크고 작은 동물의 광견병 부검 기법

Neuroscience

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Summary

이 프로토콜의 목표는 광견병 검사를 위한 만족스러운 조직 샘플을 얻기 위해 크고 작은 동물에서 안전한 부검 기술을 입증하는 것입니다.

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Jarvis, J. A., Brown, K. T., Appler, K. A., Fitzgerald, D. P., Davis, A. D. Rabies Necropsy Techniques in Large and Small Animals. J. Vis. Exp. (149), e59574, doi:10.3791/59574 (2019).

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Abstract

뉴욕 주 보건부(NYSDOH) 광견병 연구소는 매년 6,000~9,000개의 표본을 수신하고 뉴욕시를 제외한 주 전체에 대해 광견병 검사를 수행합니다. 광견병 실험실은 박쥐에서 부조에 이르기까지 다양한 동물을 부검합니다. 이 견본의 대부분은 신경학상 표시를 전시하는 동물입니다, 그러나, 미만 10% 실제로 광견병에 대한 양성 반응을 시험합니다; 외상, 병변 또는 그밖 전염하는 에이전트를 이 현상의 원인으로 암시합니다. 진단되지 않은 전염성 물질을 에어로졸화할 위험이 있기 때문에 광견병 연구소는 전동 공구나 톱을 사용하지 않습니다. 두개골이 가위로 꿰뚫을 수없는 동물을 위해 세 가지 부검 기술이 제공됩니다. 실험실은 감염에이전트에 대한 잠재적 노출을 줄이고, 시편의 불필요한 조작을 제거하고, 처리 시간을 단축하기 위해 이러한 기술을 구현했습니다. 다른 것과 반대되는 바람직한 기술의 장점은 훈련된 개별 시편 처리에 따라 달라질 수 있다.

Introduction

광견병 실험실의 부검 장에서 일하는 것은 본질적으로 위험합니다. 때때로, 표본은 내장 된 포큐파인 퀼, 화살 / 총알 / 펠릿 또는 보호 운송 포장을 관통 할 수있는 노출 된 뼈 파편을 포함한 이물질로 도착합니다. 부적절한 포장은 누출을 초래하여 표본을 풀어주어 개인을 위험에 빠뜨릴 수 있습니다. 신체적 상해 이외에, 부검 기술자는 표본의 CNS 및 체액에서 알려지지 않은 동물 유행 감염제에 노출될 위험이 있습니다. 추가적으로, 견본에 의해 운반된 ectoparasites는 벼룩과 진드기가 제출된 동물에서 일반적으로 보이기 때문에 그밖 zoonotic 질병을 전송할 수 있습니다. 지리적 위치 및 종에 따라 노출된 질병은 다양합니다. 동부 말 뇌염 바이러스 (EEEV) 또는 웨스트 나일 바이러스 (WNV), 라임 질환 또는 tularemia를 포함한 진드기 매개 질병, Q 발열 또는 결핵을 일으키는 박테리아, 및 전염성 프리온과 같은 아르보바이러스는 가능한 위험의 작은 숫자 이름1 , 2개 , 3.

이러한 방법의 목적은 전동 공구 또는 톱4,5와달리 에어로졸화 가능성을 최소화하는 계측기를 사용하여 안전하고 효율적인 부검 기술을 입증하는 것입니다. 일반적으로 광견병 실험실에서 작은 동물의 부검은 두개골 근육을 절단하고 망치와 끌을 사용하여 칼바륨 6의 꼬리 등쪽 부분을열것을 요구합니다. calvarium의이 영역을 제거 하는 뒷뇌를 노출, 전체 소뇌와 두개골 뇌 줄기를 포함 하 여. 수정 된 부검 기술은 두개골의 큰 두개골 근육과 두꺼운 두개골 부위를 피하면서 두개골의 복부 부분에 수행 될 수 있습니다. 그러나, 이러한 변형 된 부검 기술은 표본이 자궁 경부 척추가없는 경우에만 가능합니다.

유사하게, 큰 동물의 뇌 조직은 두개골 근육을 분리하고 두개골 7의 꼬리 등쪽 부분을열어 제거 될 수있다. 큰 동물의 두개골은 일반적으로 두꺼운으로 소뇌와 뇌줄기를 노출하는 상당한 노력이 필요합니다. 두개골에 침투하지 않으려면 큰 동물의 머리가 배치되어 두개골의 벤트로 코달 부분이 기술자를 향하고 있습니다. 수정 된 악기를 사용하여 소뇌와 뇌줄기는 포라멘 매그넘을 통해 제거됩니다. 이것은 전염가능한 해면상 뇌병증 (TSE) 조사를 위한 TSE 유럽 연합 기준 실험실에의해 추천된 견본 취득 방법 8와 유사합니다. 두개골 척추는 포라멘 매그넘에 대한 액세스를 제공하기 위해 사전에 제거해야합니다.

이러한 기술의 적용은 광견병 실험실에서 적절하게 훈련 된 기술자에게 유익합니다. 광견병 실험실은 청소년 박쥐에서 성인 초안 말 9에이르기까지 다양한 크기의 샘플을 수신하기 때문에 기술자는 개별 상황에 따라 선택할 수있는 여러 가지 방법이 있습니다. 광견병 검사를 위해 전체 대형 동물 머리를 배송하는 것은 번거롭고 비용이 많이 들기 때문에 큰 동물에 대해 입증 된 방법은 현장에서 부검을 수행하는 수의사에게도 적합합니다. 이러한 기술을 구현하면 에어로졸 생산 가능성을 줄임으로써 안전성을 개선하고 시편 처리를 줄이며 처리 시간을 절약할 수 있습니다. 그러나 광견병 검사를 위해 특별히 설정된 실험실과 동일한 이점이 없기 때문에 이러한 절차에 대한 수정은 안전, 특히 개인 보호 장비(PPE)의 사용에 중점을 두는 것이 필수적입니다.

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Protocol

설명된 모든 방법은 워즈워스 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 준비

  1. 돈 PPE, 최소한의 눈 보호 (안경 또는 얼굴 방패), 수술 또는 N-95 마스크, 비 라텍스 장갑.
  2. 일회용 작업 표면 덮개(예: 크래프트 용지 또는 흡수 패드)와 깨끗한 부검 기구(그림 1)가 있는 바이오 안전 캐비닛(BSC)을 준비하는 작업 영역을 준비합니다.
  3. 작업 표면에 시편을 놓고 분해 증거, 두개골 손상, 잠재적 위험 (예 : 포큐파인 퀼, 메스 블레이드) 및 참수의 품질을 포함하여 샘플의 상태를 평가하기 위해 장비를 조작하십시오.

2. 복부 방법

참고 : 표본이 턱 선에서 제대로 참수되면 포멘 매그넘과 후두 콩이 노출됩니다. 복부 방법은 소뇌와 뇌간을 검색하기위한 덜 복잡합니다.

  1. BSC의 뒤쪽으로 백부 측과 코를 향하여 시편을 배치합니다.
  2. 오른손에 정형 외과 망치 / 망치를 잡고 (오른손잡이 경우) 동시에 왼손에 시의원 끌을 개최.
  3. 치즐을 45° 각도로 배치하고 시슬의 모퉁이점이 측두골의 오른쪽과 후두 뼈 사이를 향하여 "V" 개구부를 만듭니다.
  4. 두 개의 뼈가 분리 될 때까지 망치로 끌의 상단을 공격합니다. 기초에 인접한 절단을 확인페노이드 뼈.
  5. 측두골/후두골 왼쪽에서 반복합니다(그림2A).
  6. 끌로 두개골의 "V" 영역을 아래쪽으로 구부립니다. 뇌의 전체 암뇌 영역을 노출 (소뇌와 뇌 간)(그림2B).
  7. 가위와 집게로 뇌줄기와 소뇌를 떠서 내보루. 뇌줄기와 소뇌가 한 조각으로 나오지 않으면 두개골에서 남은 조각을 제거하십시오.

3. 등쪽 방법

참고 : 표본이 가난한 참수 (볼 수 없는 포라멘 매그넘)가 있고 부검 중에 목을 쉽게 제거 할 수 없거나 소뇌에 손상이 의심되는 경우 등쪽 방법을 활용해야합니다.

  1. BSC의 뒤쪽으로 코를 향하게 하여 시편을 등쪽으로 배치합니다.
  2. 종양 tenacula를 사용하여, tenacula의 이빨로 왼쪽 측두근육을 잡고 손잡이를 압박하여 잠급기.
  3. 날카로운 조각 칼로 뼈에 현세적 근육을 잘라.
  4. 테나큘라와 나이프(손이 아님)로 시편을 180°로 회전시키고 반대쪽 측두엽 근육에서 과정을 반복합니다. 두개골을 노출합니다.
  5. 정수리 및 인내 뼈의 지점에 두개골의 중심에 끌의 모서리 포인트와 45 ° 각도로 끌을 배치합니다.
  6. 정수리 뼈에서 두개골의 상단 절반에 수평 개구부가 만들어될 때까지 망치로 끌의 상단을 공격합니다.
  7. 시편을 180° 회전시키고 반대쪽에서 과정을 반복합니다.
  8. 끌의 점을 절단 1(그림3A)의끝에 넣고 수평 개구부의 90°에 삽입합니다. 개구부가 후두뼈에 도달할 때까지 망치로 치면(시편 크기에 따라 약 10cm).
  9. 시편을 굴리고 절단 2의 끝에서 반대쪽에서 반복합니다.
    참고 : 표본 등쪽과 코가 BSC의 뒤쪽으로 위치하면 두개골의 개구부가 거꾸로 된 "U"와 유사합니다.
  10. "U"의 하단에있는 두개골에 테나큘라의 치아를 삽입하고 자신을 향해 캐고. 대뇌및 소뇌의 꼬리 말단을 노출한다(도3B).
  11. 가위를 국자로 사용하고 공동 내에서 소뇌 전체를 들어 올린다.
  12. 조직 집게를 사용하여 포어맨에서 뇌 줄기를 애타게하십시오.

4. 큰 동물 방법

  1. 두개골의 등뼈 부분이 기술자를 향한 두개골과 포라멘 매그넘의 꼬리 부분과 부검 표면과 접촉되도록 표본을 배치합니다.
  2. 수정 된 스틸 레토 나이프를 척수와 척수 수막 사이에 가능한 한 매그넘에 삽입하십시오.
  3. 척수 주위의 점수를 매기면 소뇌와 뇌줄기를 척수 막에서 분리합니다. 칼을 포라멘 매그넘을 통해 삽입 한 후, 칼을 부드럽게 각도로 두개골을 따라 가능한 한 많이 따라가십시오.
  4. 신경 조직과 척추 수막 사이의 공간에 화학 주걱 또는 얇고 긴 처리 된 숟가락을 삽입하십시오.
  5. 척수와 소뇌 주위의 프로브를 조사하여 척수 수막과의 연결이 끊어졌도록 합니다.
  6. 집게로 뇌간을 잡으하십시오. 다른 한편으로는, 숟가락을 장대하게 진행한 다음 등도를 따라 소뇌를 떠서 보루하십시오. 동시에 집게로 뇌줄기를 다시 당기고 숟가락을 사용하여 소뇌를 떠냅니다.
    참고 : 광견병 검사를위해 적절한 소뇌를 회복하는 데 한 번 이상 시도가 필요할 수 있습니다.

5. 포스트 부검

  1. 모든 일회용 물질(장갑, 패드, 작업 공간 덮개) 및 사용하지 않은 조직을 생물학적 유해 폐기물에 폐기하십시오.
  2. 사용 가능한 방법 (예 : 산업용 식기 세척기, 오토 클레이브, 화학 소독제, 끓는)으로 모든 악기를 청소하고 소독하십시오.
  3. 20% 표백제 및/또는 70% 에탄올로 모든 작업 표면을 청소하고 소독하십시오.

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Representative Results

2019년 1월 31일부터 2019년 2월 28일까지 두개골로 제출된 모든 지상파 샘플에는 목의 존재와 부검 방법에 대한 정보가 수집되었습니다. 그 기간 동안 170개의 머리가 18종을 나타냈습니다. 52%(89/170)가 제대로 참수되었습니다. 나머지 는 3 개의 전신 표본을 포함하여 적어도 하나의 척추를 부착했다. 복부 방법은 당시 75%(128/170)를 사용하였고, 그 중 목은 49개에 존재하였다. 목으로 제출 된 표본은 가능한 한 복부 방법을 허용하기 위해 부검 중에 제거해야합니다. 3마리의 큰 동물(소, 사슴, 돼지)이 제출되었고, 두 가지 경우 큰 동물 프로토콜이 사용되었다. 추가 적인 두뇌 조직 견본이 추가 시험을 위해 요구되었기 때문에 큰 동물 프로토콜은 돼지에 이용되지 않았습니다. 다람쥐는 분쇄 된 두개골로 제출하고 단순히 피부 노출 뇌 조직을 절단, 따라서위의 방법 중 어느 것도 사용되지 않았다 (표 1).

신선한 그대로 제출에, 모든 세 가지 방법은 신뢰할 수있는 광견병 진단 테스트 결과에 필요한 조직으로 발생합니다. 때때로, 소뇌와 뇌 줄기는 그대로 제거 할 수 없습니다, 뒷뇌에서 모든 조직을 제거 한 후 이러한 조직은 확인 및 그에 따라 처리 할 수 있지만.

이 세 가지 귀중한 방법은 실험실에서 수령하기 전에 발생하는 열악한 시편 품질을 보상할 수 없습니다. 외상, 분해 및 가난한 참수 방법은 샘플이 얼마나 효율적으로 수집되는지에 관계없이 결과에 영향을 미칠 수 있습니다.

Figure 1
그림 1: 광견병 부검에 사용되는 계측기. 구부러진 날카로운 무딘 마요네즈 가위, 치아가없는 부드러운 팁 조직 드레싱 집게, 의원 정형 외과 뼈 끌, 정형 외과 망치, 종양 테나큘라 잠금, 레스토랑 품질의 조각 칼, 수정 된 스틸 레토 나이프, 화학 숟가락 및 날카로운 큰 스푼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 부검의 복부 방법. (A) 컷 위치 : 화살표 의 밑에 끌의 점을 배치, 녹색 화살표의 방향으로 잘라 및 포라멘 매그넘 주위에 "V"를 형성하는 노란색 화살표 다음 반복. 뇌줄기와 소뇌를 노출하기 위해 "V"를 pry. (B) 뇌줄기(녹색)와 소뇌(파란색)가 복부 를 사용하여 노출될 경우 부검을 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 부검의 등쪽 방법. (A) 컷 위치 : 화살표의 밑에 끌의 점을 배치하고 "U"를 형성하는 것으로 표시된 순서대로 화살표 방향으로 잘라냅니다. Pry "U" 아래 뇌 줄기와 소뇌를 노출 아래로. (B) 등지 방법을 사용하여 노출될 때 소뇌(동그라미)를 사용한다. 뇌간은 바로 아래에 놓여 있으며 소뇌가 제거될 때까지 보이지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

척추 부착 방법 사용 V = 복부, D = 등살, LA = 큰 동물 코멘트
아니요 2개
고양이 아니요 32세
고양이 아니요 D 3개 2 가위로 두개골을 열 수있을만큼 작은, 1 두개골의 상단을 노출 조사되고 있었다 abcess했다
고양이 11세
고양이 D 8개
암소 아니요 1개
코요테 아니요 1개
코요테 2개
코요테 D 3개
사슴 아니요 1개
아니요 19세
아니요 D 3개
2개 1 작은 개였다
D 18세
흰 족제비 아니요 1개
피셔 아니요 1개
비행 다람쥐 D 1개 전신
회색 여우 아니요 2개
회색 여우 4개
돼지 1개
고슴도치 아니요 1개
너구리 아니요 16세
너구리 아니요 D 1개 냉동
너구리 26세
붉은 여우 아니요 2개
스컹크 아니요 1개
스컹크 3개
다람쥐 아니요 1개
다람쥐 D 1개 전신, 분쇄 된 두개골, 노출 된 뇌 구멍에 피부를 잘라 가위를 사용
위들 아니요 D 1개
우드척 D 1개 전신
170명
합계 분석
81세
목 없음 89세
복부 방법 128세
등도 방법 39세
큰 동물 방법 2개
다른 방법 1개
목이있는 복부 방법 49세

표 1: 2019년 1월 31일부터 2019년 2월 28일까지 뉴욕 주 보건 광견병 연구소에서 제출된 두개골에서 조직 제거가 필요한 표본의 분석.

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Discussion

광견병 부검을 위해 제출된 견본은 수시로 신경병과 호환되는 임상 표시의 역사가 있습니다. 임상 질병의 존재는 동물 유행 병을 포함하여 다양한 장애와 연관될 수 있으며, 획득 한 감염 실험실의 직원에게 위험을 증가시킬 수 있습니다. 이러한 위험을 줄이기 위해 시편의 취급 및 조작을 줄이는 기술이 구현되었습니다.

입증된 방법은 단일 동물에서만 원하는 조직을 제거하는 부검 이벤트를 나타낸다. 더 일반적으로 여러 시편은 교대로 처리되며 시료 간에 교차 오염이 발생하지 않도록 주의가 필요합니다. 깨끗한 작업대(일회용 크래프트 종이 또는 패드), 새로운 깨끗하고 소독된 기기 세트 및 장갑 교체가 필수입니다. 일단 조직이 장악되면, 처리를 위한 개별 실험실의 프로토콜은 분자 방법을 위한 현미경 검사법 또는 RNA 추출을 위한 슬라이드를 만드는 것을 포함하여 따를 수 있습니다.

실험실 또는 현장에서 이러한 기술을 성공적으로 구현하기 위한 몇 가지 필수 전제 조건이 있습니다. 이전 광견병 예방 접종 및 PPE는 광견병 용의자 동물을 부검하는 사람에게 매우 중요합니다. 광견병 실험실에서 일하는 개별은 항 광견병 항체의 적당한 수준이 존재하는 지 확인하기 위하여그들의 혈청시험이 6 달마다 10이 있어야 합니다. EEEV, WNV 및 소 해면상 뇌병증(BSE)과 같은 다른 동물성 질환은 광견병과 유사한 징후를 나타내며 광견병 용의자 동물11,12에서도발생할 수 있음을 기억하는 것이 중요하다.

적절한 잘 관리 된 악기는 안전하게 부검을 수행하는 데 필수적입니다. 시편이 생물학적 위험 가방에서 제거되면 사고 가능성을 줄이기 위해 손이 아닌 기기로만 조작해야 합니다. 작은 동물 부검에 앞서, 기술자는 두개골의 기지를 통해 바람직한 복부 접근이 가능한지 여부를 결정하기 위하여 견본의 상태를 평가해야 합니다. 큰 동물의 경우 추가 척추가 포라멘 매그넘을 통해 조직을 검색하기 전에 제거해야 할 수 있으므로 시편의 상태를 완전히 평가하기에는 너무 번거로울 수 있습니다.

한계는 견본 상태, 조직 질 및 나머지 자궁 경관 척추의 양을 포함하여 모든 부검 기술에 제출합니다. 자궁 경부 척추는 광견병 분석 결과에 영향을 미치지 않지만 심각하게 분해 된 조직은 만족스럽지 못한 결과를 초래할 수 있습니다. 광견병 진단에서 보다 민감한 분자 방법은 가혹하게 분해된 시편13을포함하는 직접 형광 항체 분석법(DFA)에 의해 시험될 수 없는 특정 샘플에서 성공적인 시험을 허용할 수 있다. 그러나, 감도의 양은 적당한 조직 샘플링을 위한 필요를 대체할 수 없습니다.

광견병 실험실에서 일반적인 문제는 큰 동물 부검이 현장에서 수행 될 때 테스트를 위해 부적절하거나 부적절한 뇌 조직을 받고 있습니다. 필요한 조직이 없으면 추가 조직을 재제출할 수 없는 경우 광견병 실험실에서 사용 가능한 조직에 대한 테스트를 수행하지만 표본을 음수로 확인할 수 없습니다. 짚 방법 또는 레트로 궤도 경로(14)와 같은필드 조직 수집을 위한 다른 공표 방법이 있다. 두 방법 모두 두개골을 열 필요없이 뇌 조직을 수집합니다. 빨대 또는 일회용 파이펫은 포라멘 매그넘 또는 눈 소켓에 생성된 구멍을 통해 삽입되고 뇌를 통해 밀려, 본질적으로 핵심 샘플을 복용하고 반드시 뇌줄기의 전체 단면을 샘플링하지. 이러한 필드 방법은 실험실에서 테스트에 만족하는 것으로 간주되는 방식으로 샘플을 수집하지 않기 때문에, 이러한 프로세스는 이 백서에서 설명되거나 탐구되지 않습니다.

현장에서 큰 동물 부검 광견병 테스트를 위한 올바른 조직을 제거 하도록 훈련 되지 않은 개인에 대 한 도전이 될 수 있습니다. 대신 20-45kg 사이의 무게를 수있는 동물의 전체 머리가 제출되어 현장 수의사와 광견병 실험실 기술자 모두에게 번거로운 운송을 만듭니다. 대형 동물 부검 기술에 대한 교육을 자주 요청하여 실험실에 요청했습니다. 이 원고의 목적은 이러한 기술의 혜택을 누릴 수 있는 개인 및 그룹에 이 정보를 배포하는 것입니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

우리는이 프로젝트를 지원해 주어 주어진 뉴욕 주 보건 워즈워스 센터에 감사드립니다. 우리는 또한 건강 워즈워스 센터의 에이미 윌시와 프랭크 블레델의 지원을 인정하고 싶습니다, LL 목장, 알타 몬트, 뉴욕.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemistry spoon Any
Curved, sharp-blunt mayo scissors Sklar 14-2055 Sklar Operating Scissors 5-1/2 Inch Premium OR Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Curved Sharp/Blunt
Large sharp restaurant-quality carving knife Dexter P94848 8" Scalloped Utility Knife, white handle
Locking tumor-tenacula Diamond Scientific and Surgicals N/A Czerny Tenaculum Forcep
Modified stiletto knife (6.5 inch long blade carving knife ground to 0.5 inch wide) Dexter P94848 Modified 8" Scalloped Utility Knife, white handle
Orthopedic mallet-hammer Mortech N/A Postmortem hammer with hook
Sharp councilman orthopedic bone chisel Shandon 60-5 Councilman's Chisel Blade: 2 in x 2.25 in standard 7 in
Sharpened tablespoon or other long handled spoon Any
Smooth-tipped tissue dressing forceps without teeth Shandon 63-03 Shandon Broad Point Dressing Thumb Forceps
Powder-free non-latex gloves Any
Safety glasses, goggles, or faceshield Any
Surgery or N-95 mask Any
Kraft paper, butcher paper, absorbent pad, etc Any

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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