질량 분 광 법에 의해 3 개의 DNA 병 변의 정량화 및 주변 미세 입자 상 물질에 노출 된 마우스의 조직에서 그들의 수준에 대 한 평가

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Immunology and Infection

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Summary

우리는 병 변의 민감하고 정확한 정량화를 위한 방법을 여기에 설명 합니다. 8-옥 소-7, 8 디 하이드로 deoxyguanosine),1n6조-2-deoxyadenosine 및1, n6조-2dado deoxyguanosine (1,n2-dguo) DNA에. 이 방법은 노출 된 A/J 마우스의 조직 (폐, 간 및 신장)에서 주변 미세 미 립 자 물질 (PM2.5)의 영향에 대 한 평가에 적용 되었다.

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Franco de Oliveira, T., Falcão de Oliveira, A. A., Lemos, M., Veras, M., Saldiva, P. H., Gennari de Medeiros, M. H., Di Mascio, P., de Melo Loureiro, A. P. Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter. J. Vis. Exp. (147), e59734, doi:10.3791/59734 (2019).

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Abstract

Dna 시드와 및 산화 된 dna 기지는 잔기 되는 물질의 독성 평가를 위한 유용한 생물 표지 자, 생물 변환 시 반응성 전자 기적 생성, 또는 산화 적 스트레스를 유도 하는 dna 병 변의 예이다. 산화 된 핵 염기 중에서 가장 많이 연구 된 것은 DNA에 산화 적으로 유도 된 기본 손상의 바이오 마커로 서 8-옥 소-7, 8 dihydroguanine (8 옥 소 구 아) 또는 8 옥 소 다이-deoxyguanosine. 지질 과산화 과정에서 기인 하는 알 데히드 및에 폭 자일로는 잔기 분자 exocyclic DNA 시드와와 같은 돌연 변이를 형성할 수 있게 되는데,이에 노 다 덕트 1,n2-2-deoxyguanosine εdGuo) 및 염증의병 리 생리학에서의 잠재적 바이오 마커로 서 제안 된 1,n6-deoxyadenosine-εdAdo). 세포 돌연변이 속도와 만성 질환 발달 (예: 암, 퇴행 성 신경 질환)을 느리게 하기 위한 예방 전략의 개발에는 DNA에서의 정량화를 위한 선택적이 고 민감한 방법이 필요 합니다. 검출에 사용할 수 있는 민감한 방법 중 (전기 화학적 또는 탠덤 질량 분석 검출기에 결합 된 고성능 액체 크로마토그래피, 혜성 분석 법, 면역 검사 32P-포스트 라벨링) 중에서 가장 선택적인 것은 탠덤 질량 분 광 법에 결합 된 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC-ESI/MS). 선택 성은 DNA, 소변, 혈장 및 타 액과 같은 생물학적 매트릭스에서 변형 된 시드의 정량화를 위한 금 표준으로 진화 된 복잡 한 생물학적 샘플 및 HPLC-ESI/MS를 분석할 때 필수적인 장점입니다. 동위 원소 표지 된 내부 표준의 사용은 DNA 가수분해 및 분석 물 농축 단계 동안 분자 손실에 대 한 교정 뿐만 아니라 샘플 간 분석 물질 이온화의 차이에 대 한 보정의 이점을 추가 합니다. 또한, 둘 이상의 피크가 존재할 때 올바른 크로마토그래피 피크를 식별 하는 데 도움이 됩니다.

우리는 여기에 A/J 마우스의 폐, 간 및 신장 DNA에 있는 8 옥 소 오 궈, 1,6-다도 및 1,n2의 정량화를 위해 성공적으로 적용 된 민감하고 정확 하 고 정밀한 HPLC-ESI/ms 방법을 제시 합니다 앰비언트 PM2.5 노출의 효과 평가.

Introduction

일부 반응성 산소 종 (ROS)는 산화 된 염기와 DNA 가닥 나누기를 생성 하는 deoxyribose 모이 어 티의 DNA 염기 및 일부 탄소의 탄소 이중 결합을 산화 할 수 있다1. 질소 및 산소 원자가 풍부한 음으로 하 전에 분자 인 dna는 dna 시드와2라고 하는 제품을 제공 하는 친 핵 성 사이트 (질소 및 산소)와 공유 적으로 반응 하는 잔기 그룹의 대상 이기도 합니다. 따라서, dna 시드와 및 산화 된 dna 기지는 잔기 물질의 독성 평가를 위한 유용한 바이오 마커로 서, 생물 변환 시 반응성 전기를 생성 하거나, 산화 적 스트레스를 유발 하는 dna 병변의 예입니다. 2. 변형 된 DNA 염기가 염기 또는 염기 절제 수리 (BER 또는 NER)에 의해 DNA 로부터 제거 될 수 있지만, dna 병 변의 생성 및 제거 사이에 불균형을 유도 하 여 전자에 찬성 하 여 유전자 초과 근무에서 자신의 수준의 순 증가에 이르게 한다3 < /c5 >. 결과는 DNA 변이 율의 증가, 유전자 발현 감소 및 단백질 활성 저하,도4,도6,7등의 효과가 밀접 하 게 관련 되어 있는 질병의 개발. DNA 돌연변이는 세포 신호 전달, 세포 주기, 게놈 완전성, telomere 안정성, 후 성 후 성, 크로마 틴 구조, RNA 스 플라이 싱, 단백질 항상성, 대사 및 세포 분화와 같은 다양 한 세포 기능에 영향을 미칠 수 있다8 ,9. 세포 돌연변이 속도와 만성 질환 발달을 느리게 하는 전략 (예: 암, 신경 퇴행 성 질환)은 그 중 에서도 돌연변이 원의 지식, DNA 병 변 및 그 원인 들을 통과 한다.

오염 물질 노출, 지속적인 염증, 질병 이상 (예: 당뇨병) 등으로 과잉으로 내 시경 적으로 생성 된 ROS는 DNA 및 지질 손상을 포함 한 생체 분자 손상의 중요 한 원인1입니다. 일례로 서, 전이 금속 이온 (Fe2 +, Cu+)에의 한 고 반응성 수산화 라 디 칼 (OH)이 환 원 되어 형성 된 dna 염기, dna 당 모이 어 티 및 고도 불포화 지방산을 산화 시켜 확산 조절 요금10. 80 중에서 이미 특성화 된 산화 된 뉴 클레 아 제3중 가장 많이 연구 된 것은 8 옥 소-7, 8-dihydroguanine 및 8 옥 소 다이 deoxyguanosine이 고, 도 1)에서 GT 트랜스 버전을 유도할 수 있는 병 변 포유류 세포10,11. 구 아닌의 모노 전자 산화에 의해, 또는 DNA1에서 구 아닌의 하이드 록 실 라 디 칼 또는 일 중 항 산소 공격에 의해 형성 된다. 고도 불포화 지방산은 지질 과산화1,12의 과정을 시작 하는 OH와 같은 반응성이 높은 산화 제의 다른 중요 한 표적입니다. 이는 malondialdehyde, 4 히 드 록 시 니 알, 잔기 에폭시-데 네 날, 헥 센 날, 아크로 라인, 크로 톤 알 데히드 등의 알 데히드와에 폭 시 알데하이드로 분해 될 수 있는 지방산 하이드로 퍼 옥사이드를 상승 시켜 주며 돌연 변이 exocyclic DNA 시드와 (예: malondialdehyde), propano 또는 etheno 시드와1,13등을 형성할 수 있습니다. Deoxyguanosine, εdGuo, 그림 11, n 6-εdAdo,그림 1의 경우에는이에 대 한 것을 참조 하십시오 (1, 2-2). )는 염증14,15의 병 리 생리학에서 잠재적인 바이오 마커로 제안 되었다.

Figure 1
그림 1입니다. 본 연구에서 정량화 된 DNA 병 변의 화학 구조. 박사 = 2 ´-deoxyribose. 이 수치는 올리베이라 외34에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

1980 년대 초반에 수행 된 연구는 전기 화학적 검출 (HPLC-ECD)에 결합 된 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 8 옥 소 오 궈의 민감성 검출을 허용 했습니다. 다 수의 생물학적 시스템에서 HPLC-ECD에의 한 8-옥 소 오드의 정량은 산화 성 유도 염기의 바이오 마커로 서 8 옥 소 오 궈의 인정을 받아 DNA1,16에서 손상 시켰다. 낮은 fmol 범위17에서 8-옥 소 궈의 정량화를 가능 하 게 하 고 견고 하면서 HPLC-ECD 측정은 분석 물질 식별 및 크로마토그래피 분해능에 대 한 분석 물질 보유 시간의 정확성에 의존 하 여 간섭을 방지 합니다. 다른 샘플 성분. 전기 화학적 검출은 이동 상의 염 분 (예: 인산 칼륨, 아세트산 나트륨)을 사용 해야 하므로 적절 한 분석 조건의 유지 보수에는 일상적인 칼럼 및 장비 세척 시간이 필요 합니다.

대안적으로, 세균 DNA 복구 효소 formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG)를 사용 하 고, 그 후, 인간 8-oxoguanine glycosylase의 검출 및 DNA 로부터 8 옥 소 구 아의 제거를 위한 DNA 알칼리의 유도를 위한 방법으로 등장 사이트. 알칼리 성 불안정 부위는 DNA 가닥 분리로 변환 되어 알칼리 단 세포 겔 전기 영동에의 한 8-옥 소 구 아의 매우 고감도 간접 정량화를 허용 한다 ("혜성 분석 법"). 세포 DNA 추출이 필요 없는 높은 민감도와 분석의 성취는 이러한 유형의 분석의 주요 장점입니다. 이는 DNA에서 가장 낮은 정상 상태 수준을 제공 하며, 일반적으로 HPLC를 기반으로 한 생물학적 분석 방법에 의해 얻어진 수준 보다 7-10 배 낮습니다. 그러나, 8 옥 소 구 아의 간접 측정은 몇 가지 단점이 있고 특이성의 결여 또는 수리 효소의 알려지지 않은 효율이1,16,18에 사용 된다.

면역 분석은 8-옥 소 구 아1 및 exocyclic DNA adducts 등의 검출에 사용 되는 다른 일련의 방법으로, 예를 들어 1,6-다도 및 1,n2-dado12. 민감도에도 불구 하 고, dna 병 변의 검출을 위한 항 체의 사용의 단점은 정상적인 dna 염기1,12를 포함 하는 생물학적 샘플의 다른 성분 들에 대 한 교차 반응성으로 인 한 특이성의 결여 이다. Exocyclic DNA adducts는 1,n2-dado 및 1,n2-dado를 포함 하 여, 또한 고감도 32P-포스트 라벨링 분석 법에 의해 검출 되 고 정량화될 수 있다. 32P-포스트 라벨링의 고감도는 10 개의 정상 염기19당 약 1 개의 부가 물를 검출 하기 위해 매우 적은 양의 DNA (예를 들어 10 µ g) 를 사용할 수 있게 한다. 그러나, 무선 화학 물질의 사용, 화학적 특이성의 결여 및 낮은 정확도는19,20의 몇 가지 단점이 있다.

상기 언급 된 방법의 공유 제한은 원하는 분자의 검출을 위한 낮은 선택성 또는 특이성 이다. 이 시나리오에서 전기 분무 이온화 탠덤 질량 분 광 법 (HPLC-ESI-MS/MS 및 HPLC-MS3)에 결합 된 HPLC는 DNA, 소변, 혈장 및 타 액과 같은 생물학적 매트릭스에서 변형 된 시드의 정량화를 위한 금 표준으로 발전 했습니다. 1 , 19 , 20. HPLC-ESI의 장점 (통상적으로 낮은 fmol 범위에서) 및 크로마토그래피 분리에 의해 제공 되는 높은 특이성, ii) 분자의 특성 및 공지 된 패턴이 질량 내부 단편화 및 iii) 다중 반응 모니터링 모드에서 선택 된 질량을 충전 비율 (m/z)에 대 한 정확한 측정이1,19. 동위 원소 표지 된 내부 표준의 사용은 DNA 가수분해 및 분석 물 농축 단계 동안 분자 손실에 대 한 교정 뿐만 아니라 샘플 간 분석 물질 이온화의 차이에 대 한 보정의 이점을 추가 합니다. 또한1개,12,19,20이상의 피크가 존재할 때 정확한 크로마토그래피 피크를 식별 하는 데 도움을 준다.

HPLC-ESI/ms에 기초한 몇 가지 방법은 상이한 생물학적 샘플 로부터 추출 된 8 옥 소 오 궈, 1,6-다도 및 1,n2-dado의 정량 분석을 위해 사용 되었다12,20 ,21,26,27,28,29 . 미 립 자 (PM2.5)는 염증을 유도할 수 있는 다 환 방향족 탄화수소 (pahs), 니트로 pahs, 알 데히드, 케 톤, 카 르 복 실 산, 퀴 놀 린, 금속 및 수용 성 이온과 같은 유기 및 무기 화학 물질을 운반 합니다. 산화 적 스트레스, 생체 분자 손상 및 질병의 발생을 선호 하는 조건30,31,32,33. 이 하, 본 원에 대 한 평가를 위하여 A/J 마우스의 폐, 간 및 신장 DNA에 8-옥 소 오그의 정량화를 위해 성공적으로 적용된 HPLC-ESI/ms 방법에 대 한 검증을 실시 하 고 있습니다. 앰비언트 PM2.5 노출34의 효과.

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Protocol

4 주 늙은 남성 A/J 마우스, 특정 병원 체 무료, 우 다 카오 Oswaldo 크루즈 (FIOCRUZ), 브라질 리오 데 자네이로의 실험실 동물의 사육 센터에서 얻어 졌다 고 의학 학부의 윤리 위원회에 따라 처리 하였다, 대학 (프로토콜 no 1310/09).

1. 생쥐 조직의 수집

  1. 동물에 게 xylazine 및 케 타 민를 마 취 시켰다. 체중 30g의 마우스의 경우, 케 타 민 및 복 강 내의 자일 라 딘 0.38 mg을 함유 2.63 하는 용액 (2 mL이 하)을 주입 하십시오.
  2. 보완 분석 (예: 항 산화 효소 활성, malondialdehyde 수준)을 위해 혈액 (0.5-1.5 mL)을 수집 합니다.
  3. 장티푸스 과정에 골반에서 복 부 머리를 면도. 털이 부 위에 수직 중간 선에 절 개를 하십시오. 복 부 장기를 노출 하기 위해 수평 횡 선에 절 개로 만드십시오.
  4. 복 부 대동맥을 절단 하 여 배설을 촉진 하 고 동물을 안락사 시킨다.
  5. 관심 있는 조직을 제거 하십시오 (이 경우, 간, 신장 및 폐).
    1. 간을 제거 하려면 열 등 한 정 맥과 포털 간 정 맥을 절단 하십시오.
    2. 신장, 섹션 신장 정 맥 및 동맥을 제거 합니다.
    3. 폐를 제거 하려면, 횡 경 막 말단 및 둘레를 흉부 벽에 가깝게 절 개 하십시오. 흉 강 내부에 시저를 열어 쇄 골을 깰. 폐와 심장을 노출 하기 위해, 기관을 향해 장티푸스 과정에서 extern 뼈를 잘라.
      1. 핀셋으로 폐를 잡고, 폐 주위의 기관과 인 대를 섹션. 조심 스럽게 블록 폐 플러스 마음을 제거 합니다. 블록에서 폐를 제거 하려면 핀셋으로 심장을 잡고 베이스의 모든 용기를 자릅니다.
  6. 차가운 식 염 수 용액 (0.9% 염화 물)에서 분리 된 조직을 즉시 세척 하 고 극저온 튜브로 옮겨 튜브를 액체 질소에 즉시 담 궈 냅니다. 작업을 완료 한 후-80 ° c에서 튜브를 저장 합니다.
    주의: 피부, 점 막 또는 눈에 직접 접촉 하는 액체 질소는 화상을 일으킴. 접촉을 피하기 위해 적절 한 개인 보호를 사용 합니다. 액체 질소 증기로 인 한 질 식 방지를 위해 통풍 실험실에서 작업 하십시오.

2. DNA 추출

참고: DNA 추출 방법은 Loureiro 외에서 수정 되었습니다 (2009)35 여기에서 연구 된 병 변의 분석을 허용 합니다.

  1. 조직이 포함 된 튜브를 드라이 아이스로 옮겨 주세요.
  2. 메스로 조직의 조각을 절단 하는 베이스로 얼음에 배치 된 배양 판을 사용 합니다. 무게 1g을 즉시 사용 하십시오. 나머지 조직은-80 ° c에서 보관으로 돌아올 때까지 드라이 아이스에 보관 해야 합니다.
    주: 분석의 반복이 필요한 경우 아티팩트 형성을 막기 위해 나머지 조직의 해 동을 피하는 것이 중요 합니다.
  3. 각 1 g의 티슈를 50 mL의 캡 튜브에 넣고, 0.5 mM 지연 제를 함유 하는 상용 세포 용 해 용액 10ml를 첨가 하 고 얼음을 유지 한다.
    참고: 즉시 사용할 수 있도록 용액 부피에 지연 소 아민을 추가 하십시오. 각각의 100 mL의 용액에 대해, 분 실 아민 메 실 레이트 염의 0.0328 g을 첨가 한다.
  4. 조직 절편 없이 균질 한 용액이 얻어 질 때까지 조직 균질 화기를 사용 하 여 조직을 균질 화 한다. 균질 화 하는 동안 (얼음에) 튜브 감기를 유지 합니다. 가 열을 피하기 위해 낮은 속도를 사용 합니다.
  5. 각각의 균질 화 된 샘플에 150 µ L의 프로 테이 나 제 K 용액 (20mg/ml)을 첨가 한다. 반전 하 여 튜브를 흔들어 밤새 실 온에서 그들을 유지.
  6. 40 µ L의 리본 uc임대할 용액 (15mg/ml)을 첨가 하 고, 역전 시켜 흔들어 2 시간 동안 실 온에서 튜브를 유지 한다.
    참고: 침전을 피하기 위해 아세테이트 완충 액 10mm, pH 5.2에 있는 용액을 리본 uc임대가 준비 하십시오. Deoxyribonuclease에서 무료로 용액을 얻기 위해 사용 하기 전에 15 분 동안 100 ° c에서 용액을가 열 합니다.
  7. 상용 단백질 침전 용액 5 mL를 첨가 하 고,와 류를 격렬 하 게, 2000 x g, 4°c에서 10 분간 원심 분리 한다.
  8. 상층 액를 10ml의 차가운이 소 프로 판 올 10ml를 포함 하는 50 mL의 뚜껑이 있는 튜브로 전달 합니다. 침전 된 DNA의 관찰까지 여러 번 부드럽게 튜브를 반전.
    참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지 하 고 튜브를-20°c에서 유지할 수 있습니다.
  9. 끝에 닫힌 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 침전 된 DNA를 수집 하십시오. 10mm 트리 트리 버퍼 4Ml(1mm 지연 소 아민), pH 7.0을 포함 하는 튜브로 이송 하십시오.
  10. DNA가 상기 용액에 완전히 용 해 된 후 (와 류 하지 않음), isoamyl 알코올의 4%를 함유 하는 클로로 포 름 용액 4 mL를 첨가 한다.
  11. 균질 화를 위해 튜브를 10 회 반전 하 고, 2000 x g, 4°c에서 10 분간 원심 분리 하 여 2 단계를 구분 하 고, 상부 상을 새로운 튜브로 이송 한다.
  12. 2.10 및 2.11 단계를 두 번 더 반복 합니다.
  13. 절대 에탄올 8ml과 5m 염화 나트륨 용액 0.4 mL을 첨가 하 여 DNA를 침전 시킵니다.
  14. 침전 된 DNA를 다시 모으고 3 mL 70%의 에탄올로 옮겨 준다. 이 단계를 한 번 더 반복 합니다.
  15. 에탄올 용액을 조심 스럽게 버리고 흡수 제 지에 침전 된 DNA를 포함 하는 튜브를 뒤집어 용액의 과잉을 제거 한다.
  16. 0.1 mM의 200 µ L을 추가 하 여 DNA를 용 해 시켰다. DNA가 완전히 다시 하이드레이션 될 때까지 4°c에서 튜브를 유지 하십시오 (하룻밤).
  17. 260/280 nm의 흡 광도 비율에 의해 260 nm에서의 흡 광도와 그 순도를 측정 하 여 DNA 농도를 결정 한다.
    참고: DNA 농도를 확인 하려면 DNA 용액의 10 µ L의 분 취를 초순 수의 990 µ L에 전달 하십시오 (100 배 희석). 260 nm에서 흡 광도 (이 하 이어야 한다 1) 50에 의하여 (50 µ의 농도는 260 nm에서 1 cm 경로 길이 용액의 흡 광도를 갖는 이중 가닥 DNA의 농도가 1)이 고 희석에 의해 사용 된 µ g/mL의 DNA 농도를 얻었다. 260 nm에서 흡 광도가 1 이상인 경우에는 추가 희석이 필요 합니다. 260/280 nm의 흡 광도 비율은 원하는 DNA 순도에 대해 같거나 1.8 이상 이어야 하며 1.6 주위의 비율은 허용 됩니다.

3. DNA 효소 가수분해

  1. 분석 레시피
    1. 1,nεdAdo 및 εdGuo 분석: DNA의 150 µ g을 포함 하는 분 취 액에 200 MM 트리 스/Mgcl2 버퍼 (pH 7.4), 1.4 µ l를 포함 하는 내부 표준 용액의 7.5 µ l을 추가 합니다. ] 1,nεdAdo 및 [15n5]1,n2~ εdGuo 및 deoxyribonuclease I. 최종 볼륨을 초순 수와 함께 200 µ l로 조정 하 고 3.2.1 단계에서 사용할 효소 볼륨을 뺍니다.
    2. 8-옥 사 궈 트 분석: 80 µ g의 DNA를 함유 하는 분 취 액에 200 mM 트리 스/mgcl 2 버퍼 7.4 (155n5] 8 옥 소 오이의 µ를 1000 함유 하는 내부 표준 용액의 3.8 µ l 및 deoxyribonuclease I의 8 단위를 첨가 하였다. 최종 볼륨을 초순 수로 100 µ L로 조정 하 고 3.2.2 단계에서 사용할 효소 볼륨을 뺍니다.
      참고: 내부표준 [15n5[1], εdAdo 및 [15n5] 1,n2-εdGuo 및 [15N5]8-옥 사 오 궈 수 있는 것을 특징으로 하는 설명35,36,37. 주입 된 샘플 볼륨의 내부 표준 수량은 주입 된 교정 곡선 볼륨과 같아야 합니다.
  2. 샘플을 1 시간 동안 37 ° c에서 배양 합니다.
    1. 3.1 단계의 샘플: 크로 탈 루스 아트로 에서 레이즈 I의 0.006 단위를 추가 하 고 소 창 자 점 막에서 알칼리 성 인산 가수분해의 15 단위.
    2. 3.2 단계의 샘플: 크로 탈 루스 아트로 에서 레이즈 I의 0.0032 단위를 추가 하 고 소 창 자 점 막에서 알칼리 성 인산 가수분해의 8 단위.
  3. 샘플을 1 시간 동안 37 ° c에서 배양 합니다.
  4. 샘플을 10 분 동안 14000 x g 로 원심 분리기.
  5. 3.2.1 단계에서 샘플: HPLC/DAD에의 한 deoxynucleosides의 정량화를 위해 각 시료의 10 µ L을 분리 합니다 (9 단계). 잔류 체적을 고체 상 추출에 적용 합니다 (단계 4).
  6. 3.2.2 단계에서 샘플: 80 µ L의 50의 주사를 위한 바이 알의 µ L (1000 fmol)을 HPLC-밀리/ms 시스템에 전달 한다. 나머지 20 µ L을 HPLC/DAD에의 한 dGuo의 정량화를 위해 예약 한다 (단계 9).

4.1, nεdAdo 및 1의 분석을 위한 고체 상 추출, n2-εdGuo

  1. 다음과 같은 일련의 용액을 1Ml로 카트리지 (SPE-C18, 30mg/ml, 33 µm 1Ml)를 로드 합니다. 100% 메탄올, 탈 이온 수, 가수분해 된 DNA 샘플, 탈 이온 수, 10% 메탄올 15% 메탄올 및 100% 메탄올 (수집).
    참고: 다른 솔루션의 응용 프로그램 사이에 카트리지를 건조 하 게 두지 마십시오. 이전 솔루션이 카트리지에 완전히 들어간 직후 다음 솔루션을 추가 합니다.
  2. Adducts를 포함 하는 마지막 용 출 분 획 (100% 메탄올)을 진공 건조 한다.
  3. 건조 된 샘플을 HPLC µ/MS 분석 직전 초순 수의 83.1 μ l로 소생 하 여 각 시료의 50 p L에서 각 내부 표준의 200 fmol을 얻었다.

5. 보정 곡선의 제조

  1. 각각의 지점에서 300의 6000 fmol의 고정 된 양의 1000 fmol을 포함 하는 8-옥 소 오 궈의 간격으로 최소 5 점을준비 한다. 주입 된 볼륨에서 이러한 양을 고려 하십시오.
  2. ΕdAdo 및 εdGuo의 고정 된 양의 200 fmol을 갖는 1, n-εdAdo[15n5] 1의 구간에서 적어도 5 개의 점 들을 준비 40 하는 것으로, N 각 지점에 2-εdGuo. 주입 된 볼륨에서 이러한 양을 고려 하십시오.
  3. DGuo와 Dguo의 0.05-1 nmol의 간격에서 적어도 5 점을 준비 하십시오. 주입 된 볼륨에서 이러한 양을 고려 하십시오.

6. 방법 검증을 위한 DNA 샘플의 제조

  1. εdAdo 및 εdGuo 분석: 다양 한 양의 1,nΕdAdo 및 1,n2εdGuo (예: 1.75, 8.75, 17.5 및 35 fmol) 및 고정 된 양의 [15n5] 1을 추가 ΕdAdo 및 [15n5] 1, n=2-350 εdGuo) 내지 µ의 종 아리 흉 선 DNA를 100 하 고 3 단계에서 설명한 바와 같이 효소 적 가수분해를 수행 한다. 2 개의 다른 날에 샘플을 사중으로 처리 하십시오. 샘플을 사용 하 여 방법 정확도 및 정밀 평가를 실시 합니다.
    참고: DNA 가수분해 물의 최종 부피는 200 µ L (단계 3)이 고,이 로부터 10 µ L은 HPLC/DAD에의 한 deoxynucleosides의 정량화를 위해 분리 될 것 이다 (단계 9). 나머지 용액 (190 µ L)은 고체 상 추출 (단계 4)을 거치게 되며, 건조 된 분 획은 83.1 µ L (단계 4.3)에서 재현 탁 될 것 이며,이 로부터 50 µ L이 HPLC-MS/MS 시스템에 주입 될 것 이다. 1, εdAdo 및 εdGuo 주입 되는 양은 1, 5, 10 및 20f200 mol이 고, 그 중의 fmol은 [15n5] 1, n 6 εdAdo 및 [15n5] 1, n 2-각 샘플에서 εdGuo.
  2. 8-옥 시 오도 분석: 734, 1468, 2938 및 4408 fmol)의 일정량을 추가 하 고 3 단계에서 설명한 바와 같이 종 아리 흉 선 DNA의2000 µg을 실시 하 고 효소 적 가수분해를 수행 한다. 2 개의 다른 날에 샘플을 사중으로 처리 하십시오. 샘플을 사용 하 여 방법 정확도 및 정밀 평가를 실시 합니다.
    참고: DNA 가수분해 물의 최종 부피는 100 µ L (단계 3)이 고,이 로부터 50 µ L은 HPLC-MS/MS 시스템에 주입 될 것 이다. 투입 되는 8 옥 소 오 궈의 양은 367, 734, 1469 및 2204 fmol이 될 것이 고, 각 시료에는 [15n5] 8 옥 사 오드의 1000 fmol이 있다.
  3. 13.125 fmol의 1, n=6εdAdo (주입 용적에서 7.5 fmol을 얻기 위해) 및 35 fmol의 εdGuo (주입 용적에서 20 fmol을 얻기 위해)를 8 개의 100 샘플에 µ 하 여 종 아리 흉 선 DNA를 추가 하였다.
    1. 내부 표준 [15n5〕 1, εdAdo 및 [15n5] 1, n2 200 εdGuo) 내지 4 개의 시료를 추가 한다. 모든 시료의 DNA 가수분해 및 고상 추출 과정을 진행 한다.
    2. 내부 표준 [15n5〕 1, εdAdo 및 [15n5] 1, n=2-200 εdGuo)을 다른 4 개의 샘플에 추가 한다.
    3. 샘플을 사용 하 여 고체 상 추출에서 시드와의 복구를 계산 합니다.

7.8 옥 소 오 궈의 HPLC-밀리초 분석

  1. 8-oxodGuo 표준을 장비에 주입 하 여 여러 반응 모니터링 (MRM)에의 한 조각화 패턴을 가장 잘 감지 하기 위해 ESI/MS 매개 변수를 설정 합니다. m/z 168 284, deoxyribose + h) +
    1. 15n5】 8 옥 오 궈의 검출에 동일한 파라미터를 사용 하는 경우: m/z 289 → 173 【 deoxyribose + 】+
      참고:이 작업에 사용 되는 장비와 동등 하거나 더 나은 장비를 사용 하십시오 ( 재료 표참조). 상기 표 1에 기재 된 바와 같이 ESI-MS/ms 파라미터가 설정 되었다.
  2. 필터 (0.22 µm 다공성 멤브레인을 사용 하 여) 및 모든 물 기반 HPLC 용 매 (초음파 분쇄기를 사용 하 여).
  3. 다음의 크로마토그래피 조건을 사용 하 여 분석을 수행 하 고, 그림 2와 같이 시스템을 장착 하십시오.
    주: 열 A는 2 진 펌프에 연결 됩니다. 이의 용 리 액은 도 2a에 도시 된 바와 같이, 크로마토그래피의 첫 번째 16 분 및 32에서 46 분으로 UV 검출 및 폐기물에 관한 것 이다. 이것은 주사 직후 샘플이 용 출 되는 열입니다. B 열은 등 용 매 펌프와 질량 분석기에 연결 됩니다. 이는 도 2b에 도시 된 바와 같이 밸브가 전환 되는 경우에만 16-32 분 간격으로 칼럼 A의 용 리 액을 받는다. 밸브 전환은 이진 펌프 구배에 의해 용 출 되는 두 열 사이의 연결을 허용 한다. 도 2b 에 도시 된 구성은 더 피크 분리 및 협 착을 허용 한다. 추가적으로, 관심의 크로마토그래피 분 율만 질량 분석기에 도달 하 여 민감도와 선택 성을 향상 시킵니다.
    1. 50 x 2.0 mm 아이디, 2.5 µm, 3.0 µ L/min의 유 속에서 0.1% 개미 산 (용 제 a)과 메탄올을 함유 하는 c18 보안 가드 카트리지 (4.0 x 0.1 mm 내경)와 결합 하 여 사용 하 고 있습니다. 25°c.
      1. 이진 펌프에 대해 다음 그라데이션 프로그램을 사용 합니다. 0 ~ 25 분, 용 매 B의 0-15% 25 내지 28 분, 15-80%의 용 매 B; 용 매 B의 28 내지 31 분 80%; 31 내지 33 분, 80-0%의 용 매 B; 33 ~ 46 분, 용 매 B의 0%
      2. 스위칭 밸브를 사용 하 여 처음 16 분간의 용 리 액을 낭비 하 고 16-32 분 분 획을 두 번째 열로 향하게 합니다 (150 x 2.0 mm 내경, 3.0 µm, C18, 도 2의 B 열). 15% me의 용액을 가진 등 용 매 펌프에 의해 컨디셔닝 됨 0.1%의 개미 산 (150 µ L/min)을 함유한 물에 thanol.
        참고: 스텝 7.3.1.2의 스위칭 밸브 프로그램을 사용 하기 전에, 16 분 후의 첫 번째 열에서 8 옥 소 오 궈의 표준 통근 여부를 확인 하십시오. 2 진 펌프의 기울기를 사용 하 여 두 번째 열에서 8-옥 소 궈와 날카로운 크로마토그래피 피크를 얻기 위해 32 분에 밸브를 닫는 것이 중요 합니다. 상기 병 변의 8-옥 소 궈에서 두 번째 열 로부터 약 36 분의 시간-사용 되는 컬럼 및 장비에 따라 분석 물질의 체류 시간의 변형이 발생할 수 있다. HPLC 용 매 그라데이션 프로그램의 조정이 필요할 수 있습니다.

Figure 2
그림 2입니다. 8-옥 소-7, 8 디 하이드로 deoxyguanosine) 분석에 사용 되는 두 개의 열 시스템. A) 상기 크로마토그래피의 최초 16 분 32에서 46 분으로 사용 하는 구성; B) 간격 16-32 분에 사용 되는 구성으로, 질량 분석기의 ESI 공급원에 용 출 되기 전에 b 열에서의 분리 및 피크 협 착을 허용 한다. 이 그림은 올리베이라 외.34에서 다시 게시 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

8. εdAdo 및 1, n2-εdGuo의 HPLC-ESI /ms 분석

  1. 1,nεdAdo 및n2εdGuo 표준을 장비에 주입 하 여 여러 반응 모니터링 (MRM)을 통해 조각화 패턴을 가장 잘 감지 하기 위해 ESI/ms 매개 변수를 설정 합니다. 276/εdAdo/m/z 292의 검출을 위해, deoxyribose에 대 한 + 176 → m ・ 2 ~ deoxyribose + h를 감지 하는 경우에는 【 m 160 + h 】 + ]+ 1,N2-εdGuo 검출 용
    1. 동일한 파라미터를 사용 하 여 [ 15n5] 1, εdAdo에 대 한 검출에는 281의 경우에는 deoxyribose +) 및 [15n(m2' ~ 165 5[n2-εdGuo 181 297에 대 한 deoxyribose +)을 제공 하는 것이 가장 편리 하 게 합니다. 표 1에 설명 된 대로 ESI/ms 매개 변수를 설정 합니다.
ESI-MS/MS 파라미터 8-옥 소 궈 에 세 노 시드와
커튼 가스 20 psi 20 psi
분무 가스 55 50
이온 소스 가스 50 psi 40 psi
충돌 유도 해리 가스 매체 매체
이온 스프레이 전압 5000 4500
ESI 프로브 온도 450 450
부패 가능성 31v, 8 옥 소 궈 41 V, 1, N6-εdAdo
31v, 【15N5】 8 옥 소 오 궈 41, [15n5] 1, n6-εdAdo
45 V, 1, N2-εdGuo
45V, [15n5] 1, N2-εdGuo
충돌 에너지 23 eV, 8 옥 오 궈 25ev, 1, N6-εdAdo
23ev, 【15N5】 8 옥 소 오 궈 25ev, 【15n5】 1,6εdAdo
27ev, 1, N2-εdGuo
27ev,[15n5] 1, n2-εdGuo
충돌 세포 출구 전위 16v, 8 옥 사 궈, 8 V, 1, N6-εdAdo
16v[15n5] 8 옥 소 오 궈 8v, [15n5] 1, N6-εdAdo
16 V, 1, N2-εdGuo
16v, [15n5] 1, N2-εdGuo
입학 잠재력 10v 10v

표 1. DNA 병 변의 검출을 위한 ESI-MS/MS 장비에 사용 되는 파라미터. 이 테이블은 올리베이라 외34에서 수정 되었습니다.

  1. 필터 (0.22 µm 다공성 멤브레인을 사용 하 여) 및 모든 물 기반 HPLC 용 매 (초음파 분쇄기를 사용 하 여).
  2. 분석을 위해 다음과 같은 크로마토그래피 조건을 사용 하십시오.
    1. 150 x 2.0 mm 내경, 3.0 µm, C18 칼럼 55mm 암모늄 아세테이트, pH 3.0 (용 제 A) 및 아 세토 니트 릴 (용 매 A)과 25°c의 유 속에서 µ를 갖는 C18 보안 가드 카트리지 (4.0 x 6.6 mm)에 결합 합니다.
      1. 이진 펌프에 대해 다음 그라데이션 프로그램을 사용 합니다. 0 ~ 10 분, 0%의 용 매 B; 10 내지 39 분, 용 매 B의 0-20%; 39 내지 41 분, 용 매 B의 20-75%; 41 내지 46 분, 용 매 B의 75%; 46 ~ 47 분, 75-0%의 용 매 B; 47 ~ 60 분, 용 매 B의 0%
      2. 스위칭 밸브를 사용 하 여 첫 35 분의 용 리 액을 낭비 하 고 35-42 분 분 획을 ESI 소스에 직접 연결 합니다. 설정 된 간격 (35-42 분)의 열에서 부가 물 표준이 지정 되어 있는지 확인 합니다. 필요한 경우 조정 하십시오.

9. deoxyribonucleosides-자외선에의 한 정상 2 '의 정량화

  1. 이 작업에 사용 된 장비와 유사한 장비를 사용 하십시오 ( 재료 표참조).
  2. 엘 트 250 mm x 4.6 mm 아이디, 5 µm, C18 열 c18 보안 가드 카트리지 (4.0 x 3.0 mm 내경)에는 0.1의% 포 름 산과 메탄올이 그라데이션 되어 있습니다.
    1. 다음 그라데이션 프로그램을 사용 합니다. 0 ~ 25 분, 0 ~ 18% 메탄올; 25 내지 27 분에서, 18 내지 0% 메탄올; 1Ml/min 및 30°c의 유 속에서 27 ~ 37 분, 0% 메탄올).
    2. 2 '-deoxynucleosides 정량화를 위해 예약 된 각 샘플의 5 µ L을 주입 합니다.
    3. DGuo와 Dguo 봉우리의 통합을 위해 260 nm에서 DAD 검출기를 설정 합니다.

10. DNA 병 변의 정량화

  1. 8 옥 소 오드 구 오의 봉우리 들을 통합 하 고, [15n5] 8oxodεdAdo, 1, 5 n, 1, n2, εdAdo 및 [15n5] 1, n 2 -εdGuo/ms 분석에서.
    1. 8Oxod궈의 면적 비율을 계산 하 고, [15n5] 8oxod궈, εdAdo, n2, εdAdo 및 n2 εdGuo/[15n5]를 ] 1,εdGuo는 검 량 곡선과 시료를 위한 것 이다.
    2. Y 축에서 10.1.1 단계에서 얻은 면적 비율 및 x 축의 각 점에 존재 하는 분석 물의 양을 사용 하 여 보정 곡선을 플로팅합니다.
    3. 단계 10.1.2의 10.1.1 및 보정 곡선에서 계산 된 비율을 사용 하 여 주입 된 각 샘플에서 병 변의 양 (fmol)을 계산 합니다.
  2. HPLC-UV 분석에서 dGuo와 Dguo의 봉우리를 통합 합니다.
    1. Y 축에서 10.2 단계에서 얻은 영역과 x 축의 각 점에 존재 하는 분석 물의 양을 사용 하 여 보정 곡선을 플로팅합니다.
    2. 단계 10.2.1의 10.2 단계 및 보정 곡선에서 얻어진 영역을 이용 하 여 주입 된 각 시료에서 dGuo과 Dguo의 양 (nmol)을 계산 한다.
  3. 10.2.2 단계에서 계산 된 양이 5 µ L의 샘플 부피 내에 존재 하는 것을 고려 하 여 HPLC-ms/ms 시스템에 주입 된 각 시료에 존재 하는 dGuo 및 Dguo의 양 (nmol)을 계산 하 고, 50 µ L을 HPLC-MS/MS 시스템에 주입 하였다.
    참고: 8-옥 소 오 궈 분석에 사용 되는 샘플에서 dGuo의 양을 계산 하기 위해 10.2.2 단계에서 얻어진 양 (nmol/µ L)을 50으로 곱합니다. 1, εdAdo 및 εdGuo의 분석에 사용 되는 샘플에서 dAdo 및 Dado의양을 계산 하기 위해 고체 상 추출후의 농도 단계를 고려 하십시오. Μ/MS 시스템에 주입 된 50의 부피는 원래 샘플의 114.32 µ L에 해당 한다. 단계 10.2.2에서 얻은 양 (nmol/µ L)은 올바른 값을 얻기 위해 114.32를 곱하여 야 합니다.
  4. 상기 몰 분 획을 계산 하는 8-옥 소 구 오/dguo, n2-εdGuo/dguo. 상기 비율 (fmol 병 변/nmol 정상 deoxynucleoside)은 정상 dGuo 또는 Dguo 10 개 당 병 변의 수를 부여 한다.

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Representative Results

마우스 간에 서 얻어진 평균 DNA 농도 (±sd), 폐 (~ 0.2 g 조직) 및 신장 (~ 0.4 g 조직)은 각각 5068 ± 2615, 4369 ± 1021 및 3223 ± 723 µ µ L의 최종 부피로 하였다. 정제 된 DNA의 HPLC-DAD에 의해 얻어진 대표적인 크로마 토 그램을 도 3에 나타내 었 다. 해당 2 '-deoxynucleosides 직전에 용 리 RNA ribonucleosides에서 자유로운 4 개의 2 '-deoxynucleosides의 존재는 DNA 순수성을 보여줍니다.

크로마 토 그램에서의 정량화를 위한 HPLC-MS/MS 분석에서의 대표적인 것으로는,도 1,n2 내지 εdAdo 및 εdGuo의 생쥐조직 DNA 샘플에 대 한 세포 내 유전자 시료가 4 내지 6에 도시 되어 있다. 도 4 에서 UV 검출을 통해 얻어진 크로마 토 그램은 8-옥 사 오이 오 스에서 분리가 잘 되 고 바람직하지 않은 간섭을 제거 하 여 1 열에서 ~ 10 분까지 deoxynucleosides 용 리 된 4 개의 2 '를 보여준다. 정상 2 '-deoxynucleosides는 고체 상 추출 과정에서 제거 되었기 때문에 1,n6ΕdAdo 및 1,n2εdGuo의 분석에 존재 하지 않았다. 이 작업에 사용 된 표준의 질량 스펙 트 라가 그림 7에 나와 있습니다.

8oxod궈의 정량화를 위한 대표적인 선형 교정 곡선, 1, εdAdo 및 εdGuo를도 34 8에 나타내 었 다. 상기 방법은 표 234에 제시 된 것과 같이 정확 하 고 정밀한 것 이었다. 367 fmol의 8-옥 소 오 궈로 보충 된 DNA 분 취에 대해 계산 된 간 정밀도는 16.97% 이었고, εdGuo의 10fmol으로 보충되 고, n2-εdAdo는 14.01%로 보완 되 고 1fmol의 1로 보충 되 고,N6내지 16.66% 였다. 칼럼에 주입 된 기준에 대 한 정량 (에 스/n=10)의 한계는 8 옥 소 오 궈에 대 한 25fmol, εdAdo에 대 한0.3 fmol, n2-εdGuo34에 대 한 1fmol 이었다.

상기 방법은 8 옥 소 오 그로의 정량화에 적용 하였으며, 1,n2-εdGuo 및 εdAdo의 폐암, 간, 및 신장에 있는 A/J 마우스 조직 내에 전신을 노출 시킨 DNA 샘플에 대 한 전 동체를 PM2.5에 비해 풍부 하 게 구비 연구 대조 군으로 서 현장 주변 공기에 노출 된 것은34. 발견 된 수준은 표 3에 나타나 있으며, PM2.5 노출34에의 한 폐, 간 및 신장에서의 DNA 병 변의 유도를 나타낸다.

Figure 3
그림 3 . 마우스 폐 로부터 추출 된 DNA 샘플의 가수분해 크로마 토 그램. 크로마 토 그램은 HPLC-DAD 시스템에서 260 nm에서 얻었다. Deoxynucleosides 4 개는 dC, 2 deoxycytidine로 표시 됩니다. 다, 2 '-deoxyadenosine; dG 2 '-deoxyguanosine; dT, 2 '-deoxythymidine. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 . 8- 옥 소-크로마 토 그램 ´와 deoxyguanosine의 내부 표준 [15n5] 8 옥 소 오 궈의 검출을 나타내는 대표적인 것으로, 통상 2 '-deoxynucleosides를 비롯 하 여 HPLC-ms/ms 첫 번째 컬럼에서 용 출 되 고 DAD 검출 (λ = 260 nm) 및 폐기물에 우회 한다. DNA 샘플을 마우스 폐에서 추출 하였다. HPLC-ESI-MS에의 한 분석은 이미지에 지정 된 파편을 사용 하 여 다중 반응 모니터링 (MRM)으로 수행 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 5
그림 5 . 1의 검출을 나타내는 대표적인 크로마 토 그램, N 6 -´-deoxyadenosine (εdAdo) 및 내부 표준 [15n5]1, N 6 -εdAdo에의 한 HPLC-밀리 DNA 샘플을 마우스 신장에서 추출 하였다. 분석은 이미지에 지정 된 파편을 사용 하 여 다중 반응 모니터링 (MRM)으로 수행 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 6
그림 6 . 1의 검출을 나타내는 대표적인 크로마 토 그램, N 2 -´-deoxyguanosine (εdGuo) 및 내부 표준 [15n5]1, N 2 -εdGuo에의 한 HPLC-밀리 DNA 샘플을 마우스 간에 서 추출 하였다. 분석은 이미지에 지정 된 파편을 사용 하 여 다중 반응 모니터링 (MRM)으로 수행 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 7
그림 7 . 이 작업에 사용 되는 표준의 질량 스펙 트 라. 스펙트럼은 20ev의 충돌 에너지를 사용 하 여 MS2의 [M + H]+ 이온을 절편 하 여 얻었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 8
그림 8 . 8 옥 소-7, 8 디 하이드로 deoxyguanosine의 정량화를 위한 HPLC-ESI를 통해 얻어진 검 량 곡선, 1,n2에 ´-deoxyguanosine) 및 1, 2에 니에타 오이 아 ´-Deoxyadenosine2-εdAdo)를 제공 합니다. 상대 영역은 병 변과 각각 [15n5] 내부 표준의면적 비율을 의미 한다. 이 수치는 올리베이라 외34에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

ESI-MS/MS 파라미터 8-옥 소 궈 에 세 노 시드와
커튼 가스 20 psi 20 psi
분무 가스 55 50
이온 소스 가스 50 psi 40 psi
충돌 유도 해리 가스 매체 매체
이온 스프레이 전압 5000 4500
ESI 프로브 온도 450 450
부패 가능성 31v, 8 옥 소 궈 41 V, 1, N6-εdAdo
31v, 【15N5】 8 옥 소 오 궈 41, [15n5] 1, n6-εdAdo
45 V, 1, N2-εdGuo
45V, [15n5] 1, N2-εdGuo
충돌 에너지 23 eV, 8 옥 오 궈 25ev, 1, N6-εdAdo
23ev, 【15N5】 8 옥 소 오 궈 25ev, 【15n5】 1,6εdAdo
27ev, 1, N2-εdGuo
27ev,[15n5] 1, n2-εdGuo
충돌 세포 출구 전위 16v, 8 옥 사 궈, 8 V, 1, N6-εdAdo
16v[15n5] 8 옥 소 오 궈 8v, [15n5] 1, N6-εdAdo
16 V, 1, N2-εdGuo
16v, [15n5] 1, N2-εdGuo
입학 잠재력 10v 10v

표 1. DNA 병 변의 검출을 위한 ESI-MS/MS 장비에 사용 되는 파라미터. 이 테이블은 올리베이라 외34에서 수정 되었습니다.

기저 수준 추가 감지 감지 됨 (-) 기초 정확도 이력서
평균 ± SD (fmol) fmol 평균 ± SD (fmol) 평균 (fmol) % %
8-옥 소 궈
373.00 ± 2.71 0 372.79 ± 50.6 - - 13.57
373.98 ± 4.86 367 755.41 ± 107.92 381 103.93 14.29
374.84 ± 5.19 734 1069.57 ± 108.51 695 94.65 10.14
357.94 ± 15.05 1469 1671.67 ± 44.27 1314 89.43 2.65
371.07 ± 2.43 2204 2272.01 ± 40.2 1901 86.25 1.77
1, N2-εdGuo
0.54 ± 0.01 0 0.54 ± 0.09 - - 16.88
0.54 ± 0.01 1 1.47 ± 0.16 0.93 93.39 11.17
0.55 ± 0.01 5 5.30 ± 0.72 4.76 95.11 13.50
0.53 ± 0.01 10 10.60 ± 0.39 10.06 100.63 3.67
0.54 ± 0.01 20 20.20 ± 0.93 19.66 98.29 4.60
1, N6-εdAdo
2.08 ± 0.10 0 2.29 ± 0.39 - - 17.05
2.05 ± 0.04 1 3.06 ± 0.47 1.01 100.89 15.31
1.99 ± 0.06 5 7.87 ± 1.66 5.88 117.60 21.10
2.03 ± 0.07 10 12.43 ± 1.25 10.41 104.06 10.06
1.97 ± 0.03 20 22.42 ± 3.89 20.46 102.29 17.34

표 2. 8-옥 소 궈의 정량화를 위한 방법 정밀도 및 변이 계수 (CV), 1 N 2 - εdGuo 및 1, N 6 -DNA에 εdAdo. 이 테이블은 올리베이라 외34에서 수정 되었습니다.

주변 공기 PM2.5             N P 값
평균 ± SEM 평균 ± SEM   
8 옥 소 오 궈/108 dguo 2124 ± 56.96 2466 ± 93.10 6 0.01
1, n2-εdGuo/108 다이 Nd Nd - -
1, N6-εdAdo/108 dado 1.41 ± 0.23 1.44 ± 0.13 7 Ns
8 옥 소 오 궈/108 dguo 2848 ± 183.5 2949 ± 223.8 6 5 Ns
1, n2-εdGuo/108 다이 7.79 ± 2.49 24.94 ± 5.21 4 0.02
1, N6-εdAdo/108 dado 2.82 ± 0.30 2.18 ± 0.25 6 Ns
신장
8 옥 소 오 궈/108 dguo 1854 ± 87.13 2363 ± 157.0 6 0.02
1, n2-εdGuo/108 다이 Nd Nd - -
1, N6-εdAdo/108 dado 1.09 ± 0.15 1.52 ± 0.12 7 0.04
(NS, 중요 하지 않음; ND, 감지 되지 않음)

표 3입니다. A/J 마우스 조직 샘플에서 DNA 병 변의 수준. 상기 마우스는 대기 및 대기에 노출 되었고 오후2.5 (오후2.5 농축 30 회)에 공기를 농축 시켰다. 두 그룹 사이의 의미 (대기 및 PM2.5)는 t 검정을 사용 하 여 비교 하였다. P 값이 0.05 미만인 경우 결과는 통계적으로 유의 한 것으로 간주 되었다. 이 테이블은 올리베이라 외34에서 수정 되었습니다.

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Discussion

HPLC 방법에의 한 8-옥 시 오드 구 오 분석에서 발견 되는 주요 문제점은 dna 추출, dna 가수분해 및 dna 가수분해 물의 농축 과정 중에 그 형성의 유도가22,38이다. 8-옥 시 오 스의 아 티 사실 형성의 문제를 최소화 하기 위하여, 모든 DNA 추출, 저장 및 가수분해 용액에 지연 소 아민을 첨가 하는 것이 좋으며,이는 요오드 화 나트륨의 사용과 DNA 추출 시 페 놀의 회피 방법 및 잘 가수분해 과정에서 100 µ g에 가까운 DNA 양의 사용으로 최종 결과39에 대 한 스 퓨 리 어스 산화의 기여를 최소화 한다. 우리는 DNA 추출을 위한 나트륨 요오드 화 차 열 법의 사용을 제외 하 고, 위에서 인용한 권고를 고려 했다. 대신, 간단 하 게, 우리는 DNA 추출을 위한 상업적인 해결책을 사용 하 고, 사용 하기 전에 그들에 연기 된 아민을 추가 했습니다. 또한, 얻어진 DNA 가수분해 물은 통상의 시드에서 8-옥 사 궈의 이전 분리를 위해, ESI-MS/MS 시스템의 첫 번째 칼럼에 직접 주입 하였다. 8-옥 소 궈의 용 출 직전에, 전환 밸브는 제 1 칼럼 용 리 액을 추가 분리 및 피크 협 착이 달성 된 제 2 컬럼에 전환 하기 위해 사용 되었다. 이 접근법은 간섭 으로부터 자유로운 8 옥 소 오이의 정량에 대해 적절 한 민감성을 허용 하였다. DNA에 있는 8-옥 소 오 궈의 정량화를 위한 가장 유사한 접근 방법에 의해 설명 되었다 차오와 동료22, 표본 정리를 위한 함정 열을 사용 하는 사람 및 8 옥 사 오 궈 보존에 대 한 샘플 용 출 전에 분석 컬럼에, 전환 밸브를 사용 하 여 열입니다. 대안적으로, hplc-ESI-ms/MS 분석에 앞서 DNA 가수분해 물 들을 분리 하 여 용 출 분 획 으로부터 채취 된 8 옥 소 오 궈의 농도 단계는 훨씬 더 힘든 것으로15를 수행 하였다.

HPLC 분석을 기반으로 설치류 폐 조직에서 8 옥 소 오 궈의 기저 수준 보고, 범위 180 -450/108 dguo23,39,4142, 43, 1340 dguo44, 또는 약 3000/108 dguo45,46, 요오드 화 나트륨을 이용 하 여 DNA 추출 방법 으로부터 얻어진 가장 낮은 값을 갖는다. 주위 공기에 노출 된 마우스의 폐에 여기에서 발견 되는 평균 8-옥 소 궈 레벨은 2124 /10의 dguo 였다. 2466 PM2.5 (표 3)34의 주변 공기에 노출 된 동물 들에 게는 수준 증가/108 dguo로 상승 하였다. 요오드 화 나트륨을 이용 하 여 DNA를 추출 하 여 그룹 간 차이를 검출 하는 감도를 향상 시킬 수 있다. 본 연구에서, 폐, 신장 및 간 DNA가 각각 2.0, 1.8 및 2.7 시간 보다 높은 중간 기저 수준에서 발견 되는 평균 8 옥 소 구 오도 수준으로 유럽 표준 위원회가 얻어진 산화 돼지 간38의 표준 시료에서 추출한 dna의 8 옥 사 오 궈의 실험실 간 평가에서 dna 손상 (에 스 트 리드).

이 병 변은 매우 낮은 수준에서발생 하기 때문에 DNA의 1, ΕdAdo 및 1,n2-εdGuo의 검출에 대 한 주요 제한은 방법 감도 이다. DNA에 있는 1,n2-dguo의 최저 수준은 HPLC-ESI-ms/ms에 의해 정량 하였으며, 인간 세포 라인과 랫 트 조직 (25)에서 10 개 dguo 당 0.87 병 변의 범위에서47. 그들의 정량화에 대 한 민감도 및 선택 성을 개선 하는 한 가지 방법은 고체 상 추출을 사용 하 여 큰 샘플의 DNA 가수분해 물을 농축 하는 것 이다. 이 정화 단계는 100 µ g DNA 가수분해 물의 주사로 HPLC 분석 컬럼에 발생할 수 있는 크로마토그래피 문제를 해결 합니다. 여기에 제시 된 검증 된 방법으로이 접근법을 사용 했습니다. 이 연구34 에서 검출 된 1,N6-εdAdo의 수준은 울트라 감 작 면역 친화성/32P-포스트 라벨링48,49 채용한 연구에서 얻어진 범위 내에 속합니다 50 , 51 및 다른 그룹에 의해 설명 되는 것 보다 낮은 것이 고, HPLC-ESI를 채용 한다. 유사 하 게, 여기서34 정량화 된 1,N2-ΕDGUO 수준은 HPLC-ESI/ms를 사용 하 여 가르시아25 및 안 젤리26 에 의해 보고 된 최저 수준과 일치 한다.

이 연구에서 사용 되는 장비 보다 감도가 높은 HPLC-ESI/MS 시스템을 사용할 수 있습니다. 이러한 시스템의 사용은 조직 가용성이 제한 되는 상황에 대 한 여기에 제시 된 방법의 응용 프로그램을 확대 DNA의 작은 양의 분석을 할 수 있습니다. 여기에 제시 된 방법은 그들의 표준 및 동위 원소 표준의 가용성에 따라 다른 수정 된 deoxynucleosides의 정량화를 위해 적응 될 수 있다. 분석에 포함 된 모든 분자의 날카로운 피크를 얻기 위해서는 크로마토그래피 조건의 조정이 필요 합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

Universidade 및 2012/08616-8 429184/2016-6 454214/2014-6), INCT 나이 라 (Pó-reitas 드 페 스 퀘이 사 다이 라 데 상 파울로), 프라 푸 프 (Pró-이 라이 타로 데 페 사 다스), 트 라이 라 (cccfpq) 2012/22190-3 채찍/파 마/자 위; 573813/2008-6), INCT Redoxoma (대 본) 573530/2008-4), NAP Redoxoma (PRPUSP; 2011.1.9352.1.8) 및 CEPID Redoxoma 2013/07937-8). (2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) 및 망 토에의 한 장학금을 수 여 받았다 (이에 대 한 자세한 내용은이에 대 한)를 제공 하는 것입니다. M. h. 메 데이 루스, p. 디 마 시 오, p. 에이치. 살 디바, 그리고 p. m. Loureiro는 CNPq에서 펠로 우 십을 받았다.

이 작품에 존재 하는 일부 수치와 표는 원래 올리베이라 A.A.F. et al에 출판 되었습니다. 브라질 상파울로 시에서 집중 된 주변 미세 미 립 자 물질 (PM2.5)에 노출 된 쥐에서의 유전 독성 및 후에독성 효과. 입자 및 섬유 독성 학. 40 (2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[15N5]-2’-deoxyadenosine Cambridge Isotope Laboratories NLM-3895-25
[15N5]-2’-deoxyguanosine Cambridge Isotope Laboratories NLM-3899-CA-10
acetonitrile Carlo Erba Reagents 412413000
alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa Sigma P5521
ammonium acetate Merck 101116
calf thymus DNA Sigma D1501
cell lysis solution QIAGEN 158908
chloroform Carlo Erba Reagents 412653
deferoxamine Sigma D9533
deoxyribonuclease I (DNase I) Bio Basic Inc DD0649
ethanol Carlo Erba Reagents 414542
formic acid Sigma-Aldrich F0507
HPLC-ESI-MS/MS system HPLC: Agilent 1200 series            ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).                                                            ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.
HPLC/DAD system Shimadzu Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)
HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 µm, C18) Phenomenex 00B-4446-B0
HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 µm, C18) Phenomenex 00F-4251-B0
HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 µm, C18) Phenomenex 00G-4252-E0
HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.) Phenomenex AJO-4287
isoamyl alcohol Sigma-Aldrich M32658
isopropyl alcohol (isopropanol) Carlo Erba Reagents A412790010
ketamine Ceva Commercial name: Dopalen
magnesium chloride Carlo Erba Reagents 349377
magnesium chloride Sigma M2393
methanol Carlo Erba Reagents L022909K7
phosphodiesterase I from Crotalus atrox Sigma P4506
protein precipitation solution QIAGEN 158912
proteinase K Sigma-Aldrich P2308
ribonuclease A Sigma R5000
sodium chloride Sigma-Aldrich S9625
SPE-C18 (Strata-X) Phenomenex 8B-S100-TAK
tris(hydroxymethyl)-aminomethane Carlo Erba Reagents 489983
xylazine Syntec do Brasil Commercial name: Xilazin

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