तिल्ली कोशिका जीवविज्ञान और प्रत्यारोपण प्रतिरक्षा का अध्ययन करने के लिए Vascularized विषमविषय तिल्ली प्रत्यारोपण के एक माउस मॉडल

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Summary

इस प्रोटोकॉल के एक माउस मॉडल के सर्जिकल कदम का विवरण vascularized विषम विषय तिल्ली प्रत्यारोपण, एक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण मॉडल है कि भाग्य और तिल्ली की कोशिकाओं की दीर्घायु का अध्ययन करने में एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं, अलग तिल्ली के तंत्र रोग प्रगति में सेल आबादी, और प्रत्यारोपण प्रतिरक्षा ।

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Wang, J. J., Qiu, L., Fernandez, R., Yeap, X. Y., Lin, C. X., Zhang, Z. J. A Mouse Model of Vascularized Heterotopic Spleen Transplantation for Studying Spleen Cell Biology and Transplant Immunity. J. Vis. Exp. (148), e59616, doi:10.3791/59616 (2019).

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Abstract

तिल्ली एक अद्वितीय लिम्फोइड अंग है जो प्रतिरक्षा और hematopoietic प्रणाली के homeostasis में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । रोगियों है कि splenectomy कारण precipitating कारणों की परवाह किए बिना एक भारी के बाद splenectomy संक्रमण विकसित करने के लिए प्रवण हैं और गहरी शिरापरक घनास्त्रता और malignancies के जोखिम में वृद्धि का अनुभव. हाल ही में, महामारी विज्ञान के अध्ययनों से पता चला कि splenectomy हृदय रोगों की घटना के साथ जुड़ा हो सकता है, सुझाव है कि तिल्ली के शारीरिक कार्यों अभी तक पूरी तरह से मान्यता प्राप्त नहीं किया गया है. यहां, हम एक माउस मॉडल के vascularized विषमविषय तिल्ली प्रत्यारोपण, जो न केवल समारोह और प्लीहा प्रतिरक्षा सेल सबसेट के विभिंन जीवविज्ञान प्रक्रियाओं में व्यवहार गतिविधि का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता परिचय, लेकिन यह भी एक शक्तिशाली उपकरण परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है कुछ रोगों में प्लीहा प्रत्यारोपण की चिकित्सीय क्षमता. इस मॉडल के मुख्य शल्य चिकित्सा कदम दाता तिल्ली फसल, प्राप्तकर्ता मूल तिल्ली को हटाने, और तिल्ली भ्रष्टाचार revascularization शामिल हैं । Congenic माउस उपभेदों का उपयोग करना (उदाहरण के लिए, सीडी-2/सीडी 45.2 पृष्ठभूमि के साथ चूहों), हम ने कहा कि syngeneic प्रत्यारोपण के बाद, दोनों दाता-प्लीहा लसीकाणु और माइलॉयड कोशिकाओं को भ्रष्टाचार से बाहर चले गए के रूप में के रूप में जल्दी के बाद ऑपरेटिव दिन 1, सहवर्ती प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के कई प्रकार के प्रवाह, इस प्रकार एक अद्वितीय कल्पना पैदा ।  अपेक्षाकृत चुनौतीपूर्ण तकनीकों के बावजूद, इस प्रक्रिया > 90% सफलता दर के साथ किया जा सकता है । इस मॉडल के भाग्य, दीर्घायु ट्रैकिंग, और स्थिर राज्य के दौरान और एक रोग एक तिल्ली प्रत्यारोपण के बाद की स्थापना में splenocytes के समारोह की अनुमति देता है, जिससे तिल्ली के लिए विशिष्ट भूमिका की खोज करने के लिए एक महान अवसर की पेशकश-प्रतिरक्षा कोशिकाओं में व्युत्पन्न विभिन्न रोग प्रक्रियाओं ।

Introduction

तिल्ली शरीर में सबसे बड़ा द्वितीयक लिम्फोइड अंग है और प्रतिरक्षा और hematopoietic सिस्टम में महत्वपूर्ण है । इसके कार्य मुख्यतः दो आकृति विज्ञान के विशिष्ट डिब्बों, लाल लुगदी और सफेद पल्प1द्वारा किए जाते हैं । लाल पल्प शिरापरक साइनस और प्लीहा डोरियों के तीन आयामी meshwork है कि एक प्रकार का तंतुक फाइबर, जालीदार कोशिकाओं से मिलकर बनता है, और जुड़े macrophages । इस अनूठी संरचना लाल लुगदी एक प्रभावी रक्त फिल्टर है कि विदेशी सामग्री और पुराने या क्षतिग्रस्त एरिथ्रोसाइट्स को हटा के रूप में कार्य करने के लिए अनुमति देता है । सफेद लुगदी कूप, सीमांत क्षेत्र, और periarteriolar लसीकापूर्ण आवरण (PALS) भी शामिल है और प्रतिजन फंसाने और प्रसंस्करण के लिए एक महत्वपूर्ण साइट है, लिम्फोसाइट homing, परिवर्तन, प्रसार, और परिपक्वता2. फिर भी, तिल्ली आमतौर पर एक अनावश्यक अंग के रूप में माना जाता है, क्योंकि अन्य लसीका अंगों, लिम्फ नोड्स के रूप में, अपने कार्यों में से कुछ को ले जा सकते हैं और तिल्ली की हानि आमतौर पर मौत के लिए नेतृत्व नहीं करता है. Splenectomy इसलिए व्यापक रूप से प्लीहा चोट या सौम्य hematologic रोगों के साथ रोगियों के लिए एक चिकित्सकीय विधि के रूप में प्रदर्शन किया गया है3. हालांकि, splenectomy के साथ रोगियों को दीर्घकालिक जटिलताओं के एक नंबर का सामना. बैक्टीरियल संक्रमण splenectomy की सबसे अच्छी पहचान की जटिलताओं हैं4,5. हाल ही में, भारी पोस्ट-splenectomy सेप्सिस splenectomy की एक गहन जटिलता के रूप में मांयता प्राप्त किया गया है एक उच्च मृत्यु दर के साथ जुड़े6. इसके अलावा, हाल ही में महामारी विज्ञान के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि splenectomy हृदय रोगों की घटना के साथ जुड़ा हो सकता है, सुझाव है कि आगे तिल्ली के शारीरिक कार्यों7,8का पता लगाया जा करने के लिए रहते हैं.

दोनों तिल्ली autotransplantation और तिल्ली एलोट्रांसप्लांटेशन क्लिनिक में उपयोग किया गया है. वर्तमान में, प्लीहा अधिक ओमेन्टम में बनाया पाउच में प्लीहा ऊतक के वर्गों दाखिल द्वारा तिल्ली autotransplantation दर्दनाक splenectomy9,10के बाद प्लीहा समारोह के संरक्षण के लिए ही संभावना के रूप में माना जाता है. हालांकि, इस सर्जरी की प्रभावकारिता प्लीहा ऊतक और पश्चात के आसंजन के कारण छोटे आंत्र रुकावट के अपूतित परिगलन की तरह शल्य चिकित्सा जटिलताओं के बाद के रूप में बहस का मुद्दा11हो सकता है । तिल्ली एलोट्रांसप्लांटेशन मल्टीआंत प्रत्यारोपण12में शामिल है. Multivisceral प्रत्यारोपण से नैदानिक सबूत पता चलता है कि तिल्ली allotransplantation भ्रष्टाचार के कारण के बिना छोटे आंत्र allotransplantation अस्वीकृति में एक सुरक्षात्मक भूमिका निभा सकते है बनाम-मेजबान रोग (GVHD)12। फिर भी मल्टीआंत प्रत्यारोपण के एक घटक के रूप में तिल्ली एलोट्रांसप्लांटेशन के लाभकारी प्रभाव के बारे में साहित्य अभी तक सीमित है और अंतर्निहित तंत्र को परिभाषित किया जा करने के लिए रहते हैं. २००६ में, yair reisner एट अल. की रिपोर्ट है कि सुअर भ्रूणीय तिल्ली ऊतक कि चूहों को कोई टी कोशिकाओं है हीमोफीलिया एक इलाज सकता है, एक आनुवंशिक रोग gvhd13के कारण बिना, कि तिल्ली प्रत्यारोपण समर्थन में चिकित्सकीय वादा रखती है कुछ रोगों । इसलिए, प्लीहा प्रत्यारोपण की चिकित्सीय क्षमता पर आगे जांच की आवश्यकता है ।

तिल्ली प्रत्यारोपण के पशु मॉडल तिल्ली प्रत्यारोपण के संभावित उपचारात्मक प्रभाव का परीक्षण करने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रोग प्रगति में प्रतिरक्षा कोशिकाओं से व्युत्पन्न-प्लीहा के असराहना समारोह का पता लगाने के लिए मूल्यवान हैं. प्रयोगात्मक पूरे प्लीहा प्रत्यारोपण मॉडल जल्दी 1900s के बाद से प्रलेखित किया गया है, के रूप में कोहेन14द्वारा समीक्षित । १९६९ में, coburn रिचर्ड जे और ली एट अल. चूहों में तिल्ली प्रत्यारोपण की तकनीक विस्तृत15,16. हाल ही में, Swirski FK एट अल. तिल्ली प्रत्यारोपण17के एक माउस मॉडल का वर्णन किया । चूहा मॉडल की तुलना में, तिल्ली प्रत्यारोपण के माउस मॉडल अधिक अपने कई अंतर्निहित लाभों के कारण आकर्षक हैं. उदाहरण के लिए, एक माउस मॉडल का उपयोग करके, हम चूहा मॉडल के लिए अनुपलब्ध अभिकर्मकों की एक विशाल विविधता का उपयोग कर सकते हैं । इसके अलावा, congenic चूहों का उपयोग करके (उदाहरण के लिए, सीडी के साथ चूहों/सीडी 45.2 पृष्ठभूमि), एक syngeneic तिल्ली प्रत्यारोपण यह भाग्य, दीर्घायु, और splenocytes के समारोह को ट्रैक करने के लिए संभव बनाता है18. Swirski FK एट अल.17द्वारा काम के आधार पर, हम आगे चूहों में प्लीहा प्रत्यारोपण के इस सरलीकृत और बढ़ाया प्रोटोकॉल की स्थापना की । नीचे वर्णित प्रोटोकॉल एक मानकीकृत तरीके से दोनों विश्वसनीयता और व्यवहार्यता को जोड़ती है और एक उपकरण के लिए तिल्ली जीवविज्ञान और प्रत्यारोपण प्रतिरक्षा का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।

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Protocol

इस अध्ययन में सभी प्रक्रियाओं और पशु उपयोग नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय आंतरिक पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया । इस अध्ययन में, 8 से 10 सप्ताह के पुराने पुरुष सीडी 45.2 और सीडी (दोनों BALB/सी पृष्ठभूमि पर जैक्सन प्रयोगशाला से), क्रमशः तिल्ली दाताओं और प्राप्तकर्ताओं के रूप में इस्तेमाल किया गया, syngeneic तिल्ली प्रत्यारोपण मॉडल बनाने के लिए । नॉर्थवेस्टर्न यूनिवर्सिटी के एनिमल फैसिलिटीज में माहौल में सभी जानवर रखे गए थे । आंख स्नेहक सभी चूहों के लिए लागू किया गया था सूखापन को रोकने के लिए anesthetization ।

1. सर्जिकल तैयारी, संवेदनाहारी, और पीड़ाहारी आहार

  1. एक बाँझ डिस्पोजेबल कपड़ा (४५.७ सेमी x ६६ सेमी) सर्जिकल मंच पर रखें । धीरे से माउस को पकड़ो, केटामाइन (५० मिलीग्राम/किलो) और xylazine (10 मिलीग्राम/किलो) संज्ञाहरण के लिए intraperitoneally (i. p) इंजेक्षन, और ०.०५ मिलीग्राम/
  2. पैर की अंगुली से संज्ञाहरण की गहराई सुनिश्चित करें-चुटकी, एक रेज़र के साथ पूरे पेट क्षेत्र में बाल दाढ़ी और 6-10x इज़ाफ़ा पर ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के तहत बाँझ सर्जिकल मंच पर माउस जगह है ।

2. दाता प्लीहा हार्वेस्ट

  1. एक शराब तैयारी पैड के साथ पेट, सर्जिकल टेप के साथ अंगों को सुरक्षित, और कैंची के साथ असिरूप प्रक्रिया करने के लिए जघनरोम से एक 3-4 सेमी मिडलाइन ऊर्ध्वाधर त्वचा चीरा बनाते हैं ।
  2. पेंड्रोक्लिप्स से बने बाँझ रिट्रैक्टरों से उदर भित्ति को वापस लें । एक बाँझ कपास झाड़ू के साथ तिल्ली का पर्दाफाश करने के लिए पेट (सर्जन बाईं) की ओर सही पक्ष को आंतों हटो । कम गैस्ट्रिक नस एक बाँझ कम तापमान दाग़ना के साथ तिल्ली से जुड़ी cauterize (चित्र 1a). यह नम रखने के लिए तिल्ली के ऊपर ३७ ° c खारा के साथ लथपथ बाँझ धुंध का एक टुकड़ा रखें (चित्र 1b).
  3. अलग और अग्नाशय के ऊतकों से पोर्टल नस को जुटाने (चित्रा 1 सी) पोर्टल शिरा शाखाओं (बेहतर अग्नाशय की नस और सही गैस्ट्रिक नस) ligating द्वारा; प्लीहा शिरा से बाहर की ओर पोर्टल शिरा के आसपास एक सीवन रखें (चित्रा 1 डी).
  4. प्लीहा धमनी के साथ महाधमनी और सीलीएक ट्रंक को बेनकाब करने के लिए तिल्ली को दाईं ओर फ्लिप करें (चित्र 1E) । काटना और यकृत धमनी और गैस्ट्रिक धमनी ligating द्वारा aortic-सीलिएक-प्लीहा धमनी जुटाने; महाधमनी समीपस् था के चारों ओर एक सीवन को सीक् यूक आर्टरी में रखें (चित्र 1F-छ) ।
  5. पूरे शरीर heparinize और हेपरिन प्रभाव ले सुनिश्चित करने के लिए 3 मिनट प्रतीक्षा करने के लिए अवर वेंका कावा (ivc) में १०० अंतरराष्ट्रीय इकाइयों (आईयू) हेपरिन सुई । इस महाधमनी निकटस्थ को सीलिएक आर्टरी से बांधना, पोर्टल शिरा को ट्रांसेक्ट करना, और फिर पूरे शरीर को 10 मिलीलीटर हाइपैनिनीकृत शीत (4 ° ब्) लवणीय (10 मिली/
  6. संबद्ध महाधमनी-सीलीएक-प्लीहा खंड और पोर्टल शिरा प्लीहा नस और अग्नाशय के ऊतकों का एक छोटा सा हिस्सा के साथ साथ साथ ब्लॉक तिल्ली कलम इकट्ठा । प्रत्यारोपण से पहले 4 डिग्री सेल्सियस के 5 मिलीलीटर में भ्रष्टाचार को संरक्षित रखें । ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस euthanize ।

3. प्राप्तकर्ता Splenectomy और तिल्ली भ्रष्टाचार रोपण

  1. सर्जिकल मंच पर एक हीटिंग पैड प्लेस और ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए तापमान समायोजित करें । एक कपड़ा (४५.७ सेमी x ६६ सेमी) को हीटिंग पैड के शीर्ष पर एक बंधेल सर्जिकल मंच बनाने के लिए जगह है । चरणों को दोहराएं २.१ और २.२ शल्य चिकित्सा की तैयारी और anesthetization के लिए । एक 3-4 सेमी मिडलाइन चीरा बनाओ और पेट की दीवार को वापस लेने के रूप में चरण २.१ और चरण २.२ में वर्णित है ।
  2. ध्यान से एक बाँझ कपास झाड़ू के साथ प्राप्तकर्ता की तिल्ली बेनकाब करने के लिए माउस के दाईं ओर करने के लिए आंत ले जाएँ । प्लीहा शिरा और धमनी ligate और तिल्ली हटा दें ।
  3. सावधानी से आंत को माउस के बाईं ओर ले जाएँ और गीली धुंध के साथ आंतों को कवर करें (बाँझ ३७ ° c खारा) से लथपथ । इंफ्रारेनल महाधमनी और IVC की काठ की शाखाओं को काटना और लिगेट करना; दो 4 मिमी माइक्रोवैस्कुलर क्लैम्प्स का उपयोग करके इंफ्रारेनल महाधमनी और IVC को क्रॉस-क्लैंप करें ।
  4. इंफ्रारेनल महाधमनी (एक पूर्ण मोटाई) के माध्यम से एक 11-0 नायलॉन सीवन प्लेस और microscissors के साथ एक एकल कटौती से एक दीर्घवृत्तीय aortotomy बनाने के लिए वापस लेना (लंबाई दाता महाधमनी के व्यास से मेल खाना चाहिए, चित्रा 2a) । एक 30 ग्राम सुई का उपयोग कर एक दीर्घवृत्तीय venotomy बनाने और दाता पोर्टल शिरा-मिलान लंबाई microscissors का उपयोग करने के लिए खोलने का विस्तार करने के लिए IVC पियर्स (चित्रा 2a).
  5. इंट्राएल्युनियल ब्लड या ब्लड क्लॉट (महाधमनी और आईआरसी में) ५०० μL के साथ हेपैरीराइज्ड नमकीन (10 यूनिट/एमएल) को साफ करें ।
  6. तिल्ली कलम प्राप्तकर्ता माउस पेट के सही पार्श्व में प्लेस; डोनर के महाधमनी कफ और डोनर के पोर्टल नस को ध्यान से पहचानें । सुनिश्चित करें कि जहाजों मुड़ नहीं कर रहे हैं, के बाद ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) नमकीन के साथ लथपथ धुंध के साथ प्लीहा कलम को कवर ।
  7. प्राप्तकर्ता के aortaotomy के समीपस्थ और बाहर का शीर्ष करने के लिए है दाता महाधमनी कफ कनेक्ट दो रहने टांके के साथ (11-0 नायलॉन सीवन, नीचे के रूप में ही) (चित्र 2b, C) । दाता महाधमनी कफ और प्राप्तकर्ता के महाधमनी के बीच लगातार 11-0 नायलॉन टांके के 2-3 काटने के साथ एक शाखामिलन बनाओ (पूर्ववर्ती दीवार) (चित्र 2d) । तिल्ली कलम पर प्राप्तकर्ता के बाईं ओर करने के लिए बारी; डोनर के महाधमनी कफ और प्राप्तकर्ता के महाधमनी छेदन (पश्च भित्ति) (चित्र 2E) के बीच एनास्टोमोसिस करें ।
  8. दाता के पोर्टल नस को प्राप्तकर्ता के IVC के पीछे की दीवार से जोड़ने के लिए एक एनास्टोरोसिस का प्रदर्शन करें, IVC के अंदर पर लगातार टांके के 4 से 5 काटने का उपयोग करके और फिर आईवीसी के बाहर पर टांका बंद करें (चित्रा 2F, G) ।
  9. पोत clamps जारी है और बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करने के लिए खून बह रहा है जब तक तिल्ली का रंग (चित्रा 2H) बरामद किया है ।
  10. एक सतत पैटर्न में एक 5-0 सिंथेटिक अवशोषक vicryl सीवन के साथ पेट बंद करो । एक बाधित पैटर्न में एक 5-0 नायलॉन सीवन के साथ त्वचा की परत को बंद करें ।
    नोट: कदम के लिए 4.7-4.8, वैकल्पिक रूप से, दाता के पोर्टल नस और प्राप्तकर्ता के ivc पहले (कदम ४.८) के बीच एक शाखामिलन बनाओ; तब दाता महाधमनी कफ और प्राप्तकर्ता के aortotomy के पीछे की दीवार के बीच एक शाखामिलन बनाने के लिए, महाधमनी के अंदर में 2 से 3 लगातार टांके का उपयोग कर और महाधमनी के बाहर पर टांका बंद ।

4. पशु वसूली

  1. पेट बंद करने के बाद 4 अलग स्थानों (०.२५ मिलीलीटर/स्थान) के माध्यम से गर्म नमकीन के 1 मिलीलीटर को उपक्षकतापूर्वक सुई ।
  2. एक तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर (30 डिग्री सेल्सियस) में माउस रखें पहले कुछ घंटों के बाद आपरेशन, माउस की निगरानी जब तक यह पर्याप्त चेतना आ गया है, और फिर नियमित रूप से भोजन और पानी के साथ एक नया साफ पिंजरे के लिए माउस स्थानांतरण, एक हीटिंग पैड के साथ (30 ° c ) पिंजरे के नीचे । माउस पोस्ट-सर्जरी को अलग पिंजरे में रखें ।

5. पोस्ट सर्जिकल दर्द प्रबंधन

  1. इंजेक्शन लगाना ०.०५ मिलीग्राम/किग्रा बुप्रेनोमॉर्फिन उपचक्षण के बाद 24 घंटे और ४८ एच सर्जरी के लिए दर्दनाशक आहार बनाए रखने के लिए ।

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Representative Results

माउस प्लीहा प्रत्यारोपण की पूरी प्रक्रिया अनुभवी microsurgeons द्वारा ९० मिनट के भीतर पूरा किया जा सकता है । हमारी प्रयोगशाला चूहों में १०० तिल्ली प्रत्यारोपण पर प्रदर्शन किया है. सफलता की दर ९०% से अधिक है, के रूप में दोनों प्राप्तकर्ता माउस और प्लीहा भ्रष्टाचार के अस्तित्व के बाद से परिभाषित ऑपरेटिव दिवस (POD) 1 या POD 7 (हमारे अध्ययन समापन बिंदु) । प्लीहा कलम के अस्तित्व के स्थूल उपस्थिति और प्लीहा के प्रवाह कोशिका मिति विश्लेषण द्वारा पुष्टि की गई थी । हमारे अनुभव के आधार पर, प्रवाह कोशिका-मिति विश्लेषण (लाइव/मृत कोशिका व्यवहार्यता Assays हैं) बहुत ही प्लीहा यह निर्धारित करने के लिए कि एक प्लीहा कलम बच जाता है, तिल्ली की कोशिकाओं के बहुमत के रूप में मर जाएगा यदि तिल्ली grafts परिगलित थे संवेदनशील है. इस कार्यविधि की तकनीकी चुनौतियां, सामांय जटिलताएं, और उनकी समस्या निवारण तालिका 1में सारांशित की जाती हैं ।

भ्रष्टाचार आकारिकी का परीक्षण करने के बाद प्रत्यारोपण, हेमोटॉक्सिलिन और Eosin (H & E) धुंधला हो गया था और POD 1 और POD 7 पर BALB के तिल्ली isografts में किया गया । प्रतिनिधि चित्रों को चित्र 3में दर्शाया गया है । पहले पश्चात सप्ताह के दौरान प्लीहा isografts की वास्तुकला बरकरार रही । लाल लुगदी, सफेद लुगदी और सीमांत क्षेत्र अभी भी स्पष्ट और अलग पहचाना गया था । प्लीहा प्रत्यारोपण के बाद कोशिका प्रवास की जांच करने के लिए, प्रवाह कोशिका मिति फली 1 और फली 7 में तिल्ली isografts, लिम्फ नोड्स, रक्त, और अस्थि मज्जा में ल्यूकोसाइट्स के फीनोटाइप की जांच करने के लिए किया गया था. के रूप में चित्र 4aमें दिखाया गया, POD 1, ५१ ± 7% (मतलब ± एसडी, नीचे के रूप में ही) तिल्ली की कोशिकाओं के दाता थे-व्युत्पंन और ४६ ± 3% प्राप्तकर्ता-व्युत्पंन थे । POD 7 में, दाता-ल्यूकोसाइट्स व्युत्पंन ३२ ± कुल तिल्ली कोशिकाओं का 10%, और प्राप्तकर्ता-व्युत्पंन कोशिकाओं ५६ ± 13% तक थे । हम यह भी देखा कि तिल्ली ल्यूकोसाइट्स लिम्फ नोड्स में चले गए, रक्त, और अस्थि मज्जा के रूप में जल्दी 1 दिन और 7 दिन (चित्रा 4b) में बनाए रखा,

तालिका 1: समस्या निवारण विधियां ।

Figure 1
चित्रा 1: दाता तिल्ली फसल. () प्लीहा से जुड़ी छोटी जठर शिरा को काटेज़ करें । () इसे नम रखने के लिए तिल्ली के ऊपर बाँझ गर्म गीली जाली का एक छोटा टुकड़ा रखिए । () विच्छेदन और अग्न्याशय के पीछे पोर्टल नस अलग । () पोर्टल शिरा की साइड शाखाओं को लिगेट करें और पोर्टल शिरा को प्लीहा शिरा से बाहर करने के लिए टांका लगाएं । डैश्ड रेखाएँ प्राप्तकर्ता आईवीसी के साथ एनास्टोनोसिस के लिए बाद में प्रतिच्छेद स्थान का प्रतिनिधित्व करती हैं । () प्लीहा की धमनी सहित इसकी शाखाओं के साथ महाधमनी तथा सीलीएक ट्रंक का पर्दाफाश करने के लिए तिल्ली को उदर के दायीं ओर (शल्यचिकित्सक की बायीं) पर पलटें । () दो अन्य शाखाओं को ligating करके महाधमनी-सीलिएक-प्लीहा वाहिनी का विच्छेदन करना और उसे संगठित करना । () महाधमनी समीपस्थ के चारों ओर एक सीवन को सीसीलक आर्टरी में रखें । डैश्ड रेखाएँ बाद में प्राप्तकर्ता उदर महाधमनी के साथ एनास्टोनोसिस के लिए उपयोग किए जाने वाले स्थान का प्रतिनिधित्व करती हैं । () महाधमनी को ligating और पोर्टल शिरा को प्रतिच्छेशित करने के बाद महाधमनी के द्वारा 10 मिलीलीटर हेपारीकृत लवण के साथ प्लीहा की कलम लगाना । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: तिल्ली रोपण प्रत्यारोपण । () महाधमनी और आईबीसी में अलगाव और क्रास क्लैंपिंग के बाद, महाधमनी और आईवीओसी में क्रमश एक अनुदैर्ध्य महाधमनी छेदन और शिराछेदन करना । (ख-घ) तिल्ली का कलम पेट के दाहिने ओर रखें (शल्य चिकित्सक के बाईं ओर). दाता महाधमनी कफ और प्राप्तकर्ता के aortotomy के सामने की दीवार के बीच अंत करने वाली ओर शाखामिलन बनाओ, जारी सीवन के 2-3 काटने का उपयोग कर । () प्लीहा की कलम को प्राप्तकर्ता के बाईं पार्श्व में बदल दें; दाता महाधमनी कफ और प्राप्तकर्ता के aortotomy के पीछे की दीवार के बीच पिछले प्रक्रिया को दोहराएं और महाधमनी के बाहर पर टांका बंद । (एफ-जी) दाता पोर्टल नस और प्राप्तकर्ता के ivc के पीछे की दीवार के बीच एक अंत करने वाली ओर शाखामिलन बनाओ, ivc के अंदर में लगातार 11-0 नायलॉन सीवन के 4 से 5 काटने का उपयोग कर और फिर ivc के बाहर पर टांका बंद । () एनास्टोमोसिस को पूरा करने के बाद, बर्तन क्लैम्प्स छोड़ें और कुछ सूती कलियाँ रखें जिससे रक्तस्राव को रोकने में मदद मिल सके । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: दिन 1 और दिन 7 के बाद आपरेशन पर तिल्ली isografts के प्रतिनिधि ऊतक विज्ञान. Syngeneic तिल्ली प्रत्यारोपण BALB का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया/ तिल्ली isografts दिन पर काटा गया था 1 और 7 के बाद प्रत्यारोपण और ४८ h. h & E धुंधला के लिए 10% फॉर्मेलिन में तय पैराफिन एंबेडेड ऊतक अनुभाग का उपयोग किया गया था । प्रतिनिधि ऊतक विज्ञान से पता चलता है कि प्लीहा isografts 1 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण में बरकरार रहते हैं । स्केल पट्टी = २५० μm । फली, पोस्ट ऑपरेटिव दिवस । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: Syngeneic तिल्ली प्रत्यारोपण द्वारा बनाई गई कल्पना. तीन syngeneic तिल्ली प्रत्यारोपण दाताओं के रूप में balb/सी सीडी 45.2 चूहों और balb/ तिल्ली grafts, रक्त, लिम्फ नोड (एलएन), और प्राप्तकर्ता चूहों में अस्थि मज्जा (बीएम) 1 दिन और 7 के बाद प्रत्यारोपण पर काटा गया. कोशिकाओं के फीनोटाइप का विश्लेषण करने के लिए एकल कोशिका अलगाव और प्रवाह कोशिका मिति विश्लेषण किया गया । () प्रतिनिधि डॉट प्लॉट्स (लाइव सिंगलेट्स से गेटिंग) जिसमें दाता या प्राप्तकर्ता के प्रतिशत को दर्शाया जाता है — जो संकेत दिए गए नमूनों में ल्यूकोसाइट्स प्राप्त करते हैं । () दर्शाए गए नमूनों में दाता-व्युत्पन्न प्रकोष्ठों में निदष्ट आबादियों का प्रतिशत (माध्य ± SEM) दिन 1 और 7 दिन । फली = पोस्ट ऑपरेटिव दिन । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 1: प्रतिनिधि भूखंडों (n = 3) प्रतिरोपित तिल्ली, लिम्फ नोड, रक्त, और अस्थि मज्जा में प्राप्तकर्ता-व्युत्पन्न लिम्फोसाइटों बनाम के प्रतिशत दिखा. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 2: प्रतिनिधि भूखंड (n = 3) दाता के प्रतिशत-प्राप्तकर्ता बनाम व्युत्पंन-व्युत्पंन CD11b + Ly6C + प्रतिरोपित तिल्ली, लिम्फ नोड, रक्त, और अस्थि मज्जा में monocytes दिखा. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

संमोहक सबूत पता चलता है कि तिल्ली-monocytes बाँझ भड़काऊ प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं जैसे atherosclerosis के रूप में19, तीव्र इस्कीमिक मस्तिष्क20 या फेफड़ों की चोट18, साथ ही साथ मायोकार्डियल मैं/ remodeling21,22,23। इन रिपोर्टों के तहत कई पुराने रोगों, जिनमें से हृदय रोग एक महत्वपूर्ण एक है (विशेष रूप से यह संख्या में एक हत्यारा है विश्व स्तर पर है) में तिल्ली की मांयता भूमिका पर प्रकाश डाला । तिल्ली प्रत्यारोपण के माउस मॉडल के लिए तिल्ली की भूमिका की खोज करने के लिए एक महान अवसर प्रदान करता है-विभिन्न रोगों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं व्युत्पन्न के रूप में अच्छी तरह के रूप में कैसे वे तिल्ली में primed हैं. उदाहरण के लिए, प्लीहा प्रत्यारोपण के माउस मॉडल का उपयोग करके, swirski एट अल. पाया गया कि इस्कीमिक मायोकार्डियल चोट के जवाब में, तिल्ली व्युत्पंन monocytes उनकी गतिशीलता में वृद्धि, तिल्ली से बाहर विस्थापित, घायल ऊतक का पालन करें, और करने के लिए योगदान घाव भरने17। इसके अलावा, इस मॉडल को तिल्ली और अंतर्निहित तंत्र में परिपक्व प्रतिरक्षा कोशिकाओं की longeरोधकता पता करने के लिए उपयोगी है और प्लीहा प्रत्यारोपण के चिकित्सीय क्षमता का पता लगाने के लिए.

इस प्रोटोकोल की सफलता में सुधार लाने के लिए कई पहलुओं पर विचार किया जाना चाहिए । सबसे पहले, यह माउस वजन, तनाव के बाद से डिजाइन की प्रक्रिया के दौरान उचित प्रयोगात्मक पशुओं का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है, और स्वास्थ्य की स्थिति शल्य कदम और प्रयोगात्मक परिणामों की कठिनाई को प्रभावित कर सकता है । हमारी प्रयोगशाला 25 ग्राम से अधिक वजन के साथ 8 से 12 सप्ताह पुराने चूहों का उपयोग करने के लिए मृत्यु दर है कि खून बह रहा द्वारा कारण हो सकता है कम करने की सिफारिश की । दूसरा, तिल्ली फसल प्रक्रिया के दौरान, तिल्ली वाहिकाओं के बहुत अधिक हेरफेर आसानी से प्रजनन या वाहिकाकर्ष के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और संभवतः प्लीहा कलम में माइक्रो घनास्त्रता में परिणाम. सर्जरी से पहले माउस पेट के एनाटॉमी के साथ परिचित हो रही सीखने की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए उपयोगी होगा । तीसरा, प्राप्तकर्ता शल्य चिकित्सा के दौरान, तिल्ली भ्रष्टाचार हमेशा बनाए रखा जाना चाहिए नम और शांत । प्लीहा grafts के उचित संरक्षण प्रत्यारोपण ischemia को कम कर सकता/(I/R) चोट और प्रत्यारोपण के बाद भ्रष्टाचार की विफलता को रोकने के । इसके अलावा, विचार है कि शाखामिलन के लिए दाता जहाजों अपेक्षाकृत लंबे होते हैं, ठीक से पहले एनास्टोरोसिस वाहिकाओं के घुमा को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है तिल्ली grafts स्थिति । इसके अलावा, प्राप्तकर्ता महाधमनी और ivc के venotomy के व्यास हमेशा दाता महाधमनी और पोर्टल शिरा के उन लोगों के लिए तुलनीय होना चाहिए करने के लिए उचित रक्त प्रवाह को सुनिश्चित करने और thrombosis को रोकने.

4 ° ब् में तिल्ली ग्राफ्ट का औसत भंडारण समय लगभग 10 मिनट है । कुल इस्कीमिक समय से कम ५० मिनट तक सीमित होना चाहिए ंयूनतम प्रत्यारोपण विफलता सुनिश्चित करने के लिए । हम विस्कॉंसिन विश्वविद्यालय (uw) कोल्ड स्टोरेज समाधान का उपयोग करने के लिए प्लीहा कलम की रक्षा करने की सलाह देते हैं, अगर 1 से अधिक ठंडा, इस्कीमिक समय अध्ययन में की जरूरत है । यह ध्यान देने योग्य है कि अग्ंयाशय का एक छोटा सा हिस्सा परिचित तिल्ली के साथ देते हैं, और तिल्ली grafts से पूरे को दूर करने के लिए आसानी से भ्रष्टाचार या संवहनी जटिलताओं के लिए नेतृत्व और स्पष्ट रूप से आपरेशन समय में वृद्धि होगी की कोशिश. हमने देखा है कि अग्ंयाशय तिल्ली कलम से जुड़े ऊतक 7 POD पर शोष गुजरना होगा, हालांकि कुछ तिल्ली grafts के साथ व्यवहार्य रहे । या नहीं अग्ंयाशय तिल्ली grafts के साथ संलग्न ऊतक को दूर करने के लिए अनुसंधान प्रयोजनों पर निर्भर करता है ।

Congenic चूहों की उपलब्धता यह तिल्ली की कोशिकाओं की उत्पत्ति, प्रत्यारोपण के बाद दाता बनाम प्राप्तकर्ता को ट्रैक करने के लिए संभव बना दिया है. इस अध्ययन में, हम एक syngeneic प्लीहा प्रत्यारोपण मॉडल बनाने के लिए तिल्ली दानदाताओं और प्राप्तकर्ताओं के रूप इन congenic माउस उपभेदों के बीच अंग या ऊतक प्रत्यारोपण व्यापक रूप से मूल और प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हाल ही की रिपोर्ट के एक बिंदु के बारे में परिवर्तन के संबंध में सीडी है कि एन के सेल रिस्पांस24प्रभाव, कोई प्रत्यारोपण अस्वीकृति इन विकृति संयोजन के बीच की सूचना दी गई । हम जैसे ही फली 1 पर हुई तिल्ली grafts में प्राप्तकर्ता कोशिकाओं की एक पर्याप्त बाढ़ मनाया. यह संभव है कि प्राप्तकर्ता कक्ष प्राप्तकर्ता कक्षों के बहुमत के रूप में प्रत्यारोपण I/R चोट करने के लिए प्रत्युत्तर दिया granulocytes थे । हमारे परिणाम से पता चला है कि प्लीहा लिम्फोसाइटों का एक अपेक्षाकृत उच्च प्रतिशत दाता मूल के बने रहे । और अधिक दिलचस्प है, इन लिम्फोसाइटों (repopulated) अन्य लसीकाभ डिब्बों में (लिम्फ नोड, अस्थि मज्जा, और संचलन) के लिए चले गए । ये निष्कर्ष हमें संकेत है कि लिम्फोसाइटों कि spleens से उत्पंन अनुकूली प्रतिरक्षा में बहुत महत्वपूर्ण हैं । हालांकि, अधिक जांच करने के लिए अनुकूल (चित्रा 4, अनुपूरक चित्रा 1 और अनुपूरक चित्रा 2) अनुकूलनीय लिम्फोसाइटों की अलग भूमिकाओं में चित्रित करने के लिए आवश्यक हैं ।

इस प्रोटोकॉल की प्रमुख सीमा है कि यह सीमित microsurgical अनुभव के साथ व्यक्तियों के लिए व्यापक microsurgical प्रशिक्षण की आवश्यकता है इस तकनीक में महारत हासिल है । समग्र माउस ठोस अंग प्रत्यारोपण मॉडल (जैसे, माउस दिल, फेफड़े, या गुर्दे प्रत्यारोपण) में हमारे सीखने के अनुभव के आधार पर, यह एक नए प्रशिक्षित व्यक्ति के लिए 6-10 महीने लग सकते है (किसी भी प्रयोगात्मक microsurgical तकनीक के बिना) कुशलता से इस मास्टर के लिए तकनीक. दिल, या गुर्दे प्रत्यारोपण के माउस मॉडल की तुलना में, इस मॉडल को और अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि यह अतिरिक्त ऊतक विच्छेदन शामिल करने के लिए दाता प्रक्रियाओं के दौरान तिल्ली भ्रष्टाचार अलग कदम । इसके अलावा, दाता पोर्टल शिरा (लगभग ०.६ मिमी) का व्यास आईवीसी से छोटा होता है, जो एनास्टोमोसिस के लिए अधिक कठिन होता है । एक और सीमा है कि यह स्पष्ट नहीं है अगर grafted तिल्ली बड़े पैमाने पर बाद में प्रत्यारोपण चरण (जैसे, POD ६०) पर प्राप्तकर्ता कोशिकाओं द्वारा हमला किया जाएगा । हालांकि, यह मॉडल भी अपने कई अंतर्निहित लाभों के लिए बहुत आकर्षक है । सबसे पहले, चूहों और मनुष्यों के समान जीनोम की एक पर्याप्त रेंज का हिस्सा है, जिससे एक यथार्थवादी आवेदन की एक अपेक्षाकृत सटीक प्रतिनिधित्व के लिए अनुमति । इसके अलावा, गैर के माउस मॉडल vascularized तिल्ली autoट्रांसप्लांटेशन प्लीहा ऊतक के वर्गों का उपयोग करने के लिए तुलना, इस vascularized प्लीहा प्रत्यारोपण मॉडल कम इस तरह के प्लीहा ऊतक के अपूतित परिगलन के रूप में जटिलताओं का विकास होने की संभावना है और पश्चात आसंजन के कारण छोटे आंत्र रुकावट ।

तिल्ली प्रत्यारोपण के माउस मॉडल पहले Swirski FK एट अल द्वारा सूचित किया गया है । हालांकि विस्तृत जानकारी नहीं बताई गई ।  हमारे अध्ययन रुचि शोधकर्ताओं के लिए माउस तिल्ली प्रत्यारोपण का पालन करने के लिए और इस तकनीक मेटर करने के लिए एक व्यापक कदम-by-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करता है. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल कई अनावश्यक कदम Swirski FK एट अल द्वारा रिपोर्ट में वर्णित (जैसे, पित्त नली ligation) समाप्त और anastomosis के लिए 11-0 सीवन का परिचय, जो शल्य चिकित्सा समय कम करने में मदद मिलेगी और रक्तस्राव को रोकने ।

अंत में, इस मॉडल के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के लिए प्रतिक्रियाओं में प्लीहा सेल जनसंख्या के तंत्र का पता लगाने के रोगजनकों, चोट, सूजन, या प्रत्यारोपण अस्वीकृति हो सकता है और तिल्ली की चिकित्सीय क्षमता की परीक्षा के लिए मूल्यवान है ट्रांसप्लांटेशन. उचित प्रशिक्षण और अभ्यास के साथ, इस प्रक्रिया > 90% सफलता के साथ किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय व्यापक प्रत्यारोपण केंद्र और संसाधन और वित्तीय सहायता के लिए Feinberg चिकित्सा अनुसंधान कोर कार्यक्रम के स्कूल धंयवाद । विशेष रूप से, प्रवाह कोशिका मिति और प्रोटोकॉल सेवाओं नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय फ्लो Cytometry कोर सुविधा और माउस प्रोटोकॉल और Phenotyping प्रयोगशाला, क्रमशः द्वारा प्रदान की गई, दोनों जिनमें से NCI द्वारा समर्थित है P30-CA060553 रॉबर्ट एच को संमानित किया गया Lurie व्यापक कैंसर केंद्र । हम इस पांडुलिपि की अशुद्धि जांचने के लिए श्री नैट एस्पार्ज़ा को धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Wyeth 206205-01
Xylazine Lloyd Laboratories 139-236
Heparin solution Abraxis Pharmaceutical Products 504031
Injection grade normal saline Hospira Inc. NDC 0409-4888-20
70% Ethanol Pharmco Products Inc. 111000140
ThermoCare Small Animal ICU System Thermocare, Inc.
Adson Forceps Roboz Surgical Instruments RS-5230
Derf Needle Holder Roboz Surgical Instruments RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instruments RS-5881
Micro-clip Roboz Surgical Instruments RS-5420
7-0 silk Braintree Scientific SUT-S 103
11-0 nylon on 4 mm (3/8) needle Sharpoint DR4 AK-2119
Ms CD45.2 antibody BD Bioscience 553772
Ms CD45.1 antibody BD Bioscience 553776
Ms CD11b antibody BD Bioscience 557657
Ms B220 antibody BD Bioscience 553089
Ms Ly6C antibody eBioscience 48-5932-80
Ms Ly6G antibody BD Bioscience 561236
Ms F4/80 antibody BD Bioscience 565614
Ms CD11c antibody BD Bioscience 558079
Ms CD3 antibody eBioscience 48-0032-82
Ms CD4 antibody BD Bioscience 552051
Ms CD8 antibody BD Bioscience 563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher L34955

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References

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