Implementierung eines nichtlinearen Mikroskops auf Basis der stimulierten Raman-Streuung

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Summary

In diesem Manuskript wird die Implementierung eines stimulierten Raman-Streumikroskops (SRS) beschrieben, das durch die Integration eines SRS-Experimentalaufbaus mit einem Laser-Scanning-Mikroskop gewonnen wurde. Das SRS-Mikroskop basiert auf zwei Femtosekunden (fs) Laserquellen, einem Ti-Sapphire (Ti:Sa) und einem synchronisierten optischen parametrischen Oszillator (OPO).

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Ranjan, R., Indolfi, M., Ferrara, M. A., Sirleto, L. Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering. J. Vis. Exp. (149), e59614, doi:10.3791/59614 (2019).

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Abstract

Stimulierte Raman-Streumikroskopie (SRS) verwendet Nahinfrarot-Anregungslicht; Daher hat es viele mikroskopische Bildgebungseigenschaften mit mehreren Photonen. Die SRS-Bildgebungsmodalität kann mit kommerziellen Laser-Scanning-Mikroskopen erreicht werden, indem ein nicht gescannter Vorwärtsdetektor mit richtigen Bandpassfiltern und einem Lock-in-Verstärker (LIA)-Erkennungsschema ausgestattet wird. Ein schematisches Layout eines typischen SRS-Mikroskops umfasst Folgendes: zwei gepulste Laserstrahlen (d. h. die Pumpe und sonde, die in einem Rastermikroskop gerichtet sind), die sowohl in Raum als auch Zeit auf der Bildebene überlappen und dann durch ein Mikroskopobjektiv in das Beispiel durch zwei Scanspiegel (SMs), die den Brennpunkt über eine x-y-Ebene rastern. Nach Interaktion mit der Probe werden die übertragenen Ausgangsimpulse durch ein oberes Objektiv erfasst und durch ein Vorwärtsdetektionssystem gemessen, das in ein invertiertes Mikroskop eingesetzt wird. Pumpenimpulse werden durch einen Stapel optischer Filter entfernt, während die Sondenimpulse, die das Ergebnis des SRS-Prozesses im Brennvolumen der Probe sind, mit einer Photodiode (PD) gemessen werden. Die Auslesung der PD wird von der LIA demoduliert, um die Modulationstiefe zu extrahieren. Ein zweidimensionales (2D) Bild wird durch Synchronisieren der Vorwärts-Erkennungseinheit mit der Mikroskop-Scaneinheit erhalten. In diesem Beitrag wird die Implementierung eines SRS-Mikroskops beschrieben und erfolgreich demonstriert, ebenso wie die Meldung von etikettenfreien Bildern von Polystyrolperlen mit Durchmessern von 3 m. Es ist erwähnenswert, dass SRS Mikroskope nicht kommerziell erhältlich sind, so dass, um diese Eigenschaften zu nutzen, die hausgemachte Konstruktion die einzige Option ist. Da die SRS-Mikroskopie in vielen Bereichen immer beliebter wird, wird angenommen, dass diese sorgfältige Beschreibung der Implementierung des SRS-Mikroskops für die wissenschaftliche Gemeinschaft sehr nützlich sein kann.

Introduction

In Life-Science-Anwendungen hat sich die SRS-Mikroskopie als leistungsfähiges Werkzeug für die etikettenfreie Bildgebung herauskristallisiert. Die Grundidee der SRS-Mikroskopie besteht darin, die Stärke des Schwingungskontrasts und seine Fähigkeit, Bilder in wenigen Sekunden zu erfassen, zu kombinieren.

SRS ist ein Prozess, bei dem der Frequenzunterschied zwischen zwei Laserstrahlenfrequenzen (Pumpensignal und Stokes-Signal bei unterschiedlichen Frequenzen) mit der molekularen Schwingung einer untersuchten Probe übereinstimmt, wodurch eine stimulierte Raman-Streuung und eine signifikante Erhöhung des Stokes-Signals. Im Gegensatz zur linearen Raman-Spektroskopie weist SRS eine nichtlineare Abhängigkeit von den eingehenden Lichtfeldern auf und erzeugt kohärente Strahlung. SRS hat zwei grundlegende Vorteile: 1) Geschwindigkeit, die Bilder weniger empfindlich gegenüber Artefakten macht, die durch Probenbewegung oder -degradation entstehen, und 2) ein ausgezeichnetes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR). Darüber hinaus weist SRS ein Spektrum auf, das mit dem spontanen Raman identisch ist, und das SRS-Signal ist linear proportional zur Konzentration der angeregten chemischen Bindung1,2,3,4, 5.

In unserem Mikroskop ist ein Femtosekunden-SRS-Experimentalaufbau mit einem invertierten optischen Mikroskop integriert, das mit einer schnellen Spiegel-Scaneinheit ausgestattet ist (Abbildung 1)6,7,8. Zur Implementierung dieses Mikroskops werden zwei gepulste Laserquellen verwendet. Die erste ist ein fs-Ti:Sa mit einer Pulsdauer von ca. 140 fs, einer Wiederholungsrate von 80 MHz und Emissionswellenlängen im Bereich von 680-1080 nm. Der zweite, der als Sondenstrahl verwendet und von Ti:Sa gepumpt wird, ist ein femtosekundensynchronisierter optischer parametrischer Oszillator (SOPO) mit einer Pulsdauer von ca. 200 fs, einer Wiederholungsrate von 80 MHz und Emissionswellenlängen im Bereich von 1000-1600 nm. Es sollte beachtet werden, dass die minimale Photonenenergiedifferenz zwischen dem Ti:Sa- und SOPO-Strahl 2500 cm-1beträgt. Daher kann mit dieser Kombination von Lasersystemen nur der Hochfrequenz-C-H-Bereich (2800-3200 cm-1) der Raman-Spektren 6,7,8untersucht werden.

Um ein SRS-Mikroskop einzurichten, gibt es drei entscheidende Fragen zu berücksichtigen, die in den aufeinanderfolgenden Absätzen beschrieben werden. Die erste ist die Implementierung einer Hochfrequenzmodulationsübertragungsmethode (siehe Abbildung 2 und Schritt 2.1 des Protokolls für eine Beschreibung). In einer sRS-experimentellen Untersuchung ist ein entscheidender Parameter die Empfindlichkeit des Systems. Ein SRS-Signal wird als kleine Änderung der Intensität der Anregungsstrahlen erkannt; daher kann es durch Laserintensitätsgeräusche und Schussgeräusche beschädigt werden. Dieses Problem kann durch die Integration dieses Systems in eine hochfrequente Modulationsübertragungsmethode behoben werden (Details siehe Abbildung 2 und Schritt 2.1 des Protokolls). Bei diesem Verfahren wird ein elektro-optischer Modulator (EOM) verwendet, um die Pumpe zu modulieren. Die auf den Sondenstrahl übertragene Modulation kann dann von einem PD erfasst werden, nachdem der Pumpenstrahl mit einem Stapel optischer Filter [stimulierter Raman Gain (SRG) Erkennungsmodus] blockiert wurde. Der PD-Ausgang wird über einen Tiefpassfilter mit einem Einsperrverstärker (LIA) verbunden, der das gemessene Signal demoduliert. Durch die Erhöhung der Modulationsfrequenz des Strahls auf Frequenzen über 1 MHz kann die intrinsische Grenze von PDs erreicht werden.

Das zweite zu berücksichtigende Problem ist die Installation einer mechanischen Halterung, die es ermöglicht, eine Vorwärtserkennung durchzuführen und gleichzeitig die Mikroskopbeobachtung im Hellen Feld zu erhalten. Darüber hinaus muss es das Rauschen durch mechanische Vibrationen während der Erzeugung von Bildern reduzieren und eine präzise Neupositionierung des Detektionssystems ermöglichen (siehe Abbildung 3 und Schritt 2.2 des Protokolls).

Die dritte ist die Synchronisation des signals, das durch das phasenempfindliche Detektionsschema erfasst wird, wobei der Strahl auf der Probe positioniert ist, die vom Scankopf des Mikroskops überwacht wird. Um Bilder zu realisieren, benötigen die SMs drei TTL-Signale, die über den mikroskopischen Controller zur Verfügung gestellt werden, der mit der Scankopfeinheit verbunden ist: Pixeluhr, Liniensynchronisierung und Frame-Synchronisation. Die Synchronisation erfolgt durch Steuerung über eine PCI-Karte, die drei TTL-Signale und die Erfassung eines Spannungssignals am Ausgangskanal von LIA6,7,8. Eine hausgemachte Software wurde zuvor entwickelt und beschrieben6,7,8, während die Hardware des Synchronisationssystems in Abbildung 4berichtet wird.

Ein grundlegendes Verfahren bei der Durchführung der SRS-Bildgebung ist die Mikroskopausrichtung. Es wird im Laufe von vier Schritten realisiert, die in den aufeinanderfolgenden Absätzen beschrieben werden. Der erste ist die räumliche Überlappung zweier Balken (siehe Schritt 3.1 des Protokolls). In diesem Versuchsaufbau wurden die beiden Strahlen räumlich durch einen dichroitischen Spiegel miteinander kombiniert. Der vorläufige Schritt ist die Ausrichtung von OPO und Ti:Sa, so dass jeder das Mikroskop erreicht. Wenn man dann OPO als Referenzstrahl betrachtet und einen positionsempfindlichen Detektor ausnutzt, wird der Ti:Sa räumlich mit OPO überlappt.

Der zweite entscheidende Aspekt ist die zeitliche Überlappung zweier Strahlen (siehe Schritt 3.2 des Protokolls). Auch wenn die Pumpe und OPO-Träger perfekt synchronisiert sind9, da sie leicht unterschiedlichen Strahlwegen innerhalb des OPO-Gehäuses folgen, haben sie am OPO-Ausgang eine Zeitverzögerung von ca. 5 ns und eine räumliche Differenz von 5 cm. Daher müssen Ti:Sa und OPO optisch neu getaktet werden, um eine zeitliche Überlappung an der Probe zu gewährleisten. Dies wird in der Regel mit einer fein einstellbaren optischen Verzögerungslinie erreicht, die in diesem Fall zwischen Ti:Sa und Mikroskop eingefügt wird (siehe Abbildung 1). Um die zeitliche Überlappung zweier Strahlen zu erhalten, werden zwei Techniken verwendet. Die erste wird mit einem schnellen PD und Oszilloskop durchgeführt, während die zweite auf auto- und queroptischen Korrelationen basiert. Mit der ersten Technik wird eine grobe Überlappung von zwei Strahlen erhalten (Unsicherheit von 10 ps), während eine genaue zeitliche Überlappung von zwei Strahlen mit einem Kreuzkorrelator (Auflösung von 1 fs) erreicht wird.

Der dritte entscheidende Aspekt ist die Ausrichtung der beiden Strahlen im Mikroskop (siehe Schritt 3.3 des Protokolls). Eine vorläufige Weißlichtbeobachtung der Probe ermöglicht es, das gewünschte Sichtfeld (FOV) zu individualisieren. Anschließend werden Laserstrahlen, die über einen Seitenanschluss des Mikroskops in das Mikroskop gelangen, ausgerichtet, um das am oberen Teil montierte PD zu erreichen (Abbildung 3). Für eine korrekte Bildaufnahme ist jedoch das Festlegen einer Reihe von Parametern erforderlich (z. B. Pixeldimension und Pixelverweilzeit). Die Sampling-Frequenz muss die Durchdrungen von Nyquist-Theorem auferlegte Einschränkung respektieren, um alle Informationen in einem Bild zu erhalten, während für eine korrekte Übereinstimmung zwischen den räumlichen Koordinaten der Pixel und dem sRS-Wert, der in jedem Pixel gemessen wird, die Integrationszeit LIA sollte gleich oder vergleichbar mit der Pixelverweilzeit sein.

Im letzten Schritt der Mikroskopausrichtung werden zahlreiche Tests zur Optimierung der räumlichen und zeitlichen Ausrichtung durchgeführt (siehe Schritt 3.4 des Protokolls). Zur Optimierung der räumlichen Überlappung werden eine Reihe von Übertragungsbildern (TI) für Ti:Sa und OPO erfasst. In einem TI wird ein einzelner Strahl verwendet, und die übertragene Strahlintensität aus der Probe wird durch eine PD gemessen. Im Falle von TI, die von OPO realisiert werden, wird das PD-Ausgangssignal direkt an die PCI-Karte angeschlossen, während im Fall von TI:Sa das PD-Ausgangssignal an LIA und der analoge Ausgang von LIA an die PCI-Karte angeschlossen ist. Die Übertragungsbilder sind sehr nützlich, um den FOV, die Beleuchtung, die Brennposition von Mikroskopobjektiven zu optimieren und zu überprüfen, ob die beiden Strahlen räumlich überlappend sind6,7,8.

Die Optimierung der zeitlichen Überlappung von Pumpe und Sondenstrahl wird durch Scannen der Verzögerungslinie mit Schritten von 0,001 mm, die einer 3,3-fs-Zeitverschiebung entsprechen, und Durchführung einer SRS-Messung an einem einzigen Punkt einer Polystyrol-Perlenprobe mit einem Durchmesser von 3 m erreicht. Die Amplitude eines SRS-Signals misst in Abhängigkeit von der Sonden-Pumpen-Verzögerung Werte aus LIA und liefert eine maximale zeitliche Überlappung der beiden Strahlen6,7,8. Vor dem Abschluss ist zu beachten, dass alle diskutierten Schritte obligatorisch sind, um ein qualitativ hochwertiges Bild zu erhalten.

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Protocol

1. Inbetriebnahme des Lasersystems

  1. Prüfen Sie, ob die Temperatur der Kühler bei oder unter 20 °C gehalten wird.
  2. Prüfen Sie, ob die Feuchtigkeitskontrolleinheit ordnungsgemäß funktioniert und die Luftfeuchtigkeit bei etwa 40 % gehalten wird.
  3. Schalten Sie den Ti:Sa-Laser ein und folgen Sie dabei den Anweisungen im Handbuch.
  4. Stellen Sie die Wellenlänge auf 810 nm ein.
  5. Schalten Sie den OPO und den angeschlossenen Minicomputer ein. Führen Sie die Anwendung aus, die den OPO-Laser steuert.
  6. Wählen Sie Bypass aus, wenn am Ausgang des OPO-Feldes 100 % des Ti:Sa-Laserausgangs erforderlich ist.
  7. Deaktivieren Sie Bypass, wenn 20 % der Ti:Sa-Laserausgabe und der OPO-Laserausgabe am Ausgang der OPO-Box erforderlich sind.
  8. Öffnen Sie den Verschluss von Ti:Sa und lassen Sie den Ti:Sa-Strahl an den OPO-Eingang an.
  9. Lösen Sie die beiden Laserstrahlen am OPO-Ausgang, indem Sie auf Signalausgang und Auspumpenklicken.
  10. Warten Sie, bis die beiden Laser Ti:Sa und OPO stabilisiert sind (ca. 45-60 min).
  11. Überprüfen Sie den Strahlfleck am Ausgang des OPO-Feldes für Ti:Sa und OPO mit einer Papierdetektorkarte und überprüfen Sie die Stromversorgung mit einem Netzmesser.
  12. Stellen Sie die OPO-Laserwellenlänge auf 1076 nm ein.
  13. Reduzieren Sie die Leistung für jeden Laserstrahl auf 10 mW, um die Ausrichtung durchzuführen.

2. Einrichten des Mikroskops

  1. Implementierung der Hochfrequenz-Modulationsübertragungsmethode
    1. Führen Sie das optische Ausrichtungsverfahren des Modulators so aus, dass der Ti:Sa-Strahl ohne Verzerrung ein- und ausfährt.
    2. Schalten Sie den Funktionsgenerator ein und erzeugen Sie ein TTL-Signal (Quadratwelle mit Amplitude = 5 V, Offset = 2,5 V, Frequenz = 5 MHz).
    3. Teilen Sie das TTL-Signal mithilfe einer T-Kreuzung in zwei Teile auf; eine für eOM und die andere für den Lock-in-Verstärker (LIA) (siehe Abbildung 2).
    4. Überprüfen Sie alle Signalpegel mit einem Oszilloskop.
    5. Schalten Sie die LIA ein und schließen Sie den Generatorausgangskanal an den Referenzkanal der LIA an.
    6. Schließen Sie den Generatorausgangskanal an den Hochspannungsverstärker der EOM an.
    7. Schalten Sie den Verstärker ein und stellen Sie die Spannung auf fast den maximalen Pegel ein. Überwachen Sie die Strahlleistung am Ausgang der Wahlbeobachtungsmission.
  2. Integration der mechanischen Montage zur Befestigung von PD und Zuweisung von x und y relativer Bewegung
    HINWEIS: Mit dem Mikroskop wird eine externe Halterung eingeführt, die mit einem Mikrometer ausgestattet ist, das eine Bewegungssteuerung in x- und y-Richtung bietet.
    1. Montieren Sie zwei Reiseübersetzungsstufen, um Bewegungen entlang der x- und y-Richtung zu ermöglichen (siehe Abbildung 3).
    2. Befestigen Sie die Bühne auf einem 1,5-"-Pfosten mit entsprechender Höhe.
    3. Montieren Sie die PD an einer externen Halterung.
    4. Maximieren Sie die Strahlleistung bei PD, indem Sie die PD-Positionen (x- und y-Koordinaten) mit den Mikrometern anpassen, die an der Halterung befestigt sind (siehe Abbildung 3).

3. Ausrichtung des Mikroskops

  1. Räumliche Überlappung der Balken
    HINWEIS: Unter Berücksichtigung des OPO-Strahls als Referenz und unter Ausnutzung eines positionsempfindlichen Detektors sollte der Ti:Sa nach dem folgenden Verfahren mit oPO überlappt werden:
    1. Richten Sie die OPO- und die Ti:Sa-Laserstrahlen so aus, dass sie beide das Mikroskop erreichen.
    2. Platzieren Sie die Laserstrahlpositionssensoren detektoren in zwei Positionen zwischen dichroitischem Spiegel 1 und Spiegel 6, die erste Position befindet sich in der Nähe des dichroitischen Spiegels 1 und die zweite befindet sich in der Nähe von Spiegel 6. Verwenden Sie für jede Position die Sensoren, um die x- und y-Koordinaten des OPO-Strahls zu erkennen (folgen Sie Abbildung 1).
    3. Stellen Sie sicher, dass die x- und y-Koordinaten des Ti:Sa-Laserstrahls in beiden Positionen der Sensordetektoren identisch sind. Wenn an einigen Stellen die Koordinaten von Ti:Sa und OPO nicht übereinstimmen, stimmen Sie die Neigung des angrenzenden Spiegels ab, um die Differenz auszugleichen (folgen Sie Abbildung 1).
    4. Gehen Sie wie folgt vor, um die Ti:Sa-Balkenpositionen in Bezug auf OPO für den Pfad zwischen M6-M7 auszurichten (folgen Sie Abbildung 1).
  2. Zeitliche Synchronisation der Träger
    1. Verwendung der schnellen Photodiode plus Oszilloskop:
      1. Stoppen Sie die Ausbreitung der Ti:Sa- und OPO-Strahlen und stellen Sie einen schnellen Detektor vor den OPO-Strahl (zwischen M6 und M7).
      2. Schließen Sie das von der Ti:Sa-Laserbox bereitgestellte Triggersignal mit einem Oszilloskop in Kanal 2 an.
      3. Verbinden Sie das Detektorkabel mit dem Oszilloskop in Kanal 1 und visualisieren Sie das OPO-Zeitprofil.
      4. Zeichnen Sie die Zeit (Abscissa) auf, die mit dem Oszilloskop gemessen wird, das seinem Maximalwert, nämlich t1, entspricht.
      5. Stoppen Sie den OPO-Strahl und lassen Sie den Ti:Sa-Strahl los.
      6. Visualisieren Sie das zeitliche Profil Ti:Sa und zeichnen Sie die Zeit (Abszisse) auf, die ihrem Maximalwert, nämlich t2, entspricht.
      7. Minimieren Sie den Unterschied zwischen t1-t2 mithilfe der Verzögerungslinie, um die beiden Träger zu überlappen. In unserem Fall beträgt die minimale messbare Differenz 10 ps.
      8. Entfernen Sie den schnellen Detektor zwischen M6 und M7.
    2. Verwendung des Autokorrelators:
      HINWEIS: Im Schaltplan in Abbildung 1 wird ein Autokorrelator installiert, ohne die optischen Pfade der Strahlen zu stören. Zusätzlich wird ein zusätzlicher Spiegel eingeführt und auf einer Flip-Flop-Halterung (ffM/AM) zwischen M6 und M7 montiert, um den Strahl in den Autokorrelator umzuleiten.
      1. Drehen Sie den AM, um den Strahl in den Autokorrelator zu lenken.
      2. Stoppen Sie die Ti:Sa und lassen Sie den OPO.
      3. Stellen Sie das Strahlabstands-Schraubmikrometer des Autokorrelators auf Normalstellung (8,35 mm) ein.
      4. Schalten Sie den Autokorrelator-Controller ein und starten Sie die Softwareanwendung auf dem PC, der ihn steuert.
      5. Projizieren Sie den OPO-Strahl von FFM/AM auf den Eingangsspiegel in den Autokorrelator.
      6. Steuern Sie den Reflexionspunkt (mit einer Papierdetektorkarte) des Strahls am Ausrichtungsfenster des Autokorrelators.
      7. Bei Einer No-Beam- oder Low-beam-Intensität stellen Sie die Position und Ausrichtung von FFM/AM optimal ein und versuchen Sie, den Eingangsspiegel (am Autokorrelator montiert) einzustellen, um das Laserpulssignal zu maximieren. Das Autokorrelatorsignal wird wie in Abbildung 5adargestellt erhalten.
      8. Stoppen Sie den OPO und das Projekt des Ti:Sa-Strahls von FFM/AM, um den Spiegel in den Autokorrelator einzugeben. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.2.6 und 3.2.2.7. Das Autokorrelatorsignal wird wie in Abbildung 5bdargestellt erhalten.
      9. Stellen Sie das Strahlabstands-Schraubmikrometer auf Kreuzposition (7,30 mm) ein.
      10. Lösen Sie beide Strahlen.
      11. Scannen Sie die Verzögerungslinie, um die beiden Überblendungen OPO und Ti:Sa zu erhalten. Das Kreuzkorrelatorsignal wird wie in Abbildung 6dargestellt erhalten.
      12. Drehen Sie den Spiegel FFM/AM, so dass die Strahlen M7 erreichen und den Kopf des Mikroskops scannen können.
  3. Mikroskopausrichtung
    1. Führen Sie die mikroskopische Beobachtung von weißem Licht durch:
      HINWEIS: Stellen Sie vor der mikroskopischen Beobachtung sicher, dass das Mikroskop richtig ausgerichtet ist.
      1. Bereiten Sie die Probe vor, die aus einer Phosphatpufferlösung besteht, bei der Polystyrolperlen mit Durchmessern von 3 m dispergiert werden. Die Lösung wird in einem Sandwich aus zwei Glasrutschen platziert.
      2. Schalten Sie das Mikroskop und die Stromversorgung von weißem Licht ein. Folgen Sie dem Handbuch für die Beobachtung unter weißem Licht.
      3. Verwenden Sie einen Kondensator, um die Probe zu beleuchten. Verwenden Sie Ziel von 60x, um Licht zu sammeln. Legen Sie das Sample auf die Bühne. Optimieren Sie die Brennposition des 60x Mikroskopobjektivs.
      4. Wählen Sie den FOV aus, der von Interesse ist. Nehmen Sie ein CCD-Bild des Beispiels (Abbildung 7).
      5. Schalten Sie die Stromversorgung von weißem Licht aus.
    2. Mikroskopausrichtung mit Femtosekundenlaserstrahlen: OPO und Ti:Sa
      1. Entfernen Sie den Kondensator mit der Escape-Taste, um die 60-fache Mikroskopobjektivlinse vorübergehend zurückzuziehen. Bewegen Sie die 60x Mikroskopobjektivlinse vom optischen Pfad und drehen Sie das Nasenstück.
      2. Montieren Sie den Detektor mit der externen mechanischen Halterung am oberen Teil des Mikroskops. Schließen Sie den Detektorausgang über einen Tiefpassfilter von 50" an oszilloskopund an und überwachen Sie das OPO-Signal.
      3. Schalten Sie den Prozessor ein, der den Scannerkopf steuert. Projizieren Sie den OPO-Strahl in den Scannerkopf des Mikroskops.
      4. Überprüfen Sie die Position des Strahls im Mikroskop, stellen Sie sicher, dass sich die Position des Strahls in der Mitte oder in der Nähe des Zentrums befindet.
      5. Überprüfen Sie, ob sich die Position des Balkens im Kopf von PD in der Mitte befindet.
      6. Maximieren Sie die vom Detektor gemessene Leistung mit einem x-y-Übersetzer.
      7. Schalten Sie den Strahl von OPO auf Ti:Sa um und stellen Sie sicher, dass auch für den Titan-Saphir-Laser ein maximales Signal erreicht wird. THis zeigt an, dass beide Träger gut ausgerichtet sind.
      8. Finalisieren Sie die Strahlausrichtung, führen Sie die 60x Mikroskopobjektivlinse ein und drehen Sie das Nasenstück zurück.
      9. Verwenden Sie die Refokus-Taste am Mikroskop, um den endgültigen Fokus auf die 60-fache Mikroskopobjektivlinse wiederzuerlangen.
      10. Platzieren Sie das Objektiv mit vergrößerung 40x an Stelle des Kondensators, ohne die Probe zu berühren oder zu stören.
  4. Optimierung räumlicher und zeitlicher Synchronisationen von Trägern
    1. Zeitliche Synchronisierung
      1. Stellen Sie die Leistung von Ti:Sa und OPO vor dem Mikroskop auf 30 mW für beide Strahlen ein. Stellen Sie die Wellenlänge des OPO in Bezug auf den vorherigen wert, so dass Pumpe und Sonde nicht in Resonanz mit der Schwingungsfrequenz der Perlen sind.
      2. Lassen Sie beide Strahlen (Ti:Sa und OPO) so los, dass sie in das Mikroskop gelangen.
      3. Führen Sie die Computer-Übersetzung scanngesteuert aus, und zeichnen Sie die gemessene Intensität durch LIA für jede Position der Verzögerungszeile auf. Warten Sie, bis der Scan der Verzögerungszeile abgeschlossen ist. Das erhaltene zeitliche Profil wird in Abbildung 8avisualisiert.
      4. Stellen Sie die Wellenlänge des OPO wieder auf 1076 nm ein, so dass Pumpe und Sonde mit der Schwingungsfrequenz der Perlen in Resonanz sind. Wiederholen Sie Schritt 3.4.1.3 (das erhaltene zeitliche Profil wird in Abbildung 8bvisualisiert).
      5. Legen Sie die erhaltene Überlappungsstrahlposition in der Verzögerungslinie fest, um SRS-Bilder zu erfassen.
    2. Räumliche Synchronisation der Träger
      HINWEIS: Die Übertragungsbilder sind nützlich, um die FOV-, Beleuchtungs- und Brennposition der Mikroskopobjektive zu optimieren und zu überprüfen, ob die beiden Strahlen räumlich überlappend sind.
      1. Übertragungsbildaufnahme von OPO
        1. Stoppen Sie den Ti:Sa-Strahl und reduzieren Sie die OPO-Leistung auf 8 mW.
        2. Schließen Sie den Detektorauslesung an die Datenerfassungskarte an.
        3. Führen Sie das Datenerfassungsprogramm zusammen mit der Rasterkonsole aus.
        4. Speichern Sie die Datei, und verarbeiten Sie die Daten, um das Bild abzubekommen. Das Rohbild wird wie in Abbildung 9adargestellt angezeigt.
      2. Übertragungsbildaufnahme von Ti:Sa
        1. Stoppen Sie den OPO-Strahl und reduzieren Sie die Leistung von Ti:Sa auf 2,5–4,5 mW.
        2. Verbinden Sie den Detektor mit LIA- und LIA-Auslesungen mit der Datenerfassungskarte.
        3. Wiederholen Sie die Schritte 3.4.2.1.3 und 3.4.2.1.4. Das Rohbild wird wie in Abbildung 9bdargestellt angezeigt.

4. SRS Bildaufnahme

HINWEIS: Es wurde ein dedizierter Algorithmus zum Speichern von Daten implementiert. Es unterstützt die folgenden Bildformate: 512 px x 512 px und 256 px x 256 px, mit Erfassungszeiten von 16 s, 8 s, 4 s und 2 s.

  1. Führen Sie einen Stapel von Filtern zwischen dem 40x Objektiv und PD ein, um die Pumpenimpulse (Ti:Sa) zu entfernen und nur das Stokes-Signal (OPO) zu erfassen.
  2. Stellen Sie das Pumpensignal auf 810 nm mit einer fokussierten Leistung von 8 mW und das Sondensignal auf 1076 nm mit einer fokussierten Leistung von 8 mW, um eine typische C-H-Bindung von Polystyrol zu untersuchen (Raman-Verschiebung von 3054 cm).
  3. Verbinden Sie den Detektor mit dem LIA- und LIA-Auslesen an der Datenerfassungskarte.
  4. Legen Sie das Pixelformat für die Bildaufnahme gemäß Anforderung fest, und legen Sie die Erfassungszeit fest.
  5. Führen Sie das Programm aus, das den Mikroskopcontroller steuert.
  6. Führen Sie das dedizierte Algorithmusprogramm aus, das als Synchronisation zwischen Mikroskop-Controller, Erkennungssystem und Datenerfassung fungiert (siehe Abbildung 4).
  7. Speichern Sie die Matrixdatei, sobald die Erfassung abgeschlossen ist.
  8. Importieren Sie die Rohdatendatei und speichern Sie das Bild im erforderlichen Format (in der Regel im .tif-Format gespeichert) mit ImageJ-Software. Das Bild ist in Abbildung 10dargestellt.

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Representative Results

Ein Beispiel für die SRS-Messung (d. h. die SRS-Messung an einem einzelnen Punkt der Stichprobe) ist in Abbildung 7dargestellt. Wenn die Balken nicht zeitlich oder räumsfrei überlappen, wird das erhaltene Ergebnis in Abbildung 8adargestellt. Bei Off-Resonanz ist die von LIA gemessene Amplitude des Signals Null, während die von LIA gemessene Signalphase zwischen negativen und positiven Werten springt. Während die Balken im Raum überlappen und die Verzögerungslinie in einen geeigneten Bereich verschieben, werden die erzielten Ergebnisse in Abbildung 8bdargestellt. Das von LIA gemessene Signal erhöht sich und erreicht sein Maximum, wenn die Strahlen in der Zeit perfekt überlappen, während die Phase beginnt, einen festen Wert während der Zeit zu erreichen, in der die Strahlen in der Zeit überlappen.

Die Absorptionsbilder, die mit einem einzigen Strahl (Ti:Sa oder OPO) der gleichen Polystyrolperlen erhalten wurden, sind in Abbildung 9a,b mit Skalenstäben von 6 m dargestellt. Um die SRS-Bilder zu erfassen, wird die Verzögerungslinie auf die in Abbildung 7berreichte Position eingestellt, ein typisches SRG-Bild ist in Abbildung 10 mit einem Maßstabsbalken von 6 m dargestellt.

Figure 1
Abbildung 1: Schematisches Layout des f-SRS-Mikroskopsystems. OPO = optischer parametrischer Oszillator; Ti:Sa = Titan-Saphir-Laser; M1-M7= Femtosekunden-Breitbandspiegel; FFM/AM = Flip-Flop Spiegel/ Autokorrelator Spiegel;  DM1, DM2 = dichroitische Spiegel; DL = Verzögerungslinie; AC = Autokorrelator ; EOM = elektro-optischer Modulator; FG = Funktionsgenerator; GM = Galvo Spiegel; Obj1, Obj2 = Mikroskopobjektive; PD = Photodiode; Datenerfassungssystem ; PC = PC. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Schema der Hochfrequenzmodulationsübertragungsmethode. In der Einset-Figur werden die beiden Laserstrahlen vor der Interaktion innerhalb der Probe und modifizierte Sonde aufgrund von Wechselwirkungen zwischen Sonde und Pumpe innerhalb der Probe dargestellt. Die Zeit wird in ns dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Darstellung der Photodiodenhalterung mit mechanischem Montagesystem. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Schematic des Datenerfassungssystems. PD = Photodiode, LIA = Einsperrverstärker, DS = Detektionssystem, MC = Mikroskopsteuerung, DAQ= Datenerfassungssystem, PC = Pc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Autokorrelatorfunktion von OPO (a) und Ti:SA (b). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Kreuzkorrelationsfunktion von OPO und Ti:Sa. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 7: CCD-Bild von Polystyrolperlen.

Figure 7
Abbildung 8: Amplitude und Phase des SRS-Signals gemessen durch Einsperrverstärker: Abresonanz (links) und Resonanz (rechts) . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9: Übertragungsbilder von Polystyrolperlen, die von OPO (a) und Ti:Sa (b) erreicht werden. Maßstabsleiste = 16 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 10
Abbildung 10: SRS-Bild von Polystyrolperlen. Skalenbalken = 12 m.

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Discussion

Die SRS-Mikroskopie hat die etikettenfreie Bildgebung in neue Höhen gehoben, insbesondere in Studien komplexer biologischer Strukturen wie Lipide, die für Zellen und zelluläre Architektur von grundlegender Bedeutung sind. Lipide sind an mehreren physiologischen Wegen wie der Produktion biologischer Membranen beteiligt und dienen als biosynthetische Vorläufer und Signalwandler10. Lipide werden in spezialisierte intrazelluläre Organellen verpackt, auch Lipidtröpfchen (LDs) genannt. Ihre Durchmesser variieren von wenigen Dutzend Nanometern bis zu Dutzenden von Mikrometern11,12. LDs nehmen nicht nur reichlich an fett- und steroidproduzierenden Zellen teil, sondern sind auch in anderen Zelllinien vorhanden. LDs arbeiten in mehreren physiologischen Prozessen wie Lipidspeicherung zusammen. Sie sind prominent in gemeinsamen Pathologien (z.B. veränderter Cholesterinstoffwechsel)13,14gekennzeichnet.

Traditionell wird die Visualisierung von Lipiden mittels Fluoreszenzmikroskopie und neutralen lipidspezifischen, mit Farbstoffen gekennzeichneten festen Zellen10erreicht. Es sollte beachtet werden, dass, da Lipide kleiner im Vergleich zu Proteinen und DNA sind, strukturelle und funktionelle Veränderungen und unerwünschte Artefakte auftreten können, wenn Fluorophore15,16hinzugefügt werden. SRS hat sich als leistungsfähig für das Studium von lipidreichen Strukturen erwiesen. Lipide sind in C-H2 Gruppen reichlich vorhanden. Daher bieten die relativ isolierten Spitzen, die mit C-H-Bindungsschwingungszuständen bei 2845 cm-1 in ihren Raman-Spektren verbunden sind, eine einzigartige Signatur für Lipide innerhalb einer Zelle. Da die differenzierbaren Schwingungssignaturen endlich sind, ist es leider eher schwierig, ein Zielbiomolekül von den anderen verwandten Arten innerhalb von Zellen zu unterscheiden, die ähnliche chemische Bindungen aufweisen. Es ist jedoch möglich, winzige Raman-aktive Schwingungssonden (z.B. Alkyne und stabile Isotope) hinzuzufügen, um Spezifität für die Abbildung kleiner Biomoleküle zu erhalten17.

Für biologische und biomedizinische In-vivo-Anwendungen ist die gleichzeitige Kartierung verschiedener chemischer Arten in einer bestimmten Probe notwendig, um die Koverteilung und die dynamischen Korrelationen zwischen Denkomolekülen18,19zu investieren. Daher wurden viele Anstrengungen unternommen, um mehrere chemische Kontraste zu erhalten. Bei der einfachsten Option der mehrfarbigen Bildgebung, um verschiedene Raman-Modi einer Probe abzubilden, wird die Frequenz des Pumpenstrahls oder Stokes-Strahls in sequenziellen Scans18abgestimmt. Die Verwendung des Wellenlängenoptimierungsansatzes kann jedoch zu einem Verlust von Informationen zur Kolokalisierung verschiedener Raman-Modi führen, insbesondere wenn sich die Probe in einer dynamischen Umgebung befindet18.

Als Folge der nichtlinearen Anregung bietet SRS intrinsische 3D-Auflösungsfähigkeiten der ausgewählten chemischen Bindung innerhalb biologischer Proben20. Die Volumenrekonstruktion der ausgewählten chemischen Bindung und ihrer räumlichen Verteilungen kann einfach durch Dasinsatomieren von SRS-Bildern auf unterschiedlicher Brennebene entlang der Z-Achse erreicht werden. Da die Bilder mit hohen räumlichen und zeitlichen Auflösungen aufgenommen werden, können weitere Wichtige Informationen (z.B. 3D-Struktur, chemische Zusammensetzung usw.) über die biologische Probe gewonnen werden.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Wir schätzen V. Tufano von IMM CNR für seine wertvolle technische Unterstützung und Giacomo Cozzi, Produktspezialist von Nikon Instruments, für nützliche Diskussionen und kontinuierliche Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise von den italienischen Nationalen Operativen Programmen PONa3 00025 (BIOforIU) und dem großangelegten europaweiten Forschungsinfrastrukturprojekt Euro-Bioimaging unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acquisation tool Nikon Nikon C2Tool Acquisation supported tool
APE Pulse link control software APE- APE Pulse link control software software control
Autocorrelator APE APE PulseCheck USB 50 Autocorrelator
Detector Thorlabs Thorlabs DET10A Photodiode
Detector card Thorlabs Thorlabs VRC IR detector Card
Dichroic mirror Semrock Semrock FF875-Di01-25X36 Dichroic mirror
Dichroic mirror Semrock FF875-Di01-25x36 Dichroic mirror
EOM Conoptics (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). Pockels cell
Fast detector Thorlabs Thorlabs DET025AL/M Photodiode
Fast mirror scanning unit Nikon C2 Microscpe scanning head
Femtosecond laser Ti:SA Coherent Coherent Chameleon Ultra II Chameleon Ultra II
Function generator TTi TG5011 AIM – TTi Function generator
Inverted optical microscope Nikon Eclipse TE-2000-E, Nikon Eclipse TE-2000-E, Nikon
Lock-in Amplifier Standford Research System SR844-200 MHz dual phase A lock-in amplifier from Stanford Research Systems
Notch filter, Semrock NF03-808E-25 Notch filter
Optical delay line Newport Newport M-ILS200CC Tunable optical delay line
Optical Parametric Oscillator Coherent Coherent Compact OPO Coherent Compact OPO
Oscilloscope WaveRunner 640Zi 4GHz OSC/LeCroy Digital Oscilloscope
PCI Card National instrument NI PCIe 6363 Data acquisation card
Position Sensors Detectors Newport Newport Conex PSD9 Position detector sensor
Power meter head Coherent PowerMax PM10, Laser power detector
Translation Stages Thorlabs Thorlabs PT1/M Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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