Kütle spektrometresi ile üç DNA lezyonlarının ölçülmesi ve ortam Ince partikül madde maruz fareler dokularda düzeylerinin değerlendirilmesi

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada 8-OXO-7, 8-dihydro-2'-deoknguanozin (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1, n6-dAdo) ve 1,n2-lezyonların hassas ve doğru ölçülmesini yöntemleri açıklanmaktadır etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dguo) DNA 'da. Yöntemler, ortam ince partikül maddenin (PM2,5) dokularda (akciğer, karaciğer ve böbrek) maruz kalan A/J fareler üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi için uygulanmıştır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Franco de Oliveira, T., Falcão de Oliveira, A. A., Lemos, M., Veras, M., Saldiva, P. H., Gennari de Medeiros, M. H., Di Mascio, P., de Melo Loureiro, A. P. Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter. J. Vis. Exp. (147), e59734, doi:10.3791/59734 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

DNA akıları ve oksitlenmiş DNA üsleri, elektrofilik olan maddelerin toksisite değerlendirmesi için yararlı biyomarker olan DNA lezyonları örnekleridir, Biyotransformasyon üzerine reaktif elektrofil üretir veya oksidatif strese neden olur. Oksitlenmiş nüklüler arasında en çok çalışan 8-OXO-7, 8-dihidroguanin (8-oxoGua) veya 8-OXO-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), DNA 'da oksidatif olarak indüklenen baz hasarının bir biyokarker olduğunu. Lipid peroksidasyonu işleminden kaynaklanan aldehydes ve epoxyaldehydes, etheno adduct 1,n2-etheno-2'-deokguanosin (1,n2-) gibi MUTAJISIK exokiktik DNA adaklarını oluşturabilen elektrofilik moleküllerdir. εdGuo) ve 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-εdado), inflamasyonun patofizyolojisinde potansiyel biomarkerler olarak önerilmiştir. Hücre mutasyonu oranlarını ve kronik hastalık gelişimini yavaşlatmak için önleyici stratejilerin geliştirilmesi için (örneğin, kanser, nörodejeneratif hastalıklar), DNA 'daki ölçülerinin seçici ve hassas yöntemleri gereklidir. Onların algılama için kullanılabilir hassas Yöntemler arasında (yüksek performanslı sıvı kromatografi elektrokimyasal veya TANDEM kitle spektrometri dedektörleri, kuyruklu yıldız tahlil, immünasder, 32P-postetiketleme), en seçici bu tabanlı olan birleştiğinde yüksek performanslı sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi (HPLC-ESI-MS/MS) ile birleştiğinde. Seçicilik, karmaşık biyolojik numuneleri ve HPLC-ESı-MS/MS analizinde temel bir avantajdır, DNA, idrar, plazma ve tükürük gibi biyolojik matrislerde değiştirilen nükletlerin ölçülmesinde altın standardı olarak gelişti. İzotopik etiketli iç standartların kullanımı, DNA hidroliz ve analit zenginleştirme adımları sırasında molekül kayıplarına yönelik düzeltmeler ve numuneler arasındaki analit iyonizasyon farklılıkları için bir avantaj katıyor. Aynı zamanda birden fazla zirve olduğunda doğru kromatografik zirvede tanımlanmasını da yardımcı olur.

Burada, 8-oxodGuo, 1,n6-DAdo ve 1,n2-DGUO in Lung, karaciğer ve böbrek DNA 'sı için/J farelerinin ölçülmesini başarıyla uyguladığınız hassas, doğru ve hassas HPLC-ESI-MS/MS yöntemlerinin doğrulanması Ambient PM2,5 pozlama etkilerini değerlendirilmesi.

Introduction

Bazı reaktif oksijen türleri (ROS) DNA üsleri ve deoksiriboz Moiety bazı Karbonlar karbon çift bağları okside edebiliyoruz, oksitlenmiş üsler ve DNA iplikçik tatili üreten1. Azot ve oksijen atomları açısından zengin, negatif olarak şarj edilen bir molekül olarak, DNA aynı zamanda nüktenik siteler (azot ve oksijen) ile tepki veren aromatiklerin elektrofilik yerdeğiştirmesi gruplar için bir hedeftir, DNA adduct2denilen ürünler vererek. Yani, DNA adduct ve oksitlenmiş DNA üsleri, elektrofilik olan maddelerin toksisite değerlendirmesi için yararlı biyomarker olan DNA lezyonları örnekleridir, Biyotransformasyon üzerine reaktif elektrofil üretir, ya da oksidatif stres1, 2' ye kadar. Değiştirilmiş DNA üsleri DNA 'dan baz veya nükleotit eksizyon onarımı (BER veya NER) tarafından kaldırılabilse de, DNA lezyonlarının eski yol açmasıyla birlikte DNA lezyonları arasında bir dengesizlik indüksiyonu, daha fazla zaman içinde kendi düzeylerinde net bir artışa neden olur3 < /C5 >. Sonuçlar DNA mutasyonu oranlarının artması, azaltılmış gen ifadesi ve azalmış protein aktivitesi2,4,5,6,7, etkileri ile yakından ilgili olan hastalıkların gelişimi. DNA mutasyonları, hücre sinyalizasyon, hücre döngüsü, genom bütünlüğü, telomer stabilitesi, epigenom, kromatin yapısı, RNA birleştirme, protein homeostasis, metabolizma, apoptoz ve hücre farklılaşma gibi çeşitli hücresel fonksiyonları etkileyebilir8 ,9. Hücre mutasyonu oranlarını ve kronik hastalık gelişimini yavaşlatma stratejileri (örn. kanser, nörodejeneratif hastalıklar) mutasyon kaynaklarının bilgisine, DNA lezyonları ve nedenleri arasında geçmektedir.

Kirletici pozlama, kalıcı inflamasyon, hastalık patofizyolojisi (örn. diyabet) vb. nedeniyle endojenously fazlalıkta oluşturulan Ros, DNA ve lipid hasarı dahil olmak üzere biyomolekül hasarının önemli nedenleridir1. Örnek olarak, H2O2 ' den oluşan son derece reaktif hidroksil radikal (Oh) geçiş metal iyonlarına (Fe2 +, cu+) göre difüzyon kontrollü DNA üsleri, DNA şekeri kısım ve çoklu doymamış yağ asitleri oksitlenir oranları10. 80 arasında zaten oksitlenmiş nükvanoüsler karakterize3, en çok çalışan 8-OXO-7, 8-dihidroguanin (8-oxoGua) veya 8-OXO-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo, Şekil 1), gt transversions içinde yol açan bir lezyon memelinin hücreleri10,11. Bu, guanin mono elektronik oksidasyonu veya DNA1' de guanin hidroksil radikal veya atlet oksijen saldırısı ile oluşur. Çoklu doymamış yağ asitleri, lipid peroksidasyonu1,12sürecini başlatan Oh gibi yüksek reaktif oksidanların diğer önemli hedefleridir. Aromatiklerin elektrofilik yerdeğiştirmesi aldehitler ve epoxyaldehydes için deforme olabilir yağ asidi hidroperoksitler artış sağlar, Malondialdehit, 4-hidroksi-2-nonenal, 2, 4-decadienal, 4, 5-Epoxy-(2E)-decenal, hexenal, acrolein, crotonaldehyde gibi malondialdehit-, Propano-veya etheno adduct1,12,13gibi mutajisik exokiktik DNA adduct 'ları oluşturabilecektir. Eteno adduct 1,n2-etheno-2'-deoxyguanosine (1,n2-εdguo, Şekil 1) ve 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-εdado, Şekil 1 ) inflamasyonun patofizyolojisinde potansiyel Biyomarkörler olarak önerilen14,15.

Figure 1
Şekil 1. DNA lezyonları mevcut çalışmada nicelik kimyasal yapıları. dR = 2 ́-deoksirriboz. Bu rakam Oliveira ve al.34güncellenmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

1980 ' lerin başlarında yürütülen çalışmalar yüksek performanslı sıvı kromatografi elektrokimyasal algılama (HPLC-ECD) ile birleştiğinde 8-oxodGuo hassas tespiti izin verdi. 8-oxodguo tarafından HPLC-ECD tarafından oksitlenme koşullarına maruz kalan çeşitli biyolojik sistemlerde, 8-oxodguo ' nın DNA 'da oksidatif olarak indüklenen baz hasarının bir biyomarker olarak tanınmasına yol açan1,16. Düşük fmol aralığı17' de 8-oxodGuo miktarının sağlam olmasına rağmen, HPLC-ECD ölçümleri analitik kimlik tespiti için analit tutma süresi doğruluğunu ve Kromatografi çözünürlüğünü diğer örnek bileşenleri. Elektrokimyasal algılama mobil aşamada tuz kullanımı (örneğin, potasyum fosfat, sodyum asetat) gerektirdiğinden, yeterli analitik koşulların bakımı rutin sütun ve ekipman temizleme süresi gerekir.

Alternatif olarak, bakteriyel DNA onarım enzim formayidopyrimidine DNA glycosylase (FPG) kullanımı ve daha sonra, insan 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1), algılama ve DNA 'dan 8-oxogua kaldırılması için, DNA alkali labil indüksiyon için bir yol olarak ortaya çıktı Site. Alkali labil siteleri DNA Strand molaları dönüştürülür ve alkalin tek hücreli jel elektroforez ("kuyruklu yıldız tahlil") ile 8-oxogua çok yüksek duyarlı dolaylı kantifikasyon sağlar. Yüksek hassasiyet ve hücresel DNA ekstraksiyon gerek kalmadan analizlerin başarısı bu tür tahlil ana avantajlarıdır. DNA 'da 8-oxoGua en düşük sabit devlet seviyeleri verir, genellikle 7-10 kez HPLC dayalı biyoanalitik Yöntemler ile elde edilen düzeylerinden daha düşük. Ancak, bu 8-oxogua dolaylı bir ölçüsüdür ve bazı dezavantajları özgüllük eksikliği veya onarım enzimlerin bilinmeyen verimliliği kullanılan1,16,18.

Bağışıklık sistemi, 1,n6-DAdo ve 1,n2-Dguo12gibi 8-oxogua1 ve exokiktik DNA kanalının saptanması için kullanılan diğer yöntemler kümesidir. Duyarlılık rağmen, DNA lezyonlarının tespiti için antikorların kullanımı bir eksiklik biyolojik numunelerin diğer bileşenlere çapraz reaktivite nedeniyle özgüllük eksikliği, normal DNA üsleri dahil,1,12. 1,n6-DAdo ve 1,n2-DGUO dahil olmak üzere exokiklik DNA adduct 'lar da tespit edilebilir ve son derece hassas 32P-postetiketleme12ile ölçülebilir. 32P-postetiketleme yüksek duyarlılık 1010 normal üsler başına yaklaşık 1 yaklaştırmak tespiti için DNA (örneğin, 10 μg) çok az miktarda kullanımını sağlar19. Ancak, radyo-kimyasallar, kimyasal özgüllük ve düşük doğruluk eksikliği kullanımı bazı dezavantajları19,20.

Yukarıda bahsedilen yöntemlerin paylaşılan sınırlaması, istenilen moleküllerin algılanması için düşük seçicilik veya özgüllük şeklindedir. Bu senaryoda, elektrosprey iyonizasyon tandem kütle spektrometresi (HPLC-ESI-MS/MS ve HPLC-MS3) ile BIRLEŞEN HPLC, DNA, idrar, plazma ve tükürük gibi biyolojik matrislerde değiştirilmiş nükleslerin ölçülmesini için altın standart olarak gelişti. 1 , 19 , 20. HPLC-ESı-MS/MS yöntemlerinin avantajları (genellikle düşük fmol aralığında) duyarlılık ve ı tarafından sağlanan yüksek özgüllük) kromatografik ayrım, II) kütle içinde molekül parçalanma karakteristik ve bilinen deseni Spektrometre çarpışma odası ve III) birden fazla reaksiyon izleme modunda seçilen kütlenin şarj oranı (m/z) doğru ölçümü1,19. İzotopik etiketli iç standartların kullanımı, DNA hidroliz ve analit zenginleştirme adımları sırasında molekül kayıplarına yönelik düzeltmeler ve numuneler arasındaki analit iyonizasyon farklılıkları için bir avantaj katıyor. Aynı zamanda birden fazla zirve mevcut olduğunda doğru kromatografik zirvede teşhis yardımcı olur1,12,19,20.

HPLC-ESI-MS/MS bazlı çeşitli yöntemler, farklı biyolojik örneklerden çıkarılan DNA 'da 8-oxodguo, 1,n6-dAdo ve 1,n2-dguo miktarının ölçülmesini için kullanılmıştır12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . İnce parçacıklar (PM2,5) organik ve inorganik kimyasallar taşır, polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH) gibi, Nitro-PAHs, aldehyler, ketonlar, karboksilik asitler, kinolinler, metaller, ve su çözünür iyonlarının, hangi inflamasyon neden olabilir ve oksidatif stres, biyomolekül hasar ve hastalığın oluşumu lehine koşullar30,31,32,33. Burada onaylanan HPLC-ESı-MS/MS yöntemleri, 8-oxodGuo, 1,n6-DAdo ve 1,n2-DGUO in Lung, karaciğer ve böbrek DNA 'sı/J farelerinin ölçülmesi için başarıyla uygulanmıştır. ortam PM2,5 pozlama34etkileri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dört haftalık erkek A/J fareler, spesifik patojen ücretsiz, Fundação Oswaldo Cruz (FıOCRUZ), Rio de Janeiro, Brezilya Laboratuvar hayvanları üreme merkezi 'nden elde edildi ve Tıp Fakültesi Etik Komitesi göre tedavi edildi, üniversite (protokol no 1310/09).

1. fare dokularının toplanması

  1. Ksilazin ve ketamin ile hayvan anestezize. 30 g vücut ağırlığı ile bir fare için, bir çözüm enjekte (2 mL 'den fazla) içeren 2,63 mg ketamin ve 0,38 xylazine mg, intraperitoneally.
  2. Tamamlayıcı analizler için kan (0,5-1,5 mL) toplayın (örn., antioksidan enzim aktivitesi, malondialdehit seviyeleri).
  3. Karın saçını pelviden ksifoid sürecine tıraş edin. Saçsız alanda dikey bir orta çizgi bir kesi olun. Karın organlarını açığa çıkarmak için yatay lateral çizgilerle kesikler yapın.
  4. Karın aortunu kesmeye ve hayvanı ötenize etmeye teşvik etmek.
  5. İlgi dokularını çıkarın (Bu durumda, karaciğer, böbrek ve akciğer).
    1. Karaciğer kaldırmak için, inferior Cava ven ve portal hepatik ven kesti.
    2. Böbrekleri kaldırmak için, Böbrek damarları ve arterlerin bölümü.
    3. Akciğerleri kaldırmak için, Diyaframlı ekstremite ve torasik duvara yakın çevresi bir kesi yapmak. Torasik boşluğun iç kısmına bir makas açarak köprücük kemiği kırın. Akciğerleri ve Kalbi açığa çıkarmak için ksifoid işleminden trakea 'ya doğru dış kemiği kesiniz.
      1. Akciğeri bir forseps ile tutun, trakea ve akciğerler etrafında ligamentler bölümü. Dikkatle blok akciğerleri artı kalp çıkarın. Akciğerleri bloktan çıkarmak için, kalbi bir forseps ile tutun ve üssünde tüm gemileri keser.
  6. İzole dokularda hemen soğuk tuz çözeltisi (0,9% NaCl), kriyojenik tüplere transfer ve hemen borular sıvı azot içine daldırma yıkayın. İşi tamamladıktan sonra, tüpleri-80 °C ' de saklayın.
    DIKKAT: cilt, mukoza veya gözler ile doğrudan temas halinde sıvı nitrojen yanıklara neden olur. Temas önlemek için uygun bireysel koruma kullanın. Sıvı azot buharı nedeniyle asfiksi önlemek için havalandırmalı bir laboratuvarda çalışın.

2. DNA ekstraksiyonu

Not: DNA ekstraksiyon yöntemi Loureiro ve al. (2009)35 , burada incelendiği lezyonların analizine izin vermek için değiştirildi.

  1. Dokuları içeren tüpleri buz kuru olarak aktarın.
  2. Bir neşter ile doku parçasını kesmek için bir üs olarak buz üzerine yerleştirilen bir kültür plakası kullanın. Acil kullanım için 1 g ağırlık. Kalan doku,-80 °C ' de depoya dönene kadar kuru buzda tutulmalıdır.
    Not: analizlerin tekrarlar gerekiyorsa, eserler oluşumunu önlemek için kalan doku çözülmesini önlemek için önemlidir.
  3. 50 ml kaplı tüpler her 1 gr doku için, 0,5 mm Deferoksamin içeren ticari hücre liziz çözeltisi 10 ml ekleyin ve buz üzerinde tutun.
    Not: hemen kullanım için çözüm hacmine deferoxamin ekleyin. Her 100 ml çözeltisi için deferoxamin mesilat tuz 0,0328 g ekleyin.
  4. Doku parçacıkları olmadan homojen bir çözüm elde edene kadar doku homogenizer kullanarak dokularda homojenize. Homojenizasyon sırasında tüp soğuk (buz üzerinde) tutun. Isıtma önlemek için düşük hız kullanın.
  5. Her homojenize numune için 150 μL proteinaz K çözeltisi (20 mg/mL) ekleyin. İnversiyon tarafından tüpler sallayın ve gecelik oda sıcaklığında tutun.
  6. Ekle 40 μL ribonükleaz bir çözüm (15 mg/ml), inversion tarafından sallamak ve 2 h için oda sıcaklığında tüpler tutmak.
    Not: hazırlamak ribonükleaz sodyum asetat tampon bir çözüm 10 mm, pH 5,2 yağış önlemek için. Deoxyribonuclease ücretsiz bir çözüm elde etmek için kullanmadan önce 15 dakika için 100 °C ' de solüsyonu ısıtın.
  7. Ticari protein yağış çözeltisi 5 mL ekleyin, şiddetle Vortex, ve Santrifüjü 2.000 x g, 4 °c, 10 dakika.
  8. 10 ml soğuk isopropanol içeren ml kaplı tüpler 50 için süpernatanlarında aktarın. Çöktürülmüş DNA gözlem kadar hafifçe birkaç kez tüpler tersine çevirin.
    Not: protokol, tüpleri-20 °C ' de tutarak burada duraklatılabilir.
  9. Sonunda kapalı bir Pasteur pipet kullanarak çöktürülmüş DNA toplayın. 4 mL 10 mM Tris tampon, 1 mM deferoxamine, pH 7,0 içeren tüplere aktarın.
  10. Yukarıdaki çözelti içinde DNA tamamen çözülür sonra (Vortex değil), ekamyl alkol% 4 içeren bir kloroform çözeltisi 4 mL ekleyin.
  11. Homojenizasyon için 10 kez tüplerin tersine çevirin, 2.000 x g, 4 °c ' de santrifüjün, iki fazı ayırmak için 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve üst fazı yeni bir tüpe aktarın.
  12. 2,10 ve 2,11 iki kez daha adımları yineleyin.
  13. DNA 'Yı çökeltmek için 5 M NaCl çözeltisi 8 mL mutlak etanol ve 0,4 mL ekleyin.
  14. Tekrar çökelmiş DNA toplayın ve 3 mL 70% etanol aktarın. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
  15. Etanol çözümünü dikkatli bir şekilde atın ve çözeltinin fazlalığını kaldırmak için emici kağıda çökelmiş DNA 'Yı içeren tüpleri tersine çevirin.
  16. DNA 'Yı çözmek için 0,1 mM deferoxamin çözeltisi 200 μL ekleyin. DNA tamamen rehidurasyona (gecede) kadar tüpleri 4 °C ' de koruyun.
  17. 260 Nm 'de emmeyi ve 260/280 nm emici oranı ile saflığını ölçerek DNA konsantrasyonunu belirleyin.
    Not: DNA konsantrasyonu belirlemek için, 10 μL DNA çözeltisi bir kısım transfer 990 μL ultra saf su (100x seyreltme). 260 Nm 'de (1 ' in altında olmalıdır) 50 (50 μg/mL, 1 cm 'lik yol uzunluğu çözeltisi, 260 Nm 'de emilim 1) ve μg/mL 'de DNA konsantrasyonu elde etmek için kullanılan seyreltme (100x) ile çift telli DNA konsantrasyonudur. 260 Nm 'de emici 1 ' in üstünde ise ek seyreltme gereklidir. 260/280 nm emici oranı istenilen DNA saflığına eşit veya 1,8 yukarıda olmalıdır, ancak 1,6 civarında oranlar kabul edilebilir.

3. DNA enzimatik hidroliz

  1. Analiz tarifi
    1. 1,n6-εdado ve 1,n2-εdguo analizleri: 150 μg DNA 'sı içeren bir kısım için 7,5 μL, 200 mm Tris/MgCl2 tampon (pH 7,4), 1,4 fmol/μL [15N 5 içeren dahili standart solüsyondan% 1μl ekleyin ] 1,n6-εdado ve [15n5] 1,n2-εdguo, ve 15 adet deoksirribonuclease ı. son hacmi 200 μL 'ye Ultra Saf suyla ayarlayın ve 3.2.1 adımda kullanılacak enzimlerin hacimlerini çıkarır.
    2. 8-oxodGuo analizleri: 80 μg DNA 'Sı içeren bir alan Için 3,8 μL, 200 mM Tris/MgCl2 tampon (pH 7,4), 2 μL, [15N5] 8-oxodguo ve 8 adet deoktokribonuclease ı Ile 1.000 fmol/μL içeren iç standart çözelti ekleyin. Son hacmi 100 μL ile ultra saf suyla ayarlayın ve 3.2.2 adımda kullanılacak enzimlerin hacimlerini çıkarır.
      Not: iç standartlar [15n5] 1,n6-εdado, [15n5] 1,n2-εdguo ve [15n5] 8-oxodguo sentezlenmiş ve olarak karakterize edilebilir açıklanan35,36,37. Enjekte edilen numune hacimlerindeki iç standartların miktarları, enjekte edilen kalibrasyon eğrisi hacimlerindeki aynı olmalıdır.
  2. Numuneleri 37 °C ' de 1 saat boyunca kulbe etme.
    1. Adım 3,1 örnekleri: Crotalus atrox ve sığır bağırsak mukozası gelen alkalin fosfataz 15 adet fosfodiesteraz ı 0,006 birimleri ekleyin.
    2. Adım 3,2 örnekleri: Crotalus atrox ve sığır bağırsak mukozası 8 adet alkalin fosfataz gelen fosfodiesteraz 0,0032 birimleri ekleyin.
  3. Numuneleri 37 °C ' de 1 saat boyunca kulbe etme.
  4. Numuneleri 14.000 x g 'de 10 dakika santrifüjün.
  5. Adım 3.2.1 ' den örnekler: deoxynucleosides (dAdo, dGuo) tarafından HPLC/DAD (adım 9) miktarının belirlenmesi için her bir numunenin 10 μL 'yi ayırın. Katı faz çıkarma (adım 4) için kalan hacmi konu.
  6. Adım 3.2.2 örnekleri: transfer 80 HPLC-ESı-MS/MS sisteminde 50 μL (1.000 fmol [15N5] 8-oxodguo) enjeksiyonları için süpernatant mg μL. Kalan 20 μL 'yi HPLC/DAD (adım 9) ile dGuo miktarının miktarını ayırın.

4.1, n6-Εdado ve 1, n2analizleri için katı faz ekstraksiyon-εdguo

  1. Kartuşları (SPE-C18, 30 mg/mL, 33 μm, 1 mL) aşağıdaki çözümler serisinden 1 mL ile yükleyin: 100% metanol, deiyonize su, hidrolize DNA örneği, deiyonize su,% 10 metanol,% 15 metanol ve% 100 metanol (toplanacak).
    Not: kartuşları farklı çözümlerin uygulamaları arasında kuru bırakmayın. Önceki çözümün kartuşu tamamen girdikten hemen sonra sonraki çözümü ekleyin.
  2. Vakum, son elüsyon fraksiyonu (100% metanol) içerir.
  3. HPLC-ESI-MS/MS analizinden hemen önce 83,1 μL Ultra Saf suyla kurutulmuş numuneleri, her bir numunenin 50 μL 'de her bir iç standardın 200 fmol 'i elde etmek için yeniden resuspend.

5. Kalibrasyon eğrilerinin hazırlanması

  1. Her noktada [15N5] 8-oxodguo 1.000 fmol sabit miktarda, 8-oxodguo standardı 6.000 fmol 300 aralığında en az beş puan hazırlayın. Bu tutarlar enjekte birimdeki düşünün.
  2. 1,n6-Εdado ve 1,n2-εdguo 1 ile 40 fmol aralığında en az beş puan hazırlayın, [15n5] 1,n6-εdado ve [15n5] 1 ' in sabit miktarlarda 200 fmol N 2-εdguo her noktada. Bu tutarlar enjekte birimdeki düşünün.
  3. 0,05-1 nmol dGuo ve dAdo aralığında en az beş puan hazırlayın. Bu tutarlar enjekte birimdeki düşünün.

6. Yöntem doğrulama için DNA örneklerinin hazırlanması

  1. 1,n6-Εdado ve 1,n2-εdguo analizleri: farklı miktarlarda 1,n6-εdado ve 1,n2-εdguo (örn., 1,75, 8,75, 17,5 ve 35 fmol) ve sabit miktarlarda [15N5] 1, N6-εdado ve [15n5] 1,n2-εdguo (350 fmol) için 100 μg buzağı timus DNA ve 3. adımda açıklandığı gibi enzimatik hidroliz yürütmek. İki farklı gün içinde quadruplicate örnekleri işlem. Yöntem doğruluğu ve hassasiyet değerlendirmesi için örnekleri kullanın.
    Not: DNA hidrolizinin son hacmi 200 μL (3. adım), deoxynucleosides 'in HPLC/DAD (adım 9) tarafından ölçülmesini sağlayacak şekilde 10 μL 'den ayrılacaktır. Kalan çözelti (190 μL) katı faz ekstraksiyonu (adım 4) maruz kalacak, kurutulmuş fraksiyonu 83,1 μL (adım 4,3), hangi 50 μL HPLC-ESı-MS/MS sisteme enjekte edilecektir yeniden olacaktır. 1,n6-Εdado ve 1,n2-εdguo enjekte edilen miktarlar 1, 5, 10 ve 20 fmol olacak, [15n5] 1,n6-εdado ve [15n5] 1, n ile 200 fmol her örnekteki 2-εdguo.
  2. 8-oxodguo analizleri: çeşitli miktarlarda 8-oxodguo (örn., 734, 1.468, 2.938 ve 4.408 fmol) ve sabit bir miktarda [15N5] 8-oxodguo (2.000 fmol) ile 100 μg Dana timus DNA 'sını ekleyin ve 3. adımda açıklandığı gibi enzimatik hidroliz gerçekleştirin. İki farklı gün içinde quadruplicate örnekleri işlem. Yöntem doğruluğu ve hassasiyet değerlendirmesi için örnekleri kullanın.
    Not: DNA hidrolizlerin son hacmi 100 μL (adım 3), hangi 50 μL HPLC-ESı-MS/MS sistemine enjekte edilecektir olacaktır. 8-oxodGuo miktarı enjekte edilir 367, 734, 1469, ve 2204 fmol, ile 1.000 fmol [15N5] 8-oxodguo her örnekte.
  3. 1,n6-εdado 13,125 fmol ekleyin (enjeksiyon hacminde 7,5 fmol elde etmek için) ve 1,n2-εdguo 35 fmol (enjeksiyon hacminde 20 fmol elde etmek için) sekiz numune için 100 μg buzağı timus DNA.
    1. İç standartları ekleyin [15n5] 1,n6-εdado ve [15n5] 1,n2-εdguo (200 fmol) örneklerin dördü. DNA hidroliz ve tüm numunelerin katı faz ekstraksiyon ile devam edin.
    2. Diğer dört örneğe [15n5] 1,n6-εdado ve [15n5] 1,n2-εdguo (200 fmol) iç standartları ekleyin.
    3. Katı faz ekstraksiyon gelen adduct kurtarma hesaplamak için örnekleri kullanın.

7. HPLC-ESı-8-oxodGuo MS/MS Analizi

  1. 8-oxodGuo standardını ekipmanlara bulaştırma, birden fazla reaksiyon izleme (MRM) ile parçalanma deseninin en iyi tespiti için ESı-MS/MS parametrelerini ayarlayın: m/z 284 [m + h] + → m/z 168 [m-2 '-Deokriboz + h]+.
    1. [15N5] 8-oxodguo: m/z 289 [m + h]+m/z → 173 [m-2 '-deokriboz + h]+algılaması için aynı parametreleri kullanın.
      Not: Bu çalışma içinde kullanılan ekipmandan ( malzeme tablosunabakın) eşdeğer veya daha iyi bir ekipman kullanın. ESı-MS/MS parametreleri Tablo 1' de açıklandığı şekilde ayarlandı.
  2. Filtre (0,22 μm gözenekli membranlar kullanılarak) ve tüm su bazlı HPLC çözücüleri (sonicator kullanarak) degasify.
  3. Analiz için aşağıdaki Kromatografi koşullarını kullanın, Şekil 2' de gösterildiği gibi sistemi monte etme.
    Not: A sütunu ikili pompaya bağlanır. Onun akıtıcı UV algılama ve atık ilk 16 dakika ve 32 den 46 min kromatografi, Şekil 2agösterildiği gibi yönlendirilir. Bu, numune enjekte edildikten hemen sonra el ile oluşturulan sütundur. B sütunu izokrat pompaya ve kütle spektrometresi ile bağlantılıdır. Bu sütun A, sadece 16-32 min aralığında, vana Şekil 2B'de gösterilen konuma geçiş zaman akıtıcı alır. Vana anahtarlama ikili pompa gradyan tarafından elüe iki sütun arasında bağlantı sağlar. Şekil 2B 'de gösterilen konfigürasyon daha yüksek ayrım ve daralma izni verir. Ayrıca, sadece ilgi kromatografik kesir kütle spektrometresi ulaşır, duyarlılık ve seçicilik artırır.
    1. Elute a 50 x 2,0 mm kimlik, 2,5 μm, C18 sütun ( Şekil 2sütun a) bir C18 güvenlik koruması kartuşu (4,0 x 3,0 mm kimliği) bir gradyan ile% 0,1 formik asit (solvent a) ve metanol içeren% 0,1 formülik asit (solvent B) bir akış hızında 150 μL/dak ve 25 °C ' ye kadar.
      1. İkili pompa için aşağıdaki degrade programı kullanın: 0 ile 25 dk, 0-15% solvent B; 25 ila 28 dk,% 15-80 solvent B; 28 ila 31 dk,% 80 solvent B; 31-33 min, 80-% 0 solvent B; 33% 46 min,% 0 solvent B.
      2. İlk 16 dakika israf ve 16-32 min kesir ikinci bir sütuna (150 x 2,0 mm kimliği, 3,0 μm, C18, Şekil 2sütun B), ESI kaynağına bağlı ve% 15 ' lik bir solüsyon ile izokrat pompa tarafından şartlı doğrudan yönlendirmek için anahtarlama valfi kullanın beni % 0,1 formülik asit (150 μL/dak) içeren suda thanol.
        Not: adım 7.3.1.2 anahtarlama valf programı kullanmadan önce, 8-oxodGuo standart ilk sütunda 16 dakika sonra elutes olup olmadığını kontrol edin. İkinci sütundan 8-oxodGuo elute ve keskin bir kromatografik zirve almak için ikili pompa gradyan kullanmak için 32 dakika içinde vana kapatmak önemlidir. Lezyon 8-oxodGuo yaklaşık 36 dakikada ikinci sütundan elutes. analit saklama süresi varyasyonları kullanılan sütun ve ekipman bağlı olarak oluşabilir. HPLC solvent degrade programının adaptasyonları gerekli olabilir.

Figure 2
Şekil 2. 8-OXO-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo) analizleri için kullanılan iki sütun sistemi. A) yapılandırma ilk 16 dakika ve 32 den 46 dk Kromatografi kullanılan; B) Aralık 16-32 dakika içinde kullanılan yapılandırma, daha fazla ayırma ve pik kütle spektrometre ESI kaynağına elüsyon önce B sütununda daralma izin. Bu rakam Oliveira ve al.34' den yeniden yayınlandı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

8. HPLC-ESı-MS/MS Analizi 1, n 6 -Εdado ve 1, n 2 -εdguo

  1. 1,n6-Εdado ve 1,n2-εdguo standartlarını ekipmanlara BULAŞTıRMA, birden fazla reaksiyon izleme (MRM) ile parçalanma desenlerinin en iyi tespiti için ESI-MS/MS parametrelerini ayarlayın: m/z 276 [m + h]+m/z 160 [m 2 '-deoksirriboz + h]+ 1,N6-εdado ve m/z 292 [m + h]+  m/z 176 [m-2 '-deokriboz + h tespiti için ]+ 1,N2-εdguo tespiti için.
    1. [15n5] 1,n6-εdado (m/z 281 [m + h]+m/z → 165 [m-2 '-deoksinriboz + h]+) ve [15n algılama için aynı parametreleri kullanın 5] 1,N2-εdguo (m/z 297 [m + h]+m/z 181 [m-2 '-deoksirriboz + H]+). Tablo 1' de AÇıKLANDıĞı şekilde ESı-MS/MS parametrelerini ayarlayın.
ESı-MS/MS parametreleri 8-oxodGuo Ömer akyol
Perde gazı 20 psi 20 psi
Nebulizing gaz 55 50
İyon kaynak gazı 50 psi 40 psi
Çarpışma kaynaklı Dissosyasyon gazı Orta Orta
İyon püskürtme gerilimi 5000 4500
ESı prob sıcaklığı 450 450
Dekümeleme potansiyeli 31 V, 8-oxodGuo 41 V, 1, N6-εdado
31 V, [15N5] 8-oxodguo 41 V, [15N5] 1, N6-εdado
45 V, 1, N2-εdguo
45V, [15N5] 1, N2-εdguo
Çarpışma enerjisi 23 eV, 8-oxodGuo 25 eV, 1, N6-εdado
23 eV, [15N5] 8-oxodguo 25 eV, [15N5] 1, N6-εdado
27 eV, 1, N2-εdguo
27 eV, [15N5] 1, N2-εdguo
Çarpışma hücresi çıkış potansiyeli 16 V, 8-oxodGuo, 8 V, 1, N6-εdado
16 V, [15N5] 8-oxodguo 8 V, [15N5] 1, N6-εdado
16 V, 1, N2-εdguo
16 V, [15N5] 1, N2-εdguo
Giriş potansiyeli 10 V 10 V

Tablo 1. Sı-MS/MS ekipmanında DNA lezyonlarının tespiti için kullanılan parametreler. Bu tablo Oliveira ve al.34güncellenmiştir.

  1. Filtre (0,22 μm gözenekli membranlar kullanılarak) ve tüm su bazlı HPLC çözücüleri (sonicator kullanarak) degasify.
  2. Analizler için aşağıdaki Kromatografi koşullarını kullanın.
    1. Elute a 150 x 2,0 mm kimlik, 3,0 μm, C18 sütun, 5 mM amonyum asetat, pH 3,0 (solvent A) ve Asetonitril (solvent B) gradyan ile bir C18 güvenlik koruma Kartuşu (4,0 x 6,6 mm kimliği) ile birleştiğinde, 130 μL/dak ve 25 °C akış hızında.
      1. İkili pompa için aşağıdaki degrade programı kullanın: 0 ila 10 dk,% 0 solvent B; 10 ila 39 min,% 0-20 solvent B; 39% 41 min,% 20-75 solvent B; 41% 46 min,% 75 solvent B; 46% 47 min, 75-% 0 solvent B; 47% 60 min,% 0 solvent B.
      2. Atıkların ilk 35 dk 'yi ve% 35-42 min fraksiyonunu ESı kaynağına yönlendirmek için anahtarlama valfi kullanın. Set aralığında sütundan yaklaştırmak standartları elute emin olun (35-42 min). Gerekirse ayarlamalar yapın.

9. HPLC-UV ile normal 2 '-deokribonucleosides 'in ölçülmesini

  1. Bu çalışma için kullanılan ekipmanlara benzer bir ekipman kullanın (bkz. malzeme tablosu).
  2. Elute a 250 mm x 4,6 mm kimlik, 5 μm, C18 güvenlik koruyucu kartuşuna (4,0 x 3,0 mm kimlik) bağlı,% 0,1 ' lik formik asit ve metanol degradesi ile.
    1. Aşağıdaki degrade programını kullanın: 0 ile 25 dk, 0-18% metanol; 25 ila 27 dk, 18 ila 0% metanol; 1 mL/dak ve 30 °C akış hızında 27 ila 37 min,% 0 metanol).
    2. 2 '-deoxynucleosides quantification için ayrılmış her örnek 5 μL enjekte.
    3. DGuo ve dAdo zirvelerinin entegrasyonu için 260 Nm 'de baba dedektörü ayarlayın.

10. DNA lezyonlarının ölçülmesini

  1. 8-oxodGuo doruklarına entegre, [15n5] 8-oxodguo, 1,n6-εdado, [15n5] 1,n6-εdado, 1,n2-εdguo, ve [15n5] 1,n2 -HPLC-ESI-MS/MS analizinden εdguo.
    1. 8-oxodGuo/[15n5] 8-oxodguo, 1,n6-εdado/[15n5] 1,n6-εdado ve 1,n2-εdguo/[15n 5 alan oranlarını hesaplayın ] 1,N2-εdguo kalibrasyon eğrileri ve örnekleri için.
    2. Y ekseninde, adım 10.1.1 'de elde edilen alan oranlarını ve x eksenindeki her noktada bulunan analitlerin miktarını kullanarak kalibrasyon eğrilerini çizin.
    3. Her enjekte örnekteki lezyonların tutarları (fmol), bir adım 10.1.1 'de hesaplanan oranları ve adım 10.1.2 kalibrasyon eğrilerini kullanarak hesaplayın.
  2. DGuo ve dAdo zirvelerini HPLC-UV analizinden entegre edin.
    1. Y ekseninde adım 10,2 elde edilen alanları ve x eksenindeki her noktada bulunan analitlerin miktarını kullanarak kalibrasyon eğrilerini çizin.
    2. 10,2 adımda elde edilen alanları ve adım 10.2.1 kalibrasyon eğrilerini kullanarak her bir enjekte örnekteki dGuo ve dAdo tutarları (nmol) hesaplayın.
  3. HPLC-ESı-MS/MS sistemine enjekte edilen her örnekteki dGuo ve dAdo miktarlarını (nmol) hesaplayın, adım 10.2.2 hesaplanan miktarların 5 μL örnek hacminde bulunduğunu düşünürsek, 50 μL HPLC-ESı-MS/MS sistemine enjekte edildi.
    Not: 8-oxodGuo analizi için kullanılan örneklerinde dGuo miktarını hesaplamak Için, sadece 50 tarafından adım 10.2.2 elde edilen miktarı (nmol/μL) çarpın. 1,n6-Εdado ve 1,n2-Εdguo analizleri için kullanılan örneklerde dAdo ve dguo tutarları hesaplamak için, katı faz ekstraksiyon sonra konsantrasyon adımını düşünün. HPLC-ESı-MS/MS sistemine enjekte edilen 50 μL hacmi, orijinal numunenin 114,32 μL 'ye karşılık gelir. Adım 10.2.2 elde edilen tutarlar (nmol/μL) doğru değerleri elde etmek için 114,32 ile çarpılmalıdır.
  4. Hesaplamak molar kesirler 8-oxodGuo/dGuo, 1,n6-εdado/DAdo, 1,n2-εdguo/dguo. Oranlar (fmol lezyonu/nmol normal deoxynucleoside) 106 normal dguo veya dAdo başına lezyonlar sayısını verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fare karaciğerinden (~ 1 g doku), akciğer (~ 0,2 g dokusu) ve böbrek (~ 0,4 g dokusu) elde edilen ortalama DNA konsantrasyonları (± SD), sırasıyla 5.068 ± 2.615, 4.369 ± 1.021 HPLC-DAD tarafından elde edilen, saflaştırılmış DNA 'nın temsili kromatogram Şekil 3' te gösterilir. Dört 2 '-deoxynucleosides varlığı, RNA ribonucleosides ücretsiz, karşılık gelen hemen önce elute 2 '-deoxynucleosides, DNA saflık gösterir.

HPLC-ESı-MS/MS ' den temsilci kromatogram 8-oxodGuo, 1,n6-Εdado ve 1,n2-εdguo farelerde doku DNA örneklerinin ölçülmesini 4 ile 6 rakamlardagösterilmektedir. Şekil 4 ' te UV algılama ile elde edilen kromatogram, 8-oxodGuo 'dan iyi bir ayrılık ile istenmeyen müdahaleleri ortadan kaldırarak, ilk sütundan ~ 10 dakikaya kadar dört 2 '-deoxynucleosides ' i gösterir. Normal 2 '-deoxynucleosides, 1,n6-Εdado ve 1,n2-εdguo analizlerinde, katı faz ekstraksiyon prosedürlerinde ortadan kalktıkları için mevcut değildi. Bu çalışmanın kullanılan standartların kütle spektrumları Şekil 7' de gösterilir.

8-oxodGuo, 1,n6-Εdado ve 1,n2-εdguo rakamlarından oluşan tipik doğrusal kalibrasyon eğrileri Şekil 834' de gösterilir. Tablo 234' de sunulan yöntemler doğru ve hassastır. 8-oxodguo 367 fmol ile takviye DNA plakaya için günlük hassasiyet hesaplanan% 16,97, 10 fmol ile tamamlayıcı 1,n2-εdguo oldu 14,01%, ve 1 fmol ile tamamlayıcı 1,n6-εdado oldu 16,66%. Sütun üzerine enjekte edilen standartlar için miktarın limitleri (S/N = 10) 8-oxodGuo için 25 fmol, 1,n6-εdado için 0,3 Fmol ve 1,n2-εdguo34için 1 fmol idi.

Yöntemler 8-oxodguo, 1,n2-εdguo ve 1,n6-εdado akciğer, karaciğer ve A/J fareler dokularının böbrek DNA numunelerinin kantifikasyon uygulanan PM2,5zenginleştirilmiş ortam hava tüm vücut maruz, karşılaştırıldığında Bu çalışma kontrolü34olarak situ ortam havası maruz olanlar. Bulunan seviyeleri Tablo 3gösterilir, ve akciğer DNA lezyonlarının indüksiyon gösterir, karaciğer ve böbrek PM2,5 Exposure34.

Figure 3
Şekil 3 . Fare akciğerinden çıkarılan bir DNA örneğinin hidrolizat kromatogram. Kromatogram, HPLC-Dad sisteminden 260 Nm 'de elde edilmiştir. Dört 2 '-deoxynucleosides gösterilir: dC, 2 '-deoxycytidine; dA, 2 '-deoxyadenosine; dG, 2 '-deoxyguanosine; dT, 2 '-deoxythymidine. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 . 8-OXO-7, 8-dihydro-2 ́-deoxyguanosine (8-oxodguo) ve iç Standart [15N5] 8-oxodguo tarafından HPLC-ESI-MS/MS 'nin tespiti ve normal 2 '-deoxynucleosides 'in algılanmasını gösteren temsili Kromatogramlar ilk sütundan uzaklaşarak baba tespiti (λ = 260 Nm) ve atık olarak yönlendirilir. DNA örneği fare akciğerinden çıkarıldı. HPLC-ESı-MS/MS tarafından yapılan analizler, görüntülerde belirtilen fragmentasyonlar kullanılarak birden fazla reaksiyon izleme (MRM) ile yapılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. 

Figure 5
Şekil 5 . Temsili Kromatogramlar 1 tespiti gösteren, N 6 -etheno-2 ́-deoxyadenosine (1,n6-εdado) ve iç Standart [15N5] 1, N 6 -εdado tarafından HPLC-ESI-MS/MS. DNA örneği fare böbreğinden çıkarıldı. Analizler, görüntülerde belirtilen fragmentasyonlar kullanılarak birden fazla reaksiyon izleme (MRM) ile yapılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. 

Figure 6
Şekil 6 . Temsili Kromatogramlar 1 tespiti gösteren, N 2 -etheno-2 ́-deoxyguanosine (1,n2-εdguo) ve iç Standart [15N5] 1, N 2 -εdguo tarafından HPLC-ESI-MS/MS. DNA örneği fare karaciğerinden çıkarıldı. Analizler, görüntülerde belirtilen fragmentasyonlar kullanılarak birden fazla reaksiyon izleme (MRM) ile yapılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. 

Figure 7
Şekil 7 . Bu çalışta kullanılan standartların kütle spektrumları. Spectra, [M + H]+ iyonlarının parçası Için 20 ev çarpışma ENERJISINI kullanarak MS2 yılında elde edildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. 

Figure 8
Şekil 8 . 8-OXO-7, 8-dihydro-2'-deokköozin (8-oxodguo), 1,n2-etheno-2 ́-deoxyguanosine (1,n2-εdguo) ve 1 ' in ölçülerinin belirlenmesi için HPLC-ESI-MS/MS tarafından elde edilen kalibrasyon eğrileri N6-etheno-2́-deoxyadenosine (1,N6-εdado). Bağıl alan, lezyon ile ilgili [15N5] iç standardı arasındaki alan oranları anlamına gelir. Bu rakam Oliveira ve al.34güncellenmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

ESı-MS/MS parametreleri 8-oxodGuo Ömer akyol
Perde gazı 20 psi 20 psi
Nebulizing gaz 55 50
İyon kaynak gazı 50 psi 40 psi
Çarpışma kaynaklı Dissosyasyon gazı Orta Orta
İyon püskürtme gerilimi 5000 4500
ESı prob sıcaklığı 450 450
Dekümeleme potansiyeli 31 V, 8-oxodGuo 41 V, 1, N6-εdado
31 V, [15N5] 8-oxodguo 41 V, [15N5] 1, N6-εdado
45 V, 1, N2-εdguo
45V, [15N5] 1, N2-εdguo
Çarpışma enerjisi 23 eV, 8-oxodGuo 25 eV, 1, N6-εdado
23 eV, [15N5] 8-oxodguo 25 eV, [15N5] 1, N6-εdado
27 eV, 1, N2-εdguo
27 eV, [15N5] 1, N2-εdguo
Çarpışma hücresi çıkış potansiyeli 16 V, 8-oxodGuo, 8 V, 1, N6-εdado
16 V, [15N5] 8-oxodguo 8 V, [15N5] 1, N6-εdado
16 V, 1, N2-εdguo
16 V, [15N5] 1, N2-εdguo
Giriş potansiyeli 10 V 10 V

Tablo 1. Sı-MS/MS ekipmanında DNA lezyonlarının tespiti için kullanılan parametreler. Bu tablo Oliveira ve al.34güncellenmiştir.

Bazal seviyesi Eklen -di Algılandı Algılanan (-) Bazal Doğru -luk Cv
Ortalama ± SD (fmol) fmol Ortalama ± SD (fmol) Ortalama (fmol) % %
8-oxodGuo
373,00 ± 2,71 0 372,79 ± 50,6 - - 13,57
373,98 ± 4,86 367 755,41 ± 107,92 381 103,93 14,29
374,84 ± 5,19 734 1069,57 ± 108,51 695 94,65 10,14
357,94 ± 15,05 1469 1671,67 ± 44,27 1314 89,43 2,65
371,07 ± 2,43 2204 2272,01 ± 40,2 1901 86,25 1,77
1, N2-εdguo
0,54 ± 0,01 0 0,54 ± 0,09 - - 16,88
0,54 ± 0,01 1 1,47 ± 0,16 0,93 93,39 11,17
0,55 ± 0,01 5 5,30 ± 0,72 4,76 95,11 13,50
0,53 ± 0,01 10 10,60 ± 0,39 10,06 100,63 3,67
0,54 ± 0,01 20 20,20 ± 0,93 19,66 98,29 4,60
1, N6-εdado
2,08 ± 0,10 0 2,29 ± 0,39 - - 17,05
2,05 ± 0,04 1 3,06 ± 0,47 1,01 100,89 15,31
1,99 ± 0,06 5 7,87 ± 1,66 5,88 117,60 21,10
2,03 ± 0,07 10 12,43 ± 1,25 10,41 104,06 10,06
1,97 ± 0,03 20 22,42 ± 3,89 20,46 102,29 17,34

Tablo 2. Yöntem doğruluğu ve varyasyon katsayısı (CV) 8-oxodGuo, 1, N 2 - Εdguo ve 1, N 6 -DNA 'da εdado. Bu tablo Oliveira ve al.34güncellenmiştir.

Ortam havası 2,5             N P değeri
Ortalama ± SEM Ortalama ± SEM   
Akciğer
8-oxodGuo/108 dguo 2124 ± 56,96 2466 ± 93,10 6 0,01
1, N2-εdguo/108 dguo Nd Nd - -
1, N6-εdado/108 dAdo 1,41 ± 0,23 1,44 ± 0,13 7 Ns
Karaciğer
8-oxodGuo/108 dguo 2848 ± 183,5 2949 ± 223,8 6 5 Ns
1, N2-εdguo/108 dguo 7,79 ± 2,49 24,94 ± 5,21 4 0,02
1, N6-εdado/108 dAdo 2,82 ± 0,30 2,18 ± 0,25 6 Ns
Böbrek
8-oxodGuo/108 dguo 1854 ± 87,13 2363 ± 157,0 6 0,02
1, N2-εdguo/108 dguo Nd Nd - -
1, N6-εdado/108 dAdo 1,09 ± 0,15 1,52 ± 0,12 7 0,04
(NS, önemli değil; ND, algılanmadı)

Tablo 3. A/J fareler doku ÖRNEKLERINDE DNA lezyonlarının seviyeleri. Fareler ortam hava ve PM2,5 (PM2,5 konsantre 30 kez) zenginleştirilmiş ortam havası maruz kaldılar. İki grup (ortam havası ve PM2,5) arasındaki araçlar t testi kullanılarak karşılaştırıldı. P değeri 0,05 'den az olduğunda sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi. Bu tablo Oliveira ve al.34güncellenmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HPLC metotları ile 8-oxodguo analizlerinde bulunan önemli bir sorun, DNA ekstraksiyonu, DNA hidrolizsi ve DNA hidrolizlerinin konsantrasyonu sırasında oluşumunun olası indüksiyonudur22,38. 8-oxodguo artifaktüel oluşumunun sorununu en aza indirmek için, tüm DNA ekstraksiyonu, depolama ve hidroliz çözümleri için deferoxamin ilavesi, sodyum iyosin chaotropik yönteminin kullanımı ve DNA ekstrüzyonunda fenol kaçınılması önerilir, % 100 μg 'ye yakın DNA miktarlarının kullanımı olarak hidroliz prosedürün nihai sonucu39için sahte oksidasyonun katkısı en aza indirgidir. Biz dikkate öneriler yukarıda bahsedilen, DNA ekstraksiyon için sodyum iyodir chaotropik yöntemin kullanımı dışında aldı. Bunun yerine, basitlik için, biz kullanmadan önce onlara Deferoksamin ekleyerek, DNA ekstraksiyon için ticari çözümler kullandık. Buna ek olarak, elde edilen DNA Hidrolikleri doğrudan HPLC-ESı-MS/MS sisteminin ilk sütununa, 8-oxodGuo ' nın normal nükletler 'den önceki ayrılması için enjekte edildi. 8-oxodguo ' nın elüsyonu hemen önce, daha fazla ayrılık ve zirve daralması elde edildi ikinci bir sütun akıtıcı ilk sütun aktarmak için bir anahtarlama Vana kullanıldı. Bu yaklaşım, 8-oxodguo kantifikasyon için yeterli duyarlılık engellemeleri ücretsiz izin. DNA 'da 8-oxodGuo miktarının en benzer yaklaşımı, örnek temizleme ve 8-oxodGuo saklama için bir tuzak sütunu kullanan Chao ve iş arkadaşları22tarafından, analiz sütununa numune çekimine başlamadan önce, bir anahtarlama valfi kullanılarak sütun. Alternatif olarak, HPLC-ESı-MS/MS analizinden önce HPLC ayrımlarından alınan Kesirlerden toplanan 8-oxodGuo konsantrasyon adımını, daha zahmetli olan15' e kadar gerçekleştirdiler.

8-oxodguo, HPLC analizlerine dayanan, 180-450/108 dguo23,39,41,42,43, 1.340-2120/108 aralığında bulunan kemirgen akciğer dokusunda bazal seviyeleri bildirilmiştir dguo44, veya yaklaşık 3000/108 dguo45,46, sodyum Iodide kullanarak DNA ekstraksiyon yöntemlerinden elde edilen en düşük değerler ile. Ortalama 8-oxodGuo seviyesi burada ortam havayı maruz fareler akciğer bulundu 2124/108 dguo oldu. Seviye, 2466/108 dguo 'ya, PM2,5 (Tablo 3)34' de zenginleştirilmiş ortam havaya maruz kalan hayvanlarda arttı. Bu gruplar arasındaki farklar tespiti için duyarlılık sodyum iyodir chaotropik yöntemi ile DNA ayıklayarak iyileştirilebilir mümkündür. Bu çalışmada, kontrol farelerinde akciğer, böbrek ve karaciğer DNA 'sında bulunan ortalama 8-oxodGuo seviyeleri, sırasıyla 2,0, 1,8 ve 2,7 kez Median bazal seviyesinden (1047/108 dguo) oksidatif Avrupa standartları Komitesi tarafından elde edilen daha yüksek oldu DNA hasarı (ESCODD) 8-oxodGuo bir inter-laboratuvar değerlendirmesinde domuz karaciğer38standart örneklerinden çıkarılan DNA.

1,n6-Εdado ve 1,n2-εdguo DNA tespiti için ana sınırlama, bu lezyonlar çok düşük seviyelerde meydana gibi Yöntem hassasiyettir. 1,N2-dguo en düşük seviyeleri DNA, HPLC-ESI-MS/MS tarafından nicelik, bir insan hücresi hattı ve sıçan dokularında 108 dguo başına 0,87-4 lezyonlar aralığında idi25,47. Hassasiyet ve seçicilik onların kantifikasyon iyileştirmek için bir yol, katı faz ekstraksiyon kullanarak, DNA hydrolysates büyük örneklerinden onları konsantre etmektir. Bu temizleme adımı, 100 μg 'den fazla DNA hidrolizinden HPLC analitik sütunlarına enjeksiyonlardan kaynaklanan kromatografik problemleri çözer. Bu yaklaşımı burada sunulan doğrulanmış yöntemde kullandık. Bu çalışmada tespit edilen 1,N6-εdado seviyeleri34 NEMS immünafite/32P-postetiketleme48,49, 50 , 51 ve HPLC-ESI-MS/MS21,23,24istihdam diğer gruplar tarafından açıklanan daha düşüktür. Benzer şekilde, 1,N2-εdguo SEVIYELERI burada34 HPLC-ESI-MS/MS kullanarak Garcia25 ve Angeli26 tarafından bildirilen en düşük seviyeleri ile tutarlı burada nicelik.

Bu çalışmada kullanılan ekipmandan daha yüksek hassasiyete sahip HPLC-ESı-MS/MS sistemleri mevcuttur. Bu tür sistemlerin kullanımı, doku mevcudiyeti bir sınırlama olduğu durumlar için burada sunulan yöntemlerin uygulamalarını genişleten daha küçük miktarda DNA analizine izin verir. Burada sunulan yöntemler, standartların ve izotopik standartlarının mevcudiyeti bağlı olarak diğer değiştirilmiş deoxynucleosides miktarına göre adapte edilebilir. Analizlere dahil edilen tüm moleküllerin keskin doruklarına ulaşabilmek için kromatografik koşulların ayarlanması gerekli olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, proc. 2012/22190-3 ve 2012/08616-8), CNPq (proc. 454214/2014-6 ve 429184/2016-6), CAPES, PRPUSP (Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo), ıNCL ıNAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), ıNCER Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPES; Proc. 573530/2008-4), NAP Redoxoma (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) ve CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. F. Oliveira ve A. A. F. Oliveira FAPESP (proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) ve CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de nível Superior) burs aldı. M. H. G. Medeiros, P. di Mascio, P. H. N. Saldiva ve A. P. M. Loureiro CNPq 'dan burs aldı.

Bu çalışmanın içinde bulunan bazı rakamlar ve masalar aslen Oliveira A.A.F. et al. Genotoksisik ve epigenotoksisik etkilere konsantre Ambient ince partikül madde (PM2,5) São Paulo City, Brezilya maruz farelerde yayınlandı. Parçacık ve lif toksikoloji. 15, 40 (2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[15N5]-2’-deoxyadenosine Cambridge Isotope Laboratories NLM-3895-25
[15N5]-2’-deoxyguanosine Cambridge Isotope Laboratories NLM-3899-CA-10
acetonitrile Carlo Erba Reagents 412413000
alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa Sigma P5521
ammonium acetate Merck 101116
calf thymus DNA Sigma D1501
cell lysis solution QIAGEN 158908
chloroform Carlo Erba Reagents 412653
deferoxamine Sigma D9533
deoxyribonuclease I (DNase I) Bio Basic Inc DD0649
ethanol Carlo Erba Reagents 414542
formic acid Sigma-Aldrich F0507
HPLC-ESI-MS/MS system HPLC: Agilent 1200 series            ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).                                                            ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.
HPLC/DAD system Shimadzu Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)
HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 µm, C18) Phenomenex 00B-4446-B0
HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 µm, C18) Phenomenex 00F-4251-B0
HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 µm, C18) Phenomenex 00G-4252-E0
HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.) Phenomenex AJO-4287
isoamyl alcohol Sigma-Aldrich M32658
isopropyl alcohol (isopropanol) Carlo Erba Reagents A412790010
ketamine Ceva Commercial name: Dopalen
magnesium chloride Carlo Erba Reagents 349377
magnesium chloride Sigma M2393
methanol Carlo Erba Reagents L022909K7
phosphodiesterase I from Crotalus atrox Sigma P4506
protein precipitation solution QIAGEN 158912
proteinase K Sigma-Aldrich P2308
ribonuclease A Sigma R5000
sodium chloride Sigma-Aldrich S9625
SPE-C18 (Strata-X) Phenomenex 8B-S100-TAK
tris(hydroxymethyl)-aminomethane Carlo Erba Reagents 489983
xylazine Syntec do Brasil Commercial name: Xilazin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H. G., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radical Biology and Medicine. 107, 13-34 (2017).
  2. Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. Carcinogens and DNA damage. Biochemical Society Transactions. 46, 1213-1224 (2018).
  3. Cadet, J., Davies, K. J. A. Oxidative DNA damage & repair: An introduction. Free Radical Biology and Medicine. 107, 2-12 (2017).
  4. Cao, H., Jiang, Y., Wang, Y. Stereospecific synthesis and characterization of oligodeoxyribonucleotides containing an N2-(1-carboxyethyl)-2'-deoxyguanosine. Journal of the American Chemical Society. 129, 12123-12130 (2007).
  5. Breyer, V., et al. Analysis and biological relevance of advanced glycation end-products of DNA in eukaryotic cells. The FEBS Journal. 275, 914-925 (2008).
  6. Tamae, D., Lim, P., Wuenschell, G. E., Termini, J. Mutagenesis and repair induced by the DNA advanced glycation end product N2-1-(carboxyethyl)-2'-deoxyguanosine in human cells. Biochemistry. 50, 2321-2329 (2011).
  7. Hecht, S. S. Lung carcinogenesis by tobacco smoke. International Journal of Cancer. 131, 2724-2732 (2012).
  8. Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 153, 17-37 (2013).
  9. Ong, T. P., Loureiro, A. P. M. Nutritional interventions in age-related genetic and epigenetic instability and cancer. Anti-ageing nutrients: Evidence-based prevention of age-associated diseases. John Wiley & Sons. UK. (2015).
  10. Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Cooke, M. S. Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance. Mutation Research. 567, 1-61 (2004).
  11. Moriya, M. Single-stranded shuttle phagemid for mutagenesis studies in mammalian cells: 8-oxoguanine in DNA induces targeted GC → TA transversions in simian kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1122-1126 (1993).
  12. Medeiros, M. H. G. Exocyclic DNA adducts as biomarkers of lipid oxidation and predictors of disease. Challenges in developing sensitive and specific methods for clinical studies. Chemical Research in Toxicology. 22, 419-425 (2009).
  13. Guéraud, F. 4-Hydroxynonenal metabolites and adducts in pre-carcinogenic conditions and cancer. Free Radical Biology and Medicine. 111, 196-208 (2017).
  14. Nair, U., Bartsch, H., Nair, J. Lipid peroxidation-induced DNA damage in cancer-prone inflammatory diseases: A review of published adduct types and levels in humans. Free Radical Biology and Medicine. 43, 1109-1120 (2007).
  15. Pang, B., et al. Lipid peroxidation dominates the chemistry of DNA adduct formation in a mouse model of inflammation. Carcinogenesis. 28, 1807-1813 (2007).
  16. Møller, P., et al. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radical Research. 46, 541-553 (2012).
  17. Hofer, T., Moller, L. Optimization of the workup procedure for the analysis of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine with electrochemicaldetection. Chemical Research in Toxicology. 15, 426-432 (2002).
  18. Collins, A., El Yamani, N., Dusinska, M. Sensitive detection of DNA oxidation damage induced by nanomaterials. Free Radical Biology and Medicine. 69-76 (2017).
  19. Zubel, T., Buerkle, A., Mangerich, A. Mass spectrometric analysis of sulfur mustard-induced biomolecular adducts: Are DNA adducts suitable biomarkers of exposure? Toxicology Letters. 293, 21-30 (2018).
  20. Tretyakova, N., Goggin, M., Sangaraju, D., Janis, G. Quantitation of DNA adducts by stable isotope dilution mass spectrometry. Chemical Research in Toxicology. 25, 2007-2035 (2012).
  21. Churchwell, M. I., Beland, F. A., Doerge, D. R. Quantification of multiple DNA adducts formed through oxidative stress using liquid chromatography and electrospray tandem mass spectrometry. Chemical Research in Toxicology. 15, 1295-1301 (2002).
  22. Chao, M. R., Yen, C. C., Hu, C. W. Prevention of artifactual oxidation in determination of cellular 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine by isotope-dilution LC-MS/MS with automated solid-phase extraction. Free Radical Biology and Medicine. 44, 464-473 (2008).
  23. Danielsen, P. H., et al. Oxidative stress, inflammation, and DNA damage in rats after intratracheal instillation or oral exposure to ambient air and wood smoke particulate matter. Toxicological Sciences. 118, 574-585 (2010).
  24. Danielsen, P. H., et al. Oxidative stress, DNA damage, and inflammation induced by ambient air and wood smoke particulate matter in human A549 and THP-1 cell lines. Chemical Research in Toxicology. 24, 168-184 (2011).
  25. Garcia, C. C. M., et al. [13C2]-Acetaldehyde promotes unequivocal formation of 1,N2-propano-2'-deoxyguanosine in human cells. Journal of the American Chemical Society. 133, 9140-9143 (2011).
  26. Angeli, J. P. F., et al. Lipid hydroperoxide-induced and hemoglobin-enhanced oxidative damage to colon cancer cells. Free Radical Biology and Medicine. 51, 503-515 (2011).
  27. Yu, Y., et al. Comprehensive assessment of oxidatively induced modifications of DNA in a rat model of human Wilson's disease. Molecular and Cellular Proteomics. 15, 810-817 (2016).
  28. Torres-Cuevas, I., Aupi, M., Asensi, M. A., Vento, M., Ortega, Á, Escobar, J. 7,8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine/2'-deoxiguanosine ratio determined in hydrolysates of brain DNA by ultrachromatrography coupled to tandem mass spectrometry. Talanta. 170, 97-102 (2017).
  29. Wu, D., et al. Detection of 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) as a biomarker of oxidative damage in peripheral leukocyte DNA by UHPLC-MS/MS. Journal of Chromatography B. 1064, 1-6 (2017).
  30. IARC. Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans: Outdoor Air Pollution. 109, IARC. Lyon, France. (2016).
  31. De Martinis, B. S., Kado, N. Y., Carvalho, L. R. F., Okamoto, R. A., Gundel, L. A. Genotoxicity of fractionated organic material in airborne particles from São. Mutation Research. 446, 83-94 (1999).
  32. Karlsson, H. L., Nygren, J., Möller, L. Genotoxicity of airborne particulate matter: The role of cell-particle interaction and of substances with adduct-forming and oxidizing capacity. Mutation Research. 565, 1-10 (2004).
  33. Bell, M. L., Dominici, F., Ebisu, K., Zeger, S. L., Samet, J. M. Spatial and temporal variation in PM2.5 chemical composition in the United States for health effects studies. Environmental Health Perspectives. 115, 989-995 (2007).
  34. Oliveira, A. A. F., et al. Genotoxic and epigenotoxic effects in mice exposed to concentrated ambient fine particulate matter (PM2.5) from São Paulo city, Brazil. Particle and Fibre Toxicology. 15, 40 (2018).
  35. Loureiro, A. P. M., Zhang, W., Kassie, F., Zhang, S., Villalta, P. W., Wang, M., Hecht, S. S. Mass spectrometric analysis of a cyclic 7,8-butanoguanine adduct of N-nitrosopyrrolidine: comparison to other N-nitrosopyrrolidine adducts in rat hepatic DNA. Chemical Research in Toxicology. 22, 1728-1735 (2009).
  36. Loureiro, A. P. M., Marques, S. A., Garcia, C. C. M., Di Mascio, P., Medeiros, M. H. G. Development of an on-line liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry assay to quantitatively determine 1,N2-etheno-2'-deoxyguanosine in DNA. Chemical Research in Toxicology. 15, 1302-1308 (2002).
  37. Mangal, D., et al. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chemical Research in Toxicology. 22, 788-797 (2009).
  38. ESCODD (European Standards Committee on Oxidative DNA Damage). Comparative analysis of baseline 8-oxo-7,8-dihydroguanine in mammalian cell DNA, by different methods in different laboratories: an approach to consensus. Carcinogenesis. 23, 2129-2133 (2002).
  39. Helbock, H. J., et al. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical detection assay of 8-oxo-deoxyguanosine and 8-oxo-guanine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 288-293 (1998).
  40. Risom, L., et al. Oxidative DNA damage and defence gene expression in the mouse lung after short-term exposure to diesel exhaust particles by inhalation. Carcinogenesis. 24, 1847-1852 (2003).
  41. Risom, L., et al. Repeated inhalations of diesel exhaust particles and oxidatively damaged DNA in young oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) deficient mice. Free Radical Research. 41, 172-181 (2007).
  42. Tsurudome, Y., et al. Changes in levels of 8-hydroxyguanine in DNA, its repair and OGG1 mRNA in rat lungs after intratracheal administration of diesel exhaust particles. Carcinogenesis. 20, 1573-1576 (1999).
  43. Marie-Desvergne, C., Maître, A., Bouchard, M., Ravanat, J. L., Viau, C. Evaluation of DNA adducts, DNA and RNA oxidative lesions, and 3-hydroxybenzo(a)pyrene as biomarkers of DNA damage in lung following intravenous injection of the parent compound in rats. Chemical Research in Toxicology. 23, 1207-1214 (2010).
  44. Iwai, K., et al. Early oxidative DNA damages and late development of lung cancer in diesel exhaust-exposed rats. Environmental Research. 84, 255-264 (2000).
  45. Ichinose, T., et al. Lung carcinogenesis and formation of 8-hydroxy-deoxyguanosine in mice by diesel exhaust particles. Carcinogenesis. 18, 185-192 (1997).
  46. Schmerold, I., Niedermu, H. Levels of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in cellular DNA from 12 tissues of young and old Sprague Dawley rats. Experimental Gerontology. 36, 1375-1386 (2001).
  47. Garcia, C. C. M., Freitas, F. P., Di Mascio, P., Medeiros, M. H. G. Ultrasensitive simultaneous quantification of 1,N2-etheno-2'-deoxyguanosine and 1,N2-propano-2'-deoxyguanosine in DNA by an online liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry assay. Chemical Research in Toxicology. 23, 1245-1255 (2010).
  48. Godshalk, R., et al. Comparison of multiple DNA adduct types in tumor adjacent human lung tissue: effect of cigarette smoking. Carcinogenesis. 23, 2081-2086 (2002).
  49. Dechakhamphu, S., et al. Lipid peroxidation and etheno DNA adducts in white blood cells of liver fluke-infected patients: protection by plasma alpha-tocopherol and praziquantel. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 310-318 (2010).
  50. Arab, K., et al. Typical signature of DNA damage in white blood cells: a pilot study on etheno adducts in Danish mother-newborn child pairs. Carcinogenesis. 30, 282-285 (2009).
  51. Nair, J., et al. High dietary omega-6 polyunsaturated fatty acids drastically increase the formation of etheno-DNA base adducts in white blood cells of female subjects. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 6, 597-601 (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics