Количественное определение трех поражений ДНК с помощью масс-спектрометрии и оценки их уровней в тканях мышей, подвергшихся воздействию мелких твердых частиц

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мы описываем здесь методы для чувствительной и точной количественной оценки поражений 8-оксо-7, 8-дигидро-2'-дезоксигуанозин (8-Окродго), 1,n6-этено-2'-дезоксиаденозин (1,n6-Дадо) и 1,n2- этено-2'-дезоксигуаньзин (1,N2-ДГО) в ДНК. Эти методы применялись при оценке воздействия мелких твердых частиц (ТЧ2,5) в тканях (легких, печени и почек) подвергшихся воздействию A/J мышей.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Franco de Oliveira, T., Falcão de Oliveira, A. A., Lemos, M., Veras, M., Saldiva, P. H., Gennari de Medeiros, M. H., Di Mascio, P., de Melo Loureiro, A. P. Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter. J. Vis. Exp. (147), e59734, doi:10.3791/59734 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ДНК-протоки и окисленные базы ДНК являются примерами повреждений ДНК, которые являются полезными биомаркерами для оценки токсичности веществ, которые электрофильные, генерировать реактивные электрофилы при биотрансформации, или индуцировать окислительный стресс. Среди окисленных нуклеобаз наиболее изученной является 8-оксо-7, 8-дигидрогуанин (8-Оксигуа) или 8-оксо-7, 8-дгидро-2'-дезоксигуаньзин (8-Окродго), биомаркер окислительно индуцированного базового повреждения в ДНК. Альдегиды и эпоксидииды в результате процесса перекисного окисления липидов являются электрофильными молекулами, способными образовывать мутагенные экзоциклические ДНК-протоки, такие как эгенские аддукты 1,n2-этено-2'-дезоксигуанозин (1,n2- в) и 1,n6-этено-2'-дезоксиаденозин (1,n6-на-в), которые были предложены в качестве потенциальных биомаркеров в патофизиологии воспаления. Селективные и чувствительные методы для их количественной оценки в ДНК необходимы для разработки профилактических стратегий для замедления темпов мутации клеток и развития хронических болезней (например, рака, нейродегенеративных заболеваний). Среди чувствительных методов их обнаружения (высокопроизводительного жидкостного хроматографии в сочетании с электрохимическим или тандем масс-спектрометрических детекторов, кометы анализ, иммуноанализы, 32P-постмаркировки), наиболее избирательным являются те, основанные на высокой производительности жидких хроматографии в сочетании с тандем масс-спектрометрии (HPLC-ЭСИ-МС/МС). Селективность является существенным преимуществом при анализе сложных биологических образцов и HPLC-НЕЗИ-МС/МС превратилась в золотой стандарт для количественной оценки модифицированных нуклеолы в биологических матрицах, таких как ДНК, моча, плазма и слюна. Польза изотопно чистых маркированные внутренне стандарты добавляет преимущество коррекций для потерь молекулы во время этапов гидролиза дна и анализата обогащения, также, как для разницы анализирована ионизации между образцами. Это также помогает в идентификации правильной хроматографической пик, когда более чем один пик присутствует.

Мы представляем здесь проверены чувствительной, точной и точной HPLC-НЕЗИ-MS/MS методы, которые были успешно применены для количественной оценки 8-oxodGuo, 1,N6-Дадо и 1,n2-ДГО в легких, печень и почки ДНК A/J мышей для Оценка воздействия окружающей среды ТЧ2,5 .

Introduction

Некоторые активные виды кислорода (ROS) способны окислять двойные углеродные связи баз ДНК и некоторые углероды в дезоксирибозе, создавая окисленные базы и разрывы ДНК-нити1. В качестве отрицательно заряженной молекулы, богатой атомами азота и кислорода, ДНК также является мишенью для электрофильных групп, которые ковалентно реагируют с нуклеофильных участков (азота и кислорода), давая продукты, которые называются ДНК аддуктов2. Таким образом, ДНК-аддукты и окисленные базы ДНК являются примерами повреждений ДНК, которые являются полезными биомаркерами для оценки токсичности веществ, которые электрофильные, генерировать реактивные электрофилы при биотрансформации, или индуцировать окислительный стресс1, 2. Хотя модифицированные базы ДНК могут быть удалены из ДНК с помощью базы или эксцизии нуклеотидов (BER или NER), индукция дисбаланса между генерацией и удалением поражений ДНК в пользу первого приводит к чистому увеличению их уровней в сверхурочных ДНК3 < /C5 >. Результаты являются увеличение скорости мутации ДНК, снижение экспрессии генов, и уменьшилась активность белка2,4,5,6,7, эффекты, которые тесно связаны с развития болезней. Мутации ДНК могут влиять на различные клеточные функции, такие как клеточная сигнализация, клеточный цикл, целостность генома, стабильность теломер, эпигеном, Структура хроматина, РНК-сплайсинг, протеиновый гомеостаз, метаболизм, апоптоз и клеточная дифференциация8 ,9. Стратегии, направленные на замедление темпов мутации клеток и развитие хронических заболеваний (например, рак, нейродегенеративные заболевания) проходят через знание источников мутации, среди них, поражения ДНК и их причины.

ROS генерируемые эндогенно в избытке, из-за воздействия загрязнителей, стойкие воспаления, патофизиологии болезни (например, диабет) и т.д., являются важными причинами био повреждения, включая ДНК и повреждение липидов1. В качестве примера, Высокореактивные гидроксильные радикальные (OH) формируется из H2O2 уменьшение переходных ионов металлов (Fe2 +, Cu+) окисляет ДНК баз, ДНК сахара Моисея и полиненасыщенных жирных кислот при диффузии контролируемых ставки10. Среди 80 уже охарактеризовано окисленные нуклеобазы3, наиболее изученное из них-8-оксо-7, 8-дигидрогуанин (8-оксигуа) или 8-оксо-7, 8-diгидро-2'-дезоксигуаньозин (8-Окродго, рис. 1 клетки млекопитающих10,11. Он формируется моноэлектронным окислением гуанина, или гидроксильных радикалами или сингзным кислородной атакой гуанина в ДНК1. Полиненасыщенные жирные кислоты являются другими важными целями высокореактивных окислители, такие как Oh, которые инициируют процесс перекисного окисления липидов1,12. Он порождает гидропероксиды жирных кислот, которые могут разлагаться на электрофильные альдегиды и эпоксидииды, такие, как малондиалдегид, 4-гидрокси-2-нонеал, 2, 4-decadienal, 4, 5-эпоксидной-(2е)-decenal, гексенал, акролейн, кротональдегид, которые являются способны образовывать мутагенное экзоцикловую ДНК-аддукты, такие как малондиалдегид-, пропано-, или этено аддукс1,12,13. Этено-аддукты 1,n2-этоно-2'-дезокгугуаньозин (1,n2-в., рис. 1) и 1,n6-Этоно-2'-дезоксиаденозин (1,n6-, на рисунке 1 ) были предложены в качестве потенциальных биомаркеров в патофизиологии воспаления14,15.

Figure 1
На рисунке 1. В настоящем исследовании количественно определены химические структуры повреждений ДНК. dR = 2 ́-дезоксирибоза. Эта цифра была изменена с Оливейра et al.34. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Исследования, проведенные в начале 1980-х годов, позволили чувствительное обнаружение 8-Окродго высокой производительностью жидкой хроматографии, связанной с электрохимическим обнаружением (HPLC-РДРВ). Количественное определение 8-окродго путем HPLC-РДРВ в нескольких биологических системах, подвергшихся окислительной конъюнкции, привело к распознаванию 8-окродго как биомаркера оксидативно индуцированного базового повреждения в ДНК1,16. Несмотря на прочность и возможность количественной оценки 8-oxodGuo в низком диапазоне17, HPLC-РДРВ измерений полагаться на точность анализатор времени удержания для анализа идентификации и на разрешение хроматографии, чтобы избежать помех других составляющих выборки. Поскольку для электрохимического обнаружения требуется использование соли (например, фосфата калия, ацетат натрия) на подвижной фазе, поддержание адекватных аналитических условий требует регулярной очистки времени и оборудования.

С другой стороны, использование бактериального ДНК репарации фермента формаламидина ДНК гликозилазы (ФПГ) и, впоследствии, человеческий 8-оксигуанин гликозиназы 1 (hOGG1), для обнаружения и удаления 8-Oxoгуа из ДНК, возникла как способ для индукции ДНК щелочных лабильных Сайтов. Щелочные лабильные узлы преобразуются в разрывы в ДНК и позволяют очень высоко чувствительным косвенным количественному измерению 8-oxoGua путем щелочного электрофореза одноклеточного геля ("анализ кометы"). Высокая чувствительность и выполнение анализов без необходимости клеточной экстракции ДНК являются основными преимуществами этого типа анализа. Он дает самые низкие устойчивые-государственные уровни 8-oxoGua в ДНК, как правило, 7-10 раз ниже, чем уровни, полученные биоаналитическими методами, основанными на HPLC. Однако, это косвенное измерение 8-oxogua и некоторые недостатки являются отсутствие специфики или неизвестной эффективности ремонтных ферментов, используемых1,16,18.

Иммуноанализы представляют собой другой набор методов, используемых для обнаружения 8-Оксикогуа1 и экзоцикликс ДНК-аддуктов, таких как 1,n6-Дадо и 1,n2-ДГО12. Несмотря на чувствительность, недостатком использования антител для выявления повреждений ДНК является отсутствие специфики из-за перекрестной реактивности других компонентов биологических образцов, в том числе нормальных баз ДНК1,12. ДНК экзоциклика, в том числе 1,n6-Дадо и 1,n2-ДГО, также могут быть обнаружены и количественно по высокочувствительным 32P-postlabeling анализ12. Высокая чувствительность 32P-постмаркировки позволяет использовать очень небольшое количество ДНК (например, 10 мкг) для обнаружения около 1 аддода на 1010 нормальных баз19. Однако использование радиохимикатов, отсутствие химической специфичности и низкая точность являются некоторыми недостатками19,20.

Общим ограничением указанных выше методов является низкая избирательность или специфичность для обнаружения желаемых молекул. В этом сценарии, HPLC в сочетании с электрораспылителем ионизации тандем масс-спектрометрии (HPLC-ЭСИ-МС/МС и HPLC-MS3) превратилась в золотой стандарт для количественной оценки модифицированных нуклеолы в биологических матрицах, таких как ДНК, моча, плазма и слюна 1 , в 19 , 20. преимуществами HPLC-ЭСИ-МС/МС являются чувствительность (как правило, в низком диапазоне фмоль) и высокая специфичность, предоставляемая i) Хроматографическое разделение, II) Характеристика и известный образец фрагментации молекул внутри массы спектрометр столкновение камеры, и III) точное измерение выбранной массы для зарядки соотношение (m/z) в нескольких режиме мониторинга реакции1,19. Польза изотопно чистых маркированные внутренне стандарты добавляет преимущество коррекций для потерь молекулы во время этапов гидролиза дна и анализата обогащения, также, как для разницы анализирована ионизации между образцами. Он также помогает в определении правильного хроматографического пика, когда более чем один пик присутствует1,12,19,20.

Несколько методов, основанных на хплс-Нези-МС/МС были использованы для количественной оценки 8-окродго, 1,N6-Дадо и 1,N2-ДГО в ДНК, извлеченные из различных биологических образцов12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . Мелкие частицы (PM2,5) несут органические и неорганические химические вещества, такие как полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), нитро-ПАУ, альдегиды, кетоны, карбокфильные кислоты, хинолинов, металлы и водорастворимые ионы, которые могут вызывать воспаление и окислительный стресс, условия, благоприятствуют возникновению био повреждений и заболеваний30,31,32,33. Мы представляем здесь подтверждены HPLC-НЕЗИ-МС/МС методы, которые были успешно применены для количественной оценки 8-oxodGuo, 1,N6-Дадо и 1,N2-ДГО в легких, печени и почек ДНК A/J мышей для Оценка воздействия окружающего PM2,5 экспозиции34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Четыре недели старый мужчина A/J мышей, конкретных патогенов бесплатно, были получены из центра разведения лабораторных животных Фундасао Освальдо Крус (ФИОКРУЗ), Рио-де-Жанейро, Бразилия, и были обработаны в соответствии с Комитетом по этике медицинский факультет, университет Сан-Паулу (протокол no 1310/09).

1. коллекция тканей мышей

  1. Обезболив животных с Ксилазина и кетамина. Для мыши с 30 г массы тела, впрыснуть раствор (не более 2 мл), содержащий 2,63 мг кетамина и 0,38 мг ксилазин, внутрибрючная.
  2. Собирают кровь (0,5-1,5 мл) для комплементарного анализа (например, антиоксидантную активность фермента, малодиалдегид уровни).
  3. Бритье волос на животе от таза до ксифоид процесса. Сделайте разрез в вертикальной средней линии в голые области. Сделать разрезы в горизонтальных боковых линий для того, чтобы разоблачить органов брюшной полости.
  4. Вырезать брюшной аорты для содействия обескровливания и усыпить животное.
  5. Удалите ткани, представляющие интерес (в данном случае, печень, почки и легкие).
    1. Для удаления печени, вырезать нижней Вены Кава и портальной печеночной вены.
    2. Для удаления почек, раздел почечных вен и артерий.
    3. Для удаления легких, сделать разрез в диафрагме конечностей и окружности близко к грудной стенке. Сломать ключички, открыв ножницами в интерьере грудной полости. Вырезать кость из-под сифоид в направлении трахеи, для того, чтобы подвергать легкие и сердце.
      1. Держите легкое с щипцами, раздел трахеи и связки вокруг легких. Удалите осторожно блок легких плюс сердце. Чтобы удалить легкие из блока, держите сердце с щипцами и вырезать все сосуды в его основании.
  6. Промывать изолированные ткани сразу же в холодном физиологическим раствором (0,9% наг), переносить в криогенные трубы, и сразу же окунуть трубы в жидкий азот. После завершения работы, хранить трубы на-80 ° c.
    Осторожно: жидкий азот в непосредственном контакте с кожей, слизистой оболочки или глаза вызывает ожоги. Используйте надлежащую индивидуальную защиту, чтобы избежать контакта. Работайте в вентилируемой лаборатории, чтобы избежать асфиксии из-за паров жидкого азота.

2. Извлечение ДНК

Примечание: метод извлечения ДНК был изменен с Лурейро et al. (2009)35 , чтобы позволить анализ поражений изучены здесь.

  1. Передача труб, содержащих ткани для сухого льда.
  2. Используйте тарелку культуры, размещенный на льду в качестве основания, чтобы вырезать кусочек ткани скальпелем. Вес 1 г для немедленного использования. Оставшиеся ткани должны храниться на сухом льду до тех пор, пока он не вернется в хранилище при температуре-80 ° c.
    Примечание: важно избегать оттаивания оставшихся тканей, чтобы предотвратить образование артефактов, если требуется повторение анализов.
  3. Для каждого 1 г ткани в 50 mL ограничен трубы, добавить 10 мл раствора лизиса коммерческого ячейки, содержащие 0,5 мм дефероксамин и держать на льду.
    Примечание: Добавьте дефероксамин к объему раствора для немедленного использования. Для каждого 100 mL раствора, добавьте 0,0328 г дефероксамин mesylate соли.
  4. Гомогенизации тканей с помощью ткани гомогенизатор до однородное решение без фрагментов ткани получается. Держите трубку холодной (на льду) во время гомогенизации. Используйте низкую скорость, чтобы избежать нагрева.
  5. Добавьте 150 мкл раствора протеиназы K (20 мг/мл) для каждого усредненным образцом. Встряхните трубы по инверсии и держать их при комнатной температуре на ночь.
  6. Добавить 40 мкл рибонуклеазы раствор (15 мг/мл), встряхнуть по инверсии, и держать трубы при комнатной температуре в течение 2 ч.
    Примечание: Подготовьте рибонуклеазы раствор в буфере ацетата натрия 10 mM, pH 5,2, чтобы избежать осадков. Нагрейте раствор при температуре 100 ° c в течение 15 мин перед использованием для получения раствора, свободного от дезоксирибонуклеазы.
  7. Добавить 5 мл коммерческого белка осадков раствор, вихрь энергично, и центрифуга при 2 000 х г, 4 ° c, в течение 10 минут.
  8. Перенесите супернатанты на 50 мл увенчанные трубы, содержащие 10 мл холодного изопропанола. Инвертировать трубы мягко несколько раз, пока наблюдение осажденного ДНК.
    Примечание: протокол может быть приостановлен здесь, сохраняя трубы при температуре-20 ° c.
  9. Соберите осажденный ДНК с помощью пипетки Пастера, закрытой в конце. Перенесите его в трубы, содержащие 4 мл 10 мм АТС буфера, 1 мм дефероксамин, pH 7,0.
  10. После того, как ДНК полностью растворится в вышеуказанном растворе (не вихревая), добавьте 4 мл раствора хлороформа, содержащего 4% изоамиловый спирт.
  11. Инвертировать трубы 10 раз для гомогенизации, центрифуги при 2 000 x g, 4 ° c, в течение 10 минут, чтобы отделить две фазы, и перенести верхнюю фазу в новую трубку.
  12. Повторите шаги 2,10 и 2,11 еще два раза.
  13. Добавьте 8 мл абсолютного этанола и 0,4 мл раствора на 5 м для осаждения ДНК.
  14. Соберите снова осажденный ДНК и перенесите его на 3 мл 70% этанола. Повторите этот шаг еще раз.
  15. Выбросьте раствор этанола с осторожностью и инвертировать трубы, содержащие осажденный ДНК на абсорбирующей бумаге, чтобы удалить избыток раствора.
  16. Добавить 200 мкл 0,1 мм дефероксамин раствор для растворения ДНК. Поддерживайте трубы при температуре 4 °C, пока ДНК не будет полностью увлажнена (на ночь).
  17. Определите концентрацию ДНК, измеряя абсорбцию на 260 Нм и ее чистоту с коэффициентом поглощения 260/280 Нм.
    Примечание: чтобы определить концентрацию ДНК, перенесите Алиготе 10 мкл раствора ДНК на 990 мкл ультраапертуры воды (100X разбавления). Умножьте абсорбции на 260 Нм (она должна быть ниже 1) на 50 (50 мкг/мл является концентрация двойной мель ДНК, когда абсорбции 1 см пути длины раствора на 260 Нм 1) и разбавления используется (100X) для получения концентрации ДНК в мкг/мл. Если абсорбции на 260 Нм выше 1, необходимы дополнительные разведений. Коэффициент поглощения 260/280 Нм должен быть равным или выше 1,8 для требуемой чистоты ДНК, но коэффициенты вокруг 1,6 допустимы.

3. ферментативный гидролиз

  1. Рецепт анализа
    1. 1,n6-и. и 1,n2-на-в-в: Алиготе содержит 150 мкг ДНК, добавить 7,5 мкл 200 mm рис/MgCl2 буфера (pH 7,4), 1,4 мкл внутреннего стандартного решения, содержащего 250 фмоль/мкл [15N5 ] 1,n6-на и [15N5] 1,n2-на, и 15 единиц дезокрибонуклеазы I. Отрегулируйте конечный объем до 200 мкл с ультраводяной водой, вычитая объемы ферментов, которые будут использоваться на шаге 3.2.1.
    2. 8-окродго анализы: к Алиготе содержа 80 мкг дна, добавьте 3,8 мкл 200 mm рис/MgCl2 буфер (pH 7,4), 2 мкл внутреннего стандартного решения, содержащего 1 000 фмоль/мкл [15N5] 8-окродго, и 8 единиц дезокрибонуклеазы I. Отрегулируйте конечный объем до 100 мкл с ультраводяной водой, вычитая объемы ферментов, которые будут использоваться на шаге 3.2.2.
      Примечание: внутренние стандарты [15n5] 1,n6-на, [15 n5] 1,n2-в и [15n5] 8-oxodguo может быть синтетизации и характеризуется как описано35,36,37. Количество внутренних стандартов в объемах впрыснутого образца должно быть таким же, как и в объемах впрыснутой калибровочной кривой.
  2. Инкубировать образцы при температуре 37 ° c в течение 1 часа.
    1. Образцы из шага 3,1: добавить 0,006 единиц фосфодиэстеразы I от Crotalus атрокс и 15 единиц щелочной фосфатазы от слизистой оболочки кишечника крупного рогатого скота.
    2. Образцы из шага 3,2: добавить 0,0032 единиц фосфодиэстеразы I от Crotalus атрокс и 8 единиц щелочной фосфатазы от слизистой оболочки кишечника крупного рогатого скота.
  3. Инкубировать образцы при температуре 37 ° c в течение 1 часа.
  4. Центрифуга образцов на 14 000 x g в течение 10 минут.
  5. Образцы из 3.2.1 шага: отдельный 10 мкл каждого образца для количественной оценки деоксинуклеосидес (Дадо, ДГО) HPLC/папа (шаг 9). При условии остаточного объема к твердой фазе извлечения (шаг 4).
  6. Образцы от 3.2.2 шага: Перенесите 80 мкл супернатант к флакотам для впрысок 50 мкл (1 000 фмоль [15N5] 8-oxodguo) в HPLC-Нези-MS/MS система. Резервировать оставшиеся 20 мкл для количественного определения ДГО по HPLC/папа (шаг 9).

4. твердые фазы извлечения для анализа 1, N6-и 1, n2

  1. Загрузите картриджи (ОИН-C18, 30 мг/мл, 33 мкм, 1 мл) с 1 мл следующей последовательности растворов: 100% метанола, деионизированная вода, гидролизованный образец ДНК, деионизированная вода, 10% метанол, 15% метанол и 100% метанол (для сбора).
    Примечание: не оставляйте картриджи сухими между приложениями различных решений. Добавьте следующее решение сразу после того, как предыдущее решение полностью войдет в картридж.
  2. Вакуумные сухие последние фракции революции (100% метанол), содержащий аддукты.
  3. Ресуспензируем сушеные образцы в 83,1 мкл ультраводяной воды непосредственно перед HPLC-НЕЗИ-МС/МС анализ, чтобы получить 200 фмоль каждого внутреннего стандарта в 50 мкл каждого образца.

5. Подготовка калибровочных кривых

  1. Подготовьте по крайней мере пять пунктов в интервале от 300 до 6 000 фмол 8-Окродго стандарта, с фиксированным количеством 1 000 фмоль [15N5] 8-oxodguo в каждой точке. Рассмотрим эти суммы в объеме вводили.
  2. Подготовьте по крайней мере пять пунктов в интервале от 1 до 40 фмол 1,N6-и 1,n2-в, с фиксированным количеством 200 Фмол [15n5] 1,n6-и [15n5] 1, Н 2-в каждой точке. Рассмотрим эти суммы в объеме вводили.
  3. Подготовьте по крайней мере пять точек в интервале 0,05-1 нмоль ДГО и Дадо. Рассмотрим эти суммы в объеме вводили.

6. Подготовка образцов ДНК для проверки метода

  1. 1,n6-на и 1,n2-в-в-на-в.: добавить различное количество 1,n6-и 1,n2-на (например, 1,75, 8,75, 17,5 и 35 фмоль) и фиксированные суммы [15N5] 1, N6-в. и [15N5] 1,N2-на (350 фмоль) до 100 мкг ДНК икроножной тимуса и осуществлять ферментативный гидролиз как описано в шаге 3. Обрабатываем образцы в квадрарупкате в два разных дня. Используйте образцы для оценки точности и точности метода.
    Примечание: окончательный объем гидролиз ДНК будет 200 мкл (шаг 3), из которых 10 мкл будет отделен для количественной оценки деоксинуклеосидес по HPLC/папа (шаг 9). Оставшееся решение (190 мкл) будет подвергаться твердой фазе извлечения (шаг 4), высушенная фракция будет ресуспендирован в 83,1 мкл (шаг 4,3), из которых 50 мкл будет введен в HPLC-НЕЗИ-МС/МС системы. Количество 1,n6-на и 1,n2-в впрыскивается будет 1, 5, 10 и 20 фмол, с 200 фмоль [15n5] 1,n6-и [15n5] 1,n 2-в каждом образце.
  2. 8-Окродго анализы: Добавьте различное количество 8-Окродго (например, 734, 1 468, 2 938, и 4 408 фмоль) и фиксированное количество [15N5] 8-окродго (2 000 фмоль) до 100 мкг ДНК теленка тимуса и осуществлять ферментативный гидролиз как описано в шаге 3. Обрабатываем образцы в квадрарупкате в два разных дня. Используйте образцы для оценки точности и точности метода.
    Примечание: окончательный объем гидролесных ДНК будет 100 мкл (шаг 3), из которых 50 мкл будет введен в системе HPLC-НЕЗИ-МС/МС. Количество впрыснутого 8-oxodGuo будет 367, 734, 1469, и 2204 фмол, с 1 000 фмоль [15N5] 8-oxodguo в каждом образце.
  3. Добавить 13,125 фмоль 1,N6-на-в-в (для получения 7,5 фмоль в объеме инъекций) и 35 фмоль 1,n2-к (для получения 20 фмоль в объеме инъекций) до восьми образцов 100 мкг ДНК икроножной тимуса.
    1. Добавьте внутренние стандарты [15n5] 1,n6-на-и [15n5] 1,n2-на (200 фмоль) до четырех образцов. Приступить к ДНК гидролиза и твердых фазы извлечения всех образцов.
    2. Добавить внутренние стандарты [15n5] 1,n6-в и [15n5] 1,n2-на (200 фмоль) на другие четыре образца.
    3. Используйте образцы для расчета восстановления аддуктов из твердой фазы извлечения.

7. HPLC-НЕЗИ-МС/МС анализ 8-oxodGuo

  1. Вливая стандарт 8-oxodGuo в оборудование, установите параметры НЕЗИ-МС/МС для лучшего обнаружения его структуры фрагментации путем многократного мониторинга реакции (MRM): m/z 284 [m + H] + → m/z 168 [m-2 '-Дезоксирибоза + H]+.
    1. Используйте те же параметры для обнаружения [15N5] 8-oxodguo: m/z 289 [m + H]+m/z → 173 [м-2 '-Дезоксирибоза + H]+.
      Примечание: используйте эквивалент оборудования или лучше, чем оборудование, используемое в этой работе (см. таблицу материалов). Параметры ЭСИ-МС/МС были установлены, как описано в таблице 1.
  2. Фильтр (с использованием 0,22 мкм пористых мембран) и дегазифицировать (с помощью sonicator) все воды, основанные HPLC растворителей.
  3. Используйте следующие условия хроматографии для анализа, монтаж системы, как показано на рисунке 2.
    Примечание: столбец A подключен к бинарному насосу. Его элюент направлен на обнаружение и отходы УФ-излучения в первые 16 минут и от 32 до 46 мин хроматографии, как показано на рисунке 2A. Это колонка, через которую образец ускользает сразу после инъекции. Колонка B соединена с искракратическим насосом и массовым спектрометром. Он получает элюент столбца A только в интервале 16-32 мин, когда клапан переключается на положение, показанное на рисунке 2B. Переключение клапана позволяет соединение между двумя столбцами, которые ускользаются от градиента двоичного насоса. Конфигурация, показанная на рисунке 2B , допускает дальнейшее пиковое разделение и сужение. Кроме того, только Хроматографическая фракция процентов достигает масс-спектрометра, улучшая чувствительность и селективность.
    1. Элют 50 х 2,0 мм ID, 2,5 мкм, C18 колонка (колонка A рисунка 2) в сочетании с C18 охранник картридж (4,0 х 3,0 мм ID) с градиентом 0,1% муравьевая кислота (растворитель) и метанол, содержащий 0,1% муравьевая кислота (растворитель B) при скорости потока 150 мкл/мин и на 25 °C.
      1. Используйте следующую программу градиента для бинарного насоса: от 0 до 25 мин, 0-15% растворителя B; от 25 до 28 мин, 15-80% растворителя B; 28 до 31 мин, 80% растворителя B; от 31 до 33 мин, 80-0% растворителя B; 33 до 46 мин, 0% растворителя B.
      2. Используйте коммутационный клапан, чтобы направить первые 16 минут ускользающегося мусора и 16-32 мин фракции к второму столбцу (150 x 2,0 мм ID, 3,0 мкм, C18, колонка B рисунка 2), подключенного к источнику еси и обусловленные искракратическим насосом с раствором 15% Me санол в воде, содержащей 0,1% Муравьевой кислоты (150 мкл/мин).
        Примечание: перед использованием программы переключения клапана шага 7.3.1.2, проверьте, если 8-oxodGuo Стандартный элюс из первой колонки после 16 мин. Важно закрыть клапан в 32 мин, чтобы использовать градиент бинарного насоса для 8-Оксого из второго столбца и получить резкий хроматографический пик. Поражение 8-Окродго-элютов со второй колонки примерно в 36 мин. изменения времени удержания анализата могут возникать в зависимости от используемого столбца и оборудования. Могут потребоваться адаптации программы градиента растворителя HPLC.

Figure 2
Рисунке 2. Система из двух колонн, используемых для 8-оксо-7, 8-дигидро-2'-дезоксигуанозин (8-oxodGuo) анализы. A) конфигурация, используемая в первые 16 минут и от 32 до 46 мин хроматографии; B) конфигурация используется в интервале 16-32 мин, что позволяет дальнейшее разделение и пик сужение в столбце B до революции к источнику еси масс-спектрометра. Эта цифра была переиздана с Оливейра et al.34. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

8. HPLC-НЕЗИ-МС/МС анализ 1, N 6 -и 1, n 2

  1. Вливая 1,N6-и-и 1,n2-стандартов в оборудовании, установить Нези-МС/МС параметры для наилучшего выявления их фрагментации моделей путем многократного мониторинга реакции (MRM): m/z 276 [m + h]+M/z 160 [m 2 '-Дезоксирибоза + H] + для обнаружения 1,N6m/z 292 [m + H]+  M/z 176 [m-2 '-Дезоксирибоза + H ]+ для обнаружения 1,N2-в.
    1. Используйте те же параметры для обнаружения [15n5] 1,N6-на-в (m/z 281 [m + H]+m/z → 165 [m-2 '-Дезоксирибоза + H]+) и [15n 5] 1,N2-на (m/z 297 [m + H]+m/z 181 [m-2 '-Дезоксирибоза + H]+). Установите параметры Нези-МС/МС, описанные в таблице 1.
Нези-MS/MS параметры 8-oxodGuo Этено аддукс
Занавес газ 20 ПСИ 20 ПСИ
Ингаляцинг газа 55 50
Ион источник газа 50 ПСИ 40 ПСИ
Столкновение индуцированной диссоциации газа Средний Средний
Ионный спрей напряжения 5000 4500
НЕЗИ Температура зонда 450 450
Потенциал для демобилизации 31 V, 8-Окродго 41 V, 1, N6-
31 V, [15N5] 8-oxodguo 41 V, [15N5] 1, N6-
45 V, 1, N2
45 v, [15N5] 1, N2
Энергия столкновения 23 eV, 8-oxodGuo 25 eV, 1, N6-
23 eV, [15N5] 8-oxodguo 25 eV, [15N5] 1, N6-
27 eV, 1, N2
27 eV, [15N5] 1, N2
Потенциал выхода ячейки столкновения 16 V, 8-oxodGuo, 8 V, 1, N6
16 V, [15N5] 8-oxodguo 8 V, [15N5] 1, N6-
16 V, 1, N2
16 V, [15N5] 1, N2
Входной потенциал 10 V 10 V

Таблица 1. Параметры, используемые в оборудовании ЭЗИ-МС/МС для выявления повреждений ДНК. Эта таблица была изменена с Оливейра et al.34.

  1. Фильтр (с использованием 0,22 мкм пористых мембран) и дегазифицировать (с помощью sonicator) все воды, основанные HPLC растворителей.
  2. Используйте следующие условия хроматографии для анализа.
    1. Элют 150 х 2,0 мм ID, 3,0 мкм, C18 колонки, связанные с C18 охранник картридж (4,0 х 3,0 мм ID) с градиентом 5 мм Ацетат аммония, рН 6,6 (растворитель а) и ацетонирила (растворитель B) при скорости потока от 130 мкл/мин и 25 °C.
      1. Используйте следующую программу градиента для бинарного насоса: от 0 до 10 мин, 0% растворителя B; от 10 до 39 мин, 0-20% растворителя B; 39 до 41 мин, 20-75% растворителя B; 41 до 46 мин, 75% растворителя B; 46-47 мин, 75-0% растворителя B; 47 до 60 мин, 0% растворителя B.
      2. Использование коммутационный клапан для прямого первые 35 мин от увилент отходов и 35-42 min фракция к источнику НЕЗИ. Будьте уверены, что стандарты аддоза из столбца в наборе интервал (35-42 min). Внесите корректировки в случае необходимости.

9. Количественная оценка нормальных 2 '-дезокрибонуклеосуидов по ХПЛС-УФ

  1. Используйте оборудование, похожее на оборудование, используемое в этой работе (см. таблицу материалов).
  2. Элют 250 мм х 4,6 мм ID, 5 мкм, C18 колонка прилагается к C18 охранник картриджа (4,0 х 3,0 мм ID) с градиентом 0,1% муравьиной кислоты и метанола.
    1. Используйте следующую программу градиента: от 0 до 25 мин, от 0 до 18% метанола; от 25 до 27 мин, от 18 до 0% метанола; от 27 до 37 мин, 0% метанола) при скорости потока 1 мл/мин и 30 °C.
    2. Впрыснуть 5 мкл каждого образца зарезервировано для 2 '-деоксинуклеосидес квантификации.
    3. Установите детектор папаа на 260 Нм для интеграции пиков ДГО и Дадо.

10. Количественная оценка поражений ДНК

  1. Интегрируйте пики 8-oxodGuo, [15n5] 8-Окродго, 1,n6-на, [15n5] 1,N6-на, 1,n2-в, и [15n5] 1,n2 -ВГО из HPLC-НЕЗИ-МС/МС анализы.
    1. Вычислить площадь соотношения 8-оксого/[15n5] 8-Оксого, 1,N6-в/[15n5] 1,N6-на и 1,n2-на/[15 n5 ] 1,N2-для калибровочных кривых и образцов.
    2. Участок калибровочных кривых с использованием соотношения области, полученного в шаге 10.1.1 в оси y и количества анализатов, присутствующих в каждой точке оси x.
    3. Расчет количества (фмол) поражений в каждой выборке с использованием соотношения рассчитывается в шаге 10.1.1 и калибровки кривые шага 10.1.2.
  2. Интегрируйте пики ДГО и Дадо из анализа HPLC-УФ.
    1. Участок калибровки кривые, используя области, полученные в шаге 10,2 в оси y и количество анализаций, присутствующих в каждой точке в оси x.
    2. Рассчитать количество (нмоль) ДГО и Дадо в каждой выборке с использованием областей, полученных в шаге 10,2 и калибровочных кривых 10.2.1 шага.
  3. Расчет сумм (нмоль) ДГО и Дадо, присутствующих в каждом образце, вводились в систему HPLC-НЕЗИ-МС/МС, считая, что суммы, рассчитанные в шаге 10.2.2 присутствуют в объеме выборки 5 мкл, в то время как 50 мкл вводили в систему HPLC-НЕЗИ-МС/МС.
    Примечание: для расчета количества ДГО в образцах, используемых для анализа 8-oxodGuo, просто умножьте количество (нмоль/мкл), полученное в шаге 10.2.2 by 50. Для расчета количества Дадо и ДГО в образцах, используемых для анализа 1,N6-и 1,n2-на, рассмотреть шаг концентрации после твердой фазы извлечения. Объем 50 мкл, введенный в системе HPLC-НЕЗИ-МС/МС, соответствует 114,32 мкл исходного образца. Суммы (нмоль/мкл), полученные в шаге 10.2.2, должны быть умножены на 114,32 для получения правильных значений.
  4. Расчет молярных фракций 8-Окродго/ДГО, 1,n6-от и до, 1,n2-в. Соотношение (поражение фмоль/нмоль нормальный дезоксисоидозидов) дает количество поражений на 106 нормальных ДГО или Дадо.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Средние концентрации ДНК (± SD), полученные из печени мышей (~ 1 г ткани), легких (~ 0,2 г ткани) и почек (~ 0,4 г ткани), соответственно, 5 068 ± 2 615, 4 369 ± 1 021 и 3 223 ± 723 мкг/мл в окончательном объеме 200 мкл. Репрезентативная Хроматограмма, получаемая HPLC-Папой очищенной ДНК показана на рисунке 3. Наличие четырех 2 '-деоксинуклеосидес, свободных от РНК рибонуклеотиды, которые elуты непосредственно перед соответствующими 2 '-деоксинуклеосидес, демонстрирует чистоту ДНК.

Репрезентативные хроматограммы от HPLC-НЕЗИ-МС/МС анализы для количественной оценки 8-oxodGuo, 1,N6-в и 1,n2-в в образцах ДНК мышей ткани показаны в цифрах 4 к 6. Хроматограмма, полученная с помощью УФ-излучения на рисунке 4 , показывает четыре 2 '-деоксинуклеосидес ускольтующей от первого столбца до ~ 10 мин, с хорошим разделением от 8-Окродго, исключая нежелательные помехи. Нормальный 2 '-деоксинуклеосидес не присутствовали в анализе 1,N6-и 1,n2-в, как они были устранены в процедуре твердых фазы извлечения. В рисунке 7показаны массовые спектры стандартов, используемых в этой работе.

Типичные линейные калибровочные кривые для количественной оценки 8-Окродго, 1,N6-и 1,n2-на рисунке 834. Эти методы были точными и точными, как это было представлено в таблице 234. Междневная точность, рассчитанная на ДНК-аликуты, дополнена 367 фмол 8-Окродго составила 16,97%, дополнена 10 фмоль 1,n2-к-на 14,01%, и дополнена 1 фмол 1,n6-к-на 16,66%. Пределы количественной оценки (S/N = 10) для стандартов, вводились в столбце, составляли 25 фмоль для 8-Окродго, 0,3 фмоль для 1,n6-для, и 1 фмоль для 1,n234.

Эти методы были применены к количественному измерению 8-Оксого, 1,N2-в и 1,n6-на-на-, в легких, печени и почек образцов ДНК-мышей ткани A/J подвергается все тело окружающего воздуха обогащенный PM2,5, по сравнению с тех, кто подвергается на месте окружающего воздуха как исследование управления34. Найденные уровни показаны в таблице 3и указывают на индукцию поражений ДНК в легких, печени и почках по тч2,5 34.

Figure 3
Рисунок 3 . Хроматограмма гидролизации образца ДНК, извлеченного из легкого мыши. Хроматограмма была получена в 260 Нм от системы HPLC-папа. Четыре 2 '-деоксинуклеосидес указаны: dC, 2 '-дезокситетидин; dA, 2 '-дезоксиаденозин; ГД, 2 '-дезокгугуанзин; dT, 2 '-дезокситимидин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 . Репрезентативные хроматограммы, показывающие обнаружение 8-оксо-7, 8-дигидро-2 ́-дезокгугуанозин (8-oxodguo) и внутренний стандарт [15N5] 8-oxodguo по хплс-ЭСИ-МС/МС, а также нормальный 2 '-деоксинуклеосидес от первого столбца и переадресован на обнаружение папы (λ = 260 Нм) и отходы. Образец ДНК был извлечен из легкого мыши. Анализы, выполненные HPLC-НЕЗИ-МС/МС, проводились при многократное наблюдение за реакцией (MRM) с использованием фрагментация, указанных в изображениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры. 

Figure 5
Рисунок 5 . Репрезентативные хроматограммы, показывающие обнаружение 1, Н 6 -этено-2 ́-деоксиаденозин (1,N6-в. и.) и внутренний стандарт [15N5] 1, Н 6 -к. и. по HPLC-НЕЗИ-МС/МС. Образец ДНК был извлечен из почки мыши. Анализы проводились с множественным мониторингом реакции (MRM) с использованием фрагментация, указанной в изображениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры. 

Figure 6
Рисунок 6 . Репрезентативные хроматограммы, показывающие обнаружение 1, Н 2-х -этено-2 ́-дезокгугуаньзин (1,N2-в) и внутренний стандарт [15N5] 1, Н 2-х -с. в. ХПЛС-НЕЗИ-МС/МС. Образец ДНК был извлечен из печени мыши. Анализы проводились с множественным мониторингом реакции (MRM) с использованием фрагментация, указанной в изображениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры. 

Figure 7
Рисунок 7 . Массовые спектры стандартов, используемых в этой работе. Спектры были получены в MS2, используя энергию столкновения 20 eV, чтобы раздробить ионы [M + H]+ . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры. 

Figure 8
Рисунок 8 . Калибровочные кривые, полученные хплс-Нези-МС/МС для количественной оценки 8-оксо-7, 8-дигидро-2'-дезоксигуанозин (8-окродго), 1,n2-этено-2 ́-дезоксигуаньзин (1,n2- N6-этено-2́-дезоксиаденозин (1,N6-в. в.). Относительная площадь означает площадь соотношения между поражением и его соответствующими [15N5] внутренним стандартом. Эта цифра была изменена с Оливейра et al.34. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Нези-MS/MS параметры 8-oxodGuo Этено аддукс
Занавес газ 20 ПСИ 20 ПСИ
Ингаляцинг газа 55 50
Ион источник газа 50 ПСИ 40 ПСИ
Столкновение индуцированной диссоциации газа Средний Средний
Ионный спрей напряжения 5000 4500
НЕЗИ Температура зонда 450 450
Потенциал для демобилизации 31 V, 8-Окродго 41 V, 1, N6-
31 V, [15N5] 8-oxodguo 41 V, [15N5] 1, N6-
45 V, 1, N2
45 v, [15N5] 1, N2
Энергия столкновения 23 eV, 8-oxodGuo 25 eV, 1, N6-
23 eV, [15N5] 8-oxodguo 25 eV, [15N5] 1, N6-
27 eV, 1, N2
27 eV, [15N5] 1, N2
Потенциал выхода ячейки столкновения 16 V, 8-oxodGuo, 8 V, 1, N6
16 V, [15N5] 8-oxodguo 8 V, [15N5] 1, N6-
16 V, 1, N2
16 V, [15N5] 1, N2
Входной потенциал 10 V 10 V

Таблица 1. Параметры, используемые в оборудовании ЭЗИ-МС/МС для выявления повреждений ДНК. Эта таблица была изменена с Оливейра et al.34.

Базальный уровень Добавили Обнаружены Обнаружен (-) базальный Точность Резюме
Среднее ± SD (фмол) фмол Среднее ± SD (фмол) Средний (фмол) % %
8-oxodGuo
373,00 ± 2,71 0 372,79 ± 50,6 - - 13,57
373,98 ± 4,86 367 755,41 ± 107,92 381 103,93 14,29
374,84 ± 5,19 734 1069,57 ± 108,51 695 94,65 10,14
357,94 ± 15,05 1469 1671,67 ± 44,27 1314 89,43 2,65
371,07 ± 2,43 2204 2272,01 ± 40,2 1901 86,25 1,77
1, N2
0,54 ± 0,01 0 0,54 ± 0,09 - - 16,88
0,54 ± 0,01 1 1,47 ± 0,16 0,93 93,39 11,17
0,55 ± 0,01 5 5,30 ± 0,72 4,76 95,11 13,50
0,53 ± 0,01 10 10,60 ± 0,39 10,06 100,63 3,67
0,54 ± 0,01 20 20,20 ± 0,93 19,66 98,29 4,60
1, N6
2,08 ± 0,10 0 2,29 ± 0,39 - - 17,05
2,05 ± 0,04 1 3,06 ± 0,47 1,01 100,89 15,31
1,99 ± 0,06 5 7,87 ± 1,66 5,88 117,60 21,10
2,03 ± 0,07 10 12,43 ± 1,25 10,41 104,06 10,06
1,97 ± 0,03 20 22,42 ± 3,89 20,46 102,29 17,34

Таблица 2. Точность метода и коэффициент вариации (CV) для количественной оценки 8-Окродго, 1, Н 2-х - и 1, Н 6 -в ДНК. Эта таблица была изменена с Оливейра et al.34.

Окружающий воздух PM2,5             N P значение
Средний ± Рэм Средний ± Рэм   
Легких
8-Окмодго/108 ДГО 2124 ± 56,96 2466 ± 93,10 6 0,01
1, N2-на/108 ДГО Nd Nd - -
1, N6-в/108 Дадо 1,41 ± 0,23 1,44 ± 0,13 7 Ns
Печени
8-Окмодго/108 ДГО 2848 ± 183,5 2949 ± 223,8 6 5 Ns
1, N2-на/108 ДГО 7,79 ± 2,49 24,94 ± 5,21 4 0,02
1, N6-в/108 Дадо 2,82 ± 0,30 2,18 ± 0,25 6 Ns
Почек
8-Окмодго/108 ДГО 1854 ± 87,13 2363 ± 157,0 6 0,02
1, N2-на/108 ДГО Nd Nd - -
1, N6-в/108 Дадо 1,09 ± 0,15 1,52 ± 0,12 7 0,04
(NS, не значительные; ND, не обнаружен)

Таблица 3. Уровни повреждений дна в образцах ткани мышей A/J. Мышей подвергались воздействию окружающего воздуха и окружающего воздуха обогащенный PM2,5 (PM2,5 сосредоточены 30 раз). Середины между 2 группами (окружающего воздуха и PM2,5) были сравнены использующ t испытание. Результаты были признаны статистически значимыми, когда значение P составляло менее 0,05. Эта таблица была изменена с Оливейра et al.34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Основная проблема, найденная в 8-окродго анализы методами HPLC является возможная индукция его образования во время обследование процедур извлечения ДНК, ДНК-гидролиза, и концентрация ДНК-гидролизатов22,38. Для минимизации проблемы 8-Оксодго артифактологического образования рекомендуется Добавление дефероксамин ко всем решениям по экстракции, хранению и гидролиза ДНК, применению хаотического метода йодистого натрия и избежанию фенола в экстракции ДНК, так как также как использование ДНК составляет около 100 мкг в процедуре гидролиза, чтобы свести к минимуму вклад фиктивным окислением в конечный результат39. Мы учли приведенные выше рекомендации, за исключением использования хаотического метода йодистого натрия для извлечения ДНК. Вместо этого, для простоты, мы использовали коммерческие решения для извлечения ДНК, добавив к ним дефероксамин перед использованием. Кроме того, полученные гидроломы ДНК были непосредственно введены в первый столбец системы HPLC-НЕЗИ-МС/МС для предыдущего отделения 8-oxodGuo от нормального нуклеолы. Непосредственно перед революцией 8-oxodGuo был использован коммутативный клапан для отвода первого столбца на второй столбец, где было достигнуто дальнейшее разделение и сужение пика. Такой подход позволял адекватной чувствительности для 8-Окродго количественное определение без помех. Наиболее аналогичный подход для количественной оценки 8-oxodGuo в ДНК был описан Чао и сотрудники22, который использовал ловушку колонке для очистки образца и 8-oxodGuo удержания до образца революции в аналитической колонке, используя коммутатор между колонны. Альтернативно, концентрационный шаг 8-Окродго, собранный из фракций, увилил от HPLC разделения гидролосных ДНК до HPLC-НЕЗИ-МС/МС анализы было выполнено15, что является гораздо более трудоемким.

Зарегистрированные Базальные уровни 8-окродго в легочной ткани грызунов, основанные на анализе HPLC, варьируются от 180-450/108 ДГО23,39,41,42,43, 1 340-2120/108 ДГО44, или приблизительно 3000/108 ДГО45,46, с самыми низкими значениями, полученными от методов экстракции ДНК, используя йодид натрия. Среднее 8-Окродго уровень, найденный здесь в легких мышей, подвергшихся воздействию окружающего воздуха, был 2124/108 ДГО. Уровень увеличился до 2466/108 ДГО у животных, подвергающихся воздействию окружающего воздуха, ОБОГАЩЕННЫЙ ТЧ2,5 (Таблица 3)34. Вполне возможно, что чувствительность для выявления различий между группами может быть улучшена путем извлечения ДНК с хаотического метода йодистого натрия. В настоящем исследовании, среднее 8-oxodGuo уровней, найденных в контроле мышей легких, почек и печени ДНК были, соответственно, 2,0, 1,8 и 2,7 раза выше, чем средний базальный уровень (1047/108 ДГО), полученные в Европейском комитете по стандартам окислительного Повреждение ДНК (ЭСКОДД) в межлабораторной оценке 8-Окродго в ДНК, извлеченной из стандартных образцов свиной печени38.

Основным ограничением для обнаружения 1,N6-в и 1,n2-в на ДНК метод чувствительность, так как эти поражения происходят на очень низком уровне. Самые низкие уровни 1,N2-ДГО в ДНК, количественно хплс-Нези-МС/МС, были в диапазоне 0,87-4 поражения на 108 ДГО в человеческой клеточной линии и ткани крыс25,47. Одним из способов повышения чувствительности и селективности их количественной оценки является концентрация их на больших образцах гидролотных образцов ДНК с использованием твердой фазы экстракции. Этот шаг очистки решает хроматографические проблемы, которые могут возникнуть в результате инъекций более 100 мкг гидролит ДНК в аналитические столбцы HPLC. Мы использовали этот подход в проверенная методика, представленная здесь. Уровни 1,N6-в. и., обнаруженные в этом исследовании34 попадают в диапазон, полученный в исследованиях с использованием ультрачувствительных иммуносродства/32P-постмаркировки48,49, 50 , 51 и ниже, чем те, которые описаны другими группами, использующая хплс-Нези-МС/МС21,23,24. Аналогичным образом, 1,N2-на уровнях, количественно здесь34 соответствуют самым низким уровням сообщили Гарсия25 и АНДЖЕЛИ26 с помощью HPLC-Нези-MS/MS.

HPLC-НЕЗИ-MS/MS системы с повышенной чувствительностью, чем оборудование, используемое в данном исследовании имеются. Использование таких систем позволяет анализировать меньшее количество ДНК, что расширяет применение методов, представленных здесь, для ситуаций, в которых наличие ткани является ограничением. Представленные здесь методы могут быть адаптированы для количественной оценки других измененных деоксинуклеосидес, в зависимости от наличия их стандартов и изотопо-ных стандартов. Регулировка хроматографических условий была бы необходима для того чтобы получить острые пики всех молекул включенных в анализе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

FAPESP (Фундасао де ампаро à Пескиса ду Сан-Паулу, proc. 2012/22190-3 и 2012/08616-8), CNPq (proc. 454214/2014-6 и 429184/2016-6), накидки, PRPUSP (про-Рейториа де Пескиса Da Universidade de Сан-Паулу), ИНКТ ИНАРА (ПРМ/CNPq/ННКТ/МЫСЫ/ FAPEMIG/FАПЕРJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), ИНКТ (FAPESP/CNPq/МЫСЫ; Proc. 573530/2008-4), НПД Реддоксома (ПРПУПП; Proc. 2011.1.9352.1.8) и СЕПИД Ресдокома (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). Т. ф. Оливейра и а. а. ф. Оливейра получил стипендии от FAPESP (proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) и МЫСОВ (coordenação de Аперфечоаменту де Пессоаль де Нивель). Стипендиаты из CNPq получили м. х. г. Медейрос, Пи ди Массио, P. H. N. Saldiva и а. м. Лурейро.

Некоторые цифры и таблицы, присутствующие в этой работе были первоначально опубликованы в Оливейра А.А.Ф. et al. генотоксические и эпигентоксические эффекты у мышей, подверженных воздействию концентрированных окружающих мелких твердых частиц (PM2,5) из города Сан-Паулу, Бразилия. Частица и клетчатка токсикологии. 15, 40 (2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[15N5]-2’-deoxyadenosine Cambridge Isotope Laboratories NLM-3895-25
[15N5]-2’-deoxyguanosine Cambridge Isotope Laboratories NLM-3899-CA-10
acetonitrile Carlo Erba Reagents 412413000
alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa Sigma P5521
ammonium acetate Merck 101116
calf thymus DNA Sigma D1501
cell lysis solution QIAGEN 158908
chloroform Carlo Erba Reagents 412653
deferoxamine Sigma D9533
deoxyribonuclease I (DNase I) Bio Basic Inc DD0649
ethanol Carlo Erba Reagents 414542
formic acid Sigma-Aldrich F0507
HPLC-ESI-MS/MS system HPLC: Agilent 1200 series            ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).                                                            ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.
HPLC/DAD system Shimadzu Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)
HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 µm, C18) Phenomenex 00B-4446-B0
HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 µm, C18) Phenomenex 00F-4251-B0
HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 µm, C18) Phenomenex 00G-4252-E0
HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.) Phenomenex AJO-4287
isoamyl alcohol Sigma-Aldrich M32658
isopropyl alcohol (isopropanol) Carlo Erba Reagents A412790010
ketamine Ceva Commercial name: Dopalen
magnesium chloride Carlo Erba Reagents 349377
magnesium chloride Sigma M2393
methanol Carlo Erba Reagents L022909K7
phosphodiesterase I from Crotalus atrox Sigma P4506
protein precipitation solution QIAGEN 158912
proteinase K Sigma-Aldrich P2308
ribonuclease A Sigma R5000
sodium chloride Sigma-Aldrich S9625
SPE-C18 (Strata-X) Phenomenex 8B-S100-TAK
tris(hydroxymethyl)-aminomethane Carlo Erba Reagents 489983
xylazine Syntec do Brasil Commercial name: Xilazin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H. G., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radical Biology and Medicine. 107, 13-34 (2017).
  2. Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. Carcinogens and DNA damage. Biochemical Society Transactions. 46, 1213-1224 (2018).
  3. Cadet, J., Davies, K. J. A. Oxidative DNA damage & repair: An introduction. Free Radical Biology and Medicine. 107, 2-12 (2017).
  4. Cao, H., Jiang, Y., Wang, Y. Stereospecific synthesis and characterization of oligodeoxyribonucleotides containing an N2-(1-carboxyethyl)-2'-deoxyguanosine. Journal of the American Chemical Society. 129, 12123-12130 (2007).
  5. Breyer, V., et al. Analysis and biological relevance of advanced glycation end-products of DNA in eukaryotic cells. The FEBS Journal. 275, 914-925 (2008).
  6. Tamae, D., Lim, P., Wuenschell, G. E., Termini, J. Mutagenesis and repair induced by the DNA advanced glycation end product N2-1-(carboxyethyl)-2'-deoxyguanosine in human cells. Biochemistry. 50, 2321-2329 (2011).
  7. Hecht, S. S. Lung carcinogenesis by tobacco smoke. International Journal of Cancer. 131, 2724-2732 (2012).
  8. Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 153, 17-37 (2013).
  9. Ong, T. P., Loureiro, A. P. M. Nutritional interventions in age-related genetic and epigenetic instability and cancer. Anti-ageing nutrients: Evidence-based prevention of age-associated diseases. John Wiley & Sons. UK. (2015).
  10. Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Cooke, M. S. Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance. Mutation Research. 567, 1-61 (2004).
  11. Moriya, M. Single-stranded shuttle phagemid for mutagenesis studies in mammalian cells: 8-oxoguanine in DNA induces targeted GC → TA transversions in simian kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1122-1126 (1993).
  12. Medeiros, M. H. G. Exocyclic DNA adducts as biomarkers of lipid oxidation and predictors of disease. Challenges in developing sensitive and specific methods for clinical studies. Chemical Research in Toxicology. 22, 419-425 (2009).
  13. Guéraud, F. 4-Hydroxynonenal metabolites and adducts in pre-carcinogenic conditions and cancer. Free Radical Biology and Medicine. 111, 196-208 (2017).
  14. Nair, U., Bartsch, H., Nair, J. Lipid peroxidation-induced DNA damage in cancer-prone inflammatory diseases: A review of published adduct types and levels in humans. Free Radical Biology and Medicine. 43, 1109-1120 (2007).
  15. Pang, B., et al. Lipid peroxidation dominates the chemistry of DNA adduct formation in a mouse model of inflammation. Carcinogenesis. 28, 1807-1813 (2007).
  16. Møller, P., et al. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radical Research. 46, 541-553 (2012).
  17. Hofer, T., Moller, L. Optimization of the workup procedure for the analysis of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine with electrochemicaldetection. Chemical Research in Toxicology. 15, 426-432 (2002).
  18. Collins, A., El Yamani, N., Dusinska, M. Sensitive detection of DNA oxidation damage induced by nanomaterials. Free Radical Biology and Medicine. 69-76 (2017).
  19. Zubel, T., Buerkle, A., Mangerich, A. Mass spectrometric analysis of sulfur mustard-induced biomolecular adducts: Are DNA adducts suitable biomarkers of exposure? Toxicology Letters. 293, 21-30 (2018).
  20. Tretyakova, N., Goggin, M., Sangaraju, D., Janis, G. Quantitation of DNA adducts by stable isotope dilution mass spectrometry. Chemical Research in Toxicology. 25, 2007-2035 (2012).
  21. Churchwell, M. I., Beland, F. A., Doerge, D. R. Quantification of multiple DNA adducts formed through oxidative stress using liquid chromatography and electrospray tandem mass spectrometry. Chemical Research in Toxicology. 15, 1295-1301 (2002).
  22. Chao, M. R., Yen, C. C., Hu, C. W. Prevention of artifactual oxidation in determination of cellular 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine by isotope-dilution LC-MS/MS with automated solid-phase extraction. Free Radical Biology and Medicine. 44, 464-473 (2008).
  23. Danielsen, P. H., et al. Oxidative stress, inflammation, and DNA damage in rats after intratracheal instillation or oral exposure to ambient air and wood smoke particulate matter. Toxicological Sciences. 118, 574-585 (2010).
  24. Danielsen, P. H., et al. Oxidative stress, DNA damage, and inflammation induced by ambient air and wood smoke particulate matter in human A549 and THP-1 cell lines. Chemical Research in Toxicology. 24, 168-184 (2011).
  25. Garcia, C. C. M., et al. [13C2]-Acetaldehyde promotes unequivocal formation of 1,N2-propano-2'-deoxyguanosine in human cells. Journal of the American Chemical Society. 133, 9140-9143 (2011).
  26. Angeli, J. P. F., et al. Lipid hydroperoxide-induced and hemoglobin-enhanced oxidative damage to colon cancer cells. Free Radical Biology and Medicine. 51, 503-515 (2011).
  27. Yu, Y., et al. Comprehensive assessment of oxidatively induced modifications of DNA in a rat model of human Wilson's disease. Molecular and Cellular Proteomics. 15, 810-817 (2016).
  28. Torres-Cuevas, I., Aupi, M., Asensi, M. A., Vento, M., Ortega, Á, Escobar, J. 7,8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine/2'-deoxiguanosine ratio determined in hydrolysates of brain DNA by ultrachromatrography coupled to tandem mass spectrometry. Talanta. 170, 97-102 (2017).
  29. Wu, D., et al. Detection of 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) as a biomarker of oxidative damage in peripheral leukocyte DNA by UHPLC-MS/MS. Journal of Chromatography B. 1064, 1-6 (2017).
  30. IARC. Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans: Outdoor Air Pollution. 109, IARC. Lyon, France. (2016).
  31. De Martinis, B. S., Kado, N. Y., Carvalho, L. R. F., Okamoto, R. A., Gundel, L. A. Genotoxicity of fractionated organic material in airborne particles from São. Mutation Research. 446, 83-94 (1999).
  32. Karlsson, H. L., Nygren, J., Möller, L. Genotoxicity of airborne particulate matter: The role of cell-particle interaction and of substances with adduct-forming and oxidizing capacity. Mutation Research. 565, 1-10 (2004).
  33. Bell, M. L., Dominici, F., Ebisu, K., Zeger, S. L., Samet, J. M. Spatial and temporal variation in PM2.5 chemical composition in the United States for health effects studies. Environmental Health Perspectives. 115, 989-995 (2007).
  34. Oliveira, A. A. F., et al. Genotoxic and epigenotoxic effects in mice exposed to concentrated ambient fine particulate matter (PM2.5) from São Paulo city, Brazil. Particle and Fibre Toxicology. 15, 40 (2018).
  35. Loureiro, A. P. M., Zhang, W., Kassie, F., Zhang, S., Villalta, P. W., Wang, M., Hecht, S. S. Mass spectrometric analysis of a cyclic 7,8-butanoguanine adduct of N-nitrosopyrrolidine: comparison to other N-nitrosopyrrolidine adducts in rat hepatic DNA. Chemical Research in Toxicology. 22, 1728-1735 (2009).
  36. Loureiro, A. P. M., Marques, S. A., Garcia, C. C. M., Di Mascio, P., Medeiros, M. H. G. Development of an on-line liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry assay to quantitatively determine 1,N2-etheno-2'-deoxyguanosine in DNA. Chemical Research in Toxicology. 15, 1302-1308 (2002).
  37. Mangal, D., et al. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chemical Research in Toxicology. 22, 788-797 (2009).
  38. ESCODD (European Standards Committee on Oxidative DNA Damage). Comparative analysis of baseline 8-oxo-7,8-dihydroguanine in mammalian cell DNA, by different methods in different laboratories: an approach to consensus. Carcinogenesis. 23, 2129-2133 (2002).
  39. Helbock, H. J., et al. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical detection assay of 8-oxo-deoxyguanosine and 8-oxo-guanine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 288-293 (1998).
  40. Risom, L., et al. Oxidative DNA damage and defence gene expression in the mouse lung after short-term exposure to diesel exhaust particles by inhalation. Carcinogenesis. 24, 1847-1852 (2003).
  41. Risom, L., et al. Repeated inhalations of diesel exhaust particles and oxidatively damaged DNA in young oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) deficient mice. Free Radical Research. 41, 172-181 (2007).
  42. Tsurudome, Y., et al. Changes in levels of 8-hydroxyguanine in DNA, its repair and OGG1 mRNA in rat lungs after intratracheal administration of diesel exhaust particles. Carcinogenesis. 20, 1573-1576 (1999).
  43. Marie-Desvergne, C., Maître, A., Bouchard, M., Ravanat, J. L., Viau, C. Evaluation of DNA adducts, DNA and RNA oxidative lesions, and 3-hydroxybenzo(a)pyrene as biomarkers of DNA damage in lung following intravenous injection of the parent compound in rats. Chemical Research in Toxicology. 23, 1207-1214 (2010).
  44. Iwai, K., et al. Early oxidative DNA damages and late development of lung cancer in diesel exhaust-exposed rats. Environmental Research. 84, 255-264 (2000).
  45. Ichinose, T., et al. Lung carcinogenesis and formation of 8-hydroxy-deoxyguanosine in mice by diesel exhaust particles. Carcinogenesis. 18, 185-192 (1997).
  46. Schmerold, I., Niedermu, H. Levels of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in cellular DNA from 12 tissues of young and old Sprague Dawley rats. Experimental Gerontology. 36, 1375-1386 (2001).
  47. Garcia, C. C. M., Freitas, F. P., Di Mascio, P., Medeiros, M. H. G. Ultrasensitive simultaneous quantification of 1,N2-etheno-2'-deoxyguanosine and 1,N2-propano-2'-deoxyguanosine in DNA by an online liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry assay. Chemical Research in Toxicology. 23, 1245-1255 (2010).
  48. Godshalk, R., et al. Comparison of multiple DNA adduct types in tumor adjacent human lung tissue: effect of cigarette smoking. Carcinogenesis. 23, 2081-2086 (2002).
  49. Dechakhamphu, S., et al. Lipid peroxidation and etheno DNA adducts in white blood cells of liver fluke-infected patients: protection by plasma alpha-tocopherol and praziquantel. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 310-318 (2010).
  50. Arab, K., et al. Typical signature of DNA damage in white blood cells: a pilot study on etheno adducts in Danish mother-newborn child pairs. Carcinogenesis. 30, 282-285 (2009).
  51. Nair, J., et al. High dietary omega-6 polyunsaturated fatty acids drastically increase the formation of etheno-DNA base adducts in white blood cells of female subjects. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 6, 597-601 (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics