Användning av Caenorhabditis elegans för att studera effekter av toxicants och Multigenerationseffekter

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Effekterna av långlivade kemikalier över och mellan generationer är avgörande för att bedöma deras långsiktiga konsekvenser för miljön och för människors hälsa. Vi erbjuder nya detaljerade metoder för att studera trans-och multigenerationseffekter med hjälp av fri-levande Nematoden Caenorhabditis elegans.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Li, Z., Ai, F., Zhang, J., Yu, Z., Yin, D. Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants. J. Vis. Exp. (149), e59367, doi:10.3791/59367 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Information om toxiciteter av kemikalier är avgörande för deras tillämpning och avfallshantering. För kemikalier vid låga koncentrationer är långtidseffekterna mycket viktiga för att bedöma konsekvenserna för miljön och människors hälsa. För att demonstrera långsiktiga influenser, effekter av kemikalier över generationer i nyare studier ger ny insikt. Här beskriver vi protokoll för att studera effekter av kemikalier över flera generationer med hjälp av fri-levande Nematoden Caenorhabditis elegans. Två aspekter presenteras: (1) transgenerational (TG) och (2) flergenerationseffekt studier, varav den sistnämnda är separerad till multigenerationell exponering (MGE) och flera generationer kvarvarande (MGR) effektstudier. TG Effect-studien är robust med ett enkelt syfte att avgöra om kemisk exponering för föräldrar kan resultera i eventuella kvarstående konsekvenser för avkomman. Efter att effekterna mäts på föräldrarna, natriumhypokloritlösningar används för att döda föräldrarna och hålla avkomman för att underlätta effekten mätning på avkomman. TG-effektstudien används för att avgöra om avkomman påverkas när deras förälder exponeras för föroreningarna. MGE och MGR effekt studien är systematisk används för att avgöra om kontinuerlig generationsväxling exponering kan resultera i adaptiva svar hos avkomman över generationer. Noggrann hämtning och överföring används för att särskilja generationer för att underlätta effektmätningar på varje generation. Vi kombinerade också protokoll för att mäta förflyttning beteende, reproduktion, livslängd, biokemiska och genuttryck förändringar. Några exempel experiment presenteras också för att illustrera trans-och flergenerationseffekt studier.

Introduction

Tillämpningen och avfallshanteringen av kemikalier är i hög grad beroende av informationen om deras effekter vid vissa koncentrationer. I synnerhet är tid en annan viktig faktor mellan effekter och koncentrationer. Det vill säga, kemikalier, särskilt de vid låga koncentrationer i de faktiska miljöerna, behöver tid för att provocera mätbara effekter1. Därför, forskare ordna olika längder av exponeringstiden i djurförsök, och även täcka hela livscykeln. Till exempel, möss utsattes för nikotin för 30, 90 eller 180 dagar för att studera dess toxiska effekter 2. Men sådana exponeringstider räcker fortfarande inte för att belysa de långsiktiga effekterna av föroreningar (t. ex. långlivade organiska föroreningar) som kan pågå över generationer av organismer i miljön. Därför, studier om effekter över generationer får mer och mer uppmärksamhet.

Det finns två huvudaspekter i studier av generations effekter. Den första är den transgenerational (TG) effekt studie som kan kraftfullt testa om kemisk exponering för föräldrar kan resultera i några konsekvenser på avkomman3. Den andra är en multigenerational effekt studie som är mer systematisk med överväganden i både exponering och resteffekter. Å ena sidan används multigenerationseffekter (MGE) för att illustrera adaptiva reaktioner hos djuren i de långsiktiga utmanande miljöerna. Å andra sidan används de kvarvarande effekterna av flera generationer (MGR) för att påvisa de långsiktiga kvarstående konsekvenserna efter exponering, eftersom exponering för mödrar åtföljs av embryoexponering för den första avkomman och köns linjens exponering för den andra avkomma som gör den tredje avkomman som första generationen helt av exponering4.

Även om däggdjur (t. ex. möss) är modellorganismer i toxicitetsstudier, särskilt i relation till människor, är deras tillämpning att studera generations effekter ganska tidskrävande, dyrt och etiskt om 5. Organismer, inklusive kräftdjur Daphnia magna6, insekt Drosophila melanogaster7 och zebrafiskar Danio rerio8, utgör därför alternativa alternativ. Ändå saknar dessa organismer antingen likheter med människor, eller kräver särskild utrustning i studier.

Caenorhabditis elegans är en liten fri-levande Nematoden (ca 1 mm i längd) med en kort livscykel (ca 84 h vid 20 ° c)9. Denna Nematoden delar många biologiska vägar konservativ till människor, och därför har det varit mycket anställd för att illustrera effekterna av olika spänningar eller gifter10. I synnerhet, 99,5% av nematoder är hermafroditer gör denna organismer extremt lämplig för att studera generations effekter, t. ex., TG effekter av tungmetaller och sulfonamider3,11, MGE effekter av Guldnanopartiklar och tunga metaller12 och temperatur13, MGR effekter av sulfonamid14, och både MGE och MGR effekter av Gammabestrålning15 och lindan4. Dessutom konstaterades jämförbara resultat mellan effekterna av kemikalier (t. ex. zearalenon) på utveckling och reproduktion av möss och C. elegans16,17, vilket skulle ge en fördel att extrapolera effekter från detta lilla djur till människor.

Både TG-och MG-effektstudierna är tidskrävande och kräver noggrann design och prestanda. Framför allt förekom skillnader i livsförändrande val, exponeringsförhållanden och produktions separationsmetoder i ovannämnda studier. Sådana skillnader hindrade den direkta jämförelsen mellan resultaten och försvårade vidare tolkningen av resultaten. Därför är det absolut nödvändigt att upprätta enhetliga protokoll för att vägleda studier av TG och MG-effekter, och även att ge en större bild för att avslöja liknande mönster av olika gifter eller föroreningar i långsiktiga konsekvenser. Över målet med de nuvarande protokollen kommer att Visa tydliga Operations processer för att studera trans-och flergenerationseffekter med C. elegans. Protokollen kommer att gynna forskare som är intresserade av att studera de långsiktiga effekterna av gifter eller föroreningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. kultur E. coli OP50

  1. Bered 1 M natriumhydroxidlösning genom att lösa upp 4 g natriumhydroxid i 100 mL vatten.
  2. Förbered lysogeny buljong (lb) medium genom att lösa upp 10 g Tryptone, 5 g jästextrakt och 10 g natriumklorid med 1 liter ultrarent vatten i en 1 l e kolv. Justera pH till 7,0 med 1 M natriumhydroxidlösning.
  3. Aliquot LB flytande medium från steg 1.2 till 20 koniska flaskor (maximalt tillåten volym: 100 mL) med 50 mL medium i vardera. Täck de koniska kolvar med kraftpapper.
  4. Sterilisera LB flytande medium vid 121 ° c och 0,105 MPa för 20 min. kyla LB mediet ner till rumstemperatur.
  5. Pipettera 200 μl från de bakteriella suspensionerna (se steg 1,8) eller Välj en liten koloni från agar (i steg 2,14) med en vaccinera loop, placera den i lb medium.
  6. Inkubera LB-mediet med skakning vid 150 rpm vid 37 ° c för 24-48 h. LB mediet kommer att ändras från en brun transparent vätska till grumlig khaki-färgad suspension.
  7. Använd bakterie suspensioner från 80% av de totala kolvar för att ge E. coli OP50 som Nematoden mat som ska användas i steg 2,11.
  8. Förvara resten av kolvar som innehåller bakteriesuspensionen i kylskåp vid 4 ° c. Pipettera 200 μL av LB suspensioner på den övre sidan av färskt LB-medium (steg 1,4) och upprepa steg 1.6 för efterföljande inkubering.

2. kultur C. elegans

Anmärkning: kultur C. elegans använder enligt steg 2,1 till 2,11 baserat på standardmetoder18.

  1. Lös 22,8 g K2HPO4• 3h2O i 100 ml sterilt destillerat vatten.
  2. Lös upp 6,8 g KH2Po4 i 50 ml sterilt destillerat vatten.
  3. Blanda lösningar från steg 2,1 och 2,2, för att förbereda 1 M K2HPO4-KH2Po4 buffert (pH 6,0, 150 ml totalt).
  4. Förbered 1,0 M MgSO4 genom att lösa upp 1,232 g MgSO4• 7h2O i 5 ml sterilt destillerat vatten och sterilisera den genom att filtrera lösningen genom ett sterilt engångsmembran filter på 0,22 μm till en steril behållare.
  5. Förbered 1 M CaCl2 genom att lösa 0,554 g av CaCl2 i 5 ml sterilt destillerat vatten, och sterilisera det genom att filtrera lösningarna genom ett 0,22 μm sterilt engångsmembran filter till en steril behållare.
  6. Förbered 1 M kolesterol lösning genom att lösa upp 0,025 g kolesterol i 5 mL absolut etanol, och sterilisera den genom att filtrera lösningen genom ett 0,22 μm sterilt engångsmembran filter till en steril behållare.
  7. Bered NGM-agar (Nematoden Growth medium) genom att tillsätta 17 g agar-pulver, 2,5 g pepton och 3 g natriumklorid till en 1 l e-kolv innehållande 1 l ultrarent vatten. Tillsätt 25 mL K2HPO4-KH2PO4 -lösning från steg 2,3.
  8. Sterilisera NGM-agar från steg 2,7 vid 121 ° c med 0,105 MPa i 20 min.
  9. Kyla NGM agar till ca 50 ° c, tillsätt 1 mL 1 M MgSO4, 1 m CaCl2, och 5 mg/ml kolesterol-etanollösning från steg 2,4 till 2,6 i mediet och blanda dem grundligt.
  10. Häll ~ 10 mL NGM agar medium per maträtt i 100 sterila petriskålar (6,0 cm diameter). Kylmediet i Petriskålarna till rumstemperatur för att bilda fast agar.
  11. Pipettera 170 μL av de bakteriella suspensionerna från steg 1,7 till den ovan nämnda NGM-agar med en steril spets. Skaka NGM-agar något för att fördela LB-mediet jämnt över NGM-agarytan.
  12. Inokulera NGM-agar med övre sidan upp vid 37 ° c för 8-12 h för att bilda en bakterie gräsmatta.
  13. Använd de flesta av agar med bakterie gräsmattor från steg 2,12 till kultur nematoder i steg 2,15 eller 2,19.
  14. Lagra 1 eller 2 agar upp-sida ner för att undvika vatten avdunstning och kontaminering i kylskåp vid 4 ° c för att upprätthålla bakterierna i förorening.
  15. När det finns mindre än 2 000 nematoder på strumpan NGM agar (från tidigare experiment eller begåvad från andra laboratorier), skära en sjättedel av NGM agar som innehåller C. elegans med en steril spets och överföra den till nyberedda NGM agar med bakteriell gräsmatta (från steg 2,13). Håll NGM agar upp-sida ner i en 22 ° c inkubator för den efterföljande kulturen.
  16. När det finns mer än 2 000 nematoder på strumpan NGM agar, spola nematoder av NGM agar med 2 ml sterilt vatten i Centrifugera rören. Tillförsel av 2 mL vatten kommer att resultera i en cirka 1,5 mL uteffekt.
  17. Låt nematoder bosätta sig i centrifugrör från för 30 min. Kassera 1 mL av supernatanterna genom att Pipettera och tillsätt 1 mL sterilt vatten i varje tub för att tvätta pelleten (dvs. nematoder).
  18. Slå ner nematoder i centrifugrör i 30 min. Kassera 1 ml av supernatanterna genom pipettering. Tillsätt 1 mL sterilt vatten i varje tub för att Omsuspendera nematoder.
  19. Fördela Nematoden suspensioner (ca 1,5 ml totalt) genom att Pipettera 150 μl på varje ny NGM agar med bakteriell Lawn (från steg 2,13), vilket gör 8-10 nya NGM agar totalt.
  20. Håll NGM agar från steg 2,19 upp-sida upp i en 20 ° c inkubator över natten och sedan upp-sida ner för den efterföljande kulturen.
  21. Upprepa steg 2,15 eller steg 2.16-2.20 var tredje dag.

3. Förbered synkroniserade ägg och L3 larver av C. elegans

  1. Spola av dräktiga nematoder och nyproducerade ägg från NGM agar till sterila centrifugrör, med 2 ml sterilt vatten på varje NGM-agar, vilket resulterar i cirka 1,5 ml produktion.
  2. Slå ner nematoder i centrifugrör i 30 min, och kassera sedan 85% av supernatanterna genom pipettering.
  3. Bered natriumhypokloritlösningar genom att lösa upp 0,6 g NaOH och 5 mL NaOCl (4-6% aktiva gradienter, se tabellen av material för detaljer) med 25 ml vatten för att få naoh till 0,5 M och NaOCl till 1%.
  4. Blanda pellets från steg 3,2 (Markera volymen som V0) med 7-faldigt v0 av natriumhypoklorit lösningar från (steg 3,3, dvs, volymförhållandet 1:7)19.
  5. Skaka centrifugrör varje 2 min för 10-15 min till lyse larverna och vuxna nematodes; färgen på Nematoden suspensioner kommer att vända från grumligt att rensa.
  6. Centrifugera rören vid 700 x g i 3 min vid 20 ° c, och kassera sedan supernatanterna genom pipettering.
  7. Omsuspendera pellets i 5-faldigt V0 av sterilt vatten för att tvätta ålderssynkroniserade ägg. Centrifugera vid 700 x g i 3 min vid 20 ° c, och kassera sedan supernatanterna.
  8. Upprepa steg 3,7 två gånger.
  9. Tillsätt 1-faldigt V0 sterilt vatten i rören för att Omsuspendera de ålderssynkroniserade äggen.
  10. Fördela äggen suspensioner genom att Pipettera 50 μl på varje ny NGM agar med bakteriell gräsmatta från steg 2,13. Håll NGM agar Top-Side upp i en 20 ° c inkubator i 30 min, så att vattnet kan avdunta eller adsorberas av bakterie gräsmattan. Gör sedan NGM agar upp-sida ner för den efterföljande kulturen. Märk tiden som ägg tiden (Tägg).
  11. Förbered K-medium genom att lösa upp 3 g NaCl och 2,36 g KCl i 1 L vatten. Sterilisera mediet vid 121 ° c och 0,105 MPa för 20 min och kyla ner till rumstemperatur.
  12. När tiden når 36 h efter Tägg, nematoder kommer att nå L3 larverna skede (L3 nematoder)20. Spola nematoder av NGM agar i centrifugrör, med 2 ml sterilt vatten på varje NGM-agar vilket resulterar i cirka 1,5 ml produktion.
  13. Efter ett avgörande i 30 min, ersätta 85% av samman supernatanterna (genom pipetting) med K-medium från 2 h för att smälta maten i tarmar3.
  14. Kassera supernatanterna. Använd K-medium (från steg 3,11) för att justera Nematoden suspensioner till ca 200 nematoder per 100 μl för efterföljande experiment.

4. Använd C. elegans för studie av trans-generationseffekt

  1. Bered kemiska lösningar med 5 koncentrationsnivåer och ett lösningsmedel eller absolut kontroll, dvs 6 grupper totalt.
  2. Tillsätt 100 μL av kontroll-eller kemikalielösningar med 10 brunnar som replikat i varje grupp (dvs. 60 brunnar totalt) in i mitten området av en 96-väl steril mikroplatta för att undvika kanteffekter.
  3. Späd Nematoden suspensioner från steg 3,14 med K-medium från steg 3,11 med 10-faldigt. Tillsätt 100 μL Nematoden-upphängning till var och en av de 60 brunnarna från steg 4,2. Markera tiden som t0.
  4. När tiden når 24 h efter t0, räkna levande och döda nematoder i brunnarna. Beräkna medianvärdet för dödlig koncentration (LC50).
  5. Bered en serie av 5 koncentrationer under 10% av LC50 -värdena.
  6. Tillsätt 100 μL av kontroll-eller kemikalielösningar (från steg 4,5) med 10 brunnar som replikat i varje grupp (dvs. 60 brunnar totalt) in i mitten området av en 96-väl steril mikroplatta för att undvika kanteffekter.
  7. Tillsätt 100 μl K-medium innehållande cirka 200 L3 nematoder (från steg 3,14) till var och en av de 60 brunnarna från steg 4,6. Markera tiden som T0.
  8. Utför exponeringen för 24 till 96 h sedan T0.
  9. Efter exponeringen, samla in nematoder från fem brunnar i varje grupp i 1,5 mL centrifugrör genom pipettering (dvs. 6 rör totalt).
  10. Reglera nematoder i 30 min, kassera supernatanterna genom att Pipettera, och Omsuspendera och tvätta nematoder i botten med 1 mL steriliserat vatten.
  11. Reglera nematoder i 30 min, kassera supernatanterna genom att Pipettera och Använd nematoder längst ner för indikator mätningarna (se avsnitt 7) av den exponerade moder generationen som är märkt F0.
  12. Samla in, bosätta sig och tvätta (genom resuutgiften) nematoder från de återstående fem brunnar i varje grupp i steg 4,9 enligt steg 4,10.
  13. Reglera nematoder från steg 4,12 i 30 min. Kassera supernatanterna genom att Pipettera och tillsätt 100 μL sterilt vatten för att Omsuspendera nematoder. Överför Nematoden suspensioner jämnt på tre nyberedda NGM agar med bakteriell gräsmatta från steg 2,13.
  14. Inkubera nematoder för 36 h att bli dräktig och utföra ålderssynkronisering enligt steg 3.1-3.9. Inkubera de synkroniserade äggen på respektive NGM agar med bakteriell gräsmatta från steg 2,13 för 36 h.
  15. Spola nematoder på NGM agar från steg 4,14 till sex centrifugrör.
  16. Reglera nematoder i 30 min, och kassera supernatanterna genom pipettering. Omsuspendera och tvätta pellets med 1 mL steriliserat vatten.
  17. Reglera nematoder i 30 min, och kassera supernatanterna genom pipettering. Använd nematoder längst ner för indikator mätningarna (se avsnitt 7) av avkomman som är markerad som T1.

5. Använd C. elegans för multigenerationseffekt (MGE) effekt studie

  1. Blanda 99,0 ml NGM agar (från steg 2,9) med 1 ml kontroll eller kemiska lösningar (låga och höga koncentrationer i detta protokoll som exempel, d.v.s. tre grupper totalt).
  2. Häll ca 10 mL NGM agar medium per maträtt från steg 5,1 till 100 sterila petriskålar (6,0 cm diameter). Kylmediet i Petriskålarna till rumstemperatur för att bilda fast agar.
  3. Pipettera bakterie suspensioner på agar enligt steg 2,11.
  4. Ställ undan de övre locken på Petriskålarna och utsätta bakterie gräsmattan för UV-ljus (145 μW/cm2) i biosäkerhets skåpet i 15 min.
  5. Välj en liten koloni med en vaccinera loop, placera den i lb medium från agar i steg 1,4. Inkubera LB-mediet med skakning med en hastighet av 150 rpm vid 37 ° c i 24 timmar för att bekräfta den försumbara bakterietillväxten, validera avlivnings steget 5,4.
  6. Pipettera över de ålderssynkroniserade äggen från steg 3,9 till agar (från steg 5,4). Markera början av exponeringen för den överordnade generationen F0 och markera som dag 0 (D0).
  7. Inkubera agar för 3 d vid 20 ° c. Därefter (dvs. på D3), Använd de mogna nematoder att mäta effekter i F0 (se avsnitt 7).
  8. Även på D3, plocka F0 mogna nematoder på nya NGM agar (från steg 5,4) med hjälp av en glasstav, vars ände är försedd med en man-Made fiber tråd böjd i en ring.
  9. På D4, plocka ut och kassera mogna F0 nematoder från NGM agars. Markera den nykläckta avkomman nematoder inom dessa 24 h (från D3 till D4) som F1 för att uppleva andra generationens exponering.
  10. På D6, Mät index (se avsnitt 7) av F1 mogna nematoder som har upplevt exponering för 3 dagar.
  11. På D9 upprepar du steg 5.8-5.10, använder F1 nematoder för att återge F2-maskar och mäter effekter på F2-nematoder.
  12. På D12, upprepa steg 5,11, Använd F2-nematoder för att reproducera F3-maskar och mät effekter på F3-nematoder. På samma sätt reproducera avkomma och mäta MGE effekter på nth avkomma generationen (FN).

6. Använd C. elegans för en studie med flera generationer kvarvarande (MGR) effekt

  1. Upprepa steg 5.1-5.7. På D3, plocka F0 mogna nematoder på nya NGM agar utan tillsats av kemikalier (från steg 2,13).
  2. På D4, plocka ut och kassera mogna F0 nematodes. Markera nykläckt avkomma nematoder inom dessa 24 h som T1 nematoder.
  3. På D6, Mät index (se avsnitt 7) av de T1-mogna nematoder som har vuxit i 3 dagar.
  4. På D9, upprepa steg 6.2-6.3, Använd T1 nematoder för att återge T2 nematoder och mät effekter i T1 nematoder.
  5. På D12, upprepa steg 6,4, Använd T2 nematoder för att återge T3 nematoder och mät effekter i T2 nematoder. På samma sätt reproducera avkomma och mått MGR effekter på nth avkomma generationen (TN) nematoder av F0, eller nth avkomma (TN) nematoder av FN från steg 5,12.

7. Mät indikatorer

  1. Mäta rörelse beteendet.
    1. Spola nematoder utanför NGM agar med sterilt vatten och samla dem i Centrifugera rören. Sedimentera nematoder i 30 min, kassera supernatanterna och Använd nematoder i pellets för effektmätning.
    2. Omsuspendera nematoder i pellets med 1 ml sterilt vatten och Pipettera dem på NGM agar utan bakteriell gräsmatta från steg 2,10.
    3. Använd en dissekera Mikroskop för att göra mål nematoder för (antal) kropp böjning frekvens (BBF) som hänvisar till de gånger den bakre glödlampan i svalget ändrar riktning längs den vertikala riktningen av resande väg inom ett 60 s intervall.
    4. Använd dissekera Mikroskop för att göra mål återföring rörelse (RM) som hänvisar till de tider då den resande riktningen ändras över 90 ° inklusive bakåt varv och Omega tur (OT) i ett intervall på 60 s. OT hänvisar till rörelsen när huvudet av Nematoden berör eller nästan vidrör dess svans gör Nematoden form som den grekiska bokstaven Omega (Ω).
      Anmärkning: minst 6 nematoder undersöktes för varje behandling i varje experimentellt replikat.
Exempel för MGE (F0 till F3) effekter på reproduktion och livslängd med 3 grupper (en kontroll och två exponerings behandlingar).
Dag NGM agar-nummer för MGE-studie Förklaring
Livslängd Reproduktion
0 30 (F0 exponering) 10 replikat för varje grupp, markerad som F0-1-1-0 till F0-3-10-0, med den sista siffran för att Visa överlevnads dagarna.
1 30 (F0 överleva 1 d) F0-1-1-0 till F0-3-10-0 ska bytas till F0-1-1-1 till F0-3-10-1.
2 30 (F0 överleva 2 d) F0-1-1-1 till F0-3-10-1 ska bytas till F0-1-1-2 till F0-3-10-2.
Du behöver inte överföra F0 nematoder förrän 3 d.
3 30 (F0 överleva 3 d, rensas efter nematoder överföring och insamling) Efter 3 d, F0 nematoder är mogna och 36 nya NGM agar (med 2 nematoder på varje agar) används för att iaktta deras överlevnad och reproduktion.
36 (F0-1-1-3 till F0-3-12-3) Preliminära experiment bör utföras för att arrangera antalet F0 nematoder, vilket garanterar minst 200 avkomma för efterföljande multigenerationsövergripande verksamhet.
I synnerhet om MGR-effekter studeras bör F0-nematoder överföras till tydliga NGM-agarer utan kemisk exponering, och det bör noteras som T1-start.
De flesta av de F0 nematoder samlas för att mäta kemiska och genetiska index och 30 agar i F0 rensas.
4 36 (F0-1-1-4 till F0-3-12-4) 36 (F1-1-1-1 till F1-3-12-1) Mätning av livslängd och reproduktion kräver överföring varje dag.
Förälder nematoder på F0-1-1-3 till F0-3-12-3 plockas på nya NGM agar markerade som F0-1-1-4 till F0-3-12-4.
Resterande avkomma nematoder (dvs F1 i MGE, eller T1 i MGR) i F0-1-1-3 till F0-3-12-3 agar har vuxit för 1 d, och markörer ändras till F1-1-1-1 till F1-3-12-1. Dessa agar används också för att övervaka livslängden på F1 med daglig överföring.
5 36 (F0-1-1-5 till F0-3-12-5) 36 (F1-1-1-2 till F1-3-12-2) Nematoder på F1-1-1-1 till F1-3-12-1 agar har vuxit för 2 d och blir lätt observerbara och nematoder räknas, och markörer ändras till F1-1-1-2 till F1-3-12-2.
36 (F0-1-1-4 till F0-3-12-4) Avkomman nematoder i F0-1-1-4 till F0-3-12-4 agar har vuxit för 1 d.
6 36 (F0-1-1-6 till F0-3-12-6) 36 (F0-1-1-4 till F0-3-12-4, rensas efter räknat) Nematodes på F1-1-1-2 till F1-3-12-2 agar har vuxit för 3 d och markörer ändras till F1-1-1-3 till F1-3-12-3. I synnerhet, F1 nematoder börja reproducera F2 på denna dag, F1 nematoder bör överföras till nya NGM agar gör F2-1-1-0 till F1-3-12-0. För MGR-studier startar T2 idag.
36 (F1-1-1-3 till F1-3-12-3) 36 (F0-1-1-5 till F0-3-12-5) Detta kan fördröjas genom kemisk exponering, och därför bör flexibla förändringar utföras i varje experiment för att säkerställa tillräckligt med nematoder för kommande generationer.
36 (F2-1-1-0 till F1-3-12-0) Avkomman nematoder på F0-1-1-4 till F0-3-12-4 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
Avkomman nematoder på F0-1-1-5 till F0-3-12-5 agar har vuxit för 1 d.
7 36 (F0-1-1-7 till F0-3-12-7) 36 (F0-1-1-5 till F0-3-12-5, rensas efter räknat) Avkomman nematoder på F0-1-1-5 till F0-3-12-5 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F1-1-1-4 till F1-3-12-4) 36 (F0-1-1-6 till F0-3-12-6) Den totala Nematoden nummer i F1-1-1-1 till F1-3-12-1 agar, F0-1-1-4 till F0-3-12-4 agar och F0-1-1-5 till F0-3-12-5 används för att beräkna den initiala reproduktionen av F0.
36 (F2-1-1-1 till F2-3-12-1) Avkomman nematoder på F0-1-1-6 till F0-3-12-6 agar har vuxit för 1 d.
F2 nematoder på F2-1-1-0 till F1-3-12-0 har vuxit för 1 d och deras markörer ändras till F2-1-1-1 till F2-3-12-1.
8 36 (F0-1-1-8 till F0-3-12-8) 36 (F0-1-1-6 till F0-3-12-6, rensas efter räknat) Avkomman nematoder på F0-1-1-6 till F0-3-12-6 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F1-1-1-5 till F1-3-12-5) 36 (F0-1-1-7 till F0-3-12-7) Avkomman nematoder av F0 på F0-1-1-7 till F0-3-12-7 agar har vuxit för 1 d.
36 (F2-1-1-2 till F2-3-12-2) 36 (F1-1-1-4 till F1-3-12-4) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-4 till F1-3-12-4 agar har vuxit för 1 d.
36 (F2-1-1-1 till F2-3-12-1, ändrad till F2-1-1-2 till F2-3-12-2 efter räknad) F2-nematoder på F2-1-1-1 till F2-3-12-1 har vuxit för 2 d, nematoder räknas och deras markörer ändras till F2-1-1-2 till F2-3-12-2.
9 36 (F0-1-1-9 till F0-3-12-9) 36 (F0-1-1-7 till F0-3-12-7, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F0 på F0-1-1-7 till F0-3-12-7 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F1-1-1-6 till F1-3-12-6) 36 (F1-1-1-4 till F1-3-12-4, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-4 till F1-3-12-4 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F2-1-1-3 till F2-3-12-3) 36 (F0-1-1-8 till F0-3-12-8) Avkomman nematoder av F0 på F0-1-1-8 till F0-3-12-8 agar har vuxit för 1 d.
36 (F3-1-1-0 till F3-3-12-0) 36 (F1-1-1-5 till F1-3-12-5) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-5 till F1-3-12-5 agar har vuxit för 1 d.
F2 nematoder på F2-1-1-2 till F2-3-12-2 har vuxit i 3 dagar och deras markörer ändras till F2-1-1-3 till F2-3-12-3. F2 nematoder börja reproducera idag och de överförs till 36 nya NGM agar behövs och markeras som F3-1-1-0 till F3-3-12-0. För MGR studier, T3 börja idag.
10 36 (F0-1-1-10 till F0-3-12-10) 36 (F0-1-1-8 till F0-3-12-8, rensat efter räknat) Avkomman nematoder av F0 på F0-1-1-8 till F0-3-12-8 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F1-1-1-7 till F1-3-12-7) 36 (F1-1-1-5 till F1-3-12-5, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-5 till F1-3-12-5 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F2-1-1-4 till F2-3-12-4) 36 (F0-1-1-9 till F0-3-12-9) Det totala Nematoden-numret i F2-1-1-1 till F2-3-12-1, F1-1-1-4 till F1-3-12-4 agar och F1-1-1-5 till F1-3-12-5 används för att beräkna den initiala reproduktionen av F1.
36 (F3-1-1-1 till F3-3-12-1) 36 (F1-1-1-6 till F1-3-12-6) Avkomman nematoder av F0 på F0-1-1-9 till F0-3-12-9 agar har vuxit för 1 d.
Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-6 till F1-3-12-6 agar har vuxit för 1 d.
Avkomman Nematoden på F3-1-1-0 till F3-3-12-0 agar har vuxit för 1 d och markörer ändras till F3-1-1-1 till F3-3-12-1.
I synnerhet kommer återgivningen av F0-nematoder att minska markant efter de första dagarna. Därför är Nematoden överföring inte strikt krävs för att vara dagligen efter D10 och kan utföras varje 2 dagar. Ändå kräver överlevnad fortfarande daglig observation.
Samma regel gäller även för F1 (T1, T1), F2 (T2, T2) och F3 (T3, T3).
11 36 (F0-1-1-11 till F0-3-12-11) 36 (F0-1-1-9 till F0-3-12-9, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F0 på F0-1-1-9 till F0-3-12-9 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F1-1-1-8 till F1-3-12-8) 36 (F1-1-1-6 till F1-3-12-6, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-6 till F1-3-12-6 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F2-1-1-5 till F2-3-12-5) 36 (F0-1-1-10 till F0-3-12-10) Avkomman nematoder av F0 på F0-1-1-10 till F0-3-12-10 agar har vuxit för 1 d.
36 (F3-1-1-2 till F3-3-12-2) 36 (F1-1-1-7 till F1-3-12-7) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-7 till F1-3-12-7 agar har vuxit för 1 d.
36 (F2-1-1-4 till F2-3-12-4) Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-4 till F2-3-12-4 agar har vuxit för 1 d.
36 (F3-1-1-1 till F3-3-12-1, ändrad till F3-1-1-2 till F3-3-12-2 efter räkning) Nematoder på F3-1-1-1 till F3-3-12-1 agar har vuxit för 2 d, nematoder räknas och markörer ändras till F3-1-1-2 till F3-3-12-2.
12 36 (F0-1-1-12 till F0-3-12-12) 36 (F0-1-1-10 till F0-3-12-10, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F0 på F0-1-1-10 till F0-3-12-10 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F1-1-1-9 till F1-3-12-9) 36 (F1-1-1-7 till F1-3-12-7, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-7 till F1-3-12-7 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F2-1-1-6 till F2-3-12-6) 36 (F2-1-1-4 till F2-3-12-4, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-4 till F2-3-12-4 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F3-1-1-3 till F3-3-12-3) 36 (F0-1-1-11 till F0-3-12-11) Avkomman nematoder av F0 på F0-1-1-11 till F0-3-12-11 agar har vuxit för 1 d.
36 (F4-1-1-0 till F4-3-12-0) 36 (F1-1-1-8 till F1-3-12-8) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-8 till F1-3-12-8 agar har vuxit för 1 d.
36 (F2-1-1-5 till F2-3-12-5) Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-5 till F2-3-12-5 agar har vuxit för 1 d.
Nematoder på F3-1-1-2 till F3-3-12-2 agar har vuxit för 3 d och markörerna ändras till F3-1-1-3 till F3-3-12-3. Den F3 nematoder börja reproducera idag och de överförs till 36 nya NGM agar behövs och markeras som F4-1-1-0 till F4-3-12-0. För MGR-studier börjar avkomman till F3 (dvs T1) idag.
13 36 (F0-1-1-13 till F0-3-12-13) 36 (F0-1-1-11 till F0-3-12-11, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F0 på F0-1-1-11 till F0-3-12-11 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F1-1-1-10 till F1-3-12-10) 36 (F1-1-1-8 till F1-3-12-8, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-8 till F1-3-12-8 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F2-1-1-7 till F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-5 till F2-3-12-5, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-5 till F2-3-12-5 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F3-1-1-4 till F3-3-12-4) 36 (F0-1-1-12 till F0-3-12-12) Det totala Nematoden-numret i F3-1-1-1 till F3-3-12-1, F2-1-1-4 till F2-3-12-4 agar och F2-1-1-5 till F2-3-12-5 används för att beräkna den initiala reproduktionen av F2.
36 (F4-1-1-1 till F4-3-12-1) 36 (F1-1-1-9 till F1-3-12-9) Avkomman nematoder av F0 på F0-1-1-12 till F0-3-12-12 agar har vuxit för 1 d.
36 (F2-1-1-6 till F2-3-12-6) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-9 till F1-3-12-9 agar har vuxit för 1 d.
Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-6 till F2-3-12-6 agar har vuxit för 1 d.
Avkomman nematoder av F3 på F4-1-1-0 till F4-3-12-0 har vuxit för 1 d, och markörer ändras till F4-1-1-1 till F4-3-12-1.
14 36 (F0-1-1-14 till F0-3-12-14) 36 (F0-1-1-12 till F0-3-12-12, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F0 på F0-1-1-12 till F0-3-12-12 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F1-1-1-11 till F1-3-12-11) 36 (F1-1-1-9 till F1-3-12-9, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-9 till F1-3-12-9 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F2-1-1-8 till F2-3-12-8) 36 (F2-1-1-6 till F2-3-12-6, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-6 till F2-3-12-6 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F3-1-1-5 till F3-3-12-5) 36 (F4-1-1-1 till F4-3-12-1, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F3 på F4-1-1-1 till F4-3-12-1 har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas. För MGR-studier har T1 ' nematoder vuxit för 2 d, och kommer att börja reproducera T2 ' på nästa dag (D15), och T2 ' kommer att börja reproducera T3 ' på D18. Livslängden för Wild Type C. elegans är exampled som 15 dagar. Sedan, slutet av T3 ' livslängd kommer att vara på D33.
36 (F0-1-1-13 till F0-3-12-13) Avkomman nematoder av F0 på F0-1-1-13 till F0-3-12-13 agar har vuxit för 1 d.
36 (F1-1-1-10 till F1-3-12-10) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-10 till F1-3-12-10 agar har vuxit för 1 d.
36 (F2-1-1-7 till F2-3-12-7) Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-7 till F2-3-12-7 agar har vuxit för 1 d.
36 (F3-1-1-4 till F3-3-12-4) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-4 till F2-3-12-4 agar har vuxit för 1 d.
15 36 (F0-1-1-15 till F0-3-12-15) 36 (F0-1-1-13 till F0-3-12-13, rensat efter räknat) Avkomman nematoder av F0 på F0-1-1-13 till F0-3-12-13 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F1-1-1-12 till F1-3-12-12) 36 (F1-1-1-10 till F1-3-12-10, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-10 till F1-3-12-10 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F2-1-1-9 till F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-7 till F2-3-12-7, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-7 till F2-3-12-7 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F3-1-1-6 till F3-3-12-6) 36 (F3-1-1-4 till F3-3-12-4, rensat efter räknat) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-4 till F3-3-12-4 agar har vuxit för 2D, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F0-1-1-14 till F0-3-12-14) Avkomman nematoder av F0 på F0-1-1-14 till F0-3-12-14 agar har vuxit för 1 d.
36 (F1-1-1-11 till F1-3-12-11) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-11 till F1-3-12-11 agar har vuxit för 1 d.
36 (F2-1-1-8 till F2-3-12-8) Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-8 till F2-3-12-8 agar har vuxit för 1 d.
36 (F3-1-1-5 till F3-3-12-5) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-5 till F2-3-12-5 agar har vuxit för 1 d.
16 36 (F0-1-1-15 till F0-3-12-15, över) 36 (F0-1-1-14 till F0-3-12-14, rensas efter räknat) Livslängden för Wild Type C. elegans är exampled som 15 dagar. Därför bör F0 ha alla dött före dag 16 sedan exponeringen.
36 (F1-1-1-13 till F1-3-12-13) 36 (F1-1-1-11 till F1-3-12-11, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F0 på F0-1-1-14 till F0-3-12-14 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F2-1-1-10 till F2-3-12-10) 36 (F2-1-1-8 till F2-3-12-8, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-11 till F1-3-12-11 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F3-1-1-7 till F3-3-12-7) 36 (F3-1-1-5 till F3-3-12-5, rensat efter räknat) Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-8 till F2-3-12-8 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F0-1-1-15 till F0-3-12-15) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-5 till F3-3-12-5 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F1-1-1-12 till F1-3-12-12) Den totala Nematoden nummer i F4-1-1-1 till F4-3-12-1, F3-1-1-4 till F3-3-12-4 agar och F3-1-1-5 till F3-3-12-5 används för att beräkna den initiala reproduktionen av F3.
36 (F2-1-1-9 till F2-3-12-9) Avkomman nematoder av F0 på F0-1-1-15 till F0-3-12-15 agar har vuxit för 1 d.
36 (F3-1-1-6 till F3-3-12-6) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-12 till F1-3-12-12 agar har vuxit för 1 d.
Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-9 till F2-3-12-9 agar har vuxit för 1 d.
Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-6 till F2-3-12-6 agar har vuxit för 1 d.
17 36 (F1-1-1-14 till F1-3-12-14) 36 (F0-1-1-15 till F0-3-12-15, rensas efter räknat, över) Avkomman nematoder av F0 på F0-1-1-15 till F0-3-12-15 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas. Det blir inte mer F0 avkomma.
36 (F2-1-1-11 till F2-3-12-11) 36 (F1-1-1-12 till F1-3-12-12, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-12 till F1-3-12-12 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F3-1-1-8 till F3-3-12-8) 36 (F2-1-1-9 till F2-3-12-9, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-9 till F2-3-12-9 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F3-1-1-6 till F3-3-12-6, rensat efter räknat) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-6 till F3-3-12-6 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F1-1-1-13 till F1-3-12-13) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-13 till F1-3-12-13 agar har vuxit för 1 d.
36 (F2-1-1-10 till F2-3-12-10) Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-10 till F2-3-12-10 agar har vuxit för 1 d.
36 (F3-1-1-7 till F3-3-12-7) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-7 till F2-3-12-7 agar har vuxit för 1 d.
18 36 (F1-1-1-15 till F1-3-12-15) 36 (F1-1-1-13 till F1-3-12-13, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-13 till F1-3-12-13 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F2-1-1-12 till F2-3-12-12) 36 (F2-1-1-10 till F2-3-12-10, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-10 till F2-3-12-10 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F3-1-1-9 till F3-3-12-9) 36 (F3-1-1-7 till F3-3-12-7, rensat efter räknat) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-7 till F3-3-12-7 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F1-1-1-14 till F1-3-12-14) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-14 till F1-3-12-14 agar har vuxit för 1 d.
36 (F2-1-1-11 till F2-3-12-11) Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-11 till F2-3-12-11 agar har vuxit för 1 d.
36 (F3-1-1-8 till F3-3-12-8) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-8 till F2-3-12-8 agar har vuxit för 1 d.
I MGR studier, T2 "kommer att börja återge T3" idag. Livslängden för Wild Type C. elegans är exampled som 15 dagar. Sedan, slutet av T3 ' livslängd kommer att vara på D33.
19 36 (F1-1-1-15 till F1-3-12-15, över) 36 (F1-1-1-14 till F1-3-12-14, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-14 till F1-3-12-14 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F2-1-1-13 till F2-3-12-13) 36 (F2-1-1-11 till F2-3-12-11, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-11 till F2-3-12-11 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F3-1-1-10 till F3-3-12-10) 36 (F3-1-1-8 till F3-3-12-8, rensat efter räknat) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-8 till F3-3-12-8 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F1-1-1-15 till F1-3-12-15) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-15 till F1-3-12-15 agar har vuxit för 1 d.
36 (F2-1-1-12 till F2-3-12-12) Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-12 till F2-3-12-12 agar har vuxit för 1 d.
36 (F3-1-1-9 till F3-3-12-9) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-9 till F2-3-12-9 agar har vuxit för 1 d.
20 36 (F2-1-1-14 till F2-3-12-14) 36 (F1-1-1-15 till F1-3-12-15, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F1 på F1-1-1-14 till F1-3-12-14 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas. Det kommer inte mer F1 avkomma.
36 (F3-1-1-11 till F3-3-12-11) 36 (F2-1-1-12 till F2-3-12-12, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-12 till F2-3-12-12 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F3-1-1-9 till F3-3-12-9, rensat efter räknat) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-9 till F3-3-12-9 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F2-1-1-13 till F2-3-12-13) Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-13 till F2-3-12-13 agar har vuxit för 1 d.
36 (F3-1-1-10 till F3-3-12-10) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-10 till F2-3-12-10 agar har vuxit för 1 d.
21 36 (F2-1-1-15 till F2-3-12-15) 36 (F2-1-1-13 till F2-3-12-13, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-13 till F2-3-12-13 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F3-1-1-12 till F3-3-12-12) 36 (F3-1-1-10 till F3-3-12-10, rensat efter räknat) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-10 till F3-3-12-10 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F2-1-1-14 till F2-3-12-14) Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-14 till F2-3-12-14 agar har vuxit för 1 d.
36 (F3-1-1-11 till F3-3-12-11) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-11 till F2-3-12-11 agar har vuxit för 1 d.
22 36 (F2-1-1-15 till F2-3-12-15, över) 36 (F2-1-1-14 till F2-3-12-14, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-14 till F2-3-12-14 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F3-1-1-13 till F3-3-12-13) 36 (F3-1-1-11 till F3-3-12-11, rensat efter räknat) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-11 till F3-3-12-11 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F3-1-1-12 till F3-3-12-12) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-12 till F2-3-12-12 agar har vuxit för 1 d.
23 36 (F3-1-1-14 till F3-3-12-14) 36 (F2-1-1-15 till F2-3-12-15, rensas efter räknat) Avkomman nematoder av F2 på F2-1-1-15 till F2-3-12-15 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas. Det blir inte fler F2-avkomman.
36 (F3-1-1-12 till F3-3-12-12, rensat efter räknat) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-12 till F3-3-12-12 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F3-1-1-13 till F3-3-12-13) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-13 till F2-3-12-13 agar har vuxit för 1 d.
24 36 (F3-1-1-15 till F3-3-12-15) 36 (F3-1-1-13 till F3-3-12-13, rensat efter räknat) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-13 till F3-3-12-13 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F3-1-1-14 till F3-3-12-14) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-14 till F2-3-12-14 agar har vuxit för 1 d.
25 36 (F3-1-1-15 till F3-3-12-15, över) 36 (F3-1-1-14 till F3-3-12-14, rensat efter räknat) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-14 till F3-3-12-14 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
36 (F3-1-1-15 till F3-3-12-15) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-15 till F2-3-12-15 agar har vuxit för 1 d.
26 36 (F3-1-1-15 till F3-3-12-15, rensat efter räknat) Avkomman nematoder av F3 på F3-1-1-15 till F3-3-12-15 agar har vuxit för 2 d, och agar rensas efter nematoder räknas.
Särskilt i MGR-studier skulle den första icke-exponerade avkomman av F3 (dvs. T3) födas på D18. Livslängden för Wild Type C. elegans är exampled som 15 dagar. Sedan, slutet av T3 ' livslängd kommer att vara på D33.
Både MGE och MGR studier kommer att omfatta fler dagar när Nematoden livslängd är längre.

Tabell 1: förteckning över markörer och deras definitioner.

  1. Mät reproduktion och livslängd i MGE effektstudier.
    1. På D0 upprepar du steg 5,6. Markera agar (3 grupper med 10 replikat i vardera) som Fx-a-b-c, där x hänvisar till generation nummer, a hänvisar till gruppnummer (1 för kontroll, 2 för den låga koncentrationen och 3 för den höga koncentrationen ); b hänvisar till replikat från 1 till 10; och c avser exponeringstiden (0 indikerar start). För D0, markerar agar som F0-1-1-0 till F0-3-10-0. Läsare kan hänvisa till tabell 1 för detaljerad information.
    2. På D1, kontrollera Nematoden tillväxten på agars, och ändra markörer från F0-1-1-0 till F0-3-10-0 till F0-1-1-1 till F0-3-10-1.
    3. På D2, kontrollera Nematoden tillväxten på agars, och ändra markörer F0-1-1-2 till F0-3-10-2.
    4. På D3, plocka 24 F0 nematoder från varje grupp på 12 nya NGM agar med två NGM agar från steg 5,4. Markera agar som F0-1-1-3 till F0-3-12-3.
    5. På D4, överför de två överordnade nematoder från F0-1-1-3 till F0-3-12-3 genom att plocka på nya NGM agar från steg 5,4. Markera den nya NGM agar som F0-1-1-4 till F0-3-12-4. Ändra markörer för F0-1-1-3 till F0-3-12-3 till F1-1-1-1 till F1-3-12-1 för att representera avkomman av F0 (dvs F1) inom den första dagen sedan F0 börjar reproducera.
    6. På D5, Använd en dissekera Mikroskop för att räkna nematoder på F1-1-1-1 till F1-3-12-1 agar där nematoder har vuxit 2 dagar. Tillåt F1-1-1-1 till F1-3-12-1 agar att reproducera F2 för successiva generationer.
    7. Överför de två överordnade nematoder från F0-1-1-4 till F0-3-12-4 agar genom att plocka på nya NGM agar från steg 5,4. Mark NGM agar som F0-1-1-5 till F0-3-12-5. Ändra märken av F0-1-1-4 till F0-3-12-4 till F1-1-1-2 till F1-3-12-2 för att representera avkomman av F0 (dvs., F1) inom den andra dagen sedan F0 börja reproducera.
    8. På D6, räkna nematoder på F1-1-1-2 till F1-3-12-2 agars. Överför moder nematoder från F0-1-1-5 till F0-3-12-5 agar till F0-1-1-6 till F0-3-12-6. Ändra markörer för F0-1-1-5 till F0-3-12-5 till F1-1-1-3 till F1-3-12-3 för att representera avkomman av F0 (dvs F1) inom den tredje dagen sedan F0 börjar reproducera.
    9. Den nematoder på F1-1-1-1 till F1-3-12-1 agar har vuxit i 3 dagar. Använd dem för att reproducera F2 i efterföljande MGE-effektstudier. På samma sätt kan du använda F2 nematoder för att reproducera F3 för att fortsätta MGE-effektstudierna.
    10. Genom samma sätt, överföra de två överordnade nematoder dagligen och räkna avkomman nematoder nästa dag, tills föräldern nematoder i 6 NGM agar (dvs., hälften av den totala agar i varje grupp) stoppa reproduktion.
    11. Beräkna det totala antalet avkomman under hela reproduktionstiden som den totala slakt storleken. Använd avkomman nummer inom de första 3 dagarna för att representera den första reproduktion av föräldrarna.
    12. Använd dagen då den överordnade nematodreproduktionen stannar i 6 NGM agar för att uppskatta reproduktionstiden. Använd de dagar som varje enskild förälder har överlevt som sin livslängd.
    13. Få den initiala reproduktion, reproduktion varaktighet, total slakt storlek och livslängd F1 på samma sätt som gjort för F0. Likaså, genom att upprepa ovan nämnda förfarande, reproduktion och livslängd information av F2 (till FN) kan erhållas.
  2. Mät reproduktion och livslängd i MGR effektstudier.
    1. Utför steg 7.2.4 med NGM agar från steg 5,4 ändras till de från steg 2,13.
  3. Mäta biokemiska index.
    1. Spola nematoder utanför NGM agar med sterilt vatten och samla dem i Centrifugera rören. Sedimentera nematoder i 30 min och kassera supernatanterna. Använd nematoder i pellets för effektmätning.
    2. Tillsätt 1 mL iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,0) i nematoder (pellets) i 1,5 mL centrifugrör för att tvätta nematoder.
    3. Centrifugera vid 10 000 x g i 5 min vid 4 ° c och kassera supernatanterna försiktigt med en pipett.
    4. Snap frysa pellets med flytande kväve eller i en-80 ° c frys.
    5. Homogenisera pellets med pestles i ett isbad. Använd 200 μL iskall PBS för att tvätta resterande vätskor på mortelstöt i centrifugerröret innan du tar ut mortelstöt.
    6. Centrifugera vid 10 000 x g i 5 minuter vid 4 ° c igen och Använd supernatanterna för att bestämma aktiviteter eller mängder av biokemikalier med de kommersiella satserna (se material tabellen för detaljer).
    7. Mät mängderna av det totala proteinet (TP) i prover och Använd resultaten som nämnare för att representera andra biokemiska indikatorer, så att skillnaden mellan Nematoden-numren bland proverna kan elimineras.
  4. Mäta genuttryck.
    1. Upprepa steg 7.4.1 till 7.4.4. Isolera det totala RNA från nematodproverna med hjälp av ett kommersiellt RNA-extraktionsset (se material tabellen för detaljer) enligt tillverkarens instruktioner21.
    2. Använd RNA för att syntetisera cDNA enligt tillverkarens instruktioner21.
    3. Analysera cDNA provet i realtid polymeras kedjereaktion (RT-PCR) med hjälp av SYBR Green RT-PCR Kits enligt tillverkarens anvisningar (se tabell över material)21.
    4. Kvantifiera de relativa uttrycksnivåerna för de valda generna med 2-δδct -metoden22och behandla uttrycksnivåerna av BNP-2 (eller annan referens gen) som negativ referens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här beskriver vi protokoll för att studera effekter av kemikalier över generationer med hjälp av C. elegans i trans-generations (TG), multigenerationell exponering (MGE) och flera generationer kvarvarande (MGR) effektstudier. Våra egna forskningsresultat presenteras som exempel. En studie presenterar TG-effekterna av tungmetaller på rörelse beteende3. De andra två studierna presentera MGE och MGR effekter av sulfometoxazol och lindan på reproduktion och biokemiska och genetiska index mätningar4,14.

TG-effekter av tungmetaller på rörelse beteendet hos C. elegans

TRIGLYCERIDEFFEKTERNA av kadmium (CD), koppar (Cu), bly (PB) och zink (Zn) på kroppens böj frekvens (BBF) studerades i nematodföräldern (F0) efter moderns exponering och deras avkomma (T1)3. Effekterna av metaller på BBF visade att hämningarna i T1 var större än i F0, visar mer allvarliga toxiciteter av tungmetaller på förflyttning beteende i embryoexponerade avkomma än i den direkt exponerade föräldern. De TG-effekter av tungmetaller vid miljömässigt realistiska koncentrationer visade att maternell exponering kan multiplicera farorna med tungmetall förorening i efterföljande generationer. Se figur 1.

Figure 1
Figur 1 : Effekterna av kadmium (CD), koppar (Cu), bly (PB) och zink (Zn) på kroppens böj frekvens (F0, blank) efter prenatal exponering och deras avkomma (T1, skuggad). Error bar = standardfel; * = skiljer sig väsentligt från kontrollen, p < 0,05; # = skiljer sig markant från den lägre koncentrationen, p < 0,05; + innebär signifikant olika effekter i F1 än i F0, p < 0,05. Denna siffra har modifierats från Yu et al.3 med tillstånd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

MGR effekter av sulfametoxazol (SMX) på Nematoden livslängd och reproduktion

MGR-effekterna av sulfametoxazol (SMX) på Nematoden livslängd och reproduktion14 studerades på den gesterande föräldern (F0), embryo-exponerade avkomma (T1), germline-exponerade avkomma (T2), den första icke-exponerade avkomma (T3) och de tre följande generationer (T4-T6). Resultaten visade att reproduktionen (en total slakt storlek som 49% av kontrollen) påverkades signifikant vid köns cells-exponering (T2), och toxiciteterna kvarstod i icke-exponerade generationer från T3 till T6-generationer (figur 2). Våra fynd väckte nya farhågor om den långsiktiga påverkan av antibiotika själva förutom deras effekter på antibiotikaresistens.

Figure 2
Figur 2 : Avels storlek (i a), uttryckt i procent av kontrollen) och initial reproduktion (i (B)) av C. elegans i den exponerade föräldern och dess avkomma (F0, T1 till T6, från vänster till höger vid varje koncentration). Error bar = standardfel; a = skiljer sig väsentligt från ANOVA: s kontroll (p < 0,05), b = skiljer sig väsentligt från kontrollen och från den tidigare generationen vid samma koncentration (p < 0,05), c = skiljer sig väsentligt från kontrollen och från den lägre koncentrationen i samma generation (p < 0,05), d = skiljer sig väsentligt från kontrollen och från den tidigare generationen vid samma koncentration och den lägre koncentrationen i samma generation (p < 0,05), e = skiljer sig markant från den tidigare generationen i samma koncentration och den lägre koncentrationen i samma generation (p < 0,05), f = signifikant annorlunda än den tidigare generationen i samma koncentration (p < 0,05). Denna siffra har modifierats från Yu et al.14 med tillstånd.

MGE och MGR effekter lindan på Nematoden biokemiska och genetiska index

MGE-och Mgr-effekterna av lindan (en långlivade organisk förorening [Pop]) studerades på viktiga biokemikalier i lipidmetabolismerna och de genetiska uttrycks förändringarna i den relaterade insulinliknande vägen4. Resultaten visade att lindan uppvisade obesogena effekter med störningar i insulin signal regleringen (figur 3). Dessutom, förändringarna mellan SGK-1 (F0, F3, T1 "och T3") och akt-1 (T1 och T3) signalering indikerade att nematoder från olika exponerings generationer visade olika responsstrategier för tolerans och undvikande.

Figure 3
Figur 3 : Förändringar av uttrycks nivåer av nyckelgener i insulinliknande signalväg i nematoder med olika exponerings erfarenheter. →: positiv reglering; symbol : negativ reglering; : uttryck upp-reglering; : nedreglering av uttrycket. Denna siffra har modifierats från Chen på Al.4 med tillstånd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För att kunna genomföra det beskrivna protokollet bör följande förslag beaktas. Utför den övergripande experimentella verksamheten i en steril miljö. Felaktig användning kan resultera i kontaminering av E. coli -stammar, t. ex., svampar och kvalster kan hindra den normala tillväxten av C. elegans och därför påverka experimentella resultat. I det avsnitt som beskriver odling av c. elegans, Observera tillväxt skalan av c. elegans på NGM agar av nakna ögon eller Mikroskop. När skalan av c. elegans på agar överstiger 75% i området, eller kultur tiden överskrider en vecka, utför en ny inokulering för att undvika övertillväxt eller populationsminskning av c. elegans. Innan processen för synkroniseringen, använda ett mikroskop för att observera tillväxten av C. elegans, och fortsätta processen när Nematoden ägg är allmänt spridda på agar. Dessutom, om lösningsmedel (t. ex. dimetylsulfoxid [DMSO]) används, bör deras koncentrationer i Stamlösningarna vara lägre än 1% för att säkerställa att deras slutliga koncentrationer inte överstiger 0,5% (v/v) för att undvika de skadliga effekterna av själva lösningsmedlen. I TG effektstudier, varaktigheten av exponeringen över 24 h är nödvändig för att säkerställa att exponeringstiden täcker embryobildningen av nästa generation, och varaktigheten bör vara inom 96 h för att underlätta den efterföljande generationen separation. Använd mindre mängder nematoder (vanligtvis inom 20) för att mäta livslängd och reproduktion. Å andra sidan, använda stora mängder nematoder (vanligtvis mer än 500) för att mäta biokemiska och genetiska regleringen index. Därför, för att säkerställa ett tillräckligt antal prover, utföra preliminära experiment för att grovt uppskatta hur många avkomma de mogna F0 nematoder kan reproducera inom de första 24 h eftersom de börjar reproduktion. Bestäm sedan det antal F0 nematoder som krävs för att se till att det finns minst 200 avkomma för att fortsätta med Flergenerationsstudier.

Jämfört med tidigare rapporter om TG-studier med C. elegansvar det nuvarande experimentella protokollet mer hänsynslös när det gäller valet av livsskede. I C. elegansbildas Spermer på L4-stadiet för att befrukta de senare bildade oocyterna23. Följaktligen kommer exponeringen som täcker spermiogenes och oocytogenesis period ge ett särskilt fönster för att studera TG effekter på avkomman. De ålderssynkroniserade äggen används för studier med flera generationer för att säkerställa att exponeringen täcker den totala perioden från början av varje livscykel. Jämfört med tidigare multigenerationsövergripande studier underlättade det nuvarande experimentella protokollet mätning av effekter över flera generationer i stället för endast 1-2 generationer. Dessutom ansåg detta protokoll både MGE och MGR-effekter, vilket är mer systematiskt än tidigare studier som endast mätte MGE eller MGR-effekter.

Framför allt finns det fortfarande vissa frågor att ta upp i det nuvarande experimentella protokollet. Det nuvarande protokollet sysselsätter Wild-typ C. elegans vars generation tid är runt 60 h och livslängd är 20 dagar. Detta gör den totala varaktigheten av experimentet ganska lång (t. ex., MGE effekter studie på livslängd över 3 generationer kräver minst 30 dagar). För att förkorta tiden kan forskarna välja Mutant C. elegans, såsom de kortlivade Mutant nematodes. En annan fråga är den dödande behandling på bakterierna, levande status som är nödvändig för att hålla nematoder friska 24. Dessutom kan UV-dödande processen införa förändringar i kemikalierna25. Därför, andra behandlingar på bakterierna bör övervägas, och noggrann övervakning av de kemiska förändringarna under beredningen eller exponerings processen kan vara nödvändigt, särskilt för instabila föreningar. Samtidigt finns det begränsningar i att studera könsskillnader i toxiska effekter eftersom de flesta av det faktum att C. elegans är hermafrodit. Ytterligare förbättringar för att undersöka kön bidrag i TG, MGE eller MGR effekter behövs. Sammanfattnings, vi räknar med att det föreslagna protokollet kommer att vara stor betydelse för att använda C. elegans att studera TG, MGE och MGR effekter av toxicants.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna är tacksamma för de ekonomiska stöd från National Science and Technology större projekt för vattenförorening kontroll och behandling (2017ZX07201004), och International Science & Technology samarbetsprogram i Kina (nr 2016YFE0123700).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 agar powder OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 9002-18-0
79nnHT Fast Real-Time PCR System  Applied Biosystems 
96-well sterile microplate Costar?Corning?America
Autoclave sterilizer Tomy, Tomy Digital Biology, Japan
Biosafety cabinet LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China
calcium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10043-52-4
centrifuge  5417R Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Centrifuge tubes Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America
cholesterol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 57-88-5
Dimethyl sulfoxide VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America 67-68-5
disodium hydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7558-79-4
ethanol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 64-17-5
Filter Thermo, Thermo Fisher Scientific, America
incubator YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China
inoculating loop
K2HPO4•3H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 16788-57-1
kraft paper
Mcroplate Reader Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America
MgSO4•7H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10034-99-8
Microscopes XTL-BM-9TD BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China 
Petri dishes
Pipette Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Potassium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7447-40-7
potassium dihydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7778-77-0
Qiagen RNeasy kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States
sodium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7647-14-5
sodium hydroxide Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 1310-73-2
sodium hypochlorite solution Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China 7681-52-9
tryptone OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 73049-73-7
yeast extract OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 119-44-8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
  2. Li, W., et al. Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells. Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).
  3. Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny. Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).
  4. Chen, R., Yu, Z., Yin, D. Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway. Chemosphere. 210, 607-614 (2018).
  5. Van Norman, G. A. A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation. International Anesthesiology Clinics. 53, (3), 63-78 (2015).
  6. Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, (7), 1877-1888 (2018).
  7. Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 13, 20160966 (2017).
  8. Coimbra, A. M., et al. Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study. Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).
  9. Sugi, T. Genome editing in C. elegans and other nematode species. International Journal of Molecular Sciences. 17, 295 (2016).
  10. Leung, M. C. K., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Science. 106, (1), 5-28 (2008).
  11. Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration. Journal of Environmental Sciences-China. 23, (2), 294-300 (2011).
  12. Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure. Environmental Science & Technology. 47, 5393-5399 (2013).
  13. Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans. Science. 356, 320 (2017).
  14. Yu, Z. Y., et al. Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).
  15. Buisset-Goussen, A., et al. Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans. Radioactivity. 137, 190-197 (2014).
  16. Zhao, F., et al. Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice. Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).
  17. Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans. Asian Journal of Ecotoxicology. 11, (4), 61-68 (2016).
  18. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis dlegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  19. Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).
  20. Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, (38), 13496-13501 (2005).
  21. Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Physiology. 9, 426 (2018).
  22. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, (4), 402-408 (2001).
  23. Hill, R., et al. Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes. Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).
  24. Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).
  25. Breider, F., von Gunten, U. Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide. Analytical Chemistry. 89, (3), 1574-1582 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics