Un modello murino del trapianto di milza eterotopica vascolarizzata per studiare la biologia delle cellule della milza e l'immunità ai trapianti

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Summary

Questo protocollo descrive le fasi chirurgiche di un modello murino di trapianto di milza eterotopica vascolarizzata, un modello tecnicamente impegnativo che può fungere da potente strumento per studiare il destino e la longevità delle cellule della milza, i meccanismi della milza distinta popolazioni di cellule nella progressione della malattia e immunità ai trapianti.

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Wang, J. J., Qiu, L., Fernandez, R., Yeap, X. Y., Lin, C. X., Zhang, Z. J. A Mouse Model of Vascularized Heterotopic Spleen Transplantation for Studying Spleen Cell Biology and Transplant Immunity. J. Vis. Exp. (148), e59616, doi:10.3791/59616 (2019).

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Abstract

La milza è un organo linfoide unico che svolge un ruolo critico nell'omeostasi dei sistemi immunitari e ematopoietici. I pazienti che sono stati sottoposti a splenectomia indipendentemente dalle cause precipitose sono inclini a sviluppare un'infezione post-splenectomia travolgente e sperimentano un aumento dei rischi di trombosi venosa profonda e neoplasie maligne. Recentemente, studi epidemiologici hanno indicato che la splenectomia potrebbe essere associata al verificarsi di malattie cardiovascolari, suggerendo che le funzioni fisiologiche della milza non sono ancora state pienamente riconosciute. Qui, introduciamo un modello murino di trapianto di milza eterotopica vascolarizzata, che non solo può essere utilizzato per studiare la funzione e l'attività comportamentale dei sottogruppi di cellule immunitarie spleniche in diversi processi biologici, ma può anche essere un potente strumento per testare il potenziale terapeutico del trapianto di milza in certe malattie. Le principali fasi chirurgiche di questo modello includono la raccolta della milza del donatore, la rimozione della milza nativa ricevente e la rivascolarizzazione del trapianto di milza. Usando ceppi di topo Congenici (ad es. topi con CD 45.1/CD 45.2 background), abbiamo osservato che dopo il trapianto syngeneico, entrambi i linfociti splenici e le cellule mieloidi derivate dal donatore migrarono fuori dal trapianto già nel giorno 1 post-operatorio, in concomitanza con l'afflusso di molteplici tipi di cellule riceventi, generando così una chimera unica.  Nonostante le tecniche relativamente impegnative, questa procedura può essere eseguita con > 90% tasso di successo. Questo modello consente di tracciare il destino, la longevità e la funzione dei splenociti durante lo steady state e in un setting di malattia a seguito di un trapianto di milza, offrendo così una grande opportunità per scoprire il ruolo distinto delle cellule immunitarie derivate dalla milza in diversi processi di malattia.

Introduction

La milza è il più grande organo linfoide secondario nel corpo ed è critica nei sistemi immunitari e ematopoietici. Le sue funzioni sono principalmente svolte da due compartimenti morfologicamente distinti, la polpa rossa e la polpa bianca1. La polpa rossa è un reticolo tridimensionale di seni venosi e corde spleniche costituite da fibre reticolari, cellule reticolari e macrofagi associati. Questa struttura unica permette alla polpa rossa di agire come un filtro del sangue efficace che rimuove i materiali estranei e gli eritrociti vecchi o danneggiati. La polpa bianca comprende i follicoli, la zona marginale e le guaine linfoidi periarteriolari (PALS) ed è un sito importante per l'intrappolamento e l'elaborazione di antigene, la produzione di linfociti, la trasformazione, la proliferazione e la maturazione2. Tuttavia, la milza è stata comunemente considerata come un organo dispensabile perché altri organi linfatici, come i linfonodi, possono anche svolgere alcune delle sue funzioni e la perdita della milza non porta di solito alla morte. La splenectomia è stata quindi ampiamente eseguita come metodo terapeutico per i pazienti con lesione splenica o malattie ematologiche benigne3. Tuttavia, i pazienti con splenectomia affrontano una serie di complicazioni a lungo termine. Le infezioni batteriche sono le complicanze più riconosciute della splenectomia4,5. Recentemente, la schiacciante sepsi post-splenectomia è stata riconosciuta come una complicazione intensiva di splenectomia associata ad un'alta mortalità6. Inoltre, recenti studi epidemiologici indicano che la splenectomia può essere associata al verificarsi di malattie cardiovascolari, suggerendo che ulteriori funzioni fisiologiche della milza restano da esplorare7,8.

Nella clinica sono stati utilizzati sia l'autotrandisplazione della milza che l'allotrapianto della milza. Attualmente, la milza autotrandisplazione impiantando sezioni di tessuto splenico in sacchetti creati nel maggiore omento è considerata l'unica possibilità per preservare la funzione splenica dopo la splenectomia traumatica9,10. Tuttavia, l'efficacia di questo intervento chirurgico è discutibile come complicazioni post-chirurgia come necrosi asettica del tessuto splenico e piccola ostruzione intestinale a causa di aderenze postoperatorie potrebbe verificarsi11. L'allotrapianto della milza è coinvolto nel trapianto multiviscerale12. Le evidenze cliniche del trapianto multiviscerale suggeriscono che l'allotrapianto della milza può svolgere un ruolo protettivo nel rigetto dell'alloinnesto dell'intestino tenue senza causare la malattia del trapianto contro l'ospite (GVHD)12. Eppure la letteratura riguardante l'effetto benefico dell'allotrapianto della milza come componente del trapianto multiviscerale è ancora limitata e i meccanismi sottostanti restano da definire. Nel 2006, Yair Reisner et al. ha riferito che trapiantare il tessuto della milza embrionale suina che non ha cellule T ai topi potrebbe curare l'emofilia A, una malattia genetica senza causare GVHD13, sostenendo che il trapianto di milza detiene una promessa terapeutica in alcune malattie. Pertanto, vi è la necessità di ulteriori indagini sul potenziale terapeutico del trapianto di milza.

I modelli animali di trapianto di milza sono preziosi per esplorare la funzione non apprezzata delle cellule immunitarie derivate dalla milza nella progressione della malattia e per testare il potenziale effetto terapeutico del trapianto di milza. I modelli sperimentali di trapianto di milza interi sono stati documentati fin dai primi anni del 1900, come Recensito da Cohen14. Nel 1969, Coburn Richard J. e Lee et al. dettagliato la tecnica del trapianto di milza in ratti15,16. Più di recente, Swirski FK et al. ha descritto un modello murino di trapianto di milza17. Rispetto ai modelli di ratto, i modelli murini di trapianto di milza sono più attraenti a causa dei suoi numerosi vantaggi intrinseci. Ad esempio, utilizzando un modello di mouse, possiamo accedere a un'ampia varietà di reagenti non disponibili a quello dei modelli di ratto. Inoltre, utilizzando topi Congenici (ad es. topi con CD 45.1/CD 45.2 background), un trapianto di milza singenici permette di tracciare il destino, la longevità e la funzione delle splenociti18. Sulla base del lavoro di Swirski FK et al.17, abbiamo ulteriormente istituito questo protocollo semplificato e migliorato del trapianto di milza nei topi. Il protocollo descritto di seguito combina l'affidabilità e la fattibilità in modo standardizzato e può essere utilizzato come strumento per studiare la biologia della milza e l'immunità ai trapianti.

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Protocol

Tutte le procedure e l'uso animale in questo studio sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal comitato interno per la cura e l'uso degli animali della Northwestern University (IACUC). In questo studio, 8 a 10 settimana vecchio CD 45.2 e CD 45.1 topi (entrambi su sfondo BALB/c, dal laboratorio di Jackson) sono stati utilizzati come donatori di milza e riceventi, rispettivamente, per creare modelli di trapianto di milza singenici. Tutti gli animali sono stati ospitati nell'ambiente sterile nelle strutture animali della Northwestern University. Il lubrificante per gli occhi è stato applicato a tutti i topi post-anestetizzazione per prevenire la secchezza.

1. preparazione chirurgica, anestetizzazione, e regime di analgesia

  1. Posizionare un telo monouso sterile (45,7 cm x 66 cm) sulla piattaforma chirurgica. Afferrare delicatamente il mouse, iniettare ketamina (50 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) intraperitoneale (i. p) per l'anestesia, e iniettare 0,05 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea per l'analgesia.
  2. Assicurarsi che la profondità di anestesia di toe-pizzico, radersi i capelli in tutta l'area dell'addome con un rasoio e posizionare il mouse sulla piattaforma chirurgica sterile sotto il microscopio operativo a 6-10x ingrandimento.

2. raccolta della milza del donatore

  1. Sterilizzare l'addome con un tampone di preparazione di alcol, fissare gli arti con nastro chirurgico, e fare un 3-4 cm linea mediana verticale incisione cutanea dal pube al processo xifoideo con le forbici.
  2. Ritrarre la parete addominale con retrattili sterili realizzati con graffette. Spostare l'intestino sul fianco destro dell'addome (sinistra del chirurgo) con un batuffolo di cotone sterile per esporre la milza. Cauterizzare la breve vena gastrica attaccata alla milza con una cautela sterile a bassa temperatura (Figura 1a). Collocare un pezzo di garza sterile impregnati di 37 ° c di soluzione salina sulla milza per mantenerlo umido (Figura 1B).
  3. Separare e mobilitare la vena portale dal tessuto pancreatico (Figura 1C) legando i rami della vena portale (vena pancreaticoduodenale superiore e vena gastrica destra); Posizionare una sutura intorno alla vena del portale distale dalla vena splenica (Figura 1D).
  4. Capovolgere la milza sul lato destro per esporre l'aorta e il tronco celiaca con l'arteria splenica (Figura 1e). Dissect e mobilizza l'arteria aortica-celiaca-splenica legando l'arteria epatica e l'arteria gastrica; Posizionare una sutura intorno all'aorta prossimale all'arteria celiaca (Figura 1F-G).
  5. Iniettare 100 unità internazionali (UI) di eparina nella vena cava inferiore (IVC) per eparinizzare l'intero corpo e attendere 3 minuti per assicurare che l'eparina prenda effetti. Legare l'aorta prossimale all'arteria celiaca, traslegare la vena portale, quindi perfutilizzare tutto il corpo utilizzando 10 mL di soluzione salina fredda (4 ° c) eparinizzata (10 mL/20 s) dall'aorta addominale distale al tronco celiaca (Figura 1h).
  6. Raccogliere l'innesto della milza in blocco con il segmento aortico-celiaco-splenico associato e la vena portale insieme a un segmento di vena splenica e una piccola porzione di tessuto pancreatico. Conservare l'innesto in 5 mL di 4 ° c di soluzione salina prima del trapianto. Euthanize il topo per dislocazione cervicale.

3. la splenectomia del ricevente e l'impianto di innesto della milza

  1. Posizionare un tampone riscaldante sulla piattaforma chirurgica e regolare la temperatura a 37 ° c. Posizionare un drappo sterile (45,7 cm x 66 cm) sulla parte superiore del tappetino riscaldante per creare una piattaforma chirurgica sterile. Ripetere i passaggi 2,1 e 2,2 per la preparazione chirurgica e l'anestetizzazione. Fare un 3-4 cm linea mediana incisione e ritrarre la parete addominale come descritto nel passo 2,1 e passo 2,2.
  2. Spostare con cautela l'intestino sul lato destro del mouse con un batuffolo di cotone sterile per esporre la milza del ricevente. Ligare la vena splenica e l'arteria e rimuovere la milza.
  3. Spostare con cautela l'intestino sul lato sinistro del mouse e coprire l'intestino con garza umida (impregnata con soluzione salina sterile a 37 ° c). Dissect e legare i rami lombari dell'aorta infrarenare e IVC; a croce l'aorta infrarenale e l'IVC utilizzando due morsetti microvascolari da 4 mm.
  4. Posizionare una sutura di nylon 11-0 attraverso l'aorta infrarenale (a pieno spessore) e ritrarre per creare un'aortotomia ellittica da un singolo taglio con microforbici (la lunghezza dovrebbe corrispondere al diametro dell'aorta del donatore, Figura 2a). Perforare l'IVC utilizzando un ago da 30 G per creare una venotomia ellittica ed estendere l'apertura al portale donatore con una lunghezza corrispondente con microforbici (Figura 2a).
  5. Eliminare il sangue intraluminale o il coagulo di sangue (nell'aorta e nell'IVC) con 500 μL di soluzione salina eparinizzata (10 unità/mL).
  6. Posizionare l'innesto della milza nel fianco destro dell'addome del mouse ricevente; identificare con attenzione il bracciale aortico del donatore e la vena portale del donatore. Dopo essersi assicurati che i vasi non siano attorcigliati, coprire l'innesto della milza con una garza impregnata di soluzione salina fredda (4 ° c).
  7. Collegare la cuffia aortica del donatore all'apice prossimale e distale dell'aortaotomia del ricevente con due suture di soggiorno (11-0 nylon sutura, come sotto) (Figura 2B, C). Fare un'anastomosi con 2-3 morsi di suture continue in nylon 11-0 tra il polsino aortico del donatore e l'aortaotomia del ricevente (parete anteriore) (Figura 2D). Capovolgere il innesto della milza sul lato sinistro del ricevente; fare l'anastomosi tra il polsino aortico del donatore e l'aortotomia del ricevente (parete posteriore) (Figura 2e).
  8. Eseguire un'anastomosi per collegare la vena portale del donatore alla parete posteriore dell'IVC del ricevente, utilizzando da 4 a 5 morsi di sutura continue all'interno dell'IVC e quindi chiudere la sutura all'esterno dell'IVC (Figura 2F, G).
  9. Rilasciare i morsetti del recipiente e utilizzare il tampone di cotone sterile per tamponare il sanguinamento fino a quando il colore della milza viene recuperato (Figura 2h).
  10. Chiudere l'addome con una sutura di Vicryl riassorbibibile sintetica 5-0 in un modello continuo. Chiudere lo strato di pelle con una sutura di nylon 5-0 in un motivo interrotto.
    Nota: Per i passaggi 4.7-4.8, in alternativa, fare un'anastomosi tra la vena portale del donatore e il IVC del ricevente prima (passo 4,8); quindi fare un'anastomosi tra il polsino aortico del donatore e la parete posteriore dell'aortotomia del ricevente, utilizzando da 2 a 3 sutura continue all'interno dell'aorta e chiudere la sutura all'esterno dell'aorta.

4. recupero degli animali

  1. Iniettare 1 mL di soluzione salina calda per via sottocutanea tramite 4 sedi separate (0,25 mL/posizione) dopo aver chiuso l'addome.
  2. Tenere il mouse in un incubatore a temperatura controllata (30 ° c) per le prime ore successive alla post-operazione, monitorare il mouse fino a quando non ha recuperato una coscienza sufficiente, quindi trasferire il mouse in una nuova gabbia pulita con cibo e acqua regolari, con un tampone riscaldante (30 ° c ) sotto la gabbia. Mantenere il mouse post-chirurgia in una gabbia separata.

5. gestione del dolore post-chirurgico

  1. Iniettare 0,05 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea 24 h e 48 h post-intervento chirurgico per mantenere il regime di analgesia.

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Representative Results

L'intera procedura del trapianto di milza del topo può essere completata entro 90 minuti da microchirurghi esperti. Il nostro laboratorio ha eseguito oltre 100 trapianti di milza nei topi. Il tasso di successo è superiore al 90%, come definito dalla sopravvivenza sia del topo ricevente che dell'innesto della milza al giorno post-operatorio (POD) 1 o POD 7 (il nostro endpoint di studio). La sopravvivenza dell'innesto della milza è stata confermata dall'aspetto macroscopico e dall'analisi della citometria a flusso dei splenociti. In base alla nostra esperienza, l'analisi della citometria a flusso (test di vitalità delle cellule vive/morte) è molto sensibile per determinare se un innesto di milza è sopravvissuto, poiché la maggior parte delle cellule della milza sarebbe morta se gli innesti della milza fossero necrotici. Le sfide tecniche di questa procedura, le complicazioni comuni e la loro risoluzione dei problemi sono riepilogate nella tabella 1.

Per testare la morfologia dell'innesto post-trapianto, la colorazione di Haemotoxylin e eosin (H & E) è stata eseguita in isografi di milza di topi BALB/c a POD 1 e POD 7. Le immagini rappresentative sono mostrate nella Figura 3. L'architettura della milza è rimasta intatta durante la prima settimana postoperatoria. La polpa rossa, la polpa bianca e la zona marginale erano ancora chiare e distinguibili. Per indagare sulla migrazione cellulare dopo il trapianto di milza, la citometria a flusso è stata eseguita a POD 1 e POD 7 per esaminare i fenotipi dei leucociti nelle isografe della milza, nei linfonodi, nel sangue e nel midollo osseo. Come mostrato nella Figura 4a, a Pod 1, 51 ± 7% (media ± SD, come di seguito) delle cellule della milza sono stati derivati dal donatore e 46 ± 3% sono stati derivati dal ricevente. A POD 7, i leucociti derivati dal donatore rappresentavano 32 ± 10% delle cellule totali della milza e le cellule derivate dal ricevente erano fino a 56 ± 13%. Abbiamo anche osservato che i leucociti della milza migrarono nei linfonodi, nel sangue e nel midollo osseo già al giorno 1 e mantenuti al giorno 7 (Figura 4B), generando una chimera unica preziosa per la ricerca sul traffico di splenociti.

Tabella 1: Metodi di risoluzione dei problemi.

Figure 1
Figura 1: raccolta della milza del donatore. (A) cauterizzare la breve vena gastrica attaccata alla milza. (B) Collocare un piccolo pezzo di garza umida calda e sterile sopra la milza per mantenerlo umido. (C) dissezionare e isolare la vena portale dietro il pancreas. (D) legarsi i rami laterali della vena portale e posizionare una sutura intorno alla vena portale distale alla vena splenica. Le linee tratteggiate rappresentano la posizione che si trasseca successivamente per l'anastomosi con il destinatario IVC. (E) capovolgere la milza sul lato destro dell'addome (sinistra del chirurgo) per esporre l'aorta e il tronco celiaca con i suoi rami tra cui l'arteria splenica. (F) sezionare e mobilitare l'arteria aortica-celiaca-splenica legando gli altri due rami. (G) Posizionare una sutura intorno all'aorta prossimale all'arteria celiaca. Le linee tratteggiate rappresentano la posizione che trasseca successivamente utilizzata per l'anastomosi con l'aorta addominale ricevente. H) dopo aver legeggiato l'aorta e aver transato la vena del portale, profumi l'innesto della milza con 10 ml di soluzione salina eparinizzata attraverso l'aorta. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 2
Figura 2: impianto di innesto della milza. (A) dopo l'isolamento e il bloccaggio trasversale dell'aorta e dell'IVC, effettuare rispettivamente un'aortotomia longitudinale e una venotomia nell'aorta e nell'IVC. (B-D) Posizionare l'innesto della milza sul lato destro dell'addome (lato sinistro del chirurgo). Fare l'anastomosi end-to-side tra il polsino aortico del donatore e la parete anteriore dell'aortotomia del ricevente, utilizzando 2-3 morsi di sutura continua. (E) Capovolgere il innesto della milza sul fianco sinistro del ricevente; Ripetere la procedura precedente tra il polsino aortico del donatore e la parete posteriore dell'aortotomia del ricevente e chiudere la sutura all'esterno dell'aorta. (F-G) Fare un'anastomosi end-to-side tra la vena portale donatore e la parete posteriore della IVC del ricevente, utilizzando da 4 a 5 morsi di sutura continua 11-0 nylon all'interno della IVC e quindi chiudere la sutura all'esterno della IVC. (H) dopo aver completato l'anastomosi, rilasciare i morsetti del recipiente e mettere alcuni germogli di cotone per aiutare a fermare l'emorragia. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 3
Figura 3: istologia rappresentativa della milza isografa il giorno 1 e il giorno 7 post-operazione. I trapiantati di milza syngeneic sono stati eseguiti utilizzando topi BALB/c. Gli isoteri della milza sono stati raccolti il giorno 1 e il 7 ° giorno dopo il trapianto e fissati in formalina al 10% per 48 h. H & E colorazione è stata eseguita utilizzando la sezione tissutale integrata con paraffina. L'istologia rappresentativa Mostra che le isografe della milza rimangono intatte a 1 settimana dopo il trapianto. Barra di scala = 250 μm. POD, giorno post-operatorio. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 4
Figura 4: La Chimera creata dal trapianto di milza singenici. Tre trapianti di milza singenici sono stati eseguiti utilizzando BALB/c CD 45.2 topi come donatori e BALB/c CD 45.1 topi come destinatari. Gli innesti della milza, il sangue, il linfonodo (LN) e il midollo osseo (BM) nei topi riceventi sono stati raccolti il giorno 1 e il giorno 7 dopo il trapianto. L'analisi del fenotipo delle cellule è stata eseguita per l'isolamento delle singole cellule e per la citometria a flusso. (A) diagrammi a punti rappresentativi (gating da Singlet vivi) che mostrano le percentuali del donatore o del ricevente — i leucociti derivati nei campioni indicati. B) percentuali (media ± SEM) delle popolazioni indicate nelle cellule derivate dal donatore nei campioni indicati al giorno 1 e al giorno 7. POD = giorno post-operatorio. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 1 complementare: trame rappresentative (n = 3) che mostrano le percentuali dei linfociti derivati dal donatore rispetto a quelli derivati dalla milza trapiantato, dal linfonodo, dal sangue e dal midollo osseo. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Figura complementare 2: trame rappresentative (n = 3) che mostrano le percentuali dei monociti derivati dal donatore rispetto ai CD11b + Ly6C + derivati da donatori nella milza trapiantato, nel linfonodo, nel sangue e nel midollo osseo. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Prove convincenti suggeriscono che i monociti derivati dalla milza giocano un ruolo importante nei processi infiammatori sterili come l'aterosclerosi19, il cervello ischemico acuto20 o il trauma polmonare18, così come I/R del miocardio lesioni e rimodellamento21,22,23. Questi rapporti evidenziano il ruolo di sotto-riconoscimento della milza in molte malattie croniche, di cui la malattia cardiovascolare è un importante (soprattutto dato che è il killer numero uno a livello globale). Il modello murino del trapianto di milza offre una grande opportunità per scoprire il ruolo delle cellule immunitarie derivate dalla milza in varie malattie e come sono innescati nella milza. Ad esempio, utilizzando i modelli murini del trapianto di milza, Swirski et al. ha scoperto che in risposta a lesioni miocardiche ischemico, i monociti derivati dalla milza aumentano la loro motilità, migrano fuori dalla milza, aderiscono al tessuto ferito e contribuiscono alla guarigione delle ferite17. Inoltre, questo modello è utile per affrontare le "longevities" delle cellule immunitarie mature nella milza e nei meccanismi sottostanti e per esplorare potenziali terapeutici del trapianto di milza.

Occorre prendere in considerazione diversi aspetti per migliorare il successo di questo protocollo. In primo luogo, è fondamentale scegliere gli animali da esperimento appropriati durante il processo di progettazione poiché il peso del mouse, la deformazione e la condizione di salute potrebbero influenzare la difficoltà delle fasi chirurgiche e dei risultati sperimentali. Il nostro laboratorio raccomanda l'utilizzo di topi di età da 8 a 12 settimane con peso superiore a 25 g per diminuire la mortalità che potrebbe essere causata da sanguinamento. In secondo luogo, durante la procedura di raccolta della milza, troppa manipolazione dei vasi della milza potrebbe facilmente portare all'allevamento o al vasospasmo e potenzialmente provocare microtrombosi nell'innesto della milza. Familiarizzare con l'anatomia dell'addome del topo prima dell'intervento chirurgico sarebbe utile per accelerare il processo di apprendimento. In terzo luogo, durante la chirurgia ricevente, l'innesto della milza deve essere sempre mantenuto umido e fresco. Una protezione adeguata degli innesti della milza potrebbe ridurre l'ischemia del trapianto/riperfusione (I/R) e prevenire l'insufficienza del trapianto dopo il trapianto. Inoltre, considerando che i vasi donatori per l'anastomosi sono relativamente lunghi, il posizionamento degli innesti della milza correttamente prima dell'anastomosi è fondamentale per prevenire la torsione dei vasi. Inoltre, i diametri dell'aortotomia ricevente e della venotomia di IVC devono essere sempre paragonabili a quelli dell'aorta del donatore e della vena portale per garantire il corretto flusso sanguigno e prevenire la trombosi.

Il tempo di conservazione medio degli innesti della milza in soluzione salina di 4 ° c è di circa 10 min. Il tempo di ischemico totale deve essere limitato a meno di 50 min per garantire un fallimento minimo del trapianto. Si consiglia di utilizzare la soluzione di stoccaggio freddo dell'Università del Wisconsin (UW) per preservare il trapianto di milza, se più di 1 h freddo, tempo ischemico è necessario negli studi. Va notato che una piccola porzione del pancreas si attacca intimamente con la milza e tenta di rimuovere l'intero dagli innesti della milza porterebbe facilmente a complicazioni del trapianto o vascolari e aumenta notevolmente il tempo di funzionamento. Abbiamo osservato che il tessuto pancreatico attaccato al trapianto di milza sarebbe stato sottoposto a atrofia a POD 7, sebbene alcuni restavano vitali con gli innesti della milza. Se rimuovere o meno il tessuto del pancreas attaccato con gli innesti della milza dipende dai fini della ricerca.

La disponibilità di topi Congenici ha permesso di rintracciare l'origine delle cellule della milza, donatore contro ricevente dopo il trapianto. In questo studio, abbiamo usato BALB/c CD 45.2 e BALB/c CD 45.1 Topi Congenici come donatori di milza e riceventi per creare un modello di trapianto di milza singenici. Il trapianto di organi o tessuti tra questi ceppi di topo Congenici è stato ampiamente utilizzato per tracciare l'origine e lo sviluppo del sistema immunitario. Nonostante la recente relazione riguardante una mutazione di punto associata al CD 45.1 che influenza la risposta delle cellule NK24, non è stato segnalato alcun rigetto di trapianto tra queste combinazioni di ceppi. Abbiamo osservato un afflusso sostanziale di cellule riceventi negli innesti della milza che si sono verificati non appena al POD 1. È probabile che le cellule riceventi abbiano risposto alla lesione I/R del trapianto poiché la maggior parte delle cellule riceventi erano granulociti. I nostri risultati hanno mostrato che una percentuale relativamente elevata di linfociti splenici è rimasta di origine del donatore. Più interessante, questi linfociti migrarono a (ripopolati) in altri compartimenti linfoidi (linfonodo, midollo osseo e circolazione). Questi risultati ci spingono a speculare che i linfociti che hanno avuto origine dagli milze sono molto importanti nell'immunità adattativa. Tuttavia, sono necessarie ulteriori indagini per delineare i distinti ruoli dei linfociti splenici nell'immunità adattiva contro l'innata (Figura 4, Figura complementare 1 e Figura complementare 2).

La limitazione principale di questo protocollo è che richiede una formazione microchirurgica estesa per gli individui con esperienza microchirurgica limitata per padroneggiare questa tecnica. Sulla base della nostra esperienza di apprendimento nei modelli di trapianto di organi solidi nel topo (ad esempio, cuore del topo, polmone o trapianto di rene), può richiedere 6-10 mesi per una persona appena addestrata (senza alcuna tecnica microchirurgica sperimentale) per padroneggiare abilmente questo tecnica. Rispetto ai modelli murini di cuore, o trapianto di rene, questo modello potrebbe essere più impegnativo in quanto comporta ulteriori passaggi di dissezione tissutale per isolare l'innesto della milza durante le procedure di donatore. Inoltre, il diametro della vena portale donatore (circa 0,6 mm) è più piccolo dell'IVC, il che rende più difficile per l'anastomosi. Un'altra limitazione è che non è chiaro se la milza innestata sarebbe massicciamente invasa dalle cellule del ricevente in fase di trapianto successiva (ad esempio, POD 60). Tuttavia, questo modello è anche molto attraente per i suoi diversi vantaggi intrinseci. In primo luogo, i topi e gli esseri umani condividono una vasta gamma di geniti simili, permettendo così una rappresentazione relativamente accurata di un'applicazione realistica. Inoltre, confrontando il modello murino di autotrandisplazione della milza non vascolarizzata utilizzando le sezioni del tessuto splenico, questo modello di trapianto vascolarizzato di milza ha meno probabilità di sviluppare complicazioni come la necrosi asettica del tessuto splenico e ostruzione dell'intestino tenue dovuta ad aderenze postoperatorie.

Il modello murino del trapianto di milza è stato precedentemente riportato da Swirski FK et al. Tuttavia, le informazioni dettagliate non sono state descritte.  Il nostro studio fornisce un protocollo completo passo-passo del trapianto di milza del topo per i ricercatori interessati a seguire e per Mater questa tecnica. Inoltre, questo protocollo Elimina diversi passaggi inutili descritti nel rapporto da Swirski FK et al. (ad esempio, la legatura del dotto biliare) e introduce la sutura 11-0 per anastomosi, che contribuirebbe ad abbreviare il tempo chirurgico e prevenire l'emorragia.

In conclusione, questo modello potrebbe essere un potente strumento per esplorare i meccanismi della popolazione di cellule spleniche nelle risposte a patogeni, lesioni, infiammazione, o rigetto del trapianto ed è prezioso per la prova del potenziale terapeutico della milza Trapianto. Con una corretta formazione e pratica, questa procedura può essere eseguita con > 90% di successo.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano il centro di trapianto completo di Northwestern University e il programma Feinberg School of Medicine Research core per il supporto di risorse e finanziamenti. In particolare, la citometria a flusso e i servizi di istologia sono stati forniti dalla Northwestern University Flow citometria Core Facility e mouse istologia e fenotipizzazione laboratorio, rispettivamente, entrambi i quali sono supportati da NCI P30-CA060553 assegnato al Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Ringraziamo il signor nate Esparza per la correzione di questo manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Wyeth 206205-01
Xylazine Lloyd Laboratories 139-236
Heparin solution Abraxis Pharmaceutical Products 504031
Injection grade normal saline Hospira Inc. NDC 0409-4888-20
70% Ethanol Pharmco Products Inc. 111000140
ThermoCare Small Animal ICU System Thermocare, Inc.
Adson Forceps Roboz Surgical Instruments RS-5230
Derf Needle Holder Roboz Surgical Instruments RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instruments RS-5881
Micro-clip Roboz Surgical Instruments RS-5420
7-0 silk Braintree Scientific SUT-S 103
11-0 nylon on 4 mm (3/8) needle Sharpoint DR4 AK-2119
Ms CD45.2 antibody BD Bioscience 553772
Ms CD45.1 antibody BD Bioscience 553776
Ms CD11b antibody BD Bioscience 557657
Ms B220 antibody BD Bioscience 553089
Ms Ly6C antibody eBioscience 48-5932-80
Ms Ly6G antibody BD Bioscience 561236
Ms F4/80 antibody BD Bioscience 565614
Ms CD11c antibody BD Bioscience 558079
Ms CD3 antibody eBioscience 48-0032-82
Ms CD4 antibody BD Bioscience 552051
Ms CD8 antibody BD Bioscience 563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher L34955

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References

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