إجراءات التشغيل الموحدة لمراقبة فيروس ليسا لسكان الخفافيش في تايوان

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يقدم هذا البروتوكول إجراء تشغيل مختبري قياسي للاختبار التشخيصي لمستضدات فيروس ليسا في الخفافيش في تايوان.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hsu, W. C., Hsu, C. L., Tu, Y. C., Chang, J. C., Tsai, K. R., Lee, F., Hu, S. C. Standard Operating Procedure for Lyssavirus Surveillance of the Bat Population in Taiwan. J. Vis. Exp. (150), e59421, doi:10.3791/59421 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الفيروسات داخل جنس Lyssavirus هي مسببات الأمراض الحيوانية، ويرتبط ما لا يقل عن سبعة أنواع فيروس ليسا مع الحالات البشرية. لأن الخفافيش هي الخزانات الطبيعية لمعظم الفيروسات الليسافية، وقد تم تنفيذ برنامج مراقبة فيروس ليسا من الخفافيش في تايوان منذ عام 2008 لفهم بيئة هذه الفيروسات في الخفافيش. وفي هذا البرنامج، تعاونت المنظمات غير الحكومية المعنية بحفظ الخفافيش والمراكز المحلية لمكافحة الأمراض الحيوانية لجمع الخفافيش الميتة أو الخفافيش التي تموت بسبب الضعف أو المرض. تم الحصول على أنسجة الدماغ من الخفافيش من خلال المحاصيل الفلورية وإخضاعها لاختبار الأجسام المضادة الفلورسنت المباشر (FAT) والنسخ العكسي تفاعل البوليميراز سلسلة (RT-PCR) للكشف عن مستضدات فيروس ليسا والأحماض النووية. بالنسبة للدهون، يوصى باثنين على الأقل من التتقارنات المختلفة لتشخيص داء الكلب. بالنسبة لـ RT-PCR، تُستخدم مجموعتان من المواد التمهيدية (JW12/N165-146 وN113F/N304R) لتضخيم تسلسل جزئي لجين البروتين النووي للفيروس الليسا. يراقب برنامج المراقبة هذا الفيروسات الليسافيروسية وغيرها من العوامل الحيوانية في الخفافيش. تم العثور على فيروس الخفافيش التايوانية في حالتين من بيبيستريلي اليابانية(Pipistrellus abramus)في 2016-2017. وينبغي أن تبلغ هذه النتائج الجمهور والمهنيين الصحيين والعلماء بالمخاطر المحتملة للاتصال بالخفافيش وغيرها من الأحياء البرية.

Introduction

الفيروسات داخل جنس Lyssavirus هي مسببات الأمراض الحيوانية. هناك ما لا يقل عن سبعة أنواع فيروس ليسا المرتبطة الحالات البشرية1. بالإضافة إلى 16 نوعا في هذا الجنس1،2،3، تايوان الخفافيش lyssavirus (TWBLV)4 وKotalahti الخفافيش lyssavirus5 تم تحديدها مؤخرا في الخفافيش ، ولكن حالاتها التصنيفية لم يتم تحديدها.

الخفافيش هي المضيفين الطبيعيين لمعظم الفيروسات الليسافية، باستثناء موكولا ليسافيروس وإيكوما ليسافيروس، والتي لم يتم تحديدها حتى الآن في أي الخفافيش1،2،3،6. لا تزال المعلومات المتعلقة بالفيروسات الليسافية في الخفافيش الآسيوية محدودة. تم الإبلاغ عن اثنين من الفيروسات lyssasaغير مميزة في الخفافيش الآسيوية (واحد في الهند والآخر في تايلاند)7،8 تم الإبلاغ عنها. تم الإبلاغ عن حالة واحدة من حالات داء الكلب البشري المرتبطة لدغة الخفافيش في الصين في عام 2002، ولكن تم التشخيص فقط عن طريق المراقبة السريرية9. في آسيا الوسطى، تم التعرف على فيروس أرافان ليسا في الخفافيش أقل ماوس الأذنين(Myotis blythi)في قيرغيزستان في عام 1991، وتم التعرف على فيروس Khujand lyssa في الخفافيش شعيرات (Myotismystacinus)في طاجيكستان في عام 200110. في جنوب آسيا، تم التعرف على Gannoruwa الخفافيش lyssavirus في الثعلب الطائر الهندي(Pteropus medius)في سري لانكا في عام 20153. في جنوب شرق آسيا، أظهرت العديد من الدراسات المصلية على الخفافيش في الفلبين وتايلاند وبنغلاديش وكمبوديا وفيتنام الانتشار المصلي المتغير11،12،13،14، 15. على الرغم من أنه تم التعرف على فيروس إركوت ليسا في الخفافيش أكبر أنبوب أنف(مورينا leucogaster)في مقاطعة جيلين، الصين في عام 201216،لا تزال الأنواع بالضبط ومواقع lyssaviruses في مجموعات الخفافيش شرق آسيا غير معروفة.

ولتقييم وجود فيروس الليسا في مجموعات الخفافيش التايوانية، بدأ تنفيذ برنامج مراقبة يستخدم كلا ً من فيروس FAT المباشر وRT-PCR. تم التعرف على فيروس الخفافيش التايوانية في حالتين من البيبيسترلي الياباني(Pipistrellus abramus)4 في 2016-2017. في هذه المقالة، يتم إدخال إجراء تشغيل قياسي مختبري لمراقبة فيروس الليسا لسكان الخفافيش في تايوان. يتم عرض الرسم البياني لتدفق تشخيص فيروس الخفافيش في مختبرنا في الشكل 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. احتياطات السلامة عند التعامل مع الفيروسات الليسافيروسية

  1. التأكد من أن جميع العاملين في المختبرات الذين يتعاملون مع عينات الخفافيش يتلقون الوقاية من داء الكلب قبل التعرض17. مراقبة مستويات الأجسام المضادة لداء الكلب من العمال مسبقا وإعادة فحصها كل 6 أشهر17. مطلوب متابعة التطعيم ضد داء الكلب لأولئك الذين مستويات الأجسام المضادة أقل من 0.5 وحدة IU/مل17.
  2. اعتمادا على أنظمة السلامة الأحيائية في البلد الذي يوجد فيه المختبر، تأكد من تنفيذ الإجراءات التالية في مختبرات مناسبة على مستوى السلامة الأحيائية (مثل مختبرات BSL-2 في تايوان ومختبرات BSL-3 في أستراليا)، وأن العمال مؤهلون حاليا وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة18.
    ملاحظة: التطعيم داء الكلب يوفر القليل من الحماية أو لا يمكن أن تكون من الفيروسات التي تنتمي إلى فيلوالمجموعات الثانية والثالثة18. ويجب إبلاغ العمال بأنه تم تحديد العديد من مسببات الأمراض الحيوانية في الخفافيش19 وينبغي أن تعالج العينات في ظل ظروف مختبرية مناسبة على مستوى السلامة الأحيائية مع معدات وقائية شخصية مناسبة.

2. جمع عينة

  1. استخدام وجدت الخفافيش ضعيفة أو مريضة أو الذبيحة.
    ملاحظة: يتم تسليم الخفافيش الضعيفة أو المريضة إلى جمعية حفظ الخفافيش في تايبيه للرعاية البيطرية أو البحوث، في حين يتم تقديم الذبيحة مباشرة إلى معهد بحوث صحة الحيوان. لم يتم قتل أي خفافيش صحية في برنامج المراقبة هذا.
  2. يكون عالم البيئة الخفافيش تحديد أنواع الخفافيش من خلال الخصائص المورفولوجية20.
  3. إجراء ترميز الحمض النووي من أنواع الخفافيش عندما يتم تشخيص lyssavirus إيجابية، وذلك باستخدام الإجراءات المنشورة سابقا21.
  4. تقديم ورقة معلومات عن كل جيفة الخفافيش (موقع جمع، والأنواع، والعلامات السريرية، وما إلى ذلك).

3. المحاصيل من عينات الخفافيش

  1. إعداد المواد.
    1. إعداد لوحة تشريح نظيفة ووضع وسادة ماصة معقمة لnecropsy.
    2. إعداد أنابيب جمع لجمع أجهزة الخفافيش.
    3. إعداد ملاقط المتاح ومشرط لnecropsy. تغيير الأدوات بين necropsy كل الخفافيش. إعداد كرات القطن مبللة مع الإيثانول 70٪ لتنظيف ملاقط ومشرط أثناء أخذ العينات.
    4. إعداد اثنين من الشرائح المجهر لFAT. جمع عينات جديدة وإصلاحها في حل رسمي لفحص الأنسجة المرضية.
  2. فحص جميع الفتحات الخارجية قبل necropsy. تصوير السمات الخارجية للخفافيش، وخاصة الرأس والأذنين والأجنحة، لتمايز الأنواع.
  3. جمع عينة مسحة عن طريق الفم. وضع الخفافيش في recumbency البطني على متن الطائرة وإصلاح رأس الخفافيش مع ملاقط. قطع الجلد على طول خط الوسط من calvaria مع مشرط وسحب الجلد إلى الجانبين الجانبي. قطع الجمجمة على طول خط الوسط من calvaria مع مشرط وفتحه مع ملاقط لفضح أنسجة الدماغ.
  4. إزالة أنسجة الدماغ من الجمجمة ووضعها على الاكتئاب اللسان المعقمة، وجعل مسحات الانطباع من أنسجة الدماغ (انظر الخطوة 4.2). جمع قطعة صغيرة من أنسجة الدماغ الطازجة وإصلاحه في formalin لفحص الأنسجة المرضية. احتواء أنسجة الدماغ المتبقية في أنبوب لاستخراج الحمض النووي.
  5. ملاقط نظيفة ومشرط مع كرات القطن مبللة مع الإيثانول 70٪ لإزالة الأنسجة المحتفظ بها بين جمع العينات.
  6. وضع الخفافيش على متن الطائرة في recumbency الظهرية وإصلاحه على متن الطائرة مع الإبر على جانبي axilla وكعب الذيل.
  7. نأي الجلد على طول خط الوسط من الجسم من الفك السفلي إلى فتحة الشرج. رفع وفصل الجلد والأنسجة العضلية الكامنة مع ملاقط. جمع الغدد اللعابية، والتي هي بالقرب من العظام الفكالسفلي.
  8. رفع القص قليلا مع ملاقط، وقطع القص وجدار البطن على طول خط الوسط مع مشرط. قطع الترقوة مع مشرط. إصلاح أقفاص الضلع الأيسر والأيمن إلى المجلس مع الإبر لفتح تجويف الصدر.
  9. تسجيل الآفات الإجمالية ودرجة التغيير بعد الوفاة.
  10. إزالة الأنسجة الحشوية (أي القلب والرئتين والكبد والكلى والأمعاء) من الذبيحة باستخدام ملاقط ومشرط. جمع العينات الحشوية حسب الحاجة للبحوث في المستقبل.
    ملاحظة: من المستحسن جمع عينات مكررة. وينبغي جمع واحد للتشخيص الجزيئي، والآخر ينبغي تجميدها في -80 درجة مئوية مع أو بدون وسيلة نقل الفيروسية للثقافة الفيروسية22.

4. اختبار الأجسام المضادة الفلورسنت المباشر (FAT)

  1. جعل مسحات الانطباع من أنسجة الدماغ لFAT. تنفيذ FAT كما هو موضح سابقا18،23 مع التعديلات التالية.
  2. قم بفصل أنسجة الدماغ بلطف عن الأنسجة العصبية المتصلة بملاقط ونقل أنسجة الدماغ إلى مُقِّب لللسان المعقمة. قطع المقطع العرضي من الدماغ، بما في ذلك جذع الدماغ والمخيخ18،23. جعل مسحات الانطباع من أنسجة الدماغ عن طريق لمس طفيفة سطح قطع أنسجة الدماغ، واضغط على الشريحة على أنسجة العدسة لإزالة الأنسجة الزائدة.
  3. إصلاح الشرائح مع الأسيتون في -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. استخدام كل من اثنين من الأجسام المضادة المضادة لداء الكلب FITC المترافقة تجاريا لتلطيخ مستضد فيروس ليسا ينصح بشدة23. تحديد تركيز العمل من المتقارن ة التجارية قبل تلطيخ الأول. إسقاط الكدمات المخففة من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر على الشرائح واحتضان الشرائح في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة داخل غرفة رطبة.
  5. قم بتجفيف المتقارنالزائد من الشرائح واغسل الشرائح بمحلول ملحي مُسحّص بالفوسفات (PBS) بعد الحضانة.
  6. إسقاط كمية صغيرة من الجلسرين 10٪ على الشرائح وتغطية مع الشرائح غطاء.
  7. فحص الشرائح مع المجهر الفلورسنت.

5. استخراج الحمض النووي

  1. إضافة الحجم المناسب من MEM-10 (الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية المكملة مع 10٪ مصل البقر الجنيني) إلى أنسجة الدماغ (10٪ ث / الخامس).
  2. تجانس أنسجة الدماغ مع حبة الصلب 5 مم في أداة المجانسة والطرد المركزي في 825 × ز لمدة 10 دقائق.
  3. استخراج حمض النووية، والحجم النهائي منها هو 50 درجة مئوية، في غضون 200 درجة مئوية من supernatant باستخدام مجموعة استخراج حمض نووي الكلي المتاحة تجاريا مع أداة.

6. RT-PCR والتحليل الجيني

ملاحظة: تم نشر عدة مجموعات التمهيدي للكشف عن كافة الفيروسات lyssaالمعروفة أو lyssaviruses محددة. البروتوكول الموصوف هنا هو مثال يستخدم مختبرنا وقد لا يناسب جميع الاحتياجات التجريبية. حدد التمهيديات المناسبة وفقا لاحتياجات المختبر.

  1. إعداد الكاشف RT-PCR من خطوة واحدة على النحو التالي: إضافة 5 ميكرولتر من حمض نووي المستخرج إلى خليط التفاعل الذي يحتوي على 2.5 ميكرولتر من 10X احتياطي التفاعل، 0.5 ميكرولتر من التمهيديات الأمامية والعكسية (10 ميكرومتر لكل منهما)، 4 ميكرولتر من 1.25 مليون متر من الدنتب، 0.3 ميكرولتر من مثبطات RNase (40 U/μL) ، 0.3 ميكرولتر من النسخ العكسي (10 U/μL)، و0.4 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي (5 U/μL)، و 11.5 ميكرولتر من المياه المعالجة بـ DEPC.
    ملاحظة: مجموعة التمهيدي المستخدمة في هذا البروتوكول هو JW12 (5 '-ATGTACACCYCTACAATG-3') و N165-146 (5'-GCAGGGTAYTTRTACTCATA-3')24. تعديل إعداد الكواشف وظروف ركوب الدراجات وفقا لمجموعات التمهيدي المستخدمة.
  2. أداء ركوب الدراجات في ظل الظروف التالية: الحضانة في 42 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة; النُضر الأولي عند 94 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 35 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 s, 55 °C ل 30 s, و 72 °C ل 30 s; وأخيرا، مزيد من التمديد في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. استخدام مجموعة أخرى أو أكثر التمهيدي لزيادة حساسية التشخيص.
    1. استخدام N113F (5'-GTAGGGTTATATGGG-3') و N304R (5'-TTGACGAGAATCTTTCTCAT-3')25،26 لإعداد الكاشف RT-PCR خطوة واحدة على النحو التالي: إضافة 5 ميكرولتر من حمض نووي المستخرجة إلى خليط رد فعل يحتوي على 5 ميكرولتر من 10X العازلة، 5 ميكرولتر من التمهيديات الأمامية والعكسية (4 ميكرومتر لكل منها)، 5 ميكرولتر من 1.25 مليون متر من الدنتوب، 0.5 ميكرولتر من مثبطات RNase (40 U/μL)، 0.2 ميكرولتر من النسخ العكسي (10 U/μL)، 1 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي (5 U/μL)، و23.3 ميكرولتر من المياه المعالجة بـ DEPC.
    2. أداء ركوب الدراجات في ظل الظروف التالية: الحضانة في 42 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة; النُضر الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ 35 دورة من 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 55 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 20 درجة، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة؛ وأخيرا، مزيد من التمديد في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: اعتمادا على الاحتياجات المختبرية، واختيار التمهيديات المناسبة للتشخيص. تم تصميم N113F في الأصل لتضخيم فيروس داء الكلب، ولكن قد لا تعمل بشكل جيد لفيروسات lyssas الأخرى. مجموعة من N113F و N304R يعمل بشكل جيد لفيروس داء الكلب (تايوان النمس الغرير البديل) وتايوان الخفافيش lyssavirus. سيكون من الأسهل الحصول على تسلسل البروتين النووي كله باستخدام مجموعة من التمهيديات JW12 و N304R إذا تم تضخيم ليسافيروس من قبل كل من اثنين من مجموعات التمهيدي أعلاه.
  4. تحليل المنتج PCR على 2٪ الأوروز جل الكهربائي وتصور من قبل الأشعة فوق البنفسجية الإضاءة الخفيفة.
  5. تسلسل المنتج PCR حسب خدمة التسلسل التجاري.
  6. أدخل أو حمّل التسلسل إلى صفحة ويب أداة البحث عن المحاذاة المحلية الأساسية (BLAST). حدد قاعدة البيانات "الآخرين (NR الخ)" وأدخل الكائن الحي كفيروس Lyssavirus. حدد خوارزمية MegaBlast وتشغيل BLAST.

7. فيروس العزلة

ملاحظة: تنفيذ عزل الفيروس عند إما 1) FAT أو 2) يشير RT-PCR الإيجابية.

  1. تجانس عينة الدماغ في تعليق 10٪ (ث / الخامس) في MEM-10. الطرد المركزي في 825 × ز لمدة 10 دقائق.
  2. تلقيح 200 درجة مئوية من supernatant مع تعليق 3 × 106 MNA (الماوس ورم الخلايا العصبية) الخلايا في 1 مل من MEM-10 لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية مع 1٪ CO2. نقل تعليق الدماغ خلية متجانسة إلى قارورة 25 سم2 وإضافة 6 مل من MEM-10.
  3. زراعة 1 مل من الدماغ تعليق خلية متجانسة في 4 الشريحة الزجاجية المغلفة تفلون جيدا مع قطر 6 ملم في نفس الوقت.
  4. بعد 3-4 أيام من الحضانة في 37 درجةمئوية مع 1٪ CO 2، إصلاح الخلايا على الشريحة 4 جيدا مع الأسيتون 100٪ (v / v).
  5. وصمة عار الشرائح مع اثنين من الأجسام المضادة لداء الكلب FITC المترافقة بعد الخطوات 4.4-4.7. يتم إصابة الخلايا عندما يتم التحقيق في التضمينات intracytoplasmic. تسجيل النسبة المئوية للخلايا المصابة.
  6. إجراء التغريب والثقافة الفرعية لثقافة الخلية الملقحة عندما تكون الشرائح ملطخة بالسالبة:
    1. إزالة المتوسطة وشطف قارورة مع 5 مل من PBS.
    2. إضافة 1 مل من التربسين إلى قارورة وضرب بحزم الجزء السفلي من قارورة.
    3. إضافة 6 مل من MEM-10 وإعادة تعليق الخلايا.
    4. وضع تعليق الخلية في قارورة الأنسجة الجديدة (6 مل) وعلى شريحة 4 جيدا (1 مل).
  7. كرر الخطوات 7.4-7.6 حتى يتم الوصول إلى العدوى 100%.
  8. جمع supernatant بعد 24 ساعة من الحضانة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في الفترة من عام 2014 إلى مايو 2017، تم جمع 332 جثة خفاش من 13 نوعاً للمراقبة. اثنين من اختبار إيجابي. في حالة الخفافيش الأولى، تم اختبار انطباع الدماغ سلبيًا باستخدام FAT مع أحد الأجسامالمضادة لداء الكلب التجاري المترافق ة في تَكْتَبَد (الشكل 2)، في حين أن ّ الـ RT-PCRs التي تستخدم كل من المجموعتين التمهيديتين (JW12/N165-146 وN113F/N304R) أسفرت عن نتائج إيجابية(الشكل 3). تم الحصول على تسلسل 428 نقطة أساس من amplicon (تضخيم مع N113F/N304R وتحتوي على جين البروتين النووي الجزئي). وقد تعرض تسلسلها للاستعلام عن BLAST بواسطة قاعدة بيانات GenBank. وأظهرت النتيجة أن التسلسل كان مشابها ً للفيروسات الليسافية التيتقل هوياتها عن 79% (الشكل 4)، مما يدعم هويات فيروسات الليسافيروس المكتشفة.

في وقت لاحق، تم عزل اثنين من الفيروسات lyssas بنجاح منهذين العقول، وأكد الفيروسات من قبل FAT (الشكل 5) والتسلسل. تم تعيين lyssavirus المحدد باسم تايوان الخفافيش lyssavirus (TWBLV) استنادا إلى تحليل تسلسل4. وفي الحالة الثانية، كانت النتائج التي تم الحصول عليها من الصناديق التي تستخدم كل من الأجسام المضادة لداء الكلب التجاريين المترافقتين في مركز التجارة العالمية غير متسقة، على النحو المبين في الحالة الأولى.

Figure 1
الشكل 1: مخطط تدفق تشخيص فيروس الخفافيش.
مخطط انسيابي يوضح العملية الحالية وطرق التشخيص التي يستخدمها مختبرنا الآن. يجب إجراء عزل الفيروس عندما يكون اختبار الأجسام المضادة الفلورسنت المباشر أو تفاعل سلسلة بوليميراز النسخ العكسي إيجابيًا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: FAT المباشرة مع اثنين من الأجسام المضادة لمكافحة داء الكلب فيتك المترافقة التجارية من ضغط الدماغ كله من الخفافيش المصابة TWBLV تسفر عن نتائج غير متناسقة.
رقم الحالة: 2016-2300: (A) FAT مع الكاشف A (تخفيف 5X)، مما يدل على إشارات إيجابية التفاح الأخضر. (ب) FAT مع الكاشف B، مما يدل على نتيجة سلبية (20X تخفيف). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: منتجات الـ RT-PCRs التي تستخدم مجموعتين تمهيديتين.
وكانت مجموعة التمهيدي المستخدمة في الممرات من 1 إلى 3 JW12/N165-146، وكان حجم المنتج المتوقع 111 زوجا ً أساسياً. وكانت مجموعة التمهيدي المستخدمة في الممرات من 4 إلى 6 N113F /N304R، وكان حجم المنتج المتوقع 521 زوجا ً أساسياً. وكان كلا الاختبارين للعينة (الممران 1 و 4) إيجابيين. M = 100 نقطة في الثانية سلم الحمض النووي؛ الممرات 1 و 4 = عينة اختبارها؛ الممرات 2 و 5 = الضوابط الإيجابية؛ الممرات 3 و 6 = الضوابط السلبية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: نتيجة الانفجار من الناتج N113F/N304R من TWBLV الخفافيش المصابة.
وأظهرت نتائج الانفجار أن الحالة كانت الأكثر تشابها مع فيروس ليسا، ولكن الهوية مع فيروس ليسا في قاعدة البيانات كانت 79٪ فقط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مقارنة توزيع مستضد فيروس ليسا لعزل فيروس TWBLV مع اثنين من المعوّقين في تضدات داء الكلب.
تم تلقيح مستحلب الدماغ الخفافيش 10٪ (TWBLV المصابة) في خلايا الورم الأرومي العصبي الماوس لعزل الفيروس. وقد أُجريت هذه الصناديق في الممر العاشر وملطخة بأجسامين مضادتين لداء الكلب مترافقين مع الاتحاد. أظهر توزيع مستضد خلايا الورم الأرومي العصبي للماوس مع اثنين من التتقارنات داء الكلب اختلافات كبيرة. (أ) FAT مع الكاشف A (5X تخفيف). (ب) FAT مع الكاشف B (5X تخفيف). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر إجراء التشغيل القياسي المختبري (SOP) عملية تسلسلية لاختبار عينات الخفافيش لوجود مستضدات فيروس ليسا في تايوان. وتشمل الخطوات الرئيسية توظيف FAT وRT-PCR. ومن المهم أيضا اختيار العينات المناسبة والعزل الناجح للفيروس. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء بعض استكشاف الأخطاء وإصلاحها أثناء مراقبة lyssaviruses الخفافيش. وكان الفرق الرئيسي هو الحيوانات المستهدفة. في البداية (2008-2009)، كانت الحيوانات المستهدفة من مراقبة فيروس الخفافيش الخفافيش الخفافيش الحية، التي حوصرت في جزيرة كينمن في تايوان ثم اختبارها للفيروس الليسا بعد القتل الرحيم. وكانت معظم الخفافيش المحاصرين صحية ومن غير المرجح أن تحمل فيروس ليسا، وهذا النهج في الرصد لم يكن إنسانيا. ولذلك، في السنة الثالثة، لم يتم جمع سوى الخفافيش الميتة أو المحتضرة وتوسيع منطقة المراقبة من المنطقة إلى الوطنية. بعد ثماني سنوات من الرصد المستمر، تم الكشف أخيرا عن أول حالة فيروس الخفافيش في تايوان.

على الرغم من أن FAT هي الطريقة الأكثر استخداما لتشخيص داء الكلب وأوصى بها منظمة الصحة العالمية ومنظمة الصحة العالمية18،إلا أن دراسات قليلة أظهرت نتائج غير متسقة عندما تم استخدام التتقارنات المختلفة في FAT5،27. كما ظهرت نتائج غير متسقة مماثلة في الحالات المصابة بالعدوى. في خلايا MNA المصابة TWBLV، أظهرت نتائج FAT اختلافات كبيرةفي 2 conjugates (الشكل 5). واحدة من الأجسام المضادة لداء الكلب المترافقة في مركز فيتك لم تتفاعل بشكل جيد، حتى في تركيزات أعلى. بسبب اختلاف مستضد فيروس ليسا في العينات واختلاف متعطشا الأجسام المضادة وتقارب الأجسام المضادة في التتقارنات، فمن المستحسن أن يتم استخدام اثنين من التتقارنات المختلفة في FAT لمنع النتائج السلبية كاذبة في lyssavirus التشخيص23،28،29.

RT-PCR يمكن أن توفر التشخيص المؤكد لنتائج غير متناسقة من FAT. بسبب التنوع الجيني العالي من فيروس ليسا، فمن المستحسن أن أكثر من التمهيدي مجموعة في RT-PCR يمكن استخدامها لزيادة دقة فحص فيروس ليسا29،30. مجموعة التمهيدي مصممة من الجينات البروتين النووي المحفوظة للغاية هي مجموعة الأكثر استخداما في الكشف عن فيروس ليسا29. يمكن أيضا أن تستخدم RT-PCR للتشخيص في عينات المعجون عندما لا يمكن إجراء FAT31،32. لتجنب السلبية الكاذبة منع اكتشاف فيروس ليسا رواية، ينصح المزيد من الأدوات للكشف. تم التعرف على اثنين من الفيروسات lyssaviruses رواية4, تايوان الخفافيش lyssavirus, خلال هذه الدراسة الاستقصائية باستخدام SOP.

بالإضافة إلى ذلك، تم العثور على سلالة TWBLV متنوعة للغاية والأنواع الجديدة الجديدة من فيروس الليسا في الخفافيش في تايوان في عام 2018 (بيانات غير منشورة). وقد أثبتت النتائج أن توظيف كل من FAT وRT-PCR للكشف عن فيروسات الليسافيات في الخفافيش أمر مفيد. وتجدر الإشارة إلى بعض القيود المفروضة على مجموعة التمهيدي RT-PCR المستخدمة في هذا البرنامج. في المجموعة التمهيدية من N113F/N304R، تم تصميم N113F في الأصل لتضخيم فيروس داء الكلب، ولكن قد لا تعمل بشكل جيد لفيروسات lyssas الأخرى. وقد نشرت العديد من التمهيديات للكشف عن فيروس lyssa من قبل باحثين آخرين29،30 ويمكن اختيارها وفقا لاحتياجات المختبر.

هذه المقالة هي مقدمة خطوة بخطوة لمراقبة فيروس الخفافيش في تايوان. ومن المأمول أن يكون هذا SOP مفيدة للباحثين الذين يرغبون في مراقبة فيروس الخفافيش. كما المزيد من الباحثين إجراء دراسات استقصائية للخفافيش، سيتم تحديد المزيد من الفيروسات lyssaviruses في المستقبل. هذا SOP يراقب ليس فقط lyssaviruses ولكن أيضا عوامل zoonoses أخرى في الخفافيش. ويمكن لهذه النتائج أن تُطلع الجمهور والمهنيين الصحيين والعلماء على المخاطر المحتملة للاتصال بالخفافيش وغيرها من الأحياء البرية. كما سيساعد على زيادة فهم تطور وأصول فيروس ليسا ويؤدي إلى إحراز تقدم كبير في البحث العلمي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يُعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ونشكر تيان - تشنغ لي، ويي - تانغ لين، وشيا - جونغ تساي، ويا لان لي على مساعدتهم خلال هذه الدراسة. وقد تم دعم هذه الدراسة بمنحة رقم 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) من مكتب التفتيش على صحة الحيوان والنبات والحجر الصحي، مجلس الزراعة، يوان التنفيذي، تايوان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5% Trypsin (10x) Gibco 15090046 Trypsin
25 cm2 flask Greiner bio-one 690160
Acetone Honeywell 32201-1L
Agarose I VWR Life Science 97062-250
Alcohol NIHON SHIYAKU REAGENT NS-32294
AMV Reverse Transcriptase Promega M5101
Antibiotic-Antimycotic(100X)  Gibco 15240-062 MEM-10
Blade Braun BA215
Centrifuge eppendorf 5424R
Chemilumineance system TOP BIO CO. MGIS-21-C2-1M
Collection tube Qiagen 990381
Collection tube SSI 2341-SO
Cover slide Muto Pure chemical Co., LTD. 24505
DNA analyzer Applied Biosystems 3700XL
Fetal bovine serum Gibco 10437028 MEM-10
FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin Fujirebio Diagnostic Inc. 800-092 FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B
Four-well Teflon-coating glass slide Thermo Fisher Scientific 30-86H-WHITE
Gel Electrophoresis System Major Science MJ-105-R
HBSS (1x) Gibco 14175095 Trypsin
Incubator ASTEC SCA-165DS
Inverted Microscope Olympus IX71
L-Glutamine 200 mM (100x) Gibco A2916801 MEM-10
LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent EMD Millipore Corporation 5100 FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A
MagNA Pure Compact Instrument Roche 03731146001
MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 Roche 03730964001
MEM (10x) Gibco 11430030 MEM-10
MEM NEAA (100x) Gibco 11140050 MEM-10
MEM vitamin solution Gibco 11120052 MEM-10
NaHCO3 Merck 1.06329.0500 MEM-10
Needle Terumo NN*2332R9
PBS Medicago 09-8912-100
Primer synthesis Mission Biotech
RNasin ribonuclease inhibitor Promega N2111
Sequencing service Mission Biotech
Slide Thermo Scientific AA00008032E00MNT10
Sodium Pyruvate (100 mM) Gibco 11360070 MEM-10
Stainless Steel Beads QIAGEN 69989
Sterile absorbent pad 3M 1604T-2
Syringe filter Nalgene 171-0045
Taq polymerase JMR Holdings JMR-801
Thermal cycler Applied Biosystems 2720
TissueLyser II QIAGEN 85300
Tongue depressor HONJER CO., LTD. 122246
Tweezer Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. A0601
Tylosin Tartrate Sigma T6271-10G MEM-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuzmin, I. V. Basic facts about lyssavirus. Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1. Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. Elsevier. California. 3-21 (2014).
  2. Aréchiga Ceballos, N., et al. Novel lyssavirus in bat, Spain. Emerging Infectious Diseases. 19, (5), 793-795 (2013).
  3. Gunawardena, P. S., et al. Lyssavirus in Indian Flying Foxes, Sri Lanka. Emerging Infectious Diseases. 22, (8), 1456-1459 (2016).
  4. Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24, (4), 782-785 (2018).
  5. Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. -M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary Emerging Diseases. 65, (3), 593-596 (2018).
  6. Banyard, A. C., Evans, J. S., Luo, T. R., Fooks, A. R. Lyssaviruses and bats: emergence and zoonotic threat. Viruses. 6, (8), 2974-2990 (2014).
  7. Pal, S. R., et al. Rabies virus infection of a flying fox bat, Pteropus policephalus in Chandigarh, Northern India. Tropical and Geographical Medicine. 32, (3), 265-267 (1980).
  8. Smith, P. C., Lawhaswasdi, K., Vick, W. E., Stanton, J. S. Isolation of rabies virus from fruit bats in Thailand. Nature. 216, (5113), 384 (1967).
  9. Tang, X. Pivotal role of dogs in rabies transmission, China. Emerging Infectious Diseases. 11, (12), 1970-1972 (2005).
  10. Kuzmin, I. V., et al. Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences. Virus Research. 97, (2), 65-79 (2003).
  11. Arguin, P. M., et al. Serologic evidence of Lyssavirus infections among bats, the Philippines. Emerging Infectious Diseases. 8, (3), 258-262 (2002).
  12. Lumlertdacha, B., et al. Survey for bat lyssaviruses, Thailand. Emerging Infectious Diseases. 11, (2), 232-236 (2005).
  13. Kuzmin, I. V., et al. Lyssavirus surveillance in bats, Bangladesh. Emerging Infectious Diseases. 12, (3), 486-488 (2006).
  14. Reynes, J. -M., et al. Serologic evidence of lyssavirus infection in bats, Cambodia. Emerging Infectious Diseases. 10, (12), 2231-2234 (2004).
  15. Nguyen, A. T., et al. Bat lyssaviruses, northern Vietnam. Emerging Infectious Diseases. 20, (1), 161-163 (2014).
  16. Liu, Y., Zhang, S., Zhao, J., Zhang, F., Hu, R. Isolation of Irkut virus from a Murina leucogaster bat in China. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, (3), 2097 (2013).
  17. Kaplan, M. M. Safety precautions in handling rabies virus. Laboratory Techniques in Rabies, 4th Ed. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Kiprowski, H. World Health Organization. Geneva. 3-8 (1996).
  18. World Organization for Animal Health (OIE). Rabies (infection with rabies and other lyssavirus. Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf (2019).
  19. Smith, I., Wang, L. F. Bats and their virome: an important source of emerging viruses capable of infecting humans. Current Opinion in Virology. 3, (1), 84-91 (2013).
  20. Corbet, G. B., Hill, J. E. The mammals of the Indomalayan region: a systematic review. Oxford University Press. Oxford, New York. (1992).
  21. Mayer, F., von Helversen, O. Cryptic diversity in European bats. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 268, (1478), 1825-1832 (2001).
  22. Epstein, J. H., Field, H. E. Anthropogenic epidemics: the ecology of bat-borne viruses and our role in their emergence. Bats and viruses: a new frontier of emerging infectious diseases. Wang, L. F., Cowled, C. John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. 249-280 (2016).
  23. Centers for Disease Control and Prevention. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing. Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2019).
  24. Hayman, D. T. S., et al. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses. Journal of Virological Methods. 177, (1), 87-93 (2011).
  25. Franka, R., et al. A new phylogenetic lineage of rabies virus associated with western pipistrelle bats (Pipistrellus hesperus). Journal of General Virology. 87, (8), 2309-2321 (2006).
  26. Trimarchi, C. V., Smith, J. S. Diagnostic evaluation. Rabies, 1st ed. Press, A., Jackson, A. C., Wunner, W. H. Academic Press. San Diego, CA. 307-349 (2002).
  27. Moldal, T., et al. First detection of European bat lyssavirus type 2 (EBLV-2) in Norway. BMC Veterinary Research. 13, 216 (2017).
  28. Robardet, E., et al. Comparative assay of fluorescent antibody test results among twelve European National Reference Laboratories using various anti-rabies conjugates. Journal of Virological Methods. 191, (1), 88-94 (2013).
  29. Hanlon, C. A., Nadin-Davis, S. A. Laboratory diagnosis of rabies. Rabies, 3rd ed. Jackson, A. C. Academic Press. San Diego, CA. 409-459 (2013).
  30. Fischer, M., et al. A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses--results of a ring trial among European laboratories. PLoS ONE. 8, (3), 58372 (2013).
  31. David, D., et al. Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains. Veterinary Microbiology. 87, (2), 111-118 (2002).
  32. Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques. Journal of Virological Methods. 177, (1), 15-25 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics