 15 min, en vortexant toutes les 5 min. Centrifugeuse la cellule lysaté à 15 000 x g pendant 5 min.
  5. Recueillir le supernatant de protéines sans perturber la pastille de débris cellulaires et le transférer dans un autre tube stérile de 15 ml. Obtenir la concentration de lysate de protéine virale en utilisant la méthode Bradford (voir la section 4).
  6. Enregistrer un aliquot de l'échantillon d'entrée (20 g) pour l'analyse des immunoblots occidentaux. Ajouter 2x tampon d'échantillon (20% de glycérol, 0,02% bleu bromophenol, 125 mM Tris-Cl [pH 6.8], 5% SDS, et 10% 2-mercaptoethanol) au volume final. Faites-le bouillir à 95 oC pendant 10 min, et conservez l'échantillon d'entrée à -20 oC.

4. Bradford d'assay

REMARQUE : Préparer 10x albumine de sérum bovin (BSA) à partir du stock 100x BSA avant de générer des courbes standard de protéines.

  1. Aliquot eau dans les tubes de microcentrifuge pour le blanc suivant et les normes: Blank 800 L; Norme 1 à 2 mg/ml, 798 oL; Norme 2 à 4 mg/ml, 796 oL; Norme 3 à 6 mg/ml, 794 oL; Norme 4 à 8 mg/ml, 792 l; Norme 5 à 10 mg/mL, 790 oL Aliquot 10x BSA selon les normes désignées suivantes : Norme 1 à 2 l; Norme 2 à 4 l; Norme 3 à 6 l; Norme 4 à 8 l; Norme 5 à 10 l.
  2. Préparer un mélange d'échantillons de protéines en mélangeant 795 l'eau avec 5 ll d'échantillons de protéines. Ajouter 200 l de réagent de colorant d'analyse de protéine (voir le tableau des matériaux)à chaque échantillon blanc, standard, et protéine. Vortex les échantillons brièvement pour un mélange uniforme et couver à température ambiante (18-20 oC) pendant 5 min.
  3. Transférer les échantillons de blanc, de normes et de protéines dans les cuvettes. Mesurer les concentrations protéiques à une OD de 595 nm.

5. Coimmunoprécipitation du Rev-NoLS-3'flag

  1. Rincer 25 l de perles de gel d'affinité M2 (voir le Tableau des matériaux) avec 500 lde de tampon de lyse, traité avec un cocktail inhibiteur de la protéase. Rincer plus de perles de gel d'affinité pour chaque échantillon de mutation et contrôles.
    REMARQUE : Préparez suffisamment de perles de gel d'affinité M2 pour deux gels (50 l) - l'un pour l'analyse d'immunoblot occidental et l'autre pour la coloration des protéines et la spectrométrie de masse.
  2. Faire tourner à 820 x g pendant 2 min à 4 oC. Retirez le supernatant. Rincer 2fois de plus.
  3. Ajouter le lysate de protéine virale (1 mg/mL dans 5 ml de volume total) aux perles d'affinité M2 prérinées. Ajuster le volume total à l'aide de la mémoire tampon de lyse.
  4. Incuber la réaction pendant 3 h, en tournant à 4 oC. Centrifugeuse des perles d'affinité M2/lysate de protéine virale à 820 x g pendant 1 min.
  5. Recueillir le supernatant et enregistrer un aliquot de l'échantillon post-IP (20 g) pour l'analyse immunoblot occidentale. Mesurer la concentration protéique du lysate post-IP. Recueillir 20 g pour l'immunoblotting occidental.
  6. Ajouter un tampon d'échantillon 2x au volume final. Faites-le bouillir à 95 oC pendant 10 min, et stockez l'échantillon post-IP à -20 oC.
  7. Rincer les perles M2 avec 750 l de tampon de lyse et laver les perles sur un rotateur à 4 oC pendant 5 min. Centrifuger les perles M2 à 820 x g et jeter le supernatant.
  8. Répétez les étapes 5.7 pour deux autres lavages sur un rotateur à 4 oC pendant 5 min. Après le troisième lavage, retirez toute trace de tampon de lyse du complexe de perles M2/co-IP à l'aide d'une longue pointe de chargement de gel.
    REMARQUE : Pincez l'extrémité de la pointe de gel-chargement avec des pinces plates avant d'enlever toutes les quantités de trace du tampon de lyse. Cela permettra d'éviter la perturbation et l'apaisement des perles M2.
  9. Resuspendre les perles M2 dans 55 ll de tampon de chargement 2x. Faire bouillir l'échantillon à 95 oC pendant 10 min.
  10. Chargez 25 ll d'éluhesur deux gels SDS-PAGE distincts (un gel pour l'immunoblotting occidental et l'autre pour la coloration Coomassie).

6. Préparation des gels SDS-PAGE

  1. Lancer deux gels de résolution SDS-acrylamide de 15 % en mélangeant les réactifs suivants dans un tube de 50 ml (à un volume final de 40 ml, assez pour quatre gels) : 4,16 ml d'eau ultrapure, 15 ml d'acrylamide de 40 % :bisacrylamide (29:1), 10 ml de 1,5 M Tris-HL (pH 8.8) , 400 L de 10 % de SDS, 400 L de 10 % de persulfate d'ammonium et 40 L de TEMED.
  2. Mélanger le gel de résolution en inversant le tube de 50 ml plusieurs fois. Pipette le mélange de gel de résolution dans un appareil de gel occidental prénettoyé (quatre gels - trois pour l'immunoblotting occidental et un pour Coomassie/coloration d'argent).
  3. Doucement pipette assez d'eau pour couvrir la couche supérieure du mélange de gel. Laissez le gel de résolution polymériser.
  4. Verser la couche d'eau du gel de résolution, à l'aide d'un essuie-glace délicat (voir la Table des Matériaux)pour absorber tout excès d'eau.
  5. Lancer deux gels d'empilement SDS-acrylamide de 5 % en mélangeant les réactifs suivants dans un tube de 50 ml (à un volume final de 20 ml, assez pour quatre gels): 11,88 ml d'eau ultrapure, 2,5 ml d'acrylamide de 40% :bisacrylamide (29:1), 5,2 ml de 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) , 200 L de 10 % de SDS, 200 L de 10 % de persulfate d'ammonium et 20 L de TEMED.
  6. Mélanger le gel d'empilage en inversant le tube de 50 ml plusieurs fois. Pipette le mélange de gel d'empilage au-dessus du gel de résolution au dessus de l'appareil.
  7. Placez un peigne à cassette en gel contenant le nombre approprié de voies dans le gel d'empilage. Absorber tout débordement du mélange de gel à l'aide d'un essuie-glace délicat (voir le Tableau des matériaux). Laissez le gel d'empilage polymériser complètement.
  8. Inondez l'appareil de gel occidental avec 1x tampon de fonctionnement occidental (5x concentration : 250 mM Tris-Cl [pH 8.3], 1,92 M de glycine, 0,5 % de SDS et 10 mM EDTA).
  9. Tirez doucement le peigne à cassette de gel du gel d'empilage. Laissez le tampon de fonctionnement 1x ouest pour remplir les puits de chargement. Rincer chaque puits avec un tampon de fonctionnement 1x western à l'aide d'une seringue avant de charger les échantillons.
  10. Chargez les échantillons d'immunoblot occidentaux dans chaque gel correspondant (échantillons d'entrée, échantillons coimmunoprécipités et échantillons post-IP). Chargez les marqueurs de protéines de gel de l'Ouest.
  11. Chargez les échantillons coimmunoprécipités pour la coloration Coomassie/argent dans un autre gel. Chargez les marqueurs de protéines de gel de l'Ouest.
  12. Connectez l'appareil de gel en marche à une source d'alimentation et exécutez les gels à 100 V jusqu'à ce que le colorant de chargement atteigne le gel de résolution. Augmenter la tension à 140 V jusqu'à ce que le colorant de chargement atteigne le fond du gel de résolution.

7. Transfert de blot occidental

  1. Démonter l'appareil de gel occidental. Trancher et jeter le gel d'empilage, en laissant le gel de résolution intact.
  2. Transférer délicatement les gels résolvants sur un plateau propre rempli de tampon de transfert occidental (25 mM Tris, 194 mM de glycine, 0,005% SDS, 20% de méthanol) et les faire tremper pendant 15 min.
  3. Assembler l'appareil de transfert de gel comme suit.
    1. Couper trois membranes de transfert PVDF et six morceaux de papier filtre (voir le tableau des matériaux)à la taille du gel de résolution.
    2. Faire tremper la membrane PVDF dans du méthanol pendant 5 min. Hydratez-la dans l'eau pendant 5 min. Placez la membrane PVDF dans le tampon de transfert occidental jusqu'à ce qu'elle soit prête à l'utiliser.
    3. Placez la cassette de porte-gel dans une plaque à pâtisserie en verre remplie partiellement de tampon de transfert occidental, avec le côté noir au fond.
    4. Placez un tampon de mousse imbibé de tampon de transfert occidental contre le côté noir de la cassette de porte-gel.
    5. Mouillez un morceau de papier filtre dans le tampon de transfert occidental et placez-le sur le dessus du tampon de mousse. Placer le gel résolvant sur le papier filtre.
      REMARQUE : Placez le gel de résolution dans l'orientation de chargement correcte à transférer à la membrane PVDF.
    6. Placez une membrane de transfert PVDF sur le gel de résolution. Mouillez un morceau de papier filtre avec un tampon de transfert occidental et placez-le sur la membrane de transfert PVDF.
    7. Placez un autre tampon de mousse imbibé de tampon de transfert occidental sur le papier filtre. Pliez délicatement le côté blanc de la cassette de porte-gel sur le dessus du tampon de mousse trempé. Verrouillez la cassette.
    8. Placez la cassette de support de gel dans l'assemblage d'électrode d'appareil de transfert. Répétez les étapes 7.3.4-7.3.8 pour chaque gel de résolution restant.
    9. Remplissez le réservoir de l'appareil de transfert avec un tampon de transfert occidental. Placer une tige remuante dans le réservoir de l'appareil.
    10. Placer le réservoir de l'appareil sur une plaque à remuer. Ajustez le réglage de remuer à 5-6, en vous assurant que la barre d'agitation n'est pas coincée ou en frappant les cassettes de porte de gel.
    11. Connectez l'appareil de transfert de gel à une source d'alimentation et transférez le gel à 100 V pendant 1 h à 4 oC.

8. Immunoblotting

  1. Retirez la cassette du porte-gel et placez le côté noir contre une plaque à pâtisserie en verre propre. Ouvrez la cassette et jetez soigneusement le tampon de mousse et le papier filtre. Marquez un coin de la membrane PVDF pour identifier la bonne orientation de chargement. Gardez la membrane humide.
    REMARQUE : La membrane PVDF peut être séchée à l'air et stockée dans un contenant propre et scellé. Réhydratez la membrane en répétant les étapes 7.3.2.
  2. Placez la membrane dans 100 ml de solution de blocage (5 % de lait, 1x SCT et 0,1 % d'entre eux 20). Bloquer la membrane par bascule douce à température ambiante (18-20 oC) pendant 1 h.
  3. Couper la membrane au-dessus du marqueur protéique de 25 kDa. Placez la partie supérieure de la membrane, contenant des bandes protéiques de plus de 25 kDa, dans la solution de blocage contenant b23 souris monoclonal IgG1 (1:500 dilution). Bloquer toute la nuit, en se balançant à 4 oC.
  4. Placez la partie inférieure de la membrane, contenant des bandes protéiques inférieures à 25 kDa, dans la solution de blocage contenant M2 souris monoclonal IgG1 (1:1,000 dilution, voir le tableau des matériaux). Bloquer toute la nuit, en se balançant à 4 oC.
  5. Laver la membrane 3x pendant 10 min en 25 ml de solution de lavage occidentale (1x TBS, 0,1% Tween 20) sur une plate-forme à bascule.
  6. Incuber les membranes dans la chèvre-anti-souris IgG1-HRP (1:5,000 dilution) diluée dans la solution de blocage pendant 1 h à température ambiante. Laver la membrane 3x pendant 10 min en 25 ml de solution de lavage occidentale sur une plate-forme à bascule.
  7. Préparer le substrat de blotting occidental de chemiluminescence. Utilisez une micropipette p1000 pour ajouter le substrat à la membrane.
  8. Développer chaque membrane dans le substrat de blotting occidental de chemiluminescence pendant 5 min. Enlevez la membrane du substrat. Absorber l'excès de substrat à l'aide d'un essuie-glace délicat (voir le Tableau des matériaux).
  9. Placez la membrane dans un protecteur de feuille propre scotché à l'intérieur d'une cassette. Emmenez la cassette dans une pièce sombre et placez une feuille de film dans la cassette. Verrouillez la cassette en place et incubez pendant 5 à 15 min. Retirez le film de la cassette et développez-le.

9. La coloration de Coomassie

  1. Démonter l'appareil de gel occidental. Trancher et jeter le gel d'empilage, en laissant le gel de résolution intact. Transférer délicatement le gel résolvant sur un plateau propre rempli de 25 ml d'eau ultrapure.
  2. Incuber le gel sur une plate-forme de bascule pendant 15 min. Utilisez un basculement doux pour empêcher le gel résolvant de se briser. Jeter l'eau ultrapure et répéter l'étape de lavage 2x plus.
    REMARQUE : Si des bulles DeSD demeurent après les étapes de lavage, le gel peut être lavé dans de l'eau ultrapure pendant la nuit. Les SDS résiduels peuvent causer une coloration de fond élevée du gel.
  3. Mélanger le réactif à la tache Coomassie en inversant la bouteille (voir la Table des Matériaux). Placer 100 ml de réactif à la tache Coomassie pour couvrir le gel résolvant et incuber le gel sur une plate-forme de bascule pendant 1 h. Jetez le réactif de tache de Coomassie et lavez le gel dans l'eau déionisée sur une plate-forme de bascule pendant 15 min.
  4. Jeter l'eau déionisée. Répétez l'étape de lavage 2x plus. Continuer à laver le gel jusqu'à ce que la résolution désirée des bandes protéiques soit observée.

10. Coloration argentée

  1. Démonter l'appareil de gel occidental. Trancher et jeter le gel d'empilage, en laissant le gel de résolution intact. Transférer délicatement le gel résolvant sur un plateau propre rempli de 25 ml d'eau ultrapure.
  2. Incuber le gel sur une plate-forme de bascule pendant 15 min. Utilisez un basculement doux pour empêcher le gel résolvant de se briser. Jeter l'eau ultrapure et répéter l'étape de lavage 2x plus.
    REMARQUE : Si des bulles DeSD demeurent après les étapes de lavage, le gel peut être lavé dans de l'eau ultrapure pendant la nuit. Les SDS résiduels peuvent causer une coloration de fond élevée du gel.
  3. Fixez le gel dans 30% d'éthanol: 10% solution d'acide acétique (6:3:1 eau:ethanol:acide acétique) pendant la nuit à température ambiante. Laver le gel dans une solution d'éthanol de 10 % pendant 5 min à température ambiante. Remplacer la solution d'éthanol et laver pendant encore 5 min.
  4. Préparer la solution de travail de sensibilisation du kit de tache argentée pierce en mélangeant un sensiplusateur de tache argenté d'une partie avec 500 parties d'eau ultrapure (50 l de sensitizer avec 25 ml d'eau ultrapure). Incuber le gel résolvant dans la solution de travail de sensibilisation pendant 1 min. Laver le gel dans de l'eau ultrapure pendant 1 min, remplacer l'eau, et laver le gel à nouveau pendant 1 min.
  5. Préparer la solution de travail de tache en mélangeant l'améliorateur de tache argenté d'une partie avec la tache argentée de 50 parties (500 l d'exhausteur avec 25 ml de tache argentée). Incuber le gel dans la solution de travail de tache pendant 30 min.
  6. Préparer la solution de travail développeur en mélangeant 1 partie d'amélioration de tache d'argent avec 50 parties de développeur de taches d'argent (500 l d'améliorateur avec 25 ml de développeur). Préparer 5% solution d'acide acétique comme solution d'arrêt. Laver le gel avec de l'eau ultrapure pendant 1 min, remplacer l'eau, et laver le gel pendant 1 min supplémentaire.
  7. Remplacer l'eau par une solution de travail du développeur et incuber jusqu'à ce que l'intensité souhaitée de la bande protéique soit résolue (5 min). Remplacez la solution de travail du développeur par une solution stop et incubez pendant 10 min.

11. Réduction in-gel, alkylation et digestion des bandes de gel tachées de Coomassie

  1. Couper les bandes de gel du gel à l'aide d'une lame de rasoir propre. Couper chaque bande de gel en cubes d'environ 5 mm et les placer dans un tube microcentrifuge propre de 0,5 ml.
  2. Détainles les morceaux de gel en les recouvrant de 100 mM de bicarbonate d'ammonium en 1:1 acétonitrile :eau à température ambiante pendant 15 min. Jetez le supernatant. Répétez cette étape.
  3. Sécher les morceaux de gel pendant 5 min dans une centrifugeuse sous vide. Réduire les protéines en recouvrant les morceaux de gel séché s'il y a 10 mM de dithiothreitol en 100 mM de bicarbonate d'ammonium et en les incubant pendant 1 h à 56 oC.
  4. Pipette hors de tout supernatant. Alkyler les protéines en recouvrant les morceaux de gel avec 100 mM d'iodoacétamide dans l'eau et en les incubant pendant 1 h à température ambiante dans l'obscurité.
  5. Pipette hors du supernatant et rétrécir les morceaux de gel en les recouvrant avec de l'acétonitrile et en les secouant doucement à température ambiante pendant 15 min. Pipette outre du supernatant et reswell les morceaux de gel en les recouvrant avec le bicarbonate d'ammonium de 100 mM et en les secouant doucement à température ambiante pendant 15 min.
  6. Répétez l'étape 11.5. Sécher les morceaux de gel pendant 5 min dans une centrifugeuse sous vide.
  7. Couvrir les morceaux de gel avec de la trypsine modifiée de séquençage de 50 ng/L (voir le Tableau des matériaux)en bicarbonate d'ammonium de 100 mM. Laisser gonfler le gel pendant 5 min; puis, pipette hors de toute solution restante. Couvrir les morceaux de gel avec 100 mM de bicarbonate d'ammonium et leur permettre de regonfler complètement, en ajoutant 100 mM supplémentaires de bicarbonate d'ammonium afin que les morceaux de gel soient complètement recouverts.
  8. Incuber les morceaux de gel pendant la nuit à 37 oC. Arrêtez la réaction en ajoutant 1/10 du volume de 10% d'acide formique dans l'eau. Recueillir le supernatant de chaque tube.
  9. Extraire les morceaux de gel en les recouvrant de 1% d'acide formique dans 60% d'acétonitrile et les incuber pendant 15 min avec des secousses douces.
  10. Réduire le volume des supernatants combinés à moins de 20 l dans une centrifugeuse sous vide, tout en prenant soin d'éviter de sécher complètement les supernatants. Ajouter 1 % d'acide formique pour ramener le volume total à 20 l.

12. Chromatographie liquide/spectrométrie de masse

REMARQUE : Les échantillons ont été analysés à l'aide d'un spectromètre de masse équipé d'ultra HPLC, d'une source de nanospray et d'une colonne (voir le Tableau des matériaux). Les solvants A et B sont respectivement de 0,1 % d'acide formique dans l'eau et l'acétonitrile.

  1. Chargez les protéines digérées en flacons d'ausampler en polypropylène à haute récupération. Chargez les flacons dans le gestionnaire d'échantillons d'un système UPLC.
  2. Injecter 6 ll de chaque échantillon. Chargez chaque échantillon sur la colonne de piégeage du nanotile pendant 1,5 min à 8 l/min, à l'aide d'un solvant A/1 % solvant B à 99 %.
  3. Élilez les peptides dans le spectromètre de masse avec un gradient linéaire de 3 % à 35 % du solvant B sur 30 min, suivi d'un gradient de 35 % à 50 % du solvant B sur 4 min et de 50 % à 90 % du solvant B sur 1 min. Maintenir 90 % d'acétonitrile pendant 3 min; puis réduire le %B à 3% sur 5 min.
  4. Acquérir des données spécifiques de masse de profil ionique positif en mode résolution (20 000 résolutions). Acquérir des données de 100 à 2 000 Da à un taux d'une analyse par 0,6 s. Acquérir des données en mode MSE en alternant les balayages sans énergie de collision et les balayages avec l'énergie de collision élevée.
  5. Pour l'énergie de collision élevée, rampez l'énergie de collision dans la cellule Trap de 15 V à 40 V. Acquerlez un balayage de masse de serrure tous les 30 s, en utilisant l'ion no 2 de [Glu1]-Fibrinopeptide B comme masse de verrouillage. Acquérir un fichier de données à l'aide d'une injection blanche de solvant A, en utilisant la même méthode d'acquisition entre chaque paire d'échantillons pour contrôler le report.

13. Analyse des données pour la spectrométrie de masse

  1. Copiez les fichiers de résultats de spectrométrie de masse à l'ordinateur exécutant une plate-forme de recherche quantitative et qualitative en protéomique (p. ex., ProteinLynx Global Server). L'analyse des données est très intensive en CPU et doit être effectuée sur un ordinateur d'analyse de données distinct et performant.
  2. Créez un nouveau projet pour les données. Créez une nouvelle plaque de microtimètre représentant la plaque d'autosampler. Attribuez les échantillons à la même position dans la plaque de microtiter que leur position dans l'autosampler.
  3. Attribuez à chaque exemple de paramètres de traitement. Les paramètres à utiliser sont la largeur de pointe chromatographique automatique et la résolution MSTOF; seuil de faible énergie, 100 comptes; seuil d'énergie élevée, 5 dénombrements; seuil d'intensité, 500 comptes.
  4. Attribuez à chaque exemple de paramètres de flux de travail. Les paramètres à utiliser sont la base de données, l'humain concatenated SwissProt et le VIH, avec des séquences inversées; tolérance automatique au peptide et aux fragments; min fragment ion correspond par peptide, 3; min fragment ion correspond par protéine, 7; min peptide correspond par protéine, 1; réactif de digestion primaire, trypsine; clivages manqués, 1; réactifs modificateurfixefixe, carbamidomethyl C; réactifs modificateurs variables, oxydation M; fausse découverte, 100.
  5. Sélectionnez les échantillons et choisissez Process Latest Raw Data. Lorsque la recherche est terminée, sélectionnez les échantillons et choisissez Les données d'exportation à l'échafaud (version 3). Ouvrez L'échafaudage, créez un nouveau fichier et importez chaque fichier exporté à partir de la plate-forme protéomique comme un nouveau bioéchantillon utilisant la quantitation des ions précurseurs.
  6. Lorsque tous les fichiers ont été importés, passez à l'écran de données de charge et d'analyse. Sélectionnez la même base de données utilisée pour les données de recherche et d'importation à l'aide de la notation LFDR et du groupement standard de protéines à l'échelle de l'expérience. Définir les options d'affichage à la probabilitéd'identification des protéines , le seuil de protéines à 20%, le nombre minimum de peptides à 1, et le seuil de peptide à 0% au cours de l'analyse.

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Representative Results

Rev-NoLS single- et multiple-point mutations arginine, correspondant à une variété de modèles de localisation subcellulaire, ont été examinés dans leur capacité à interagir avec les facteurs de l'hôte cellulaire par rapport à WT Rev. WT Rev-3'flag et pcDNA-flag vecteur ont été exprimés dans la culture HLfB. Des complexes de protéine ont été traités du lysate total de cellules et souillés avec le réactif argenté de tache. Rev-NoLS-3'flag est détectable (environ 18 kDa) dans trois conditions tampons de lyse différentes contenant diverses concentrations de NaCl (137 mM, 200 mm et 300 mM) dans la figure 1. Le B23 était détectable (37 kDa) dans un tampon de lyse contenant une concentration de sel plus faible (137 mM, voies 2 à 4), à peine détectable dans le tampon de lyse contenant 200 mM NaCl, et indétectable dans la mémoire tampon de lyse contenant une concentration élevée de sel (300 mM NaCl). Dans la figure 2, WT Rev-3'flag, Rev-NoLS M1-3'flag, et pcDNA-flagvector ont été exprimés dans la culture HLfB. Les complexes protéiques ont été traités à partir de lysates cellulaires totaux préparés à partir de deux conditions tampons de lyse (137 mM et 200 mM NaCl). M2 souris monoclonal IgG1 a été utilisé dans la détection de Rev-3'flag expression de lysates cellulaires. La détection B23 était optimale dans la mémoire tampon de lyse contenant 137 mM NaCl avec WT Rev-3'flag (entrée et IP de drapeau-Rev) mais a perdu l'affinité avec Rev-NoLS M1-3'flag. L'affinité B23 avec le wT Rev-3'flag a diminué avec une concentration plus élevée de sel dans la mémoire tampon de lyse contenant 200 mM NaCl. le contrôle négatif decDNA n'a pas donné l'immunodétection non spécifique dans l'entrée et la PI de '-flag-Rev de toutes les conditions tampons de lyse.

Les conditions d'élution ont été optimisées pour la propriété intellectuelle Rev-NoLS-3'flag à la figure 3. WT Rev-3'flaget p cDNA-flag vector ont été exprimés dans la culture HLfB. Les complexes protéiques ont été traités à partir de lysates cellulaires totaux et élifiés à l'aide de trois conditions différentes pour éradiquer le fond de chaîne léger et lourd (25 et 50 kDa) - 2x tampon de chargement de l'échantillon à 37 oC pendant 15 min, tampon de chargement de l'échantillon 2x à 95 oC pour 3 min, et 3x peptid drapeau e à 4 oC pendant 30 min. Le drapeau Rev NoLS-3'flag (18 kDa) était le plus détectable après l'élution par ébullition dans un tampon de chargement d'échantillon 2x. Le B23 (37 kDa) était détectable dans deux conditions : incubation de 37 oC dans un tampon de chargement de l'échantillon de 2x pendant 15 min et d'incubation de 95 oC dans un tampon de chargement de l'échantillon de 2 x pendant 3 min.

M2 (nucléaire/nucléolar dans la localisation, non fonctionnel dans la production de HIV-1HXB2), M6 (nucléolar dans le modèle, fonctionnel dans la production de HIV-1HXB2), et M9 (dispersé dans le cytoplasme/noyau, non fonctionnel dans la production virale) ont été exprimé dans la culture HLfB. Les complexes protéiques ont été traités à partir du lysate total des cellules, ont été évacués à 95 oC d'incubation dans un tampon de chargement de l'échantillon de 2 x pendant 3 min, et résolus dans un réactif de taches argentées (figure 4). WT Rev était détectable après la réaction du drapeau IP. Rev-NoLS M2, M6 et M9 étaient également détectables à 18 kDa. Des bandes correspondant à la protéine B23 ont été observées au marqueur de 37 kDa. Des complexes protéiques ont été observés dans chaque voie correspondant aux réactions IP de WT Rev, M2, M6, M9, et pcDNA contrôle négatif de fond. Les lysates protéiques ont été analysés par immunodétection pour le drapeau-Rev et le B23. Des niveaux abondants de WT Rev et modérés de M6 ont été exprimés (entrée du drapeau) et détectables après drapeau IP (IP de drapeau,« - Figure 5). M2 et M9 n'ont pas été fortement exprimés à partir de 20 g d'entrée de lysate protéique, mais détectables à faible intensité après le drapeau IP de 5 mg de lysate protéique. p Le contrôle négatif decDNA n'a pas donné l'immunodétection non spécifique dans l'entrée et la propriété intellectuelle de '-flag-Rev. L'affinité B23 avec WT Rev a été observée après la réaction du drapeau IP (B23 co-IP). L'affinité De B23 a été légèrement observée avec M2 (deux mutations à un seul point R48,50G) et M6 (mutation à un seul point R50G). L'affinité De B23 a été perdue en présence de trois mutations à un seul point de M9 (R46,48,50G) dans Rev-NoLS.

Les lysates totaux des mutations immunoprécipitées de WT Rev et rev-NoLS-3'flag (4, 5, 6, et 8) ont été traitées, souillées avec le réactif de Coomassie, et visualisées par rapport aux dilutions sérielles de BSA (panneau droit). Rev-NoLS-3'flag est détectable (12,5-25 g) en présence et en absence de mutations à 18 kDa (figure 6). Les complexes protéiques traités à partir des réactions IP de WT Rev-3'flag, nucléolar-localisant Rev-NoLS-3'flag mutations (M4, M5, et M6), et le contrôle négatif pcDNA-flagont été visualisés dans les gels SDS-PAGE tachés de réactif Coomassie ( Figure7). WT Rev (WT1 et WT2) était détectable après une réaction du drapeau IP à 18 kDa. Les mutations de Rev-NoLS étaient légèrement détectables après expression dans la réaction de hLfB et de drapeau IP. le contrôle négatif decDNA n'a pas produit le fond non spécifique à 18 kDa.

Les lysates immunoprécipitées préparés à partir du drapeau WT Rev-3'flag, M2, M6, M9, et du drapeau pcDNAde contrôle négatif (montré dans la figure4) ont été analysés par spectrométrie de masse en tandem. La probabilité d'identification des protéines (en pourcentages) est affichée pour la comparaison des interactions protéiques se produisant avec chaque mutation Rev-NoLS localisée des nucléolaire par rapport à WT Rev (tableau 1). Les protéines cellulaires, dont certaines sont nucléolaires dans le modèle de localisation (isoformes ribosomal, facteur d'initiation de traduction eucaryotique 48, boîte de snoRNA C/D 58B, et nucléophosmin B23), ont été identifiées en tant que partenaires de liaison directs/indirects de WT Rev. Ces nucléolar ces nucléolar les facteurs ont perdu l'affinité de liaison à M2 (deux mutations d'un point R48,50G), M6 (mutation à un seul point R50G), et M9 (trois mutation salitaine R46,48,50G), semblable au contrôle négatif de pcDNA. Chaque voie du gel taché de Coomassie à la figure 6 a été traitée pour la spectrométrie de masse en tandem (tableau 2). L'affinité peptide aux mutations rev-NoLS a été analysée et affichée à l'aide de la probabilité d'identification des protéines (en pourcentages). Une variété de protéines cellulaires, dont certaines sont nucléolar dans le modèle de localisation (nucléoline C23, nucléophosme B23, et protéine d'assemblage nucléosome), ont été identifiés comme facteurs de liaison directe/indirecte de protéine de WT Rev. Ces facteurs nucléolaires n'étaient pas muniait m4, M5 et M6. Les facteurs de transport ARHGEF1 (facteur d'échange de nucléotides de guanine de rho 1) et TBC1D24 (famille de domaine TCB1, membre 24) ont été perdus dans l'affinité en présence des mutations de Rev-NoLS. Des facteurs d'épiplication hnRNPC (protéine ribonuclear hétérogène C) et PNN (pinin, protéine desmosome-associée) ont été en outre observés pour se lier à WT Rev, qui a perdu l'interaction avec Rev des mutations nucléolées à un seul point.

Figure 1
Figure 1 : Optimisation des conditions de lyse cellulaire pour la co-PI Rev-3'flag pendant la production du VIH-1. WT Rev-NoLS-3'flag etcontrôle négatif p cDNA-flag ip conditions ont été optimisés dans trois différentes concentrations de NaCl (137 mM, 200 mM, et 300 mM) dans la mémoire tampon de lyse. Comme on l'a observé par la coloration argentée, 137 mM NaCl était la concentration optimale de sel pour rev immunoprecipitation et B23 liant. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Optimisation des conditions de lyse pour la co-IP Rev-3'flag et l'immunodétection B23 pendant la production du VIH-1. WT Rev-NoLS-3'flag, M1-3'flag, andnegative control p cDNA-flag IP conditions were optimized in two different NaCl concentrations (137 mm and 200 mM) in lysis buffer. Comme observé par immunodétection, 137 mM NaCl était la concentration optimale de sel pour rev immunoprecipitation et B23 liaison. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Optimisation de l'élution de la copropriété Rev-3'flag pendant la production du VIH-1, visualisée par des taches d'argent. Les complexes protéiques ont été traités à partir delysates cellulaires totaux préparés pendant la propriété IP WT Rev-3'flag et p cDNA-flag. Trois conditions d'élution différentes ont été testées : un tampon de chargement de l'échantillon de 2x à 37 oC pour 15 min, un tampon de chargement de l'échantillon 2x à 95 oC pour 3 min et un peptide de drapeau 3x à 4 oC pour 30 min. Les conditions optimales d'élution de WT Rev se sont produites après la période d'incubation de 15 minutes dans le tampon de chargement de l'échantillon 2x à 37 oC et après la période d'incubation de 3 min dans le tampon de chargement de l'échantillon 2x à 95 oC. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Immunoprécipitation des mutations Rev-3'flag 2, 6 et 9 pendant la production du VIH-1. Les complexes protéiques qui se sont liés directement/indirectement avec WT Rev, M2 (R48,50G), M6 (R50G), M9 (R46,48,50G), et le contrôle négatif pcDNA-flagen présence de la réplication DU VIH-1 sont représentés dans un gel SDS-PAGE taché d'argent. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Rev-3'flag co-IP des mutations 2, 6 et 9 pour l'immunodétection B23 pendant la production du VIH-1. Les lysates protéiques et les réactions IP préparées à partir de WT Rev, M2, M6, M9, et le contrôle négatif pcDNA-flag à la figure 4 ont été analysés plus en détail par immunodétection pour le drapeau-Rev et B23. WT Rev et l'expression mutante, ainsi que l'interaction avec la protéine nucléocytoplasmique B23, sont observées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Quantification des mutations Rev-NoLS 4, 5, 6 et 8 après la réaction IP du drapeau . Les réactions IP de HLfB exprimant WT Rev et nucléolar-localisation M4 (R46G), M5 (R48G), M6 (R50G), M8 (RQ), et le contrôle négatif pcDNA-flagont été mesurées pour la concentration de protéines en utilisant des dilutions en série BSA. Une concentration protéique de 12,5 à 25 g a été observée pour chaque échantillon. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : Immunoprécipitation des mutations Rev-NoLS localisées nucléolar 4, 5 et 6 pendant la production du VIH-1. Le gel SDS-PAGE taché de Coomassie contenant des complexes protéiques immunoprécipités de WT Rev (1 et 2), M4, M5 et M6 sont présentés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Protéines identifiées Poids moléculaire Révérend WT M2 (M2) M6 (en) M9 (en)
particule de reconnaissance de signal 14kDa (protéine de liaison homologous d'ARN d'Alu) 15 kDa 95% 0 (en) 0 (en) 0 (en)
protéine ribosomal S3A 30 kDa 95% 0 (en) 0 (en) 0 (en)
facteur d'initiation à la traduction eucaryotique 4B 69 kDa 95% 0 (en) 0 (en) 0 (en)
protéine ribosomal L31 14 kDa 91% 0 (en) 0 (en) 0 (en)
protéine ribosomal L12 18 kDa 93% 0 (en) 0 (en) 0 (en)
protéine ribosomal L22 15 kDa 91% 0 (en) 0 (en) 0 (en)
petit ARN nucléolateur, boîte C/D 58B 15 kDa 87% 0 (en) 0 (en) 0 (en)
doigt de zinc, domaine CCHC contenant 11 185 kDa 87% 0 (en) 0 (en) 0 (en)
actine liant lim protéine 1 79 kDa 79% 0 (en) 0 (en) 0 (en)
protéine ribosomal S13 17 kDa 78% 0 (en) 0 (en) 0 (en)
nucléophosmine (phosphoprotéine nucléolique B23, numatrine) 33 kDa 73% 0 (en) 0 (en) 0 (en)

Tableau 1 : Identification des facteurs de l'hôte cellulaire qui interagissent avec WT Rev pendant la production du VIH-1. Les éluates protéiques préparées à partir de WT Rev, M2, M6 et M9 ont été directement analysées par spectrométrie de masse en tandem. Les interactions protéiques directement/indirectement liées à WT Rev versus M2, M6 et M9 sont résumées par la probabilité d'identification des protéines (en pourcentages).

Protéines identifiées Poids moléculaire M4 (en) M5 (en) M6 (en) pds pCDNA
poly(A) protéine de liaison, cytoplasmique 1 61 kDa 98% 0 (en) 100% 100% 0 (en)
choc thermique 70kDa protéine 1B 70 kDa 100% 100% 100% 100% 0 (en)
protéine ribosomal L7 29 kDa 91% 0 (en) 100% 100% 0 (en)
histone cluster 1, H1e 22 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 100% 0 (en)
protéine ribosomal L4 48 kDa 95% 0 (en) 100% 100% 0 (en)
protéine ribosomal L13 24 kDa 99% 0 (en) 100% 100% 0 (en)
compléter le composant 1, q protéine de liaison sous-composant 31 kDa 100% 100% 100% 100% 0 (en)
Y boîte de liaison protéine 1 36 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 100% 0 (en)
protéine d'assemblage nucléosome 1-like 1 45 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 100% 0 (en)
protéine ribosomal L8 28 kDa 89% 36 % 100% 100% 0 (en)
protéine ribosomal L18 22 kDa 27% 0 (en) 100% 100% 0 (en)
choc thermique 70kDa protéine 8 71 kDa 5% 99% 100% 100% 0 (en)
protéine ribosomal L19 23 kDa 10% 0 (en) 81% 100% 0 (en)
protéine ribosomal L27 16 kDa 92% 0 (en) 100% 100% 0 (en)
protéine ribosomal L7a 30 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 100% 0 (en)
protéine ribosomal L24 18 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 99% 0 (en)
tubulin, bêta classe I 50 kDa 92% 69% 100% 100% 0 (en)
protéine ribosomal L6 33 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 100% 0 (en)
choc thermique 70kDa protéine 9 (mortalin) 74 kDa 33% 99% 100% 100% 0 (en)
protéine ribosomal S2 31 kDa 87% 0 (en) 100% 100% 0 (en)
caséine kinase 2, alpha 1 polypeptide 45 kDa 0 (en) 0 (en) 50% 100% 0 (en)
protéine ribosomal L14 23 kDa 0 (en) 0 (en) 81% 100% 0 (en)
protéine ribosomal, grande, P0 34 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 100% 0 (en)
histone cluster 1, H1b 23 kDa 0 (en) 0 (en) 73% 100% 0 (en)
choc thermique 70kDa protéine 5 (protéine régulée par le glucose) 72 kDa 99% 0 (en) 100% 100% 0 (en)
protéine ribosomal S4, liée à la X 30 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 100% 0 (en)
protéine ribosomal S20 13 kDa 98% 74k 74k 99% 99% 0 (en)
protéine ribosomal L28 16 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 99% 0 (en)
protéine ribosomal S14 16 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 100% 0 (en)
protéine ribosomal S3A 30 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 100% 0 (en)
protéine ribosomal L21 19 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 100% 0 (en)
doigt de zinc de type CCCH, antiviral 1 101 kDa 0 (en) 0 (en) 97% 100% 0 (en)
histone cluster 1, H1c 21 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 98% 0 (en)
protéine ribosomal L36 12 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 100% 0 (en)
protéine ribosomal S18 18 kDa 90% 0 (en) 100% 100% 0 (en)
modulateur de l'apoptose 1 40 kDa 42% 88% 34 % 0 (en) 0 (en)
protéine ribosomal L17 21 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 100% 0 (en)
protéine ribosomal S26 13 kDa 91% 0 (en) 99% 98% 0 (en)
protéine ribosomal L32 18 kDa 0 (en) 0 (en) 48% 100% 0 (en)
protéine ribosomal L35 15 kDa 0 (en) 0 (en) 97% 100% 0 (en)
protéine ribosomal L29 18 kDa 0 (en) 0 (en) 57% 94 % 0 (en)
protéine ribosomal S9 23 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 100% 0 (en)
ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène H1 (H) 51 kDa 98% 0 (en) 100% 100% 0 (en)
protéine ribosomal S8 22 kDa 0 (en) 0 (en) 78% 100% 0 (en)
protéine ribosomal L10 25 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 100% 0 (en)
protéine ribosomal L23a 18 kDa 0 (en) 0 (en) 68 % 100% 0 (en)
protéine ribosomal S6 29 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 100% 0 (en)
protéine ribosomal L31 14 kDa 0 (en) 0 (en) 95% 100% 0 (en)
protéine ribosomal S13 17 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 99% 0 (en)
protéine ribosomal L10a 25 kDa 45% 0 (en) 81% 100% 0 (en)
poly(A) protéine de liaison, cytoplasmique 4 (forme inductible) 70 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 100% 0 (en)
transmembrane emp24 domaine de transport de protéines contenant 1 25 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 100% 0 (en)
Protéine de liaison EBNA1 2 35 kDa 0 (en) 0 (en) 69% 100% 0 (en)
conservé helix-boucle-helix kinase omniprésente 85 kDa 74 % 92% 65% 83% 0 (en)
protéine ribosomal L12 18 kDa 0 (en) 0 (en) 57% 100% 0 (en)
protéine ribosomal S24 15 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 100% 0 (en)
protéine de domaine de choc froid A 40 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 100% 0 (en)
protéine ribosomal L27a 17 kDa 0 (en) 0 (en) 89% 99% 0 (en)
ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène F 46 kDa 0 (en) 0 (en) 99% 99% 0 (en)
protéine ribosomal L11 20 kDa 0 (en) 0 (en) 99% 100% 0 (en)
protéine ribosomal L26-like 1 17 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 100% 0 (en)
caséine kinase 2, alpha prime polypeptide 41 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 100% 0 (en)
tubuline, alpha 1a 50 kDa 33% 0 (en) 100% 0 (en) 0 (en)
protéine ribosomal L3 46 kDa 0 (en) 0 (en) 86% 94 % 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal L15 33 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 99% 0 (en)
nucléolin 77 kDa 0 (en) 0 (en) 25% 100% 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal S21 11 kDa 0 (en) 0 (en) 93% 94 % 0 (en)
KRR1, petit composant de processome de sous-unité (SSU), homolog (levure) 44 kDa 89% 0 (en) 76% 99% 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal S7 28 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 100% 0 (en)
canal chlorure, sensible aux nucléotides, 1A 22 kDa 0 (en) 0 (en) 97% 86% 0 (en)
cyclin B3 158 kDa 0 (en) 0 (en) 67 % 49% 0 (en)
guanine nucléotide liant protéine-like 3 (nucléolar) 61 kDa 0 (en) 0 (en) 99% 98% 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal S23 22 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 50% 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal S22 41 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 99% 0 (en)
nucléophosmine (phosphoprotéine nucléolique B23, numatrine) 33 kDa 0 (en) 0 (en) 52% 97% 0 (en)
protéine ribosomal S19 16 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 99% 0 (en)
déshydrogénase de glycéraldéhyde-3 phosphate 36 kDa 0 (en) 0 (en) 100% 0 (en) 0 (en)
histone cluster 1, H2bg 14 kDa 0 (en) 0 (en) 53% 72% 0 (en)
protéine ribosomal S23 16 kDa 0 (en) 0 (en) 68 % 0 (en) 0 (en)
Facteur d'échange de nucléotides de guanine de Rho (GEF) 1 104 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 94 % 0 (en)
protéine associée à la mort 3 46 kDa 0 (en) 0 (en) 87% 87% 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal S6 14 kDa 0 (en) 0 (en) 52% 84 % 0 (en)
protéine ribosomal L39 6 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 87% 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal S28 21 kDa 0 (en) 0 (en) 85% 99% 0 (en)
histone cluster 1, H4h 11 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 93% 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal L43 23 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 97% 0 (en)
protéine ribosomal S15 17 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 85% 0 (en)
protéine ribosomal S12 15 kDa 0 (en) 0 (en) 68 % 39% 0 (en)
protéine ribosomal L35a 13 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 96% 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal L38 45 kDa 0 (en) 0 (en) 42% 98% 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal S14 15 kDa 0 (en) 0 (en) 45% 76% 0 (en)
phosphodiesterase 5A, cGMP-spécifique 95 kDa 14 % 0 (en) 0 (en) 72% 0 (en)
protéine ribosomal L15 24 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 56% 0 (en)
ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène C (C1/C2) 22 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 100% 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal S16 11 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 92% 0 (en)
protéine ribosomal S15a 15 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 91% 0 (en)
neurexin 2 185 kDa 0 (en) 50% 0 (en) 0 (en) 0 (en)
autisme candidat de susceptibilité 2 139 kDa 0 (en) 0 (en) 46% 0 (en) 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal L17 20 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 92% 0 (en)
facteur d'épissage 3a, sous-unité 1, 120kDa 89 kDa 0 (en) 0 (en) 56% 89% 0 (en)
Famille de domaine La ribonucleoprotein, membre 1 116 kDa 0 (en) 0 (en) 65% 66 % 0 (en)
leprecan-like 2 62 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 68 % 0 (en)
protéine ribosomal L18a 21 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 86% 0 (en)
protéine ribosomal L23 15 kDa 0 (en) 0 (en) 60% 47% 0 (en)
transmembrane emp24 domaine de transport de protéines contenant 9 27 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 78% 0 (en)
particule de reconnaissance de signal 72kDa 75 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 100% 0 (en)
lectine, galactoside-contraignant, soluble, 3 26 kDa 0 (en) 71% 28% 0 (en) 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal L1 37 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 69% 0 (en)
Famille Histone H1, membre X 22 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 96% 0 (en)
caséine kinase 2, bêta polypeptide 25 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 89% 0 (en)
solute transporteur famille 4, cotransporter bicarbonate de sodium, membre 7 118 kDa 82% 0 (en) 0 (en) 0 (en) 0 (en)
Domaine de répétition WD 13 54 kDa 0 (en) 81% 0 (en) 0 (en) 0 (en)
facteur d'allongement de transcription A (SII), 3 17 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 38% 0 (en)
protéine ribosomal S16 16 kDa 0 (en) 0 (en) 75% 0 (en) 0 (en)
Protéine du corps nucléaire SP140 92 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 64 % 0 (en)
otoferlin 227 kDa 62% 0 (en) 0 (en) 0 (en) 0 (en)
transport golgi 1B 15 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 33% 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal S34 26 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 33% 0 (en)
protéine ribosomal L30 13 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 49% 0 (en)
actine liant lim protéine 1 96 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 43% 0 (en)
guanine nucléotide liant protéique-like 2 (nucléolar) 84 kDa 40% 0 (en) 0 (en) 0 (en) 0 (en)
protéine de liaison lipoprotéine de haute densité 141 kDa 0 (en) 0 (en) 34 % 0 (en) 0 (en)
adénosine deaminase, ARN-spécifique, B2 81 kDa 0 (en) 0 (en) 28% 0 (en) 0 (en)
cystatine E/M 17 kDa 0 (en) 27% 0 (en) 0 (en) 0 (en)
protéine de doigt de zinc 786 80 kDa 0 (en) 0 (en) 23% 0 (en) 0 (en)
pleckstrin homology-like domaine, famille B, membre 1 145 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 95% 0 (en)
protéine phosphatase méthylestérase 1 44 kDa 0 (en) 0 (en) 94 % 0 (en) 0 (en)
janus kinase et microtubule interagissant protéine 2 95 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 94 % 0 (en)
particule de reconnaissance de signal 68kDa 67 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 93% 0 (en)
Famille de domaine TBC1, membre 24 63 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 89% 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal L27 16 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 89% 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal L2 24 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 88% 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal S2 33 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 87% 0 (en)
Domaine de répétition Pentatricopeptide 3 79 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 84 % 0 (en)
protéine ribosomal, grande, P2 12 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 76% 0 (en)
IMP (inosine 5'-monophosphate) déshydrogénase 2 56 kDa 0 (en) 0 (en) 76% 0 (en) 0 (en)
tubulin, bêta classe 4B IVb 50 kDa 0 (en) 0 (en) 76% 0 (en) 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal L23 19 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 74 % 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal S31 45 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 74 % 0 (en)
galactose-3-O-sulfotransferase 1 49 kDa 74 % 0 (en) 0 (en) 0 (en) 0 (en)
suppresseur de la variété 4-20 homolog 1 (Drosophila) 99 kDa 0 (en) 72% 0 (en) 0 (en) 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal S25 20 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 70% 0 (en)
domaine ribosomal L1 contenant 1 55 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 70% 0 (en)
famille avec séquence similitude 110, membre D 29 kDa 69% 0 (en) 0 (en) 0 (en) 0 (en)
protéine ribosomal L36a-like 12 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 66 % 0 (en)
cerebellin 4 précurseur 22 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 64 % 0 (en)
Sous-unités de transfert de n-acétylglucosamine-1-phosphate, alpha et bêta 144 kDa 64 % 0 (en) 0 (en) 0 (en) 0 (en)
RAD51 homolog B (S. cerevisiae) 38 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 64 % 0 (en)
régulateur d'allongement de transcription 1 124 kDa 63 % 0 (en) 0 (en) 0 (en) 0 (en)
homeobox A1 15 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 62% 0 (en)
protéine de transfert de phospholipide 49 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 62% 0 (en)
Rho GTPase activant la protéine 33 137 kDa 0 (en) 0 (en) 54 % 0 (en) 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal S18B 29 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 52% 0 (en)
endoplasmique réticulum aminopeptidase 2 106 kDa 51% 0 (en) 0 (en) 0 (en) 0 (en)
motif tripartite contenant 28 89 kDa 0 (en) 50% 0 (en) 0 (en) 0 (en)
transcription immature de carcinome de deux points 1 24 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 50% 0 (en)
At riche domaine interactif 1A (SWI-like) 242 kDa 0 (en) 0 (en) 49% 0 (en) 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal S17 15 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 48% 0 (en)
pinin, protéine associée de desmosome 82 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 48% 0 (en)
protéine phosphatase, mg2MD/Mn2MD dépendant, 1G 59 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 45% 0 (en)
G patch domaine et ankyrin répète 1 39 kDa 45% 0 (en) 0 (en) 0 (en) 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal L3 39 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 44 % 0 (en)
bourgeonnant décomplexé par benzimidazoles 3 homolog (levure) 37 kDa 0 (en) 44 % 0 (en) 0 (en) 0 (en)
DEO et tétratricopeptide répète1 76 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 44 % 0 (en)
protéine disulfure isomerase famille A, membre 2 58 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 42% 0 (en)
kazrin, protéine periplakin interagissant 86 kDa 0 (en) 41% 0 (en) 0 (en) 0 (en)
domaine enroulé-coil-helix-coiled-coiled-coil-helix contenant 2 16 kDa 0 (en) 0 (en) 40% 0 (en) 0 (en)
protéine de choc thermique 90kDa alpha (cytosolique), membre de classe A 1 85 kDa 0 (en) 0 (en) 40% 0 (en) 0 (en)
rétinite pigmentaire pigmentosa GTPase régulateur 83 kDa 0 (en) 0 (en) 40% 0 (en) 0 (en)
CTD (domaine carboxy-terminal, ARN polymérase II, polypeptide A)
phosphatase, sous-unité 1
104 kDa 0 (en) 39% 0 (en) 0 (en) 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal L37 48 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 39% 0 (en)
C2CD2-like 76 kDa 0 (en) 38% 0 (en) 0 (en) 0 (en)
DnaJ (Hsp40) homolog, sous-famille C, membre 6 106 kDa 0 (en) 0 (en) 38% 0 (en) 0 (en)
protéine mitochondriale ribosomal L51 15 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 38% 0 (en)
bystin-like 50 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 38% 0 (en)
protéine associée à la huntingtine 1 76 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 37 % 0 (en)
protéine de doigt de zinc 263 77 kDa 0 (en) 36 % 0 (en) 0 (en) 0 (en)
cycle de division cellulaire et régulateur d'apoptose 1 133 kDa 0 (en) 0 (en) 34 % 0 (en) 0 (en)
protéine tyrosine phosphatase, non-récepteur de type 13
(Phosphatase associée à l'APO-1/CD95 (Fas))
256 kDa 0 (en) 0 (en) 34 % 0 (en) 0 (en)
Domaine KRAB-A contenant 2 56 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 31% 0 (en)
activation du cointegrator de signal 1 sous-unité complexe 2 28 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 31% 0 (en)
protéine centrosomal 76kDa 74 kDa 0 (en) 30% 0 (en) 0 (en) 0 (en)
polymérase (ARN) III (ADN dirigé) polypeptide C (62kD) 61 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 30% 0 (en)
5-hydroxytryptamine (sérotonine) récepteur 6 47 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 29% 0 (en)
Récepteur t cellulaire alpha joignant 56 2 kDa 0 (en) 26% 0 (en) 0 (en) 0 (en)
biorientation des chromosomes dans la division cellulaire 1-like 330 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 25% 0 (en)
Ras association et dIL domaines 114 kDa 0 (en) 0 (en) 25% 0 (en) 0 (en)
Domaine de répétition WD 66 130 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 24 % 0 (en)
chromosome 6 cadre de lecture ouvert 25 13 kDa 0 (en) 0 (en) 22% 0 (en) 0 (en)
protéine transmembranaire 177 34 kDa 0 (en) 0 (en) 0 (en) 21% 0 (en)
cellule précurseur neuronale exprimée, régulée du développement 4-like 101 kDa 0 (en) 20% 0 (en) 0 (en) 0 (en)

Tableau 2 : Identification des facteurs de l'hôte cellulaire complexes avec les mutations Rev localisées par les nucléolifs 4, 5 et 6 pendant la production du VIH-1. Le gel SDS-PAGE taché de Coomassie à la figure 6 a été traité pour la spectrométrie de masse en tandem. Les résultats d'interaction protéique de WT Rev par rapport aux mutations nucléolées M4, M5 et M6 sont résumés par la probabilité d'identification des protéines (en pourcentages).

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Discussion

Des analyses spectrométriques de masse comparant les mutations Rev-NoLS et WT Rev en présence du VIH-1 ont été évaluées pour comprendre les facteurs nucléolaux impliqués dans le cycle de réplication virale. Ceci identifierait les composants nucléolaux requis pour l'infectiosité virale. Le nucléolar B23 a une forte affinité avec Rev-NoLS et fonctionne dans la localisation nucléolif du Rev3 et le transport nucléocytoplasmique des ARNM du VIH 22 . L'affinité du B23 avec les mutations Rev-NoLS, qui contenaient des substitutions d'arginine simples ou multiples, a été évaluée par immunoprécipitation du Rev-3'flag pendant la production virale (figure2; WT et mutations M2, M6 et M9). L'affinité B23 avec les mutations Rev-NoLS à un seul point M4, M5 et M6 a déjà été examinée en présence de la réplication du VIH-1. Dans l'étude précédente, les éluates IP de M4, M5 et M6 ont été soumis à l'immunoblotting occidental avec un anticorps spécifique au drapeau pour rev et B23 affinité1. Dans le fond des mutations de Rev à un seul point, l'affinité de liaison De B23 a été considérablement réduite. B23 a maintenu une affinité avec WT Rev pendant la réplication du VIH. On s'attendait à ce que les mutations à un seul point induites dans rev-NoLS diminuent l'affinité de liaison à d'autres facteurs d'hôte cellulaire facilitant la liaison et le transport d'ARNm de VIH. Rev-NoLS single- et multiple-point mutations dans ce modèle aboli nucléophosmin B23 affinité à Rev, indiquant une perturbation dans le shuttling nucléocytoplasmique et le transport de l'ARNm VIH. Il est probable que les facteurs nucléolaire (nucléoline C23 et protéine d'assemblage nucléosome 1), les facteurs de transport (ARHGEF1 et TCB1D24), et les facteurs d'épissage (hnRNPC et PNN) sont impliqués dans le cycle infectieux du VIH-1 par interaction avec les complexes protéiques Rev. Le tableau 1 et le tableau 2 révèlent divers autres facteurs cellulaires, à la fois nucléolaire et noncléolaire dans le modèle, qui sont potentiellement impliqués dans le cycle de réplication du VIH-1 par le révérend Le facteur nucléolaire - snoRNA C/D boîte 58, impliqué dans le snoRNA le traitement, le transport de snoRNA au nucléolus, et 2'-O-méthylation de l'ARN ribosomal - ont été identifiés pourtant la fonction de cette protéine dans le cycle de réplication de HIV-1 demeure inconnue. Les rôles spécifiques de ces facteurs cellulaires dans le cycle infectieux du VIH-1 sont actuellement à l'étude.

Les résultats présentés ici démontrent l'utilisation de cette approche pour l'identification des facteurs nucléolaire viraux/hôtes qui maintiennent le cycle infectieux du VIH-1. Les facteurs nucléolaire viraux/hôtes qui participent à d'autres modèles de maladie s'en sont donné savants à l'aide de cette approche. Il est en outre probable qu'un facteur nucléolaire pourrait impliquer des rôles multifonctionnels dans divers modèles de maladies. Par exemple, B23 a été impliqué dans le transport des protéines virales nucléolaires, de l'assemblage viral, de l'encapsidation, de la réplication et de la latence dans d'autres modèles infectieux viraux. B23 est caractérisé dans les interactions avec NoLS des facteurs cellulaires pour le transport nucléocytoplasmique - p120 facteur de croissance (acides aminés 40-57)23 et C23 processeur pré-rRNA (acides aminés 540-628)24. B23 est également documenté pour interagir avec le virus lymphotrope à cellule T humaine (HTLV-1) protéine Rex (acides aminés 1-22)25, HIV-1 Tat (acides aminés 49-57)2, et HIV-1 Rev (acides aminés 37-47)26. Le génome du virus de l'encéphalite japonaise (JEV) code une protéine centrale localisant les nocléolaires, à travers laquelle les acides aminés Gly42 et Pro43 interagissent avec la région N-terminale de B23 pendant l'infection par le VJE, ce qui entraîne le transport de protéines virales de base/B23 le noyau27. Le génome de l'ARN unique du virus de l'hépatite B (VHB) est composé en partie d'ADN à double brin, qui code une protéine centrale nucléolée. La protéine de base du VHB s'associe à la nucléoline et au B23 dans le nucléole28; Le B23 a été démontré dans l'assemblage de HBV par l'interaction avec le domaine de noyau de protéine N-terminal. Plus précisément, les acides aminés B23 259-294 se lient au domaine N-terminal de la protéine de base du VHB pour permettre l'encapsidation virale29. Le virus de l'hépatite D (HDV) à l'ARN à sens négatif et à brin unique exprime l'antigène HDVAg dans deux isoformes; les petites aides d'isoforme dans la réplication d'ARN, et le grand isoforme facilite l'assemblage viral. La réplication de l'ARN a lieu dans le nucléole et nécessite une interaction B23 avec HDVAg30,31. L'infection à HDV provoque une upregulation de B23, qui interagit principalement avec le petit isoforme HDVAg et moins avec le grand isoforme HDVAg. Les interactions ont lieu à travers le petit domaine HDVAg NLS, par lequel B23 lie et réalise l'accumulation nucléaire. Lors de la suppression du site de liaison HDV à B23, la réplication d'ARN a été altérée. HDVAg a été montré pour colocaliser avec B23 et nucléolin dans le nucléolus. On a découvert que la nucléoline possédait des propriétés transcriptionnelles en tant que répresseur32, révélant le nucléolus comme compartiment pour la régulation de la réplication du VHD. B23 est également impliqué dans la latence du génome de l'herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi (KSHV). KSHV protéine latente - v-cyclin - avec hôte CDK6 kinase, phosphorylates B23 à Thr199, facilitant l'interaction B23 avec l'antigène nucléaire latence-associé33. L'antigène nucléaire associé à la latence agit pour prévenir la réplication lytique virale. L'épuisement du B23 conduit à la réactivation du KSHV, révélant B23 comme un régulateur de la latence KSHV. La fonction B23 dans le cycle de réplication du VIH-1 est caractérisée dans l'activité de transport nucléocytoplasmique de Tat et Rev, et on ne sait pas si B23 peut induire la latence pendant l'infection par le VIH. L'implication de B23 dans la réplication, l'encapsidation et l'assemblage du VIH-1 est actuellement inconnue.

L'adaptation de cette méthode à d'autres modèles de maladies exigerait beaucoup d'efforts et de temps pour la génération d'épines dorsales infectieuses déficientes en protéines exprimées dans les lignées cellulaires appropriées. L'avantage de cette colonne vertébrale Rev-déficiente HIV-1HXB2 est la capacité d'examiner les mutations Rev-NoLS en présence de l'épine dorsale virale complète, des facteurs infectieux viraux et des facteurs d'hôte impliqués dans le cycle de réplication du VIH-1. D'autres études ont examiné la fonction nucléolif rev en l'absence du système infectieux complet du VIH-1. La caractérisation approfondie des voies infectieuses et de maladie doit inclure des environnements représentatifs qui soutiennent le cours normal de la progression de la maladie. Deux types différents d'analyses ont été effectués et comparés dans la capacité d'identifier les facteurs nucléolaux. Le tableau 1 énumère les facteurs qui sont restés liés à WT Rev à la suite de l'analyse directe de spectrométrie de masse de l'éluate de protéine. Cette analyse a donné plusieurs facteurs connus du révérend HIV-1 Cette méthode directe a été comparée à un autre processus impliquant l'extraction de protéines séparées dans les gels SDS-PAGE et l'analyse de spectrométrie de masse de ces protéines. Cette deuxième méthode a donné une variété de facteurs connus et potentiels qui sont liés au complexe protéique Rev, mais n'avaient pas les protéines suivantes précédemment identifiées dans le tableau 1: particule de reconnaissance du signal 14 kDa, initiation à la traduction eucaryote facteur 4B, protéine ribosomal L22, petite boîte d'ARN nucléolif C/D 58B, et domaine de CCHC de doigt de zinc contenant 11. En fin de compte, la méthode supérieure choisie pour les analyses de spectrométrie de masse dans ce protocole impliquait l'extraction de peptides à partir de gels SDS-PAGE. La première méthode directe a inclus le tampon d'échantillon 2x dans l'éluate sans bleu bromophenol ; les composants restants du tampon d'échantillon 2x pourraient interférer avec le traitement complet de trypsine et pourraient produire des peptides incomplètement transformés pour l'analyse de spectrométrie de masse. La deuxième méthode indirecte a été en mesure de purifier les peptides traités à la trypsine à partir de contaminants potentiels de SDS-PAGE.

Les méthodes de préparation à la spectrométrie de masse décrites ici pourraient être utilisées pour l'identification d'interventions thérapeutiques visant à éradiquer l'infection par le VIH-1 en ciblant le révérend. Toutes les mutations de la suppression et du Rev-NoLS à un seul point pourraient être examinées pour activité dominante-négative et utilisé dans l'arrestation de la fonction Rev. Les caractéristiques négatives dominantes d'intérêt pour l'arrestation fonctionnelle de Rev sont les suivantes : affinité de liaison Rev/RRE ; la relocalisation du neuloliste WT Rev par multimerisation avec des mutants Rev; perte d'affinité avec les principaux facteurs cellulaires impliqués dans le transport et l'épissage de l'ARNm VIH-1. La multimerisation de rev impliquant la coexpression des mutations de Rev-NoLS avec Le Rev de WT pourrait être examinée. On s'attend à ce que les mutations négatives dominantes dans ce modèle se multiment avec Le Rev de WT et déplacent des modèles nucléolaire vers le noyau et le cytoplasme, menant à une arrestation fonctionnelle de Rev. La spectrométrie de masse pourrait être utilisée pour identifier la perte de facteurs cellulaires clés impliqués dans l'épissage et le transport de l'ARNm VIH-1. L'identification des interactions manquantes avec WT Rev à la suite de la coexpression avec des mutations Rev-NoLS dominante-négatives révélerait la participation des voies nucléolaire-spécifiques dans la pathogénie de HIV-1. Alternativement, les particules virales HIV-1NL4-3 générées en arrière-plan des mutations Rev-NoLS pourraient être étudiées pour tous les facteurs cellulaires emballés. Les facteurs cellulaires et viraux emballés dans les particules virales peuvent être identifiés par spectrométrie de masse. Ceci indiquerait la présence des facteurs nucléolaires dans les particules virales et le rôle des facteurs nucléolaires identifiés dans l'infection virale. Les méthodes décrites s'appliquent à d'autres modèles viraux et de maladies pour l'identification et la caractérisation des voies sous-étudiées. Cela permettrait le développement d'interventions thérapeutiques contre les maladies par lesquelles des traitements limités sont disponibles.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Les auteurs reconnaissent la Dre Barbara K. Felber et le Dr George N. Pavlakis pour la culture adhérente du HLfB fournie par le National Institutes of Health (NIH) AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, National Institute of Allergy and Infectious maladies (NIAID), NIH. Les auteurs reconnaissent également les sources financières fournies par les NIH, Grants AI042552 et AI029329.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Fisher Chemical A38S-212
Acetonitrile Fisher Chemical A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide BioRad 1610158
Ammonium bicarbonate Fisher Chemical A643-500
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel Sigma-Aldrich A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG Sigma-Aldrich F3165
BioMax MS film Carestream 8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL Bio-Rad 5000006
B23 mouse monoclonal IgG Santa Cruz Biotechnologies sc-47725
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carnation non-fat powdered milk Nestle N/A
Cell scraper ThermoFisher Scientific 179693PK
C18IonKey nanoTile column Waters 186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes Fisher Scientific 08-772-22
Dithiothreitol Thermo Scientific J1539714
1 x DPBS Corning 21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate Pierce 32106
Ethanol, 200 proof Fisher Chemical A409-4
FBS Gibco 16000044
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GelCode blue stain reagent ThermoFisher 24590
Glycerol Fisher Chemical 56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnologies sc-2005
Iodoacetamide ACROS Organics 122270050
KimWipe delicate task wiper Kimberly Clark Professional 34120
L-glutamine Gibco 25030081
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
NanoAcuity UPLC Waters N/A
Pierce Silver Stain Kit Thermo Scientific 24600df
15-mL Polypropylene conical tube Falcon 352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo Scientific 26616
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001
Purified BSA New England Biolabs B9001
PVDF  Western blotting membrane Roche 3010040001
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
10 x TBS Fisher Bioreagents BP2471500
TEMED BioRad 1610880edu
Triton X-100 detergent solution BioRad 1610407
Trizaic source Waters N/A
trypsin-EDTA Corning 25-051-CIS
Tween 20 BioRad 1706531
Synapt G2 mass spectrometer Waters N/A
Whatman filter paper Tisch Scientific 10427813

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References

  1. Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. (2018).
  2. Li, Y. P. Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat. Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).
  3. Szebeni, A., et al. Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin. Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).
  4. Truant, R., Cullen, B. R. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals. Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).
  5. Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Genetics. 173, 1835-1850 (2006).
  6. Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. BioEssays. 29, 49-59 (2007).
  7. Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone. FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).
  8. Szebeni, A., Olson, M. O. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Science. 8, 905-912 (1999).
  9. Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).
  10. Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell. 56, 379-390 (1989).
  11. Yun, J. P., et al. Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix. Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).
  12. Savkur, R. S., Olson, M. O. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).
  13. Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).
  14. Grisendi, S., et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. Nature. 437, 147-153 (2005).
  15. Itahana, K., et al. Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation. Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).
  16. Ye, K. Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biology & Therapy. 4, 918-923 (2005).
  17. Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor. Genes & Development. 18, 1862-1874 (2004).
  18. Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3. Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).
  19. Horn, H. F., Vousden, K. H. Cancer: guarding the guardian. Nature. 427, 110-111 (2004).
  20. Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. Nucleophosmin and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).
  21. Dingwall, C., et al. Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals. The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).
  22. Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element. Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).
  23. Valdez, B. C., et al. Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23. Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).
  24. Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein. European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).
  25. Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23. Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).
  26. Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals. Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).
  27. Tsuda, Y., et al. Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication. Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).
  28. Ning, B., Shih, C. Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein. Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).
  29. Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1. Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).
  30. Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication. Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).
  31. Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies. Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).
  32. Yang, T. H., et al. Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor. Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).
  33. Sarek, G., et al. Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency. PLoS Pathogens. 6, 1000818 (2010).

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