Doku ve kütle spektrometresi Imaging kullanarak hücreleri arasında küçük molekül iletişim yakalama

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Numune hazırlama bir roman yöntemi görüntüleme kütle spektrometresi kullanılarak küçük molekül alışverişte algılamak için hücre ve doku coculture karşılamak için geliştirilmiştir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (146), e59490, doi:10.3791/59490 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kütle spektrometresi (IMS) görüntüleme rutin olarak uygulanmış örnekleri üç tür: doku bölümler, pulcuklarının ve mikrobiyal koloniler. Bu örnek türleri faiz biyolojik örnek arasında proteinler, lipidler ve metabolitleri dağılımını görselleştirmenizi matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma uçuş zaman kütle spektrometresi (MALDI-TOF MS) kullanılarak analiz. Memeli hücre kültürleri içinde özel içine tohum tarafından kanser, kimyasal iletişim tanımlamak için underexplored bir yaklaşım adrese üç önceki uygulama güçlü bir araya getiren bir roman örnek hazırlama yöntemi geliştirdik sağlıklı dokulara kuruma örnek tarafından takip ile coculture. Memeli doku ve hücreleri yakın üzerinden Difüzyon doku ve hücreleri arasındaki kimyasal iletişim sağlayan cocultured. Zaman belirli noktalarda, mikrobiyal kolonileri IMS analiz için hazırlanan aynı şekilde özel tabanlı örnek kurutulur. Bizim yöntem yüksek dereceli seröz over kanseri metastaz sırasında yumurtalık ile etkileşim gibi fallopian tüp sizden türetilmiş arasındaki iletişimi modellemek için geliştirilmiştir. Numune hazırlama duruma getirilmesi norepinefrin kimlik anahtar kimyasal bileşen olarak yumurtalık microenvironment sonuçlandı. Yeni geliştirilen bu yöntem bitişik hücreleri veya doku arasındaki kimyasal iletişim bir anlayış gerektiren diğer biyolojik sistemleri uygulanabilir.

Introduction

Kütle spektrometresi (IMS) görüntüleme en iyi duruma getirilmiş üç yaygın olarak kullanılan uygulamalarda moleküler özelliklerinin mekansal dağılımı niteleyen: dokusu dilimlerin, pulcuklarının ve mikrobiyal kolonileri1,2,3. Dokusu dilimlerin metabolitleri, hedeflenen ya da belirli bir kitle aralığı içinde hedefsiz bir ev sahibi, biyolojik koşullar bağlamında lokalizasyonu değerlendirmek için kullanılabilir. Ancak, bir sağlıklı doku hastalıklı bir durum, örneğin, bir tümör karşılaştırıldığında moleküler özellikleri arasındaki farklar en önemli ve açık vardır. Bu IMS yaklaşım özellikle hastalık biyolojik tespiti için adapte, ancak, hastalık ilerleme (tümör notlar gibi) farklı aşamalarında doku örnekleri alınıyor kabul töreni için önemli olabilir sinyalleri tanımlaması engellemektedir hastalık. Uzayda bilgi alışverişi birçok biyolojik sistemleri her yerde bulunan bir özelliktir ve dokusu dilimlerin dinamik bu kimyasal aktarma yakalamak değildir. Kimyasal değişimi ve Difüzyon görselleştirme kapasitesine sahip bir mikrobiyal kolonileri Ağar kaplamalar üzerinde yetiştirilen IMS tekniktir; küçük moleküller aracılığıyla ve agar genelinde yaygın edebiliyoruz ve matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma (MALDI-TOF) kütle spektrometresi4yolu ile yakalanabilir. Bu büyüme Kur ayrı biyolojik varlıklar (kolonileri) arasında değiş tokuş molekülleri tanımlamak için kullanılan ve yön metaboliti üretim öğeleri de belirleyebilirsiniz. Mikrobiyal koloni büyüme için tasarlanan platformu doku explants memeli hücreleri ile yetiştirilen birincil metabolizma keşfetmek için adapte oldu ve IMS dinamik kimyasal değişimi tüp bebek bir memeli sisteminde değerlendirmek için kullanıldı.

Son birkaç yıl içinde yüksek dereceli seröz over kanseri (HGSOC) kez fallopian tüp epitel (FTE) kaynaklanan ve yumurtalık için erken hastalığı geliştirme5,6sırasında, metastaz açık hale gelmiştir 7 , 8. tumorigenic FTE nerede büyük tümör sonunda oluşturmak ve daha fazla metastaz, yumurtalık yayılmasına hücreleri nedeni şu anda belli değil. Önceki araştırma yumurtalık için birincil metastaz yumurtalık proteinlerin rolü üzerinde odaklanmıştır; Ancak, bu son zamanlarda tumorigenic bir doku için sağlıklı bir geçiş hücre metabolizması büyük bozulma sonuçları ve üretim küçük moleküller9,10,11değiştirir kanıtlanmıştır. Bu nedenle, biz olan küçük moleküller FTE yumurtalık arasında değiş tokuş kısmen HGSOC birincil metastaz için sorumlu olabilir.

Bizim yeni geliştirilen IMS işlemi uygulayarak, biz coculture tumorigenic FTE ve sağlıklı yumurtalık dokusu yumurtalık üzerinden norepinefrin üretimini indükler belirledik. Ancak, diğer hücre tipleri veya normal FTE hücreleri bu etkiyi temin değil. Bu yöntem olağanüstü bir avantajı nedir Moleküler üretim ve Satım gerçek moleküller temsil sinyallerin görselleştirildiği, bu yüzden bile bir coculture bir sinyalin kaynağını saptamak mümkündür. Bu analiz homojenize örnekleri, üzerinde bir avantaj nerede bütün mekansal bilgi kaybolur. Modeli sistemimizde açıkça norepinephrine üretimi için yumurtalık atamak başardık. Metastaz ve yumurtalık kanserlerinin chemoresistance norepinefrin bağlantılı ve bu molekül bizim tespiti roman IMS yöntemi biyolojik ilgili molekülleri12,13, ortaya çıkarabilir geçerliliği 14. bu doğrulama IMS bu yeni uygulama coculture ortamlarda küçük moleküller tanıtmakta ve hücre dönüşüm etkisi erken olayları anlamaya çalışıyorsunuz gruplar araştırma özellikle yararlı olabilir teklif izin veriyor ve metastaz. Bu yöntem genel kimlik ve küçük moleküller kayma dağılımını doku ve organları, vitro 3D hücre kültürleri veya ex vivo dokusu tarafından temsil edilen arasında değişim sırasında aydınlatmak için hedeftir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan yordamlar ulusal sağlık kuralları Enstitüleri bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları için uygun olduğunu ve Chicago Illinois Üniversitesi'nde Kurumsal hayvan kullanımı ve Bakımı (IACUC) Komitesi tarafından onaylanmış.

1. hazırlanması reaktifler

  1. Fare oviductal epitel (MOE) %5 CO2 Alfa en az gerekli orta (αMEM) medya % 10 fetal sığır serum ile desteklenmiş bir oksijen kuluçka 37 ° C'de (FBS), 2 mM L-glutamin, 10 mg/mL insülin, transferrin, selenyum (ITS) hücreleri korumak , 1.8 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF), 100 U/mL penisilin-streptomisin, 1 mg/mL viomisin ve 18,2 ng/mL estradiol-17β. Hücreleri her 3-4 gün geçirmek, aynı gün yetecek sayıda hücre sağlayarak fareler feda.
  2. % 2 özel düşük erime özel 1 g 50 mL distile su karıştırılarak hazır olun. Otoklav özel izin soğumaya ve özel katılaşır önce sonra aliquot (1 mL) 2 ml ( Tablo malzemelerigörmek) tüpleri. Özel-20 ° C'de süresiz olarak depolanabilir.
  3. En az 2 mL 1 x Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) ortam hazırlamak.
  4. 1:1 alfa-cyano-4-hyroxycinnamic asit (CHCA) 5 mg/mL 10 mL için matris MALDI-TOF MS için hazırlamak: dihidroksibenzoik asit (DHB) ( Tablo malzemelerigörmek) 90:10 ACN:H2O + %0,1 trifluoroacetic asit (TFA). Matris eriyene kadar çözüm solüsyon içeren temizleyicide.

2. fare koloni ve yumurtalık kaldırma

  1. Standart konut yordamları kullanarak CD-1 fareler çiftlerini üreme korumak. Doğum gün yakın belgili tanımlık pups yaş bilinen fareler her gün denetleyin.
  2. Yavruların başına NIH yönergeleri CO2 Solunduğunda yaş 16-18 gün ötenazi. CO2 (% 100) teslim bir akış oranı % 10-%20 dakika başına birim odası ve iki dakika sonra solunum durmuştu devam. Ötenazi tarafından servikal çıkığı onaylayın.
  3. Tüm cerrahi ekipman % 70 etanol batış tarafından dezenfekte. İyi'nın L-15 medya ile 1 x penisilin-streptomisin 37 ° c sıcak
  4. Bölgeyi dezenfekte edin ve saç ile kirlenme en aza indirmek için % 70 etanol ile karın yüzey ıslak. Karın duvarının kapsayan deriyi büyük yapmak künt forseps ve kullanım Cerrahi makas kullanarak şekil V cilt ve karın duvarı iç organların açığa kesme kavramak.
  5. İç organları forseps kullanarak kenara çek. Tek tek iyi Forseps ile rahim her boynuzun kapmak ve biraz kaldırın.
  6. Hemen altındaki böbrek rahim boynuz sonunda olacak yumurtalık bulun. Cerrahi makas bağ dokusu ücretsiz yumurtalık incelemek için kullanın. O zaman, yumurtalık boynuz yarıya.
  7. Yumurtalık, ovidukt ve yaklaşık bir hareket Önceden ısıtılmış iyi'nın L-15 medya için rahim her boynuzun yarısı.
  8. Diseksiyon mikroskop altında her yumurtalık ovidukt, bursa ve herhangi bir yağ dokusu serbest bırakarak çevreleyen bursa dikkatli taşıyın. Her yumurtalık iyi'nın L-15 medya yeni bir tabak için hareket.
  9. Eksenel her yumurtalık yarıya. Özel kaplama kadar 37 ° C'de muhafaza (şu anda explants olarak) yumurtalık parçaları tutmak.

3. Kurulum ve Ito tedavi slayt Cocultures için kuluçka

  1. Bölünmemiş cocultures
    1. 70 ° c sıcak tabakta özel Sıvılaştır.
    2. 8-şey bölücü indiyum tinoxide (ITO) üstüne koyun-tedavi slayt (şekil 1A). Bölücü kauçuk altta yapışma slayda davranacak bir parça, ama hiçbir sızıntı veya kuyu arasında karıştırma sağlamak için özel kaplama sırasında sürekli hafif aşağı doğru basınç uygulamak emin olun.
    3. Hücreleri bir 15 mL konik tüp, santrifüj (800 rpm'de 5 dk) toplamak ve 50 k için 1 x DMEM medya 150 µL başına hücre resuspend. Farklı hücre yoğunluğu en iyi ise, bu adımda 2 x için (örneğin, bir son 300 µL, bu aşamada hücre yoğunluğu 50.000 hücreleri 150 µL 50.000 hücreleri bölgedir) son yoğunluk istenen hücre süspansiyon olduğundan emin olun.
    4. Hücre kültürü kaplama önce yumurtalık explant eklemek için merkezi iyi (şekil 1B).
    5. Özel bireysel 2 mL tüpler hemen önce kaplama her hücre kültüründe ekleyin. Her şey için hücre süspansiyon, 200 µL ve sıvılaştırılmış özel 2 mL tüp içinde 200 µL birleştirir. Örneğin, dört kuyular için 800 µL hücre süspansiyon ve 800 µL % 2 özel birleştirir. Bazı karışımı sol olacaktır, ama biraz daha fazla gerekli olduğunun pipetting sırasında hava kabarcıkları önler.
      1. Özel bireysel hücre kültürleri için hemen o hücre kültürü kaplama önce ekleyin. Özel bir dakika altında serin, çok hızlı bir şekilde plaka için hazır olun.
    6. Hemen her şey (şekil 1 c) 300 µL hücre/özel karışımı ekleyin. Şekil 1 c üç hücre koşulları ve bir medya durumu, her kaplama ile ve bir yumurtalık olmadan gösterir.
    7. Slayt 37 ° C ve % 5 CO2 oksijen kuluçka kuluçkaya.
  2. Bölünmüş Cocultures.
    1. Bölücüler ince, pürüzsüz plastik (şekil 2A) kesti.
      Not: düz ve ince oldukları için bu deney bir tek kullanımlık steril ortam lavabo kenarlarında kullanır. Cut onları iyi (~ 13 mm) hipotenüs rahatça uyacak kadar geniş.
    2. 70 ° c sıcak tabakta özel Sıvılaştır.
    3. 8-şey bölücü ITO tedavi slayt (şekil 2B) üstüne yerleştirin. Bölücü kauçuk altta yapışma slayda davranacak bir parça, ama hiçbir sızıntı veya kuyu arasında karıştırma sağlamak için özel kaplama sırasında sürekli hafif aşağı doğru basınç uygulamak emin olun.
    4. Hücreleri bir 15 mL konik tüp, santrifüj (800 rpm'de 5 dk) toplamak ve 50 k için 1 x DMEM medya 150 µL başına hücre resuspend. Farklı hücre yoğunluğu en iyi ise, bu aşamada hücre süspansiyon 2 x istenen son yoğunluk olduğundan emin olun (örneğin bir son 300 µL 50.000 hücreleri için hücre yoğunluğu bu aşamada 150 µL 50.000 hücreleri bölgedir).
    5. Plastik bölücüler çapraz wells (şekil 2C) yerleştirin.
    6. Özel bir zaman hemen önce kaplama her hücre süspansiyon bir ekleyin. Her şey için hücre süspansiyon, 100 µL ve sıvılaştırılmış özel bir 2 mL tüp 100 µL birleştirir. Örneğin, dört kuyular için 400 µL hücre kültür ve 400 µL % 2 özel birleştirir. Bazı hücre/özel karışımı sol olacaktır ama biraz daha fazla gerekli olduğunun pipetting sırasında hava kabarcıkları önler.
      1. Özel bireysel hücre kültürleri için hemen o hücre kültürü kaplama önce ekleyin. Özel bir dakika altında serin, çok hızlı bir şekilde plaka için hazır olun.
    7. Bölücü, plaka 150 µL hücre/özel karışımı bir tarafında. Serin ve (yaklaşık bir dakika) kuvvetlendirmek ve bölücü (şekil 2B) kaldırmak özel izin.
    8. Yumurtalık explant iyi boş yarısı ortasına yerleştirin. Yer 150 µL medya/özel karışımı üst yumurtalık ve sadece iyi (şekil 2E) doğru yüzü üzerinde.
    9. Slayt 37 ° C ve % 5 CO2 oksijen kuluçka kuluçkaya.

4. slayt kurutma ve MALDI-TOF MS için hazırlanıyor

  1. Sonra dört gün (ya da herhangi bir tercih edilen zaman noktası), özel Prizler ve slayt (şekil 1 d) odası bölücü çıkarın. Yavaşça düz bir spatula ile özel odası üzerinden tarafını ayırmak ve yavaşça yukarı doğru herhangi bir özel prizler oynatmamaya dikkat odası çekin. Onlar taşırsanız, her birbirlerine dokunuyorlar değil bu yüzden nazikçe onları yeniden konumlandırın.
  2. Slayt yaklaşık 4 h her h 90 ° döner, 37 ° C fırında yerleştirin.
    Not: Döndürme slayt boyunca örnek bile ısı dağılımı sağlamak önemlidir.
  3. Kuru bir kez, slayt (şekil 1E) fırından çıkarın.
  4. Matris çözüm püskürtme (şekil 1F) kullanarak aşağıdaki parametrelerle geçerlidir: sıcaklığı 30 ° C arasında akış hızı = 0.2 mL/dak, geçişleri sayısı = = 8, yön CC ve meme mesafe = = 40 mm.
    Not: bir matris püskürtücü yerine sanatsal Pistole sıvı matris uygulamak için kullanılabilir. Aynı matris çözüm sprey için kullanılabilir, ancak yaklaşık iki kat daha fazla çözüm gereklidir. Böylece dikey olarak asılı klempe slayt ile slayt sprey bir açıdan 90° yaklaşık bir ayak üzerinden (Hoffmann15uyarlama) matrix kadar katman görülür.
  5. Calibrant 1 µL ekleyin (fosfor kırmızı hedefleri için < 500 Da, peptid karışımı ( Tablo malzemelerigörmek) hedefleri için < 5000 Da) için slayt üzerinde net nokta. Fosfor kırmızı yok matris ile karıştırma gerektirir, ancak peptid karışımı iyonlaşma yardım için matris ile 1:1 karışımı gerektirir. Calibrant kurumasını bekleyin.
  6. Bir X çizmek kalıcı bir kalem kullanarak slayt her köşedeki ve 1200 dpi çözünürlükte bir kamera veya tarayıcı kullanarak bir optik görüntü al.

5. görüntüleme kütle spektrometresi veri toplama

  1. IMS verileri analiz yazılımı yeni bir sıra açın (bkz. Tablo malzeme). Raster genişliği istediğiniz uzamsal çözünürlük, en az 50 µm ayarlayın.
  2. Slaydın optik görüntü analiz yazılımı yüklemek ve set üç öğretmek ile kavşak noktaları x her köşede çizilmiş.
  3. Bölgeler edinme yazılım görüntüleme için ilgi atayın ve bunları uygun şekilde adlandırın.
  4. Veri toplama yazılımı kullanarak araç kalibre ( Tablo malzemelerigörmek) 5 ppm hata içinde.
  5. En iyi duruma getirilmiş yöntemi Kaydet ve Çalıştır başlar. Bu deneme aşağıdaki parametreler optimize: polarite pozitif, dedektörü = reflektron, lazer boyutu = = 2, lazer güç % 50, reflektör modu dedektörü kazanç = 3 x =.

6. işleme IMS verileri

  1. Alma .mis istatistiksel yazılım dosyasına ( Tablo malzemelerigörmek) önemi çözümlenmesi için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En iyi şekilde kurutulmuş ITO slayt ile düz bir kabuktan örnek yol açacak hiçbir kırışıklıkları özel ve slayt (şekil 3) üzerinde kayma ayrılık korumak özel parçalar yüzey üzerinde çok az. Şekil 3A şekil 3B kaçınılmalıdır kırışıklıkları gösterirken en iyi kurutma gösterir. Bu iyileştirme üzerinde bağıl nem tabanlı fırında, slaydın tam zaman değişebilir gibi izleme dikkatli gerektirir. Kırışıklıkları biraz yüksekliği etkileyebilir ve bu nedenle IMS kitle doğruluğunu sinyalleri iken, hafif kırışıklıkları verilerin kalitesini etkilemez. Bu nedenle, sonuçta hafif kırışıklıkları vardır herhangi bir özel hala MALDI-TOF MS yolu ile çözümlenebilir. Slayt tamamen kurumuş olmalı veya bu örnek MALDI-TOF Kütle Spektrometre yüksek vakum ortamında bir patlama neden olabilir.

Diğer yüzeylerde özel bir yana çalışabilir, ancak çoğu zaman kurutma veya ITO slayt ve mekansal bilgi kaybı arasında yayılmasında sonuçları iyi odası kaldırılması üzerine kendi yapısal bütünlüğünü korumak değil. Örneğin, daha önce kollajen bir substrat olarak test ettik ve bu yayılmasında sonuçlandı ve iyi odası yaşındayken mekansal bilgi kaybı (veri gösterilmez) kaldırıldı. Ayrılmışsa, IMS verileri edinimi kenar efektleri ile kontamine değil kullanılan doku bölünmemiş ise iyi merkezinde veya yarım üçgen merkezinde olmalıdır. Şekil 4 en iyi şekilde bulunduğu doku (Masası'nda) örnekleri ve kötü bir şekilde konumlandırılmış doku (Masası B) gösterir. Şekil 4B', doku özel kenarında bulunan, yansıma, neden olabilir zaman kenar efektleri yanlış kitle sinyalleri ve doku anlamına gelir sinyalleri salgılanan kaçırmış olabilir, çevreleyen özel görüntü kullanıcılara izin vermez Çözümleme sırasında. Doku Merkezi gibi mümkün olduğunca yakın şekil 4Agösterildiği şekilde olması gerekir.

Çünkü diğer daha büyük odaları gerektirir, ancak en az tedirginlikler hücreleri, 8-şey odası sonuçlanan deneyler bir dizi bir 8-şey odası için kuluçka, bir 6-şey plaka ve 24-şey plaka ile karşılaştırıldığında en iyi gemi olduğunu tespit ettik. özel bir ITO veya paslanmaz çelik slayt kuluçka16takip transfer edilecek tabaka. 8-iyi odaları odası slaytların çeşitli markalardan kullanılabilir ancak bu bir yapışkan lastik alt ve paralel taraf Wells ile kolay başlangıç ve bölünmüş kuyuları için plastik bir bölücü kaldırılmasını kolaylaştırmak. 6-şey plaka çok daha fazla malzeme gerekli ve zorluklar gibi geniş alanlarda kurutma ile karşı karşıya. Menisküs etkisi wells açıktı çünkü 24-şey odası de sorunları kurutma sırasında vardı ve bu nedenle, prizler kurutulmuş anlamlı olarak daha yüksek kenarlı. 8-şey odası Menisküs yürürlükte özel iyi ortasında doğrudan kaplama ve özel prizler aktarılacak var mı yol açmaz. Ayrıca, test veya için tek bir deneyde kontrol 8 koşulları için 8-şey odası sağlar. Bağlı olarak deneme, wells (1) ile hiçbir yumurtalık explants veya hücre, wells (2) yalnızca hücreleri ile veya (3) wells ile yumurtalık explants sadece gibi denetimler eklemek önemli olabilir. Numune Hazırlama (kesin medya ve özel toplama, matris tutar, vb) biraz çalışmaları arasında değişir çünkü ne zaman onlar aynı slaytta iktisap koşulları karşılaştırılmalıdır.

Daha fazla deney ITO kaplı bir slayt slayt hücre görsel doğrulama için devlet ve konumlandırma sağlar çünkü bir maldı sac karşılaştırıldığında kuluçka için en iyi platform olduğunu tespit ettik. Örneğin, ITO slayt kullanarak, biz hücreleri normal morfoloji var ve onlar özel öncesinde ve aşağıdaki kuruma16boyunca homojen dağılımı korumak doğrulayabilirsiniz. Slayt-ecek da bırakmak floresan hücre satırları ve eklenmesi için gerektiği gibi. Ayrıca, kaldırma önce kuruma odası özel tak tamamını korumak için gereklidir. Slayt ile kurumuş uydurdugunuz hikayeye bagli kaldim 8-şey odası, plastik özel tak ayrı çeker ve prizler büyük çatlaklar sonuçlanır. Şekil 5 odası kurutma önce kaldırılmaz ne zaman karşı karşıya sorunları gösterir.

Hücre popülasyonlarının analiz ederken, Uzaysal çözünürlük doku ve hücresel etkileşimlerin küçük boyutlu yakalamaya başlamak için en az 50 µm olması önemlidir. Toz boya matris ile 5 µm çözünürlük elde etmek mümkündür, ancak bu benzer sonuçları verimli kütle spektrometresi veri toplamak için toplam süresini uzatır. Uzaysal çözünürlüğü de MALDI-TOF Kütle Spektrometre lazer odak yeteneği bağlıdır.

Genel olarak, en iyi coculture içinde alışverişinde küçük moleküller algılamak için bu slayt kurulum optimize. Bu nedenle, veri çözümlemesi sırasında yalnızca varsa veya önemli ölçüde daha ilgi biyolojik durumunu gösteren bir özel eklenti bol moleküler özellikler arıyorlar. Yedi diğer denetimleri ve koşullar slayt eklemek için seçenek olduğundan, bu görsel ve IMS verileri için tasarlanmış istatistiksel yazılım yardımıyla elde edilebilir. Uygun yüksek çözünürlüklü bir kütle ve parçalanma veri alabilmesi için bizim dereplication işlemi dağınık şekilde ilgili kitlelerin algılama geniş kapsamlıdır. Biz dereplication için ilk adım bir veritabanı, memeli metabolitleri için insan Metabolome veritabanı (HMDB) gibi yoluyla nominal kütlesinin bir arama 's. Veritabanındaki moleküllerin çoğu spectra karşılaştırma deneysel veriler için birçok teknik kapsayan çok sayıda var. Nominal kitleler potansiyel aday molekülleri onların sözde kimliği olarak bir kez fiziksel veri MS/MS parçalanma, UV profil ve aday yapı ve bir standart arasındaki tutma zamanı gibi karşılaştırın kez mümkündür.

Örneğin, yumurtalık dokusu ile inkübe tumorigenic FTE hücre coculture norepinefrin tanımlaması bu IMS yöntemi bu sistem16ilgili küçük moleküller algılama kapasitesine sahip olduğunu geçerliliği. Şekil 6 bir bölünmemiş chambers için iletişim kuralı takip ederek beklemek veri türü gösteren IMS ishal, duyarlılığını gösteriyor. Şekil 7 benzer şekilde bölünmüş odası kurulumu için temsilcisi verileri gösterir.

Figure 1
Şekil 1: iş akışı için örnek hazırlanması bölünmemiş coculture. (A)uyun 8-şey odası ITO kaplı slayt iletken tarafına. (B) yer yumurtalık Wells coculture koşulları için Center'da yarıya. (C) eklemek 300 µL özel/hücre süspansiyon kuyu içine doğrudan. Hiçbir hava kabarcıkları vardır ve yumurtalık iyi ortasında olduğundan emin olun. Yavaşça pipetted özel yumurtalık rahatsız ettiysem, damlalıklı ipucu özel soğutur önce o merkez için kullanın. (D), kuluçka dört gün sonra (ya da başka türlü optimize edilmiştir) 8-şey odası slaytından kaldırmak. Özel odasına bağlı kalır, yavaşça bir spatula kullanarak odası özel fiş bağlantısını kesin ve slayt üzerinde yeniden konumlandırmak. Taşımak kolay olur, böylece özel slayt için uygun olmaz. Slayt her köşede bir 'X' çizmek ve fotoğraf çekmek. (E) kuru slayt 4 h, dönen 90 ° her saat 37 ° C fırında. Özel tamamen kurumuş ve düz slayt üzerinde yalan söylemeliyim. (F) Uygula matris slayt için seçtiğiniz bir püskürtme veya airbrush üzerinden. Matris katman görünür olmalı sarı olarak. Slayt üzerinde bir tarayıcı 1200 dpi çözünürlükte tarama ve calibrants veya standartları MALDI-TOF MS analizi için ekleyin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: iş akışı için örnek hazırlanması bölünmüş coculture. (A)kesim sekmeleri dışarı medya Havzası (~ 13 mm) ve iki taraf düz olduğundan emin olun. (B) Ekle 8-şey odası ITO kaplı slayt iletken tarafına. (C) eklemek bölücüler çapraz olarak kuyu. (D) eklemek 150 µL hücre kültüründe özel ayırıcı, bir yana soğutmak özel izin ve bölücü kaldırın. (E) Ekle Over 150 µL medya ve özel süspansiyon ile boş iyi yarım ve kapak Merkezi'nde. Bu rakam çinko ve ark. 201816izniyle çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: özel prizler kırışıklıkların. Slayt çok uzun süre fırında bırakılırsa kırışıklıkları özel prizler oluşabilir. Bu örnek MALDI-TOF MS analizinden engel değil ama verilerin kalitesini etkileyebilir. (A)en iyi şekilde kurutulmuş bir slayt görüntüsünü. Tüm yumurtalık dokusu çevreleyen özel tamamen düz ve kırışıklıkları, IMS analiz için yeterli alan sağlayan ücretsiz. (B) örnek boyunca buruşuk özel ile kötü kurutulmuş bir slayt görüntüsünü. Bu rakam çinko ve ark. 201816izniyle çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: dokusunun konumlandırma. Dokusunun bulunduğu kurutulmuş örnek veri toplama için çok önemlidir. (A)kurutulmuş özel prizler bölünmüş odalarının göstermek yumurtalık bir ortasında görüntüleme için en iyi şey, yarısı. (B) kurutulmuş özel prizler, bölünmüş odasının nerede yumurtalık merkezli kuluçka veya kurutma için. Yumurtalık dokusu özel prizler çevre üzerinde kurutulmuş ve bu nedenle analiz edemez. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: slaytlar odası ile kurutma. Fırın odası kaldırma önce slayt ayarladığınızda, özel prizler daha güçlü plastik kendilerine uygun ve ısı ayır başlar. Bu özel ve küçük yapışma ciddi çatlaklar slayt için sonuçlar. Bu büyük çatlaklar IMS analiz için elverişli değildir. Top: 2 h kuruma 8-şey odası ile yapıştırılır sonra slayt. 8-şey odasına yapışma nedeniyle Merkezi aracılığıyla tüm özel fişleri ama iki kırık. Alt: 8-şey odası çıkarıldıktan sonra kaydırın. Tek bir özel tak slayt üzerinde kaldı. Bu rakam çinko ve ark. 201816izniyle çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: benzersiz sinyalleri tespit. 8 koşulları karşılaştırırken, bir tek koşul için benzersiz olan sinyalleri tespit etmek mümkündür. (A) kurutulmuş slayt görüntüsü görüntü için hangi bölgelerde MALDI-TOF Kütle Spektrometre öğretmek için kullanılır. Burada biz yumurtalık dokusu çevresinde küçük bölgeleri için IMS, 50 µm. (B) bir temsili resim upregulated karşı sekiz aynı slaytta yer alan bir durumda olduğu bir m/z sinyal seçtiniz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: bölünmüş odası kurulum temsilcisi verilerden. Yumurtalık dokusu beyaz olarak sıraladı. M/z 112 de içeren yumurtalık yarısı salgılanan. IMS 50 µm gerçekleştirildi. Bu rakam çinko ve ark. 201816izniyle çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HGSOC12,17,18norepinefrin'ın rolü implicates kanıt büyüyen bir ceset ve bu teknik daha mekanik bilgi katkıda bulunmuştur. Gen ve hücre özgüllük yanı sıra tek bir IMS medya denetimleri çalıştırmak gibi en az sekiz biyolojik koşullar ile aynı slayt üzerinde mevcut, biyolojik denetimler için yöntem hesap. Yöntem optimize edildi, ancak değerlendirmek için birincil metastaz HGSOC, herhangi bir hücre, bir modeli küçük moleküller değiş tokuş veya çok çeşitli biyolojik sorular ve hastalık durumlarında analiz etmek için özel yerleştirilebilir doku türü yerine.

İletişim kuralı en önemli adımlardan biri doku veya hücre türleri birbirlerine yakın bir mesafede bulunmaktadır ve özel tak merkezinde mevcut garanti etmektedir. Kuruma süresi için tüm slayta duruma getirilmesi bir başka önemli noktadır. Bu yöntem hangi kolayca kurutulmuş ve küçük boyutu küçük kurutma komplikasyon sonuçlandı yumurtalık dokusu kullanarak optimize edildi. Ancak, diğer dokular, şişman gibi farklı bileşimi ile çok farklı kurutma profilleri vardır ve bu nedenle daha geniş kuruma optimizasyonu gerektirir. Kurutma için biyolojik örnek getirildikten sonra kalan iş akışı yalnızca çok az değişiklik istemeniz gerekir.

Kitle spektral satın alma sırasında birçok proje dışında küçük moleküller bileşik grupları analiz gerektirecektir olasıdır. Bu biliniyorsa IMS parametreleri edinme ve matris, seçim için bu nedenle, ilgili hedef için en iyi verileri oluşturmak için adapte olmalıdır. Buna ek olarak, biz sadece olumlu modunda bir 50: 50 CHCA:DHB matris veri toplama gerçekleştirdiyseniz ama negatif modu deneyler farklı türde bir matris tercih edebilirsiniz ve büyük moleküllerin farklı dizey içinde de daha kolay algılanması. Yöntem geniş kitle aralığında hedefsiz bir yaklaşım veya daha dar bir kütle aralığı ile hedeflenen bir arama için kullanılabilir. Yukarıda anlatılan yöntem söz konusu olduğunda küçük moleküller faiz hedefinin..... .çünkü hücre ve doku temsilcileri arasında özel aracılığıyla alışverişinde edildi molekülleri algılamak için odak noktası oldu. Özel hareketi engelleyen sınırlamalar boyutu ve yapısı açısından iddia edemez rağmen bizim matris karar ve MALDI-TOF MS parametreleri bu hedefe için optimize küçük moleküller, algılayacak şekilde amacımız olmuştur. Gelecekteki deneyler için geliştirilen hedef lipidler ve bizim orijinal satın alma yönteminde cevapsız proteinler.

Bileşik sınıfı algılamasını sınırlama ek olarak, bu yöntem de hücrelerin özel ile uyumlu olması ve doku örneği (kullanılıyorsa) bir sekiz-şey odanın içine sığacak şekilde adapte olması gerektirir. Bazı dokularda daha büyük kuyu için daha az biyolojik koşullar karşılaştırma için gereklidir, ancak seçilen doku kuruma4' ten sonra daha az 100-200 µm Tekdüzen yüksekliğe kurutma yeteneğine sahip çok önemlidir adapte edilebilir. Birden fazla biyolojik örnekleri gibi birden fazla hücre tipi bir doku ile iletişim içinde değerlendirilmiş. Numune hazırlama dağınık şekilde özel tabanlı hücre kültürleri ayrı mümkün olduğundan, mümkün olduğu görselleştirildiği ata m/z 's hücre kültür kaynağına dayalı gözlenen Difüzyon kalıpları üzerinde.

İnsan örnekleri veya transgenik fare modelleri doku bölümleri çalışmaya IMS kullanarak doku karmaşıklığı beyannamedir. Ancak, insan örnekleri hangi ölçüde hastalık ilerleme gibi şeyler çalışma yeteneğini sınırlayabilirsiniz elde etmek zor. Transgenik fare modelleri dokudan iyi tanımlanmış zaman noktalarda toplanabilir. Ama fare modelleri geliştirmek pahalı ve zaman alıcı olabilir. Buna ek olarak, bu modellerin her ikisi de gerçek dokulara tam karmaşıklığı doğru belirli hücreleri veya doku arasındaki iletişimi değerlendirmek zorlaştırabilir. Buna ek olarak, burada sunulan en son derece uyarlanabilir yöntemdir. İletişim farklılıkları incelemek için aynı slaytta yer alan farklı dokular veya hücre hatları cocultured. Örneğin, normal hücreleri veya tümör hücreleri aynı dokusundan dönüştürme nedeniyle farklılıkları anlamak için aynı slaytta yer alan kültürlü. Saat ders çalışmaları hücreler arasında roman sinyal cascades ortaya çıkarmak veya küçük molekül inhibitörleri ve/veya RNAi belirli sinyal molekülleri ya da metabolitleri rolü incelemeye dahil. Biz bu olanakları bu teknik hücre hücre iletişim çeşitli bağlamlarda çalışmak için yararlı mı edecek sanıyorsun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa yoktur

Acknowledgments

Finansman desteği ile Chicago Biyomedikal Konsorsiyumu tarafından Chicago toplum güven (C-076) (L.M.S.); Searle fonlarından sağlanan University of Illinois Chicago başlangıç (L.M.S.) fonları; Grant 543296 üzerinden yumurtalık kanseri araştırma fonu İttifak (MD); ve UG3 ES029073 (J.E.B.) ve Ulusal Merkezi ilerleyen translasyonel Bilimler, Ulusal Enstitüsü sağlık, hibe UL1TR002003 yoluyla (JEB & LMS) tarafından.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Falcon tubes Denville C1017-O To collect cells
8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) Millipore PEZGS0816 Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34998-4L Solvent for sprayed matrix
Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) Fisher 10-022-CV Cell culture media
Autoflex speed MALDI-TOF LRF Bruker For IMS data analysis
Centrifuge Eppendorf 5810 R To collect cells and remove supernatant
CHCA Matrix Bruker Daltonic 8201344 Matrix sprayed onto dried slide
DHB Matrix Bruker Daltonic 8201346 Matrix sprayed onto dried slide
Disposable Scalpels Fisher 22-079-707 For removal of the ovaries
Dissecting Scissors Fisher 13-804-6 For removal of the ovaries
DMEM Media Gibco 11995-065 Media mixed with agarose
epidermal growth factor Peprotech Inc. 100-15 Cell culture media supplement
Eppendorf tubes Genesee Scientific 22-282 For agarose aliquots
Estradiol-17β Simga-Aldrich E2758 Cell culture media supplement
Fetal Bovine Serum Denville fb5001 Cell culture media supplement
FlexControl 3.4 Bruker Daltonic IMS data acquisition software
FlexImaging 4.1 Bruker Daltonic IMS data analysis software
Forceps (fine) Fsiher 22-327379 For removal of the ovaries
Gentamycin Cellgro 30-005-CR Cell culture media supplement
Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) Sigma-Aldrich 11074547001 Cell culture media supplement
ITO-coated slide Bruker 8237001 Platform for co-culture incubation
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 11415064 Media used during tissue dissection
L-glutamine Gibco 25030-081 Cell culture media supplement
Low-melting agarose Sigma-Aldrich A9414-10G Mixed with media for plating
Media basin Corning 4870 Used to cut plastic dividers for divided chambers
Penicillin-streptomycin Gibco 15140-122 Cell culture media supplement
Peptide Calibration Standard Bruker Daltonic 8206195 Calibrant for medium mass range
Phophorus red Sigma-Aldrich 343-242-5G Calibrant for low mass range
SCiLS Lab 2015 Bruker Daltonic IMS data statistical analysis
Surgical Forceps (blunt) Fisher 08-875-8B For removal of the ovaries
TFA Fisher Technologies A116-50 Added to matrix solution
TM Sprayer HTX Technologies For applying matrix

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11, (5), e0154837 (2016).
  2. Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating Metabolic Exchange with Imaging Mass Spectrometry. Nature Chemical Biology. 5, (12), 885-887 (2009).
  3. Li, H., Hummon, A. B. Imaging Mass Spectrometry of Three-Dimensional Cell Culture Systems. Analytical Chemistry. 83, (22), 8794-8801 (2011).
  4. Yang, J. Y., et al. Primer on Agar-Based Microbial Imaging Mass Spectrometry. Journal of Bacteriology. 194, (22), 6023-6028 (2012).
  5. Coscia, F., et al. Integrative Proteomic Profiling of Ovarian Cancer Cell Lines Reveals Precursor Cell Associated Proteins and Functional Status. Nature Communications. 7, 12645 (2016).
  6. Labidi-Galy, S. I., et al. High Grade Serous Ovarian Carcinomas Originate in the Fallopian Tube. Nature Communications. 8, (1), (2018).
  7. Klinkebiel, D., Zhang, W., Akers, S. N., Odunsi, K., Karpf, A. R. DNA Methylome Analyses Implicate Fallopian Tube Epithelia as the Origin for High-Grade Serous Ovarian Cancer. Molecular Cancer Research. 14, (9), 787-794 (2016).
  8. Falconer, H., Yin, L., Gronberg, H., Altman, D. Ovarian Cancer Risk After Salpingectomy: A Nationwide Population-Based Study. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 107, (2), dju410 (2015).
  9. Dean, M., Davis, D. A., Burdette, J. E. Activin A Stimulates Migration of the Fallopian Tube Epithelium, an Origin of High-Grade Serous Ovarian Cancer, through Non-Canonical Signaling. Cancer Letters. 391, 114-124 (2017).
  10. King, S. M., Burdette, J. E. Evaluating the Progenitor Cells of Ovarian Cancer: Analysis of Current Animal Models. BMB Reports. 44, (7), 435 (2011).
  11. Reznik, E., et al. Landscape of Metabolic Variation across Tumor Types. Cell Systems. 6, (3), 301-313 (2018).
  12. Watkins, J. L., et al. Clinical Impact of Selective and Nonselective Beta-Blockers on Survival in Patients with Ovarian Cancer: Beta-Blockers and Ovarian Cancer Survival. Cancer. 121, (19), 3444-3451 (2015).
  13. Lutgendorf, S. K., et al. Stress-Related Mediators Stimulate Vascular Endothelial Growth Factor Secretion by Two Ovarian Cancer Cell Lines. Clinical Cancer Research. 9, (12), 4514-4521 (2003).
  14. Sood, A. K. Stress Hormone-Mediated Invasion of Ovarian Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 12, (2), 369-375 (2006).
  15. Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous Matrix Deposition on Dried Agar for MALDI Imaging Mass Spectrometry of Microbial Cultures. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26, (11), 1959-1962 (2015).
  16. Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Imaging Mass Spectrometry Reveals Crosstalk between the Fallopian Tube and the Ovary That Drives Primary Metastasis of Ovarian Cancer. ACS Central Science. 4, (10), 1360-1370 (2018).
  17. Armaiz-Pena, G. N., et al. Src Activation by β-Adrenoreceptors Is a Key Switch for Tumour Metastasis. Nature Communications. 4, 1403 (2013).
  18. Choi, M. J., et al. HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness. Oncogene. 34, (26), 3402 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics