Opsonophagocytic Tötung Assay Immunreaktionen gegen bakterielle Krankheitserreger zu bewerten

Immunology and Infection

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Summary

Dieser Opsonophagocytic Tötung Assay wird verwendet, um die Fähigkeit der phagocytic Immunzellen zur Beantwortung und töten Bakterien basierend auf verschiedene Behandlungen und/oder Bedingungen zu vergleichen. Klassisch, dient dieser Assay als der Goldstandard für die Beurteilung der Effektor-Funktionen von Antikörpern gegen ein Bakterium als Opsonin erhoben.

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Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (146), e59400, doi:10.3791/59400 (2019).

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Abstract

Ein wesentlicher Aspekt der Immunantwort auf bakterielle Besiedlung des Gastgebers ist Phagozytose. Ein Opsonophagocytic-Tötung-Assay (OPKA) ist ein experimentelles Verfahren, in dem phagocytic Zellen mit bakteriellen Einheiten Co kultiviert sind. Die Immunzellen werden phagozytieren und töten die Bakterienkulturen in einer Ergänzung-abhängigen Weise. Die Effizienz der immun-vermittelte Zelle Tötung ist eine Reihe von Faktoren abhängig und kann verwendet werden, um festzustellen, wie die verschiedenen bakteriellen Kulturen zu vergleichen, in Bezug auf Widerstand zum Zelltod führt. Auf diese Weise kann die Wirksamkeit von potenziellen immun-basierten Therapeutika gegen bestimmte Bakterienstämme und/oder Serotypen beurteilt werden. In diesem Protokoll beschreiben wir eine vereinfachte OPKA, die grundlegende Kulturbedingungen und Zelle zählen, um bakterielle Zellviabilität nach Kokultur mit Behandlung und HL-60 Immunzellen bestimmen verwendet. Diese Methode wurde erfolgreich mit einer Reihe von verschiedenen Pneumokokken-Serotypen, Kapsel und Acapsular Stämme und andere Bakterienarten genutzt. Die Vorteile dieses OPKA-Protokolls sind seine Einfachheit, Vielseitigkeit, (da dieser Test auf Antikörper Behandlungen wie Opsonins nicht beschränkt), und Minimierung von Zeit und Reagenzien zu grundlegenden experimentelle Gruppen zu beurteilen.

Introduction

Die Opsonophagocytic töten Assay (OPKA) ist ein wichtiges Werkzeug für spätere Änderungen der Immunantwort und Funktion Änderungen in bakteriellen Struktur oder Funktion verlinken. Als solche häufig dient es als eine ergänzende Assay immun-basierte Wirksamkeit von Antikörper-Therapien, Impfstoffkandidaten, Enzym-Optimierung zu bestimmen. In-vivo-Tests sind notwendig, um effektive Räumung oder Schutz in eine bakterielle Infektion-Modell zu bestimmen, kann die OPKA verwendet werden, um immun Beitrag zur bakteriellen Zelltod zu den grundlegende Komponenten bewerten: Bakterien, Immunzellen, und experimentelle Behandlungen. Frühere Studien haben gezeigt, dass die OPKAs geändert und für eine Vielzahl von Bakterien und Serotypen, darunter Streptococcus Pneumoniae1, Staphylococcus Aureus2, Pseudomonas Aeruginosa3verwendet werden kann. Darüber hinaus können diese optimierten Assays verwendet werden, um verschiedene experimentelle Behandlungen, einschließlich der Möglichkeit eines Enzyms, das Bakterium zugänglicher zu ergänzen-vermittelten immunen Zellen4 und Antikörper-Behandlungen zur Verbesserung machen bewerten Opsonization5. Klassisch, OPKA Assay erfolgreich eingesetzt in der Grundlagenforschung und klinische Forschung Einstellungen als ein aussagekräftiger Indikator für Schutz induziert durch Erreger-spezifischen Antikörper6,7,8,9 .

Verschiedene Arten von Immunzellen können zur Beurteilung der Opsonophagocytic töten verwendet werden. Eine häufig verwendete phagocytic Bevölkerung ist der HL-60 menschlichen leukämischen Zell-Linie. Diese Zelllinie kann als inaktivierte Promyelocytes in Kultur gehalten werden; jedoch können sie in verschiedene aktivierte Zustände über verschiedene Drogen Behandlungen10,11unterschieden werden. Behandlung von HL60 mit N, N-Dimethylformamid unterscheidet die Zellinie in aktivierten Neutrophilen mit starken phagocytic Aktivität11. Während HL-60 Zellen optimiert wurden und werden häufig für die Phagozytose Assays10verwendet, können andere primäre polymorphkernigen Leukozyten als immun Arm der Experiment-12verwendet werden.

Darüber hinaus können diese Assays vereinfachte13 oder14 betrachten mehrere Antibiotika-resistente Bakterienstämme der zu prüfenden gemultiplext. Die Multiplex-Methode worden eher möglich durch die Entwicklung von Software erzielt, die effizient bakterielle Koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Spot auf einem Agar-Platte15zählen kann. Hier beschreiben wir eine optimierte Methode mit ein Bakterienstamm, HL-60-Zellen, Baby-Kaninchen-Ergänzung und Blutagar Platten. Mit dieser Methode können mehrere Behandlungen schnell beurteilt werden, um spezifische Forschung Fragen auf wie der angeborenen Immunantwort auf bakterielle Infektion moduliert werden kann.

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Protocol

(1) Kultur, Differenzierung und Validierung von HL-60 Zellen

  1. HL-60 Zellkulturmedien bestehend aus 500 mL RPMI mit L-Glutamin und 50 mL Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum vorzubereiten. Fügen Sie keine Antibiotika, da dies die Differenzierung der HL-60 Zellen beeinflussen kann.
  2. Für die Vermehrung/Wartung von HL-60 Zellen entlüftet Kultur 5 x 106 Zellen in HL-60 Zellkulturmedien 75 cm2 10 mL Fläschchen bei 37 ° C und 5 % CO2. Die Passage Zellen alle 3−4 Tage, optimale Zelle Konzentrationen beizubehalten.
    Hinweis: Die Zellkonzentration sollte 5 x 106/mL nicht überschreiten.
  3. Generieren Sie arbeiten Bestände von HL-60 Zellen durch Aliquotierung ca. 1 x 106 Zellen/mL in HL60 Kulturmedien mit 10 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in 1 mL Kryo Röhrchen.
    Hinweis: Funktionierende Aktien können bei-80 ° c gelagert werden Der Meister Bestand sollte bei-120 ° c gelagert werden
  4. Differenzieren Sie HL-60 Zellen durch Kultivierung 1,5 x 107 Zellen in 15 mL HL-60 Zellkulturmedien mit 0,6 % N, N-Dimethylformamid (DMF) bei 37 ° C und 5 % CO2 in steriler Filter-capped 75 cm2 Flaschen für 3 Tage vor OPKA.
  5. Überprüfen Sie, ob die HL-60-Zellen erfolgreich differenziert haben und eignen sich für den Einsatz in der OPKA-Test testen Lebensfähigkeit und Zelle Oberflächenmarker nach etablierten Flow Cytometry Protokolle16,17, 18,19. Ernten Sie nach Differenzierung HL-60 Zellen und Flecken Sie ca. 1 x 104 Zellen mit Gewebekulturen konjugierten Antikörpern/Flecken für CD71, CD35, annexin V und Propidium Jodid.
    Hinweis: Differenzierte Zellen sollte ≥65 % lebensfähig, ≥55 % CD35+, und ≤20 % CD71+ durch bestimmt gegründet Validierung Protokolle14 (Abbildung 1).

2. Vorbereitung des OPKA Puffer und Reagenzien

  1. Bereiten Sie 50 mL sterile Opsonization Puffer B (OBB vor) durch Mischen 42,5 mL sterilen 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Ca2 +/Mg+ 2, 5 mL des Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum und 2,5 mL 0,1 % sterile Gelatine. Shop bei 4 ° C.
  2. Erhalten Sie Baby Kaninchen ergänzen und speichern bei-80 ° C.
  3. Zu erhalten Sie, oder bereiten Sie Bakterienkultur Platten (d. h. 15 x 100 mm2 5 % Schafe Blutagar Platten).

3. Vorbereitung der bakteriellen Lager Proben

  1. Erhalten Sie einen Vorrat an der bakteriellen Angabe getestet werden.
    Hinweis: Für dieses Protokoll, Serotyp 3 Streptococcus Pneumoniae (WU2, großzügig zur Verfügung gestellt von Dr. Moon Nahm) verwendet wird.
  2. Wachsen Sie die bakterielle Belastung in einer entsprechenden Brühe (d. h. Todd Hewitt Brühe + 0,5 % Hefeextrakt für diese Sorte WU2) für ca. 2−4 h bei 37 ° C.
    Hinweis: Die Extinktion bei 600 nm (OD600) der Kultur sollte zwischen 0,6 und 0,8.
  3. Pellet-die Bakterien durch Zentrifugation bei 6.000 X g für 2 min und Aufschwemmen der Zellen in 10−30 mL 15 % Glycerin in der entsprechenden Brühe. Aliquoten die Bakterienkultur (500 µL pro aliquoten) in sterilen 1,5 mL Zentrifuge Tuben und Speicher bei-80 ° C.
  4. Eine Durchstechflasche bakterielle bestand in einem 37 ° C Wasserbad aufzutauen. Pellet-die Bakterienzellen und in 500 µL OBB unter sterilen Bedingungen aufzuwirbeln.
  5. Bereiten Sie verschiedene Verdünnungen der bakteriellen Aktien OBB (d. h. 10 µL keine Verdünnung, 10 µL 01:10, 10 µL 1: 100, etc.). Führen Sie OPKA Assay (Abschnitte 4 – 6, einschließlich HL-60/Ergänzung Kokultur), wie beschrieben unter Verwendung von verschiedenen Verdünnungen von der unbehandelten bakteriellen bestand. Kultur die Platten über Nacht bei 30 ° C (CO2).
    Hinweis: Die Temperatur von 30 ° C ist spezifisch für WU2 Überwucherung zu verhindern; andere Stämme/Serotypen kann optimal bei 37 ° c wachsen.
  6. Zählen der Kolonien für jede Verwässerung des unbehandelten bakteriellen Lager zusammen mit HL-60 Zellen und Ergänzung kultiviert. Bestimmen Sie, welche Verdünnung der Bakterien die optimale Anzahl von zählbaren Kolonien (etwa 80−120 KBE für unbehandelte Bakterien zusammen mit HL-60 Zellen kultiviert) ergibt. Beachten Sie diese Verdünnung für zukünftige OPKAs mit dieser bakteriellen bestand.

4. bakterielle Behandlung und Kultur

  1. Tauen Sie eine Tube bakterielle Lager in Schritt 3.3 vorbereitet. Pellet-Bakterien (6.000 X g für 2 min) und Zelle Pellet in OBB bei optimalen Verdünnung gemäß Schritt 3.6 aufzuwirbeln.
  2. Pipette 10 µL resuspendierte bakterielle Verdünnung pro Bohrloch in einer Kultur Rundboden 96-Well Zellplatte.
  3. Geben Sie 20 µL des entsprechenden Antikörper oder medikamentöse Behandlung in jeder experimentellen in zweifacher Ausfertigung.
    Hinweis: In diesem Protokoll wird ein Serotyp-spezifische Antikörper in Mäusen erzeugt als Behandlung X und ein Glykosid Hydrolase Enzym bekannt zu die Serotyp 3 Polysaccharid-Kapsel zu erniedrigen ist als Therapie Y (Abbildung 2)4,20hinzugefügt. Verwenden Sie für Kontroll-Vertiefungen 1 x PBS oder OBB, abhängig von der Puffer für die Behandlung Brunnen verwendet.
  4. Schütteln Sie Probenteller mit ca. 90 u/min für 1 h bei Raumtemperatur. Passen Sie diese abhängig von der optimalen Temperatur oder schütteln Bedingungen der Behandlungen getestet.

5. HL-60 Co Bakterienkultur

  1. Bereiten Sie HL-60 Zellen durch die HL-60 differenzierte Zellen, die mit DMF behandelt werden drei Tage vor (siehe Punkt 1.4) in 15 mL konische Röhrchen Ernte vor. Pellet-Zellen (500 X g, 3 min), den Überstand zu verwerfen und mit mindestens 10 mL 1 X PBS waschen.
  2. Pellet-die gewaschenen Zellen (500 X g, 3 min), den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in OBB (beginnen Sie mit 1 mL OBB und für eine Endkonzentration von 1 x 107/mL nach Zellzählung anpassen).
  3. Fügen Sie Baby-Kaninchen-Ergänzung (steril, unverdünnt Baby-Kaninchen-Serum, Alter 3−4 Wochen) zu einem Endvolumen von 1:5.
    Hinweis: Die Endkonzentration der HL-60-Ergänzung Mischung sollte 1 x 107/mL. Wenn Ergänzung Abhängigkeit zu testen, kann eine zweite Lösung mit aktiven HL-60-Zellen mit Hitze-inaktivierten Ergänzung verwendet werden (Ergänzung durch Inkubation in einem Wasserbad bei inaktiviert werden kann > 55 ° C für mindestens 30 min).
  4. Nach 1 h Bakterienkultur komplett (4.4) ist, teilen Sie jede Probe (d. h. 10 µL jeder 30 µL Probe in zwei neue Brunnen) in doppelte Brunnen für zwei Gruppen (z. B. Nutzung nur 20 µL der ursprünglichen 30 µL Kokultur Pipettieren Fehler ausmachen) : ein Satz wird Co kultiviert mit HL-60-Ergänzung und eine beinhaltet nur Bakterien. Fügen Sie 50 µL der HL-60-Ergänzung Mischung (aus Schritt 5.3) auf die einzelnen experimentellen Wells (Delegierte + HL-60); Fügen Sie 50 µL OBB allein in die Vertiefungen der Bakterien nur (Delegierte -HL-60).
    Hinweis: In diesem Beispiel werden ca. 800 bakterielle KBE für die anfängliche Kokultur mit 5 x 10550 µL HL-60 Zellen verwendet. Diese Multiplizität der Infektion zu hoch oder zu niedrig, wie letzte Kolonie Zahlen angegeben, passen Sie die bakterielle Anfangsverdünnung im Gegensatz zu den HL-60-Zellzahl.
  5. Schütteln Sie die 96-Well-Platte bei 37 ° C für 1 h (CO2).

6. Probieren Sie Beschichtung und Inkubation über Nacht

  1. Verdünnen Sie jeweils gut 1:5 mit OBB, so dass jede Probe ein Volumen von mindestens 50 µL hat.
  2. Pipette 50 µL jeder Probe direkt auf einen bestimmten Bereich einer Bakterienkultur Platte, ausreichend Abstand zwischen den Proben zu gewährleisten. Für 15 x 100 mm Runde2 Agarplatten, Pipettieren ca. 4 Proben auf einer Platte.
  3. Decken und Proben für ca. 15 min bei Raumtemperatur trocknen lassen.
  4. Invertieren Sie Platten und Kultur über Nacht bei 30 ° C (CO2). Alternativ Kultur Platten in anaeroben Gläsern zu testen, ob anoxische Bedingungen das bakterielle Wachstum beeinflussen oder zu kontrollieren für Morphologie.
  5. Zählen Sie nach Übernachtung Kultur die Kolonien in jeder bestimmten Musterbereich. Analysieren von Daten durch den Vergleich der Anzahl von lebenden Zellen in jedem Satz an den entsprechenden Regler und/oder Proben, die nicht HL-60 Co Zellkultur erhalten (indikativ für 100 % Zelle überleben, 0 % Zelle Tötung).

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Representative Results

Validierung von HL-60 Differenzierung sollte vor Beginn der OPKA durchgeführt werden. Dies kann erreicht werden mit Durchflusszytometrie um zu bestimmen, die extrazellulären Ausdruck von CD11b, CD35, CD71 und annexin V (Abbildung 1). Propidium Jodid kann auch als Lebensfähigkeit Marker verwendet werden. Nach der Behandlung mit DMF für 3 Tage, Ausdruck der CD35 erhöht werden sollte (≥55 % aller Zellen) und Ausdruck der CD71 verringert werden sollte (≤20 % aller Zellen). Der Prozentsatz von annexin V + und Propidium Jodid (PI +) Zellen zusammen sollte sein < 35 % ausreichende Sicherstellung Zelle überleben. Wenn diese Prozentsätze die Mindestanforderungen nicht erfüllen, sollten die Kulturbedingungen eingestellt werden, wie beschrieben in der Diskussion.

Die Anzahl der KBE gewonnenen Schritt 6.5 kann verwendet werden, zu vergleichen, die bakterielle Zelle überleben verschiedener Gruppen im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollgruppe (100 % Zelle überleben), wie in Abbildung 2dargestellt. Beispielsweise sollte die durchschnittliche Grafen von Brunnen, die keine Behandlung erhielten aber waren Co kultiviert mit HL-60 erhalten relativ enge in Reihe zu den Zellen sein, die keine Behandlung und keine Kokultur HL-60, die 100 % Zelle überleben hindeuten würde, oder 0 erhalten % Zelltod. Mit eine wirksame Behandlung sollte die Anzahl der Kolonien mehr zwischen verschiedenen HL-60 Kokulturen und keine HL-60-Zellen (Abbildung 2 und Abbildung 3). Größere Unterschiede zwischen den HL-60 und keine HL-60-Sets sind kennzeichnend für eine effizientere Phagozytose. Jedoch kann die Behandlung tatsächlich bakterielle Zelle Wachstum in der Gruppe verbessern, die nicht zusammen mit HL-60 Zellen kultiviert wird. Dieser Unterschied in der behandelten und unbehandelten Proben sollte beachtet werden. Wenn die bakterielle Verdünnung nicht ist optimiert (Schritt 3.6) oder das Koloniewachstum wird nicht sorgfältig beobachtet nach Beschichtung (Schritt 6.5 oder siehe Diskussion), übermäßiges Wachstum der Kolonien kann verhindern, dass genaue Zählung der Kolonien (Abbildung 4).

Figure 1
Abbildung 1 : Validierung von HL-60-Zell-Differenzierung über Durchflusszytometrie. Differenzierte HL-60-Zellen wurden geerntet, gewaschen und Nukleinsäuretablette in 1 x 105 Zellen/mL PBS. Zellen wurden dann in 12 Vertiefungen (100 µL/Well) in eine 96-Well-Platte regelmÄÑig. Zellen wurden dann mit Gewebekulturen konjugierten Anti-CD35, Anti-CD71 und annexin V Propidium Jodid gebeizt. Ungefärbten Zellen oder Zellen befleckt mit Isotype Eindringmittel konjugierten Antikörpern dienten als Kontrollen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : HL-60-vermittelten Zelle Tötung von Bakterien verbessert die Behandlung Y. Streptococcus Pneumoniae Proben wurden mit Behandlung X behandelt (Antikörper) oder Behandlung Y (Enzym). OPKA erfolgte nach dem Protokoll und bakterielle KBE doppelt gezählt wurden. Proben, die nicht mit HL-60 Zellen behandelt wurden, dienten als ein Steuerelement (100 % Zelle überleben). Gezeigt werden die durchschnittlichen Prozentsätze der bakteriellen KBE in den HL-60 behandelt-Gruppen im Vergleich zu den entsprechenden HL-60-unbehandelten Gruppen. Balken stehen für Standardfehler. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Bakterielle KBE nach OPKA und über Nacht Kultur. Bakterielle Proben wurden behandelt und Co kultiviert ohne (A) oder (B) HL-60 Zellen für 1 h bei 37 ° C. Proben wurden gemäß dem Protokoll verdünnt und vernickelt auf Blutagar, die Platten über bei 30 ° C (CO2 Nacht). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : KBE bakterielle Überwucherung. Bakterielle Proben wurden behandelt und OPKA wurde durchgeführt. Proben wurden verdünnt und vernickelt auf Blutagar, die Platten über bei 37 ° C (CO2 Nacht). Beurteilung der Kolonie zahlen kann nicht bestimmt werden, wie übermäßiges Wachstum von Kolonien zu sehen ist. Als 37 ° C (CO2) führte zum bakterielle Überwucherung, die Inkubationstemperatur für zukünftige Platten bis 30 ° C (CO2) weiterhin Abzählbarkeit der Kolonien gesenkt wurde. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

OPKAs dienen die entscheidende Rolle bei der Beurteilung der Antikörper-vermittelten Immunantwort induziert durch Impfungen6,8. Die Hauptbedeutung dieser vereinfachten OPKA ist die Anpassungsfähigkeit der Bedingungen getestet werden (d. h., Antikörper, Enzym-Behandlungen). In diesem Sinne während dieser Assay verwendet werden kann, um den Beitrag von Opsonins (z.B. Antikörper) in Phagozytose, testen sie auch lässt sich beurteilen, Wege zur Überwindung von Virulenzfaktoren (d. h. Kapsel Polysaccharide), die normalerweise phagocytic Wege hemmen. Minimiert die Anzahl der Schritte, die in der Regel in einem Multiplex OPKA möglicherweise verwendet werden, minimiert die Chancen für technische Fehler, die die experimentellen Ergebnisse beeinflussen können und reduziert die Menge der Problembehandlung und Optimierung für den Erhalt der nutzbaren Daten. Da dieses Protokoll für Variationen zur Behandlung geeignet ist, ermöglicht es für ein hohes Maß an Vielseitigkeit.

Vor Einrichtung der Assay durch Kultur von HL-60 und Aufbau der bakteriellen Bestände ist wichtig, überflüssige Optimierungsschritte zu verhindern, wenn die OPKA durchführen. Zeit muss sicherstellen, dass alle Reagenzien gewidmet sein und Zelltypen sind bereit und funktionale vor dem Experiment wird durchgeführt. Diese Schritte umfassen propagieren die Zellinie HL-60 in der Kultur (ca. zwei Wochen), Validierung, dass bestimmte Konzentrationen von DMF effektiv die HL-60-Zellen (ca. eine Woche) unterscheiden, und schadstofffreie und optimierte bakterielle Lager Einrichtung Verdünnungen (etwa zwei Wochen).

Einige Schritte dieses Protokolls sind entscheidend für den Erhalt der zählbaren Kolonien und ausreichende Daten. Dieses Protokoll verwendet HL-60-Zellen als Phagozyten durch die Leichtigkeit der Verwendung einer menschlichen Zelllinie, die in Kultur gepflegt und differenziert werden kann mit relativ wenigen Schritten. Menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) können auch verwendet werden; jedoch kann diese Zellgewinnung und Optimierung der Bedingungen für ihre Verwendung schwieriger sein. Die HL-60-Zellen müssen differenziert werden, um als Fresszellen gegen die Bakterien fungieren. Um zu überprüfen, Differenzierung nach der 3-Tages-Behandlung mit DMF, sollte Durchflusszytometrie verwendet werden, testen für den Ausdruck von CD11b und CD35 auf eine Mehrheit der Zellen, bevor irgendwelche OPKA versucht wird, wie in Schritt 1.5 erläutert. Zellviabilität sollte auch überprüft werden (vorzugsweise mit annexin V und Propidium Jodid Färbung). Wenn eine große Anzahl von Zellen tot sind, Apoptose, oder undifferenziert als mit Durchflusszytometrie, die 3-Tages-Differenzierung mit 0,6 % beobachtet DMF in RPMI Medien geändert werden kann (0,4 % −0. 8 % DMF, 2−6 Tag Kulturzeit) bis Zellenmarkierungen Lebensfähigkeit und Differenzierung sind verbessert. Diese Differenzierung sollte die erste Optimierung der OPKA, wie HL-60-Funktion für effektive bakteriellen Tötung von entscheidender Bedeutung ist. Es wird empfohlen, Validierung von HL-60 Differenzierung vor jeder OPKA Experiment.

Die Anzahl der Bakterien KBE (Schritt 3.6) zunächst verzichtet in 96-Well-Platte (Schritt 4.2) ist auch wichtig: Verzicht auf zu viele Zellen wird schwierig und ungenau (Schritt 6.5) zu zählen und kann verringern den Zelltod von HL-60 Kokultur, beobachtet werden, während Verzicht auf zu wenige Zellen kann erhöhen Sie die Menge der Abweichung zwischen Duplikate und kann keine zählbaren Kolonien nach HL-60 Kokultur zeigen. Optimierung der Lager Verdünnung ist daher äußerst wichtig und muss mit dem vollständigen Protokoll, einschließlich HL-60/Ergänzung Kokultur getestet werden.

Die Bedeutung der Ergänzung kann auch mit diesem Protokoll durch die Einbeziehung von zwei Sätze von Proben getestet werden: eine mit aktiven Baby Kaninchen Ergänzung und eine mit Hitze-inaktivierten ergänzen. HL-60 Zellen sollte mit beiden Sets, Co kultiviert werden, obwohl eine Reihe von Bakterien nur noch als eine 100 % Zelle überleben Baseline enthalten sein sollte.

Für einige bakterielle Serotypen kann die Morphologie der Kolonien Zellzählung oder Sicht problematisch machen. Mucoid Serotypen wie Typ 3 Streptococcus Pneumoniae, zum Beispiel kann, leicht überwuchern und reduzieren die KBE zählt. Dies kann besonders problematisch sein, wenn Behandlungen zu testen, die die Kapsel zu beeinflussen, während Überwucherung in der behandelten Gruppe verhindert werden würde, aber größerer Anzahl von kleineren Kolonien gezählt werden würde. Um diese Diskrepanz zu verhindern, ist die Kontrolle des Zellwachstums entscheidend. Kultivierung der vergoldeten Kolonien bei 30 ° C über Nacht wird wahrscheinlich ermöglichen bessere Überwachung des Bakterienwachstums und die Platten entfernt werden, wenn alle Kolonien unterscheidbare, zählbare Größen erreichen. Darüber hinaus können verschiedene Agarplatten zur Verbesserung der Sichtbarkeit der einzelnen Kolonien. Auf diese Weise ist dieses Protokoll vorteilhaft, da kleine Änderungen an Bedingungen zu optimieren damit verwendet werden können, um eine Anzahl von Bakterienstämmen oder verschiedene Behandlungsmöglichkeiten zu berücksichtigen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) für seine unschätzbare Hilfe bei der Gründung OPKA Tests in unserem Labor. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health Grant 1R01AI123383-01A1, FYA unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Annexin V (APC conjugated) BioLegend 640919
anti-CD35, human (PE conjugated) BioLegend 333405
anti-CD71, human (PE conjugated) BioLegend 334105
bacterial strain to be used (i.e., Streptococcus pneumoniae, WU2) Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) 
blood agar plates Hardy Diagnostic A10
Fetal Clone serum HyClone SH30080.03
glycerol Sigma G9012-1L
HL-60 cells ATCC CCL-240
IgG Isotype Control (PE conjugated) BioLegend 400907
N,N-dimethylformamide (DMF) Fisher Chemical UN2265
propidium iodide Sigma P4864
RPMI media with L-glutamine Corning 10-040-CV

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