Techniques d'autopsie de la rage chez les grands et les petits animaux

Neuroscience

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Summary

L'objectif de ce protocole est de démontrer des techniques d'autopsie sûres chez les petits et grands animaux afin d'obtenir des échantillons de tissus satisfaisants pour les tests de dépistage de la rage.

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Jarvis, J. A., Brown, K. T., Appler, K. A., Fitzgerald, D. P., Davis, A. D. Rabies Necropsy Techniques in Large and Small Animals. J. Vis. Exp. (149), e59574, doi:10.3791/59574 (2019).

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Abstract

Le New York State Department of Health (NYSDOH) Rabies Laboratory reçoit entre 6 000 et 9 000 spécimens par an et effectue des tests de dépistage de la rage pour l'ensemble de l'État, à l'exception de la ville de New York. Le laboratoire de la rage écorferme une variété d'animaux allant de la taille des chauves-souris aux bovidés. La plupart de ces spécimens sont des animaux présentant des signes neurologiques, cependant, moins de 10% effectivement testé positif pour la rage; traumatismes, lésions ou autres agents infectieux comme cause de ces symptômes. En raison du risque d'aérosol des agents infectieux non diagnostiqués, le Laboratoire de la rage n'utilise pas d'outils électriques ou de scies. Trois techniques d'autopsie seront présentées pour les animaux dont les crânes sont impénétrables avec des ciseaux. Le laboratoire a mis en œuvre ces techniques pour réduire l'exposition potentielle aux agents infectieux, éliminer la manipulation inutile de l'échantillon et réduire le temps de traitement. Les avantages d'une technique préférée par opposition à une autre sont soumis au traitement individuel formé du spécimen.

Introduction

Travailler sur le plancher d'autopsie d'un laboratoire de la rage est intrinsèquement dangereux. Parfois, les spécimens arrivent avec des piquants de porc-épic intégrés, des objets étrangers, y compris des flèches/balles/pellets ou des éclats d'os exposés qui peuvent pénétrer dans l'enveloppe d'expédition protectrice. Un emballage inadéquat peut entraîner des fuites, mettant en danger les individus qui déballent des spécimens. En plus des blessures physiques, les techniciens en autopsie risquent d'être exposés à des agents infectieux zoonotiques inconnus du SNC et aux liquides organiques des spécimens. En outre, les ectoparasites transportés par le spécimen peuvent transmettre d'autres maladies zoonotiques, comme les puces et les tiques sont couramment observées sur les animaux soumis. Selon l'emplacement géographique et les espèces concernées, les maladies exposées varient. Les arbovirus tels que le virus de l'encéphalite équine orientale (EEEV) ou le virus du Nil occidental (VNO), les maladies transmises par les tiques, y compris la maladie de Lyme ou la tularémie, les bactéries causant la fièvre Q ou la tuberculose, et les prions infectieux nom un petit nombre des dangers possibles1 , 2 (en) , 3.

Le but de ces méthodes est de démontrer des techniques d'autopsie sûres et efficaces à l'aide d'instruments qui minimisent le potentiel d'aérosol contrairement aux outils électriques ou aux scies4,5. Généralement, l'autopsie des petits animaux dans le laboratoire de la rage nécessite de couper les muscles crâniens et à l'aide d'un marteau et un ciseau pour ouvrir la partie dorsal caudale du calvarium6. L'enlèvement de cette zone de calvarium expose le cerveau postérieur, y compris le cervelet entier et le tronc crânien de cerveau. Des techniques d'autopsie modifiées peuvent être pratiquées sur la partie ventrale du crâne, en évitant les grands muscles crâniens et les régions plus épaisses du crâne. Cependant, ces techniques d'autopsie modifiées ne sont possibles que lorsque le spécimen est sans vertèbres cervicales.

De même, le tissu cérébral chez les grands animaux peut être enlevé en séparant les muscles crâniens et en ouvrant la partie dorsal caudale du crâne7. Des efforts considérables sont nécessaires pour exposer le cervelet et le tronc cérébral car les crânes des plus grands animaux sont généralement plus épais. Pour éviter de pénétrer le crâne, la tête d'un gros animal est positionnée de sorte que la partie ventro-caudale du crâne est face au technicien. À l'aide d'instruments modifiés, le cervelet et le tronc cérébral sont enlevés par le magnum foramen. Ceci est similaire à la méthode d'acquisition d'échantillons recommandée par le Laboratoire de référence de l'Union européenne tSE pour les enquêtes sur l'encéphalopathie spongiforme transmissible (TSE)8. Les vertèbres crâniennes doivent être enlevées à l'avance pour donner accès au magnum foramen.

L'application de ces techniques est bénéfique pour les techniciens dûment formés dans les laboratoires de la rage. Comme le laboratoire de la rage reçoit des échantillons de différentes tailles, des chauves-souris juvéniles aux chevaux de trait adultes9, le technicien a plusieurs méthodes à choisir en fonction de la circonstance individuelle. La méthode démontrée pour un gros animal est également appropriée pour les vétérinaires qui effectuent des nécropsies sur le terrain, puisque l'expédition d'une tête entière de gros animal pour l'essai de rage est lourde et coûteuse. La mise en œuvre de l'une ou l'autre de ces techniques améliorera la sécurité en diminuant le potentiel de production d'aérosols, en réduisant la manipulation du spécimen et en économisant le temps de traitement. Cependant, comme le domaine n'a pas les mêmes avantages qu'un laboratoire mis en place spécifiquement pour les tests de dépistage de la rage, il est essentiel que toute modification apportée à ces procédures se concentre sur la sécurité, en particulier l'utilisation d'équipements de protection individuelle (PPE).

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Protocol

Toutes les méthodes décrites ont été approuvées par le Wadsworth Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Préparation

  1. Don PPE, au minimum de protection oculaire (lunettes ou bouclier facial), masque chirurgical ou N-95, et gants non latex.
  2. Préparer une aire de travail, idéalement une armoire de biosécurité (BSC), avec un revêtement de surface de travail jetable (p. ex., papier kraft ou coussinets absorbants) et des instruments d'autopsie propres (figure 1).
  3. Placez le spécimen sur la surface de travail et utilisez des instruments pour le manipuler pour évaluer l'état de l'échantillon, y compris des signes de décomposition, de dommages au crâne, de dangers potentiels (p. ex. piquants de porc-épic, lames de scalpel) et de la qualité de la décapitation.

2. Méthode Ventral

REMARQUE : Lorsque le spécimen est correctement décapité à la mâchoire, le magnum de foramen et le condyle occipital seront exposés. La méthode ventrale est moins compliquée pour récupérer le cervelet et le tronc cérébral.

  1. Placez le spécimen avec le côté ventral vers le haut et le nez dirigeant distally vers l'arrière du BSC.
  2. Tenez un marteau orthopédique/mallet dans la main droite (si droitier) et en même temps tenez un ciseau de conseillers dans la main gauche.
  3. Placez le ciseau à un angle de 45 degrés avec le point d'angle du ciseau en dirigeant entre le côté droit de l'os temporel et l'os occipital faisant une ouverture « V ».
  4. Frapper le haut du ciseau avec le marteau jusqu'à ce que les deux os se séparent. Faire la coupe à côté de l'os de basephenoid.
  5. Répéter sur le côté gauche de l'os temporel / os occipital (Figure 2A).
  6. Pliez la zone "V" du crâne vers le bas avec le ciseau. Exposer toute la zone du rhombencephalon du cerveau (cerebellum et tronc cérébral) (Figure 2B).
  7. Éteignons le tronc cérébral et le cervelet avec des ciseaux et des forceps. Enlever les morceaux restants du crâne si le tronc cérébral et le cervelet ne sont pas sortis en une seule pièce.

3. Méthode Dorsal

REMARQUE : Si le spécimen a une mauvaise décapitation (foramen magnum non visible) et que le cou ne peut pas être facilement enlevé pendant l'autopsie ou si des dommages au cervelet sont soupçonnés, la méthode dorsal doit être utilisée.

  1. Placez le spécimen dorsally avec le nez dirigeant distally vers l'arrière de BSC.
  2. Utilisant la tumeur tenacula, saisissez le muscle temporel gauche avec des dents de tenacula et verrouillez en serrant la poignée.
  3. Couper le muscle temporel jusqu'à l'os avec un couteau à découper pointu.
  4. Faites pivoter le spécimen à 180 degrés avec la tenacula et le couteau (pas la main) et répétez le processus sur le muscle temporel opposé. Exposez le crâne.
  5. Placez un ciseau à un angle de 45 degrés avec le point d'angle du ciseau au centre du crâne à la jonction de l'os pariétal et intrapariétal.
  6. Frapper le haut du ciseau avec un marteau jusqu'à ce qu'une ouverture horizontale soit faite sur la moitié supérieure du crâne à l'os pariétal.
  7. Faites pivoter le spécimen à 180 degrés et répétez le processus du côté opposé.
  8. Insérer le point du ciseau à l'extrémité de la coupe 1 (Figure 3A) et à 90 degrés d'ouverture horizontale. Frapper avec le marteau jusqu'à ce que l'ouverture atteigne l'os occipital (environ 10 cm selon la taille du spécimen).
  9. Rouler le spécimen et répéter sur le côté opposé à la fin de la coupe 2.
    REMARQUE : Avec le spécimen dorsal et le nez placé vers l'arrière du BSC, les ouvertures dans le crâne ressemblent à un « U » à l'envers.
  10. Insérez les dents de la tenacula dans le crâne au bas du "U" et indiscret vers soi-même. Exposer l'extrémité caudale du cerveau et du cervelet (figure 3B).
  11. Utilisez des ciseaux comme une cuillère et extraire le cervelet entier de l'intérieur de la cavité.
  12. Utilisez des forceps tissulaires pour taquiner le tronc cérébral du foramen.

4. Grande méthode animale

  1. Placez le spécimen de manière à ce que la partie dorsale du crâne soit en contact avec la surface d'autopsie avec la partie caudale du crâne et le magnum de foramen face au technicien.
  2. Insérez le couteau à talons aiguilles modifié dans le magnum foramen entre la moelle épinière et les méninges de la colonne vertébrale dans la mesure du possible.
  3. Score autour de la moelle épinière pour séparer le cervelet et le cerveau tige des méninges spinales. Après que le couteau est inséré à travers le magnum foramen, angle doucement le couteau à suivre le long du crâne autant que possible.
  4. Insérez une spatule de chimie ou une cuillère mince et longue manipulée dans l'espace entre le tissu neural et les méninges spinales.
  5. Sonde autour de la moelle épinière et du cervelet pour s'assurer que la connexion aux méninges de la colonne vertébrale a été sectionnée.
  6. Tenez le tronc cérébral avec des forceps. D'autre part, avancez la cuillère vers le haut puis doracer pour ramasser le cervelet. Simultanément tirer vers l'arrière sur le tronc cérébral avec les forceps et retirer le cervelet à l'aide de la cuillère.
    REMARQUE : Il peut prendre plus d'une tentative pour récupérer le cervelet proportionné pour l'essai de rage.

5. Post nécropsie

  1. Éliminer tous les matériaux jetables (gants, tampons, revêtements de surface de travail) et les tissus inutilisés dans les déchets biodangereux.
  2. Nettoyer et désinfecter tous les instruments avec la méthode disponible (p. ex. lave-vaisselle industriel, autoclave, désinfectant chimique, ébullition).
  3. Nettoyez et désinfectez toutes les surfaces de travail avec 20 % d'eau de Javel et/ou 70 % d'éthanol.

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Representative Results

Tous les échantillons terrestres soumis avec des crânes entre le 31 janvier 2019 et le 28 février 2019 avaient des informations concernant la présence d'un cou et la méthode d'autopsie recueillie. Pendant ce temps, 170 têtes ont été nécropsiées avec 18 espèces représentées. 52 % (89/170) ont été correctement décapités. Le reste avait au moins une vertèbre attachée comprenant trois spécimens entiers de corps. La méthode ventrale a été utilisée 75% (128/170) du temps, de ceux-ci, cous étaient présents sur 49. Les spécimens soumis avec un cou le feront enlever pendant l'autopsie pour permettre la méthode ventrale chaque fois que possible. Trois grands animaux (vache, cerf, porc) ont été soumis et dans deux cas, le protocole animal de grande taille a été utilisé. Le protocole animal de grande taille n'a pas été utilisé sur le porc parce que des échantillons supplémentaires de tissus cérébraux ont été nécessaires pour des tests supplémentaires. Un écureuil a été soumis avec un crâne écrasé et simplement couper le tissu cérébral exposé à la peau, donc aucune des méthodes ci-dessus ont été utilisés (tableau 1).

Sur les soumissions intactes fraîches, les trois méthodes résulteront avec le tissu requis pour des résultats fiables d'essai diagnostique de rage. De temps en temps, le cervelet et le tronc cérébral ne peuvent pas être enlevés intacts, bien qu'après avoir enlevé tous les tissus du cerveau postérieur ces tissus puissent être identifiés et traités en conséquence.

Ces trois méthodes précieuses ne peuvent pas compenser la mauvaise qualité des échantillons causée avant la réception au laboratoire. Les traumatismes, la décomposition et les mauvaises méthodes de décapitation peuvent influer sur le résultat, quelle que soit l'efficacité des prélèvements.

Figure 1
Figure 1 : Instruments utilisés dans l'autopsie de la rage. Ciseaux de mayo courbés pointus, cloisonnements de pansement de tissu lisse-vers où sans dents, ciseau orthopédiste d'os orthopédique, maille orthopédique-marteau, verrou de tumeur-tenacula de verrouillage, couteau de découpage de restaurant-qualité, couteau à talons aiguille stécaux modifiés, cuillère de chimie, et cuillère à soupe aiguisée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Méthode ventrale d'autopsie. (A) Emplacement des coupes: Placer le point d'un ciseau à la base de la flèche, couper en direction de flèche verte et répéter après la flèche jaune formant un "V" autour du magnum foramen. Pry "V" vers le bas pour exposer le tronc cérébral et le cervelet. (B) Tige cérébrale (verte) et cervelet (bleu) lorsqu'il est exposé à l'aide de la méthode ventrale de l'autopsie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Méthode d'autopsie dorsal. (A) Emplacement des coupes: Placer le point d'un ciseau à la base de la flèche et couper dans la direction de la flèche dans l'ordre noté formant un "U". Pry "U" vers le bas pour exposer le cervelet avec le tronc cérébral en dessous. (B) Cerebellum (encerclé) lorsqu'il est exposé à l'aide de la méthode dorsal. Le tronc cérébral se trouve directement en dessous et n'est pas visible jusqu'à ce que le cervelet soit enlevé. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

espèce vertèbres attachées méthode utilisée V-ventral, D'dorsal, LA total Commentaires
supporter non contre 2 (en)
félin non contre 32 Ans, états-unis (
félin non D 3 (en) 2 assez petit pour ouvrir le crâne avec des ciseaux, 1 avait abcess qui faisait l'objet d'une enquête exposant le haut du crâne
félin ouais contre 11 Ans, états-unis (
félin ouais D 8 Annonces
vache non LA LA 1 Fois
coyote non contre 1 Fois
coyote ouais contre 2 (en)
coyote ouais D 3 (en)
cerf non LA LA 1 Fois
chien non contre 19 ans, états-unis qui
chien non D 3 (en)
chien ouais contre 2 (en) 1 était petit chien
chien ouais D 18 ans, états-unis qui
furet non contre 1 Fois
Fisher non contre 1 Fois
Polatouche ouais D 1 Fois corps entier
renard gris non contre 2 (en)
renard gris ouais contre 4 ( en plus)
cochon ouais contre 1 Fois
porc-épic non contre 1 Fois
raton laveur non contre 16 Annonces
raton laveur non D 1 Fois La Reine des neiges
raton laveur ouais contre 26 Annonces
renard roux non contre 2 (en)
moufette non contre 1 Fois
moufette ouais contre 3 (en)
écureuil non contre 1 Fois
écureuil ouais D 1 Fois corps entier, crâne écrasé, ciseaux utilisés pour couper la peau à la cavité cérébrale exposée
weasle (weasle) non D 1 Fois
Marmotte ouais D 1 Fois corps entier
total 170 Annonces
Répartition du total
avec le cou 81 Annonces
pas de cou 89 Ans et plus
méthode ventrale 128 Annonces
méthode dorsal 39 Ans et plus qu'ils
grande méthode animale 2 (en)
autre méthode 1 Fois
méthode ventrale avec le cou 49 ans, en plus

Tableau 1 : Répartition des spécimens nécessitant l'ablation des tissus du crâne soumis du 31 janvier 2019 au 28 février 2019 au Laboratoire de la rage du département de la Santé de l'État de New York.

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Discussion

Les spécimens soumis pour l'autopsie de la rage ont souvent des antécédents de signes cliniques compatibles avec une maladie neurologique. La présence de maladies cliniques peut être associée à une variété de troubles, y compris les maladies zoonotiques, ce qui augmente le risque pour le personnel d'une infection acquise en laboratoire. Pour réduire ces risques, des techniques ont été mises en œuvre qui réduisent la manipulation et la manipulation des spécimens.

Les méthodes démontrées représentent un événement d'autopsie pour enlever les tissus désirés d'un seul animal seulement. Plus souvent, plusieurs spécimens sont traités en quart de travail et des soins sont nécessaires pour s'assurer qu'il n'y a pas de contamination croisée entre les échantillons. Une surface de travail propre (papier kraft jetable ou tampons), un nouvel ensemble d'instruments propres et désinfectés et des changements de gants sont obligatoires. Une fois les tissus obtenus, le protocole de traitement du laboratoire individuel peut être suivi, y compris la fabrication de diapositives pour la microscopie ou l'extraction de l'ARN pour les méthodes moléculaires.

Il existe plusieurs conditions préalables essentielles à la mise en œuvre réussie de ces techniques en laboratoire ou sur le terrain. La vaccination préalable contre la rage et l'EPI sont essentielles pour toute personne qui ne soude un animal suspect de rage. Les personnes travaillant dans les laboratoires de la rage devraient faire tester leur sérum tous les six mois afin de s'assurer qu'un niveau adéquat d'anticorps antirabiques est présent10. Il est important de se rappeler que d'autres maladies zoonotiques, telles que eEEV, VNO et encéphalopathie spongiforme bovine (ESB), présentent des signes similaires à la rage et peuvent également se produire chez les animaux suspects de rage11,12.

Des instruments appropriés bien entretenus sont essentiels pour effectuer en toute sécurité l'autopsie. Une fois qu'un spécimen a été retiré de son sac de biorisque, il ne doit être manipulé qu'avec des instruments, et non des mains, pour diminuer le risque d'accidents. Avant l'autopsie des petits animaux, le technicien devrait évaluer l'état du spécimen afin de déterminer si une approche ventrale préférée à travers la base du crâne est possible. Avec les gros animaux, il peut être trop lourd pour évaluer pleinement l'état du spécimen que les vertèbres supplémentaires peuvent avoir besoin d'être enlevés avant de récupérer le tissu à travers le magnum foramen.

Les limitations se présentent dans toutes les techniques d'autopsie, y compris l'état du spécimen, la qualité des tissus et la quantité de vertèbres cervicales restantes. Les vertèbres cervicales n'affecteront pas les résultats de l'analyse de la rage, mais les tissus gravement décomposés peuvent entraîner des résultats insatisfaisants. Des méthodes moléculaires plus sensibles dans le diagnostic de la rage peuvent permettre des tests réussis dans certains échantillons incapables d'être testés par test d'anticorps fluorescents directs (DFA), y compris les spécimens gravement décomposés13. Cependant, aucune quantité de sensibilité ne peut remplacer la nécessité d'un échantillonnage approprié des tissus.

Un problème courant dans le laboratoire de la rage reçoit des tissus cérébraux inappropriés ou inadéquats pour les tests lorsque de grandes nécropsies animales sont pratiquées sur le terrain. Sans le tissu requis, et si les tissus supplémentaires ne sont pas disponibles pour la nouvelle soumission, notre laboratoire de la rage effectuera des tests sur le tissu disponible, mais est incapable de vérifier le spécimen négatif, au lieu de cela il est insatisfaisant pour le test. Il existe d'autres méthodes publiées pour les collections de tissus de champ telles que la méthode de paille ou rétro orbitale route14. Les deux méthodes recueillent le tissu cérébral sans avoir besoin d'ouvrir le crâne. Une pipette de paille ou jetable est insérée soit par le magnum de foramen ou un trou créé dans l'orbite oculaire et poussé à travers le cerveau, prenant essentiellement un échantillon de noyau et ne échantillonnant pas nécessairement la section transversale complète du tronc cérébral. Comme ces méthodes sur le terrain ne recueillent pas d'échantillons d'une manière à considérer comme satisfaisante pour les essais en laboratoire, ces processus ne sont pas démontrés ou explorés dans le présent document.

Dans le domaine de grandes autopsies animales peut être difficile pour les personnes qui ne sont pas formés pour enlever le tissu correct pour le test de la rage. Au lieu de cela, la tête entière de l'animal, qui peut peser entre 20-45 kg, est soumise créant le transport encombrant pour le vétérinaire de champ et les techniciens de laboratoire de rage. De fréquentes demandes de formation sur la technique d'autopsie des grands animaux ont été faites à notre laboratoire. L'objectif de ce manuscrit est de distribuer ces informations aux individus et aux groupes dont le travail peut bénéficier de ces techniques.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants au New York State Department of Health Wadsworth Center pour son soutien à ce projet. Nous tenons également à souligner le soutien d'Amy Willsey et Frank Blaisdell du Department of Health Wadsworth Center et de LL Ranch, Altamont, NY.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemistry spoon Any
Curved, sharp-blunt mayo scissors Sklar 14-2055 Sklar Operating Scissors 5-1/2 Inch Premium OR Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Curved Sharp/Blunt
Large sharp restaurant-quality carving knife Dexter P94848 8" Scalloped Utility Knife, white handle
Locking tumor-tenacula Diamond Scientific and Surgicals N/A Czerny Tenaculum Forcep
Modified stiletto knife (6.5 inch long blade carving knife ground to 0.5 inch wide) Dexter P94848 Modified 8" Scalloped Utility Knife, white handle
Orthopedic mallet-hammer Mortech N/A Postmortem hammer with hook
Sharp councilman orthopedic bone chisel Shandon 60-5 Councilman's Chisel Blade: 2 in x 2.25 in standard 7 in
Sharpened tablespoon or other long handled spoon Any
Smooth-tipped tissue dressing forceps without teeth Shandon 63-03 Shandon Broad Point Dressing Thumb Forceps
Powder-free non-latex gloves Any
Safety glasses, goggles, or faceshield Any
Surgery or N-95 mask Any
Kraft paper, butcher paper, absorbent pad, etc Any

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References

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  14. Chapter 7. Brain removal. Laboratory techniques in Rabies 5th Edition. Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. World Health Organization. 67-72 (2018).

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