Quantifizierung von drei DNA-Mäsionen durch Massenspektrometrie und Bewertung ihrer Niveaus in den Themen von Mäusen, die der zämatten Feinstaub ausgesetzt sind

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Immunology and Infection

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Summary

Wir beschreiben hier Methoden zur sensiblen und genauen Quantifizierung der Läsionen 8-oxo-7,8-Dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo),1, N6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) und 1,N2- Etheno-2 '-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in der DNA. Die Methoden wurden zur Beurteilung der Auswirkungen von Umgebungsfeinstaub (PM 2,5) inGeweben (Lunge, Leber und Niere) von exponierten A/J-Mäusen eingesetzt.

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Franco de Oliveira, T., Falcão de Oliveira, A. A., Lemos, M., Veras, M., Saldiva, P. H., Gennari de Medeiros, M. H., Di Mascio, P., de Melo Loureiro, A. P. Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter. J. Vis. Exp. (147), e59734, doi:10.3791/59734 (2019).

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Abstract

DNA-Addukte und oxidierte DNA-Basen sind Beispiele für DNA-Läsionen, die nützliche Biomarker für die Toxizitätsbewertung von Substanzen sind, die elektrophil sind, reaktive Elektrophilen nach Bioveränderung erzeugen oder oxidativen Stress verursachen. Unter den oxidierten Nukleobasen ist die am meisten untersuchte 8-oxo-7,8-Dihydroguanin (8-oxoGua) oder 8-oxo-7,8-Dihydro-2 '-Deoxyguanosin (8-oxodGuo), ein Biomarker von oxidativ induzierten Basisschäden in der DNA. Aldehyde und Epoxyaldehyde, die aus dem Lipidperoxidationsprozess resultieren, sind elektrophile Moleküle, die in der Lage sind, mutagene exozyklische DNA-Adduktezu bilden, wie zum Beispiel die Etheno-Addukte 1, N 2-etheno-2 '-deoxyguanosine (1,N2- Die "Guo" und "1, N6-etheno-2"-deoxyadenosine (1,N6-bobdAdo), die als potenzielle Biomarker in der Pathophysiologie der Entzündung vorgeschlagen wurden. Für die Entwicklung präventiver Strategien zur Verlangsamung von Zellmutationsraten und chronischer Krankheitsentwicklung (z.B. Krebs, neurodegenerative Erkrankungen) sind selektive und sensible Methoden für ihre Quantifizierung in der DNA notwendig. Unter den für ihre Erkennung zur Verfügung stehenden sensiblen Methoden (Hochleistungs-Flüssigchromatographie gekoppelt mit elektrochemischen oder Tandemmassenspektrometrie-Detektoren, Kometenuntersuchungen, Immunoassays, 32 P-Postbeschriftung) sind die selektivsten, die aufder Grundlage von Auf Hochleistungs-Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandemmassenspektrometrie (HPLC-ESI-MS/MS). Die Selektivität ist ein wesentlicher Vorteil bei der Analyse komplexer biologischer Proben, und HPLC-ESI-MS/MS entwickelte sich als Goldstandard für die Quantifizierung von veränderten Nukleoside in biologischen Matrizen wie DNA, Urin, Plasma und Speichel. Der Einsatz isotopisch beschrifteter interner Standards erhöht den Vorteil von Korrekturen für Molekülverluste während der DNA-Hydrolyse-und Analytenanreicherungsschritte sowie für Unterschiede bei der Analytitisierung zwischen Proben. Es hilft auch bei der Identifizierung des korrekten chromatographischen Peaks, wenn mehr als ein Peak vorhanden ist.

Wir stellen hier validierte sensible, genaue und präzise HPLC-ESI-MS/MS-Methoden vor, die erfolgreich für die Quantifizierung von 8-oxodGuo,1, N6-dAdo und 1,N2-dGuo in Lungen-, Leber-und NierenDNA von A/J-Mäusen eingesetzt wurden. Die Bewertung der Auswirkungen der Umgebungsbelastung PM 2.5.

Introduction

Einige reaktive Sauerstoffarten (ROS) sind in der Lage, Kohlenstoff-Doppelbindungen von DNA-Basen zu oxidieren und einige Kohlenstoff in der Deoxyribose-Feuchtigkeit, wodurch oxidierte Basen und DNA-Strangbrüche 1 erzeugt werden. Als negativ geladenes, stickstoff-und Sauerstoffatome geladenes Molekül ist die DNA auch ein Ziel für elektrophile Gruppen, die mit den nukleophilen Standorten (Stickstoff und Sauerstoff) kovalent reagieren und Produkte liefern,die als DNA-Adduktoren bezeichnet werden. DNA-Addukte und oxidierte DNA-Basen sind also Beispiele für DNA-Läsionen, die nützliche Biomarker für die Toxizitätsbewertung von elektrophilen Substanzen sind, reaktive Elektrophilen bei Bioveränderung erzeugen oder oxidativen Stress erzeugen1, 2. Runde Obwohl die modifizierten DNA-Basen durch Basis-oder Nukleotid-Exzisionsreparatur (BER oder NER) aus der DNA entfernt werden können, führt die Induktion eines Ungleichgewichts zwischen der Erzeugung und Entfernung von DNA-Läsionen zu Gunsten der ersteren zu einer Nettoerhöhung ihrer DNA-Überstunden 3< /c5 >. Ergebnisse sind die Erhöhung der DNA-Mutationsraten, eine verminderte Genexpression und eineverminderte Proteinaktivität 2, 4,5, 6, 7,Effekte, die engmitder Entwicklung von Krankheiten. DNA-Mutationen können sich auf verschiedene zelluläre Funktionen auswirken, wie z. B. Zellsignalisierung, Zellzyklus, Genomintegrität, Telomerstabilität, Epigenom, Chromatin-Struktur, RNA-Splicing, Protein-Haffeestose, Stoffwechsel, Apoptose und Zelldifferenzierung8 ,9. Strategien zur Verlangsamung von Zellmutationsraten und chronischer Krankheitsentwicklung (z.B. Krebs, neurodegenerative Erkrankungen) durchlaufen das Wissen um die Mutationsquellen, darunter DNA-Läsionen und deren Ursachen.

ROS, die endogen im Übermaß erzeugt werden, aufgrund von Schadstoffexposition, hartnäckiger Entzündung, Krankheitspophysiologie (z.B. Diabetes), etc., sind wichtige Ursachen für Biomolekule-Schäden, einschließlichDNA und Fettschäden 1. Zum Beispiel oxidiert das hochreaktive Hydroxylradikal (OH), das sich aus der H2O 2-Reduktion durch Übergangs-Metallionen (Fe2 +, Cu+) gebildet hat, die DNA-Basen, die DNA-Zuckergerüchte und die mehrfach ungesättigten Fettsäuren bei diffusionsgesteuerten Fettsäuren. Sätze10. Unter den 80 bereits charakterisierten oxidierten Nukleobasen3, Die am meisten untersuchte ist 8-oxo-7,8-Dihydroguanin (8-oxoGua) oder 8-oxo-7,8-Dihydro-2 '-Deoxyguanosin (8-oxodGuo , Abbildung1), eine Läsion, die in der Lage ist, GT-Transformatoren in induzieren Säugetierzellen10,11. Es wird durch die monoelektronische Oxidation von Guanin oder durch Hydroxylradikal oder Singlet-Sauerstoff-Attacke von Guanin in DNA1 gebildet. Polyungesättigte Fettsäuren sind weitere wichtige Ziele hochreaktiver Oxidantien, wie zum Beispiel • OH, die den Prozess der Fettperoxidation1,12inGang setzen. Es entstehen Fettsäure-Hydroperoxide, die zu elektrophilen Aldehyden und Epoxyaldehyden zersetzen können, Wie Malondialdehyd, 4-hydroxy-2-nonenal, 2,4-deadienal, 4,5 epoxy-(2E)-dezental, hexenal, Akrolein, Krotonaldehyd, die In der Lage, mutagene exozyklische DNA-Addukte wie Malondialdehyde-, Propano-oder Etheno-Addukte 1,12,13zu bilden. Das Etheno Addukte 1,N2-etheno-2 '-deoxyguanosine (1,N2-DGuo , Abbildung 1) und 1,N6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,N6-madAdo, Abbildung 1 ) wurden als potenzielle Biomarker in der Pathophysiologie der Entzündung14,15vorgeschlagen.

Figure 1
Bild 1. Chemische Strukturen der DNA-Läsionen, die in der vorliegenden Studie quantifiziert wurden. DR = 2 ́-deoxyribose. Diese Figur wurde von Oliveira et al. 34 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Studien, die in den frühen 1980er Jahren durchgeführt wurden, ermöglichten die sensible Erkennung von 8-oxodGuo durch eine hochleistungsfähige Flüssigchromatographie in Verbindung mit elektrochemischer Erkennung (HPLC-ECD). Die Quantifizierung von 8-oxodGuo durch die HPLC-ECD in mehreren biologischen Systemen, die oxidierenden Bedingungen unterworfen waren, führte zur Erkennung von 8-oxodGuo als Biomarker oxidativ induzierter Grundschäden in DNA1,16. Obwohl robust und die Quantifizierung von 8-oxodGuo im niedrigen Fmol-Bereich 17 ermöglicht, setzen die HPLC-EKD-Messungen auf die Genauigkeit der Analyte-Retendesszeit zur Analyteerkennung und auf die Chromatographie-Auflösung, um Störungen von Andere Stichproben. Da die elektrochemische Erkennung den Einsatz von Salz (z.B. Kaliumphosphat, Natriumacetat) in der mobilen Phase erfordert, benötigt die Aufrechterhaltung adäquater Analysebedingungen eine routinemäßige Säulen-und Gerätereinigungszeit.

Alternativ ist die Verwendung des bakteriellen DNA-Reparaturenzyms formamidopyrimidine DNA Glycosylase (FPG) und, Danach entstand menschliches 8-oxoguanin-Glykosylase 1 (hOGG1) zur Erkennung und Entfernung von 8-oxoGua aus der DNA als Mittel zur Induktion von DNA-Alkali labile Websites. Die Alkali-Labillierungsstellen werden in DNA-Strang-Breaks umgewandelt und ermöglichen die sehr hohe empfindliche indirekte Quantifizierung von 8-oxoGua durch alkalische Einzelzellen-Gel-Elektrophorese ("Kometenuntersuchen"). Die hohe Empfindlichkeit und die Durchführung der Analysen ohne zelluläre DNA-Extraktion sind die Hauptvorteile dieser Art von Test. Es gibt den niedrigsten Stand-Zustand-Wert von 8-oxoGua in der DNA, in der Regel 7-10 Mal niedriger als die, die durch bioanalytische Methoden auf der Basis von HPLC erhalten. Es handelt sich jedoch um eine indirekte Messung von 8-oxoGua und einige Nachteile sind die fehlende Spezifität oder die unbekannte Effizienz der verwendeten Reparaturenzyme1,16,18.

Immunoassays sind weitere Methoden, die zur Erkennung von 8-oxoGua1 und exozyklischen DNA-Addukten verwendet werden, wie1, N6-dAdo und 1,N2-dGuo12. Trotz der Empfindlichkeit ist ein Mangel an Antikörpern zur Erkennung von DNA-Läsionen der Mangel an Spezifität aufgrund von Kreuzreaktionen auf andere Bestandteile biologischer Proben, einschließlich der normalenDNA-Basen 1,12. Die exozyklischen DNA-Addukte, darunter 1,N6-dAdo und1, N2-dGuo, können auch durch hochsensible 32P-Postbeschriftungsuntersuchungen 12 erkanntund quantifiziert werden. Die hohe Empfindlichkeit von 32P-Postbeschriftung ermöglicht die Verwendung von sehr geringen Mengen an DNA(z.B. 10 μg) zur Erkennung von etwa 1 Addukt pro 1010 normalen Basen 19. Allerdings sind der Einsatz von Radio-Chemikalien, mangelnde chemische Spezifität und geringe Genauigkeit einige Nachteile 19,20.

Eine gemeinsame Einschränkung der oben genannten Methoden ist die geringe Selektivität oder Spezifität für die Erkennung der gewünschten Moleküle. In diesem Szenario entwickelte sich HPLC in Verbindung mit der Elektrospray-Ionisierung der Massenspektrometrie (HPLC-ESI-MS/MS und HPLC-MS3) zu dem Goldstandard für die Quantifizierung von modifizierten Nukleoside in biologischen Matrizen, wie DNA, Urin, Plasma und Speichel. 1 , 19 , 20. Vorteile der HPLC-ESI-MS/MS-Methoden sind die Empfindlichkeit (typischerweise im niedrigen Fmol-Bereich) und die hohe Spezifität, die i zur Verfügung stellt, die chromatographische Trennung, ii) das charakteristische und bekannte Muster der Molekül-Fragmentierung innerhalb der Masse Spektrometer-Kollisionskammer, und iii) die genaue Messung des ausgewählten Massen-bis Ladungsverhältnisses (m/z) im Multitreaktionsüberwachungsmodus 1,19. Der Einsatz isotopisch beschrifteter interner Standards erhöht den Vorteil von Korrekturen für Molekülverluste während der DNA-Hydrolyse-und Analytenanreicherungsschritte sowie für Unterschiede bei der Analytitisierung zwischen Proben. Es hilft auch bei der Identifizierung der richtigen chromatographischen Spitze, wenn mehr als ein Peak ist1,12,19,20.

Für die Quantifizierung von 8-oxodGuo,1,N6-dAdo und 1,N 2-dGuo in DNA, die aus verschiedenen biologischen Proben gewonnen wurde, wurden mehrere Methoden verwendet, die auf HPLC-ESI-MS/MSbasieren. ,21,22, 23,24, 25, 26, 27,28,29 . Feinstaub (PM 2.5) trägt organische und anorganische Chemikalien, wie polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK), Nitro-PAHs, Aldehyde,Ketone, Carboxylsäuren, Quinoline, Metalle und wasserlösliche Ionen, die Entzündungen verursachen können und Oxidativer Stress, Bedingungen, die das Auftreten von Biomolekule-Schäden und Krankheit30,31,32,33begünstigen. Wir stellen hier validierte HPLC-ESI-MS/MS-Methoden vor, die erfolgreich für die Quantifizierung von 8-oxodGuo,1, N6-dAdo und 1,N2-dGuo in Lungen-, Leber-und Nieren-DNA von A/J-Mäusen zur Beurteilung der Die Auswirkungen der UmgebungsbelastungPM2.5 34.

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Protocol

Vier Wochen alte männliche A/J-Mäuse, spezifische Erreger frei, wurden vom Zuchtzentrum für Labortiere der Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brasilien, erhalten und entsprechend dem Ethikkomitee der Medizinischen Fakultät der Universität behandelt São Paulo (Protokoll no 1310/09).

1. Sammlung von Mäzenen

  1. Das Tier mit Xylazine und Ketamin betäuben. Für eine Maus mit 30 g Körpergewicht, injizieren Sie eine Lösung (nicht mehr als 2 mL) mit 2,63 mg Ketamin und 0,38 mg Xylazin, intraperitoneal.
  2. Sammeln Sie Blut (0,5-1,5 mL) für ergänzende Analysen (z.B. antioxidative Enzymaktivität, Malondialdehydspiegel).
  3. Das Bauchhaar vom Becken zum Xiphoid-Verfahren rasieren. Machen Sie einen Schnitt in einer vertikalen Mittellinie im haarlosen Bereich. Machen Sie Schnitte in horizontalen Seitenlinien, um die Bauchorgane zu entlarven.
  4. Schneiden Sie die Bauchaorta, um die Exsanguinisierung zu fördern und das Tier zu euthanisieren.
  5. Entfernen Sie das Gewebe von Interesse (in diesem Fall, Leber, Nieren und Lunge).
    1. Um die Leber zu entfernen, schneiden Sie die untere Cava-Ader und Portal hepatische Ader.
    2. Um die Nieren zu entfernen, schneiden Sie die Nierenvenen und Arterien.
    3. Um die Lunge zu entfernen, machen Sie einen Schnitt in den Zwerchfell-Extremitäten und Umfang in der Nähe der Thoraxwand. Brechen Sie die Klavicles, indem Sie eine Schere im Inneren der Thoraxhöhle öffnen. Schneiden Sie den extern Knochen aus dem xiphoiden Prozess in Richtung der Luftröhre, um die Lunge und das Herz zu entlarven.
      1. Halten Sie die Lunge mit einer Zange, schneiden Sie die Luftröhre und die Bänder um die Lunge. Entfernen Sie sorgfältig die Block-Lunge plus Herz. Um die Lungen aus dem Block zu entfernen, halten Sie das Herz mit einer Zange und schneiden Sie alle Gefäße in seinem Boden.
  6. Das isolierte Gewebe sofort in der Kaltsalzlösung (0,9% NaCl) waschen, auf kryogene Rohre übertragen und die Rohre sofort in flüssigen Stickstoff tauchen. Nach Abschluss der Arbeiten die Rohre bei-80 ° C aufbewahren.
    CAUTION: Flüssiger Stickstoff im direkten Kontakt mit der Haut, Schleimhaut oder Augen verursacht Verbrennungen. Verwenden Sie einen richtigen individuellen Schutz, um den Kontakt zu vermeiden. Arbeiten Sie in einem belüfteten Labor, um Erstickung durch flüssigen Stickstoffdampf zu vermeiden.

2. DNA-Extraktion

Anmerkung: Die DNA-Extraktionsmethode wurde von Loureiro et al. (2009)35 modifiziert, um die Analysen der hier untersuchten Läsionen zu ermöglichen.

  1. Übertragen Sie die Schläuche, die das Gewebe enthalten, auf Trockeneis.
  2. Verwenden Sie eine Kulturplatte, die auf Eis platziert ist, um ein Stück Gewebe mit einem Skalpell zu schneiden. Gewicht 1 g für den sofortigen Einsatz. Das restliche Gewebe sollte auf Trockeneis gehalten werden, bis es bei-80 ° C wieder gelagert wird.
    NOTE: Es ist wichtig, das Auftauen des verbleibenden Gewebes zu vermeiden, um die Bildung von Artefakten zu verhindern, wenn Wiederholungen der Analysen erforderlich sind.
  3. Zu jedem 1 g Gewebe in 50 mL-gedeckten Röhren, 10 ml der kommerziellen Zelllyse-Lösung mit 0,5 mM-Deferoxamin hinzufügen und auf Eis halten.
    Hinweis: Fügen Sie das Lösungsvolumen für den sofortigen Einsatz mit Deferoxamin um. Für je 100 ml Lösung 0,0328 g des Deferoxamin-Mesylat-Salzes hinzufügen.
  4. Homogenisierung des Gewebes mit einem Gewebehomogenisierer, bis eine homogene Lösung ohne Gewebefragmente entsteht. Halten Sie die Röhre kalt (auf Eis) während der Homogenisierung. Verwenden Sie eine niedrige Geschwindigkeit, um das Heizen zu vermeiden.
  5. Fügen Sie 150 μL proteinase K-Lösung (20 mg/mL) zu jeder homogenisierten Probe hinzu. Schütteln Sie die Rohre umkühlung und halten Sie sie bei Raumtemperatur über Nacht.
  6. 40 μL Ribonuclease A-Lösung (15 mg/mL) dazugeben, umsionsbereit schütteln und die Rohre bei Raumtemperatur 2 Stunden halten.
    NOTE: Bereiten Sie Ribonuclease A-Lösung in Natrium-Acetatpuffer 10 mM, pH 5.2, um Niederschläge zu vermeiden. Die Lösung bei 100 ° C für 15 Minuten vor dem Gebrauch erhitzen, um eine Lösung zu erhalten, die frei von deoxyribonuclease ist.
  7. 5 ml der kommerziellen Proteinniederschlagslösung, Wirbel kräftig und Zentrifuge bei 2.000 x g, 4 ° C, 10 Minuten lang.
  8. Die Supernatanten auf 50 mL-gedeckte Rohre mit 10 ml kaltem Isopropanol übertragen. Umkehrung der Rohre sanft mehrmals bis zur Beobachtung der vorgedeckten DNA.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden, wobei die Rohre bei-20 ° C bleiben.
  9. Sammeln Sie die vorgeführte DNA mit einer Pasteur-Pipette am Ende geschlossen. Übertragen Sie es auf Rohre mit 4 mL von 10 mM Tris Puffer, 1 mM deferoxamin, pH 7.0.
  10. Nachdem die DNA in der obigen Lösung vollständig aufgelöst ist (nicht wirbeln), fügen Sie 4 mL einer Chloroformlösung hinzu, die 4% des Isoamylalkohols enthält.
  11. Die Röhren 10-mal für die Homogenisierung, Zentrifuge bei 2.000 x g,4 ° C, 10 Minuten umkehren, um die beiden Phasen zu trennen, und die obere Phase auf ein neues Rohr übertragen.
  12. Wiederholen Sie die Schritte 2.10 und 2.11 zwei weitere Male.
  13. Fügen Sie 8 ml absolutes Ethanol und 0,4 ml einer 5 M NaCl-Lösung hinzu, um die DNA zu überstürzen.
  14. Sammeln Sie die vorgeführte DNA wieder und übertragen Sie sie auf 3 mL von 70% Ethanol. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
  15. Die Ethanol-Lösung mit Vorsicht abwerfen und die Rohre, die die ausgelaufene DNA auf saugfähigem Papier enthalten, umkehren, um den Überschuss der Lösung zu beseitigen.
  16. Fügen Sie 200 μL von 0,1 mM-Deferoxamin-Lösung hinzu, um die DNA aufzulösen. Halten Sie die Röhren bei 4 ° C, bis die DNA vollständig rehydriert ist (über Nacht).
  17. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration, indem Sie die Aufnahme auf 260 nm und ihre Reinheit durch das 260/280 nm Absorbationsverhältnis messen.
    Hinweis: Um die DNA-Konzentration zu bestimmen, übertragen Sie einen Aliquot von 10 μL der DNA-Lösung auf 990 μL ultrareines Wasser (100x Verdünnung). Multiplizieren Sie die Absorption bei 260 nm (sie sollte unter 1 liegen) um 50 (50 μg/mL ist die Konzentration der doppelt gestrandeten DNA, wenn die Absorption einer 1 cm langen Pfadlängenlösung bei 260 nm 1 beträgt) und durch die Verdünnung (100x), um die DNA-Konzentration in μg/mL zu erhalten. Liegt die Absorption bei 260 nm über 1, sind zusätzliche Verdünnungen notwendig. Das 260/280 nm Absorbtionsverhältnis sollte für die gewünschte DNA-Reinheit gleich oder über 1,8 sein, aber die Verhältnisse um 1,6 sind akzeptabel.

3. DNA-enzymatische Hydrolyse

  1. Analyse-Rezept
    1. 1,N6-Papier-dAdo und 1, N2-DGuo-Analysen: Zu einem Aliquot mit 150 μg DNA, addieren 7,5 μL von 200 mM Tris/MgCl 2 Puffer (pH 7.4), 1,4 μL der internen Standardlösung, die 250 fmol/μL von [15N5 ] 1,N6-fach dAdo und [15N5] 1,N2-der-Guo, und 15 Einheiten deoxyribonuclease I. Stellen Sie das endgültige Volumen auf 200 μL mit ultrareinem Wasser ein, wobei die Mengen der Enzyme, die auf Schritt 3.2.1 verwendet werden sollen, abgezogen werden.
    2. 8-oxodGuo Analysen: Zu einem Aliquot, der 80 μg DNA enthält, fügen Sie 3,8 μL von 200 mM Tris/MgCl 2 Puffer (pH 7.4), 2 μL der internen Standardlösung hinzu, die 1.000 fmol/μL von [15N5] 8-oxodGuo und 8 Einheiten deoxyribonuclease I enthält. Stellen Sie das endgültige Volumen auf 100 μL mit ultrareinem Wasser ein und subtrahieren Sie die Mengen an Enzymen, die auf Schritt 3.2.2 verwendet werden sollen.
      NOTE: Die internen Standards [15 N5] 1,N6--dAdo, [15N5] 1,N2----oxodGuo könnensynthetisiert und als beschrieben35,36,37. Die Menge der internen Standards in den injizierten Probenmengen sollte die gleichen sein wie die in den injizierten Kalibrierungskurvenmengen.
  2. Die Proben bei 37 ° C 1 Stunde lang einwürgen.
    1. Proben aus Schritt 3.1: Fügen Sie 0,006 Einheiten Phosphodiesterase I von Crotalus atrox und 15 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Rinderintestinen-Schleimhaut hinzu.
    2. Proben aus Schritt 3.2: Fügen Sie 0,0032 Einheiten Phosphodiesterase I von Crotalus atrox und 8 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Rinderintestinen-Schleimhaut hinzu.
  3. Die Proben bei 37 ° C 1 Stunde lang einwürgen.
  4. Zentrifuge die Proben 10 Minuten lang auf 14.000 x g.
  5. Proben aus Schritt 3.2.1: Trennen Sie 10 μL jeder Probe für die Quantifizierung der deoxynucleoside (dAdo, dGuo) durch HPLC/DAD (Schritt 9). Das Restvolumen der festen Phasenextraktion unterziehen (Schritt 4).
  6. Proben aus Schritt 3.2.2: Übertragen Sie 80 μL des Supernatants auf Vials für Injektionen von 50 μL (1.000 fmol von [15N5] 8-oxododGuo) im HPLC-ESI-MS/MS-System. Reservieren Sie die restlichen 20 μL für die Quantifizierung von dGuo durch HPLC/DAD (Schritt 9).

4. Festphasenextraktion für Analysen von 1, N6-DAdo und 1, N2-oder Guo

  1. Laden Sie die Patronen (SPE-C18, 30 mg/mL, 33 μm, 1 mL) mit 1 mL der folgenden Lösungsfolge: 100% Methanol, göttliches Wasser, hydrolysierte DNA-Probe, deionisiertes Wasser, 10% Methanol, 15% Methanol und 100% Methanol (gesammelt).
    Achtung: Lassen Sie die Patronen nicht zwischen den Anwendungen der verschiedenen Lösungen trocknen. Fügen Sie die nächste Lösung unmittelbar nach dem Betreten der Patrone hinzu.
  2. Vakuum trocknen die letzte Elasspfraktion (100% Methanol), die die Zulätze enthält.
  3. Die getrockneten Proben in 83.1 μL ultrareines Wasser unmittelbar vor der HPLC-ESI-MS/MS-Analyse wiederauferstehen, um 200 Fmol jedes internen Standards in 50 μL jeder Probe zu erhalten.

5. Vorbereitung der Kalibrierkurven

  1. Bereiten Sie mindestens fünf Punkte im Intervall von 300 bis 6.000 Fmol 8-oxodGuo-Standard vor, wobei die feste Menge von 1.000 Fmol von [15N5] 8-oxodGuo in jedem Punkt liegt. Betrachten Sie diese Beträge in der injizierten Menge.
  2. Bereiten Sie mindestens fünf Punkte im Intervall von 1 bis 40 fmol von 1,N6-Wert und 1, N 2-Wert Guo, mit festen Mengen von 200 Fmol von [15N5] 1,N6-Wert-dAdo und [15N5] 1, N 2-:DGuo in jedem Punkt. Betrachten Sie diese Beträge in der injizierten Menge.
  3. Bereiten Sie mindestens fünf Punkte im Intervall von 0,05-1 nmol von dGuo und dAdo. Betrachten Sie diese Beträge in der injizierten Menge.

6. Erstellung von DNA-Proben zur Methodenvalidierung

  1. 1,N-bob-Adound 1,N2-DGuo-Analysen: Fügen Sie unterschiedliche Mengen von 1,N6-Wert-dAdo und 1,N2-Wert Guo (z.B. 1,75, 8,75, 17,5 und 35 fmol) und feste Mengen von [15N5] 1, N6-α dAdo und [15N5] 1,N2-Flaf-Guo (350 fmol) bis 100 μg Kalbsthymus-DNA und führen die enzymatische Hydrolyse durch, wie in Schritt 3 beschrieben. Die Proben in zwei verschiedenen Tagen vervierfacht. Verwenden Sie die Proben für die Methodengenauigkeit und Präzisionsbewertung.
    Hinweis: Das endgültige Volumen der DNA-Hydrolysate wird 200 μL (Schritt 3) sein, von denen 10 μL für die Quantifizierung von deoxynucleoside durch HPLC/DAD (Schritt 9) getrennt werden. Die restliche Lösung (190 μL) wird einer festen Phasenextraktion unterzogen (Schritt 4), der getrocknete Bruchteil wird in 83.1 μL (Schritt 4.3) wiederbelebt, von dem 50 μL in das HPLC-ESI-MS/MS-System eingespritzt wird. Die Mengen von 1,N6-Wert-dAdo und 1, N2-Wert-injiziert werden 1, 5, 10 und 20 fmol, mit 200 fmol von [15N5] 1, N 6-Wert-dAdo und [15N5] 1,N 2-:DGuo in jeder Probe.
  2. 8-oxodGuo-Analysen: Fügen Sie unterschiedliche Mengen von 8-oxodGuo hinzu (z.B. 734, 1.468, 2.938 und 4.408 fmol) und eine feste Menge von [15N5] 8-oxodGuo (2.000 fmol) bis 100 μg Kalbsthymus-DNA und führen die enzymatische Hydrolyse durch, wie in Schritt 3 beschrieben. Die Proben in zwei verschiedenen Tagen vervierfacht. Verwenden Sie die Proben für die Methodengenauigkeit und Präzisionsbewertung.
    Hinweis: Das endgültige Volumen der DNA-Hydrolysate wird 100 μL (Schritt 3) sein, von dem 50 μL in das HPLC-ESI-MS/MS-System eingespritzt wird. Die Mengen von 8-oxodGuo injiziert werden 367, 734, 1469 und 2204 fmol, mit 1.000 Fmol von [15N5] 8-oxodGuo in jeder Probe.
  3. Um 13,125 fmol von 1,N6-DAdo (um 7,5 fmol im Injektionsvolumen zu erhalten) und 35 fmol von 1, N 2-DGuo (um 20 fmol im Injektionsvolumen zu erhalten), werden acht Proben von 100 μg Kalbsthymien-DNA.
    1. Die internen Standards [15N5] 1,N6-pute-Ado und [15N5] 1,N2-po (200 fmol) zu vier Proben hinzufügen. Gehen Sie mit der DNA-Hydrolyse und der festen Phasenextraktion aller Proben voran.
    2. Die internen Standards [15N5] 1,N6-pute-Ado und [15N5] 1,N2-po (200 fmol) zu den anderen vier Proben hinzufügen.
    3. Verwenden Sie die Proben, um die Rückgewinnung der Addukte aus der festen Phasenextraktion zu berechnen.

7. HPLC-ESI-MS/MS Analyse von 8-oxodGuo

  1. Wenn Sie den 8-oxodGuo-Standard in die Geräte einstöbern, stellen Sie die ESI-MS/MS-Parameter für die beste Erkennung seines Fragmentierungsmusters durch Multiple Reaktionsüberwachung (MRM): M/z 284 [M + H] + → m/z 168 [M-2 '-deoxyribose + H]+.
    1. Verwenden Sie die gleichen Parameter für die Erkennung von [15N5] 8-oxodGuo: M/289 [M +H] +m/z → 173 [M-2 '-deoxyribose + H]+.
      Hinweis: Verwenden Sie ein Gerät, das äquivalent oder besser ist als die Ausrüstung, die bei dieser Arbeit verwendet wird (siehe Materialtabelle ). Die ESI-MS/MS-Parameter wurden wie in Tabelle 1beschrieben eingestellt.
  2. Filter (mit 0,22 μm porösen Membranen) und entgasen (mit einem Soundator) alle wasserbasierten HPLC-Lösungsmittel.
  3. Verwenden Sie für die Analysen die folgenden Chromatografiebedingungen, die das System wie in Abbildung2 zeigen.
    Hinweis: Die Spalte A ist an die Binärpumpe angeschlossen. Sein Eluent richtet sich an die UV-Erkennung und den Abfall in den ersten 16 Minuten und von 32 bis 46 Minuten der Chromatographie, wie in Abbildung 2Agezeigt. Dies ist die Säule, durch die die Probe unmittelbar nach der Injektion abgelulert wird. Spalte B ist mit der isokratischen Pumpe und dem Massenspektrometer verbunden. Er erhält das Eluent der Spalte A nur im Abstand von16-32 Minuten, wenn das Ventil auf die in Abbildung 2B angezeigte Position geschaltet wird. Die Ventilschaltung ermöglicht die Verbindung zwischen den beiden Säulen, die durch den binären Pumpenverlauf gelöst werden. Die in Abbildung 2B gezeigte Konfiguration ermöglicht eine weitere Spitzentrennung und Verengung. Zusätzlich erreicht nur der chromatographische Anteil des Interesses das Massenspektrometer, was die Empfindlichkeit und Selektivität verbessert.
    1. Elute a 50 x 2.0 mm i.d., 2,5 μm, C18-Spalte (Spalte Avon Abbildung 2) gekoppelt an eine C18-Sicherheitsschutzpatrone (4,0 x 3,0 mm i.d.) mit einem Gefälle von 0,1% Ameisensäure (Lösungsmittel A) und Methanol mit 0,1% Ameisensäure (Lösungsmittel B) bei einer Fließgeschwindigkeit von 150 μLmin und 25 ° C.
      1. Verwenden Sie für die Binärpumpe folgendes Gradientenprogramm: Von 0 bis 25 min, 0-15% des Lösungsmittels B; 25 bis 28 min, 15-80% des Lösungsmittels B; 28 bis 31 min, 80% des Lösungsmittels B; 31 bis 33 min, 80-0% des Lösungsmittels B; 33 bis 46 min, 0% des Lösungsmittels B.
      2. Mit dem Schaltschalter können die ersten 16 Minuten des Eluents zum Verschwendung und der 16-32-minütige Bruchteil auf eine zweite Säule (150 x 2,0 mm i.d., 3,0 μm , C18, Spalte B der Abbildung 2) geleitet werden, die an die ESI-Quelle angeschlossen ist und durch die isokratische Pumpe mit einer Lösung von 15% mir bedingt ist. Danol in Wasser mit 0,1% Ameisensäure (150 μL/min).
        Hinweis: Bevor Sie das Schalttevel von Schritt 7.3.1.2 verwenden, prüfen Sie, ob die 8-oxodGuo-Standardlutes aus der ersten Spalte nach 16 Minuten ausfallen. Es ist wichtig, das Ventil bei 32 min zu schließen, um den Gefälle der Binärpumpe zu verwenden, um 8-oxodGuo aus der zweiten Säule zu elutschen und eine scharfe chromatographische Spitze zu erhalten. Die Läsion 8-oxodGuo elutten aus der zweiten Spalte bei etwa 36 min. Abweichungen der Retentionszeit des Analyten können je nach Spalte und Ausrüstung auftreten. Anpassungen des HPLC-Lösungsmittelgradierprogramms können notwendig sein.

Figure 2
Bild 2. System von zwei Säulen, die für 8-oxo-7,8-Dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo) Analysen verwendet werden. A) Konfiguration in den ersten 16 Minuten und von 32 bis 46 Minuten der Chromatographie; B) Konfiguration, die im Intervall von 16-32 min verwendet wird, was eine weitere Trennung und Spitzenverengung in Spalte B vor der Elastizierung an der ESI-Quelle des Massenspektrometers ermöglicht. Diese Figur wurde von Oliveira et al. 34 neu veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

8. HPLC-ESI-MS/MS-Analyse von 1, N 6 -oder-dAdo und 1, N 2 -oder

  1. Die Einstinflussung der Standards 1, N6-und1, N2-Wert Guo in die Geräte setzen die ESI-MS/MS-Parameter für die beste Erkennung ihrer Fragmentierungsmuster durch Multiple Reaktionsüberwachung (MRM): m/z 276 [M + H]+m/z 160 [M 2 '-deoxyribose + H]+ zur Erkennung von 1,N6-f.dAdo undm/z 292 [M + H] + →m/z 176 [M-2 '-deoxyribose + H ]+ zur Erkennung von 1,N2-, dGuo.
    1. Verwenden Sie die gleichen Parameter für die Erkennung von [15N5] 1,N6-Wert (m/z 281 [M + H] +m/z → 165 [M-2 '-deoxyribose + H] +) und [15N 5] 1,N2--: DGuo (m/z 297 [M + H ] + → m/z 181 [M-2 '-deoxyribose + H]+). Stellen Sie die ESI-MS/MS-Parameter ein, wie in Tabelle 1beschrieben.
ESI-MS/MS Parameter 8-oxodGuo Etheno adduct
Vorhang auf Gas 20 psi 20 psi
Gas wird verneulere 55 50
Ion Source Gas 50 psi 40 psi
Kollisionsbedingte Dissoziationsgas mittel mittel
Ion-Spray-Spannung 5000 4500
ESI-Probe-Temperatur 450 450
Potenzial abschöpfend 31 V, 8-oxodGuo 41 V, 1,N6--
31 V, [15N5] 8-oxodGuo 41 V, [15N5] 1,N6-bon
45 V, 1,N2--dGuo
45V, [15N5] 1,N2-bo
Kollision Energie 23 eV, 8-oxodGuo 25 eV, 1.N6-
23 eV, [15N5] 8-oxodGuo 25 eV, [15N5] 1,N6-bor
27 eV, 1,N2--dGuo
27 eV, [15N5] 1,N2--dGuo
Kollisionszellausstiegs-Potenzial 16 V, 8-oxodGuo, 8 V, 1,N6--dAdo
16 V, [15N5] 8-oxododGuo 8 V, [15N5] 1,N6-bon
16 V, 1,N2--dGuo
16 V, [15N5] 1,N2---dGuo
Eintrittspreise 10 V 10 V

Tabelle 1. Parameter, die in den ESI-MS/MS-Geräten zur Erkennung der DNA-Läsionen verwendet werden. Diese Tabelle wurde von Oliveira et al. 34 geändert.

  1. Filter (mit 0,22 μm porösen Membranen) und entgasen (mit einem Soundator) alle wasserbasierten HPLC-Lösungsmittel.
  2. Verwenden Sie für die Analysen folgende Chromatografiebedingungen.
    1. Elute a 150 x 2.0 mm i.d., 3,0 μm, C18-Spalte gekoppelt an eine C18-Sicherheitswachtpatrone (4,0 x 3,0 mm i.d.) mit einem Gefälle von 5 mM Ammoniumacetat, pH 6,6 (Lösungsmittel A) und Acetonitril (Lösungsmittel B) mit einer Durchflussrate von 130 μL/min und 25 ° C.
      1. Verwenden Sie für die Binärpumpe folgendes Gradientenprogramm: Von 0 bis 10 min, 0% des Lösungsmittels B; 10 bis 39 min, 0-20% des Lösungsmittels B; 39 bis 41 min, 20-75% des Lösungsmittels B; 41 bis 46 min, 75% des Lösungsmittels B; 46 bis 47 min, 75-0% des Lösungsmittels B; 47 bis 60 min, 0% des Lösungsmittels B.
      2. Mit dem Schaltschalter können Sie die ersten 35 Minuten des Eluents zum Verschwenden und den 35-42-minütigen Bruchteil auf die ESI-Quelle leiten. Achten Sie darauf, dass die Adduct-Standards von der Spalte im eingestellten Intervall (35-42 min) aussteigen. Anpassungen, wenn nötig.

9. Quantifizierung der normalen 2 '-deoxyribonucleoside durch HPLC-UV

  1. Verwenden Sie eine Ausrüstung, die der Ausrüstung ähnelt, die bei dieser Arbeit verwendetwird (siehe Materialliste).
  2. Elit a 250 mm x 4,6 mm i.d., 5 μm, C18-Spalte an einer C18-Sicherheits-Wache Patrone (4,0 x 3,0 mm i.d.) mit einem Gefälle von 0,1% Ameisensäure und Methanol befestigt.
    1. Verwenden Sie folgendes Gradientenprogramm: Von 0 bis 25 min, 0 bis 18% Methanol; 25 bis 27 min, 18 bis 0% Methanol; Von 27 bis 37 min, 0% Methanol) bei einer Durchflussrate von 1 mL/min und 30 ° C.
    2. Fügen Sie 5 μL jeder Probe ein, die für die Quantifizierung von 2 '-deoxynucleoside reserviert ist.
    3. Setzen Sie den DAD-Detektor auf 260 nm für die Integration der DGuo und dAdo-Gipfel.

10. Quantifizierung der DNA-Läsionen

  1. Integrieren Sie die Spitzen von 8-oxodGuo,[15 N 5] 8-oxododGuo, 1,N6-dAdo,[15 N 5] 1, N--dGuo,und[15N5] 1,N2 -DGuo aus den Analysen von HPLC-ESI-MS/.
    1. Berechnen Sie die Flächenverhältnisse von 8-oxodGuo/[15 N5] 8-oxodGuo, 1,N6-D-/[15N5] 1,N6-of-DAdo und1,N2-dGuo/[15 N5 ] 1,N2--dGuo für die Kalibrierkurven und die Proben.
    2. Die Kalibrierkurven mit den Flächenverhältnissen, die im Schritt 10.1.1 in der y-Achse und den Mengen an Analyten, die in jedem Punkt in der x-Achse vorhanden sind, erhalten.
    3. Berechnen Sie die Mengen (fmol) der Läsionen in jeder injizierten Probe anhand der in Schritt 10.1.1 berechneten Verhältnisse und der Kalibrierkurven des Schrittes 10.1.2.
  2. Integrieren Sie die Spitzen von dGuo und dAdo aus den HPLC-UV-Analysen.
    1. Die Kalibrierkurven mit den in Schritt 10.2 in der y-Achse gewonnenen Bereichen und den Analysenzentren, die in jedem Punkt in der x-Achse vorhanden sind, können Sie die Kalibrierkurven verwenden.
    2. Berechnen Sie die Mengen (nmol) von dGuo und dAdo in jeder injizierten Probe mit den in Schritt 10.2 gewonnenen Bereichen und den Kalibrierkurven des Schrittes 10.2.1.
  3. Berechnen Sie die Mengen (nmol) von dGuo und dAdo, die in jeder Probe enthalten sind, die in das HPLC-ESI-MS/MS-System injiziert wird, wobei die im Schritt 10.2.2 berechneten Beträge im Probenvolumen von 5 μL enthalten sind, während 50 μL μL in das HPLC-ESI-MS/MS-System injiziert wurden.
    Hinweis: Um die Menge von DGuo in den Proben zu berechnen, die für die 8-oxodGuo-Analyse verwendet werden, multiplizieren Sie einfach die Menge (nmol/μL), die im Schritt 10.2.2 um 50 gewonnen wird. Um die Menge von dAdo und dGuo in den Proben zu berechnen, die für Analysen von 1,N6--und 1,N2-oder Guo verwendet werden, betrachten Sie den Konzentrationsschritt nach der festen Phasenextraktion. Das Volumen von 50 μL, das in das HPLC-ESI-MS/MS-System eingespritzt wird, entspricht 114.32 μL der ursprünglichen Probe. Die im Schritt 10.2.2 gewonnenen Beträge (nmol/μL) sollten mit 114.32 multipliziert werden, um die richtigen Werte zu erhalten.
  4. Berechnen Sie die molaren Fraktionen 8-oxododGuo/dGuo, 1,N6--dAdo,1, N2--dGuoo. Die Verhältnisse (fmol lesion/nmol normal deoxynucleoside) geben die Anzahl der Läsionen pro 106 normal dGuo oder dAdo.

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Representative Results

Die durchschnittlichen DNA-Konzentrationen (± SD), die von der Mäuselleber (~ 1 g Gewebe) gewonnen werden, Die Lunge (~ 0,2 g Gewebe) und die Niere (~ 0,4 g Gewebe) waren jeweils 5,068 ± 2,615, 4.369 ± 1,021 und 3,223 ± 723 μg/mL im Endvolumen von 200 μL. Ein repräsentatives Chromatogramm, das von HPLC-DAD der gereinigten DNA gewonnen wurde, ist in Abbildung3 dargestellt. Das Vorhandensein der vier 2 '-deoxynucleoside, frei von den RNA-Ribonucleo-Seiten, die unmittelbar vor den entsprechenden 2 '-deoxynucleo-Seiten austricken, zeigt die DNA-Reinheit.

In den Abbildungen4 bis 6 werden repräsentative Chromatogramme aus HPLC-ESI-MS/MS-Analysen zur Quantifizierung von 8-oxodGuo, 1,N6-DAdo und 1,N2-DGuo in Mäusegewebe-DNA-Proben gezeigt. Das Chromatogramm, das bei der UV-Erkennung in Abbildung 4 gewonnen wurde, zeigt die vier 2 '-deoxynucleoside, die von der ersten Säule bis ~ 10 min reichen, mit einer guten Trennung von 8-oxodGuo, wodurch unerwünschte Störungen vermieden werden. Die normalen 2 '-deoxynucleoside waren bei den Analysen von 1,N6--und 1, N2-oder Guo nicht vorhanden, da sie bei der Festphasenextraktion eliminiert wurden. In Abbildung 7 sind Massenspektren der in dieser Arbeit verwendeten Standards zusehen.

Typische lineare Kalibrierkurven für die Quantifizierung von 8-oxodGuo,1, N6-oder 1,N2-DGuo sind in Abbildung8 34 dargestellt. Die Methoden waren präzise und präzise, wie in Tabelle 234 dargestellt. Die intertägige Präzision, die für DNA-Aliquots berechnet wurde, die mit 367 Fmol 8-oxodGuo ergänzt wurden, betrug 16,97%, ergänzt um10 Fmol von 1, N 2-DGuo waren 14.01%, und ergänzt mit 1 Fmol von 1,N6-DAdo war 16,66%. Die Grenzen der Quantifizierung (S/N = 10) für die auf Spalte injizierten Standards waren 25 fmol für 8-oxodGuo, 0,3 fmol für 1, N-: dAdo und 1 fmol für 1,N2-modGuo34.

Die Methoden wurden auf die Quantifizierung von 8-oxodGuo,1, N2--DGuo und 1,N6-DAdo in Lunge, Leber und Nieren-DNA-Proben von A/J-Mäuse-Gewebe ausgesetzt ganzen Körper, um Umgebungsluft in PM 2.5 angereichert ausgesetzt, im Vergleich zu Diejenigen, die in situ Umgebungsluft ausgesetzt sind, wie die Studiesteuern34. Die gefundenen Werte werden in Tabelle 3gezeigt und zeigen die Induktion von DNA-Läsionen in Lunge, Leber und Niere bis PM 2.5 Exposition34.

Figure 3
Bild 3 . Chromatogramm des Hydrolysaten einer DNA-Probe, die aus der Maus-Lunge extrahiert wird. Das Chromatogramm wurde mit 260 nm aus dem HPLC-DAD-System gewonnen. Die vier 2 '-deoxynucleoside sind angezeigt: dC, 2 '-deoxycytidin; DA, 2 '-deoxyadenosine; DG, 2 '-deoxyguanosine; DT, 2 '-deoxythymidin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 4
Bild 4 . Repräsentative Chromatogramme, die die Erkennung von 8-oxo-7,8-Dihydro-2 ́-deoxyguanosine (8-oxodGuo) und den internen Standard [15N5] 8-oxododGuo von HPLC-ESI-MS/MS, sowie die normalen 2 '-deoxynucleoside zeigen Von der ersten Säule aus elliessend und auf die DAD-Erkennung (") = 260 nm) und Abfall umgeleitet. Die DNA-Probe wurde aus der Maus-Lunge extrahiert. Die Analysen von HPLC-ESI-MS/MS wurden mit mehrfacher Reaktionsüberwachung (MRM) mit den in den Bildern angegebenen Fragmentierungen durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 

Figure 5
Bild 5 . Repräsentative Chromatogramme, die die Erkennung von 1, N 6 -etheno-2 ́-deoxyadenosine (1,N6--: DAdo) und der interne Standard [15N5] 1, N 6 -: DAdo von HPLC-ESI-MS/. Die DNA-Probe wurde aus der Maus Niere extrahiert. Die Analysen wurden mit mehreren Reaktionsbeobachtungen (MRM) mit den in den Bildern angegebenen Fragmentierungen durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 

Figure 6
Bild 6 . Repräsentative Chromatogramme, die die Erkennung von 1, N 2 -etheno-2 ́-deoxyguanosine (1,N2-DGuo) und der interne Standard [15N5] 1, N 2 -dGuo von HPLC-ESI-MS/. Die DNA-Probe wurde aus der Mausleber extrahiert. Die Analysen wurden mit mehreren Reaktionsbeobachtungen (MRM) mit den in den Bildern angegebenen Fragmentierungen durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 

Figure 7
Bild 7 . Massenspektren der Standards, die in dieser Arbeit verwendet werden. Die Spektren wurden in MS2 mit der Kollisionsenergie von 20 eV gewonnen, um die [M + H]+ + Ionen zu fragmentieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 

Figure 8
Bild 8 . Kalibrierkurven, die von HPLC-ESI-MS/MS zur Quantifizierung von 8-oxo-7,8-Dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,N2-etheno-2 ́-deoxyguanosine (1,N2-Dogus) und 1, N6-etheno-2́-deoxyadenosine (1,N6-). Relativer Bereich bedeutet die Flächenverhältnisse zwischen der Läsion und ihrem jeweiligen [15N5] internen Standard. Diese Figur wurde von Oliveira et al. 34 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

ESI-MS/MS Parameter 8-oxodGuo Etheno adduct
Vorhang auf Gas 20 psi 20 psi
Gas wird verneulere 55 50
Ion Source Gas 50 psi 40 psi
Kollisionsbedingte Dissoziationsgas mittel mittel
Ion-Spray-Spannung 5000 4500
ESI-Probe-Temperatur 450 450
Potenzial abschöpfend 31 V, 8-oxodGuo 41 V, 1,N6--
31 V, [15N5] 8-oxodGuo 41 V, [15N5] 1,N6-bon
45 V, 1,N2--dGuo
45V, [15N5] 1,N2-bo
Kollision Energie 23 eV, 8-oxodGuo 25 eV, 1.N6-
23 eV, [15N5] 8-oxodGuo 25 eV, [15N5] 1,N6-bor
27 eV, 1,N2--dGuo
27 eV, [15N5] 1,N2--dGuo
Kollisionszellausstiegs-Potenzial 16 V, 8-oxodGuo, 8 V, 1,N6--dAdo
16 V, [15N5] 8-oxododGuo 8 V, [15N5] 1,N6-bon
16 V, 1,N2--dGuo
16 V, [15N5] 1,N2---dGuo
Eintrittspreise 10 V 10 V

Tabelle 1. Parameter, die in den ESI-MS/MS-Geräten zur Erkennung der DNA-Läsionen verwendet werden. Diese Tabelle wurde von Oliveira et al. 34 geändert.

Basal-Niveau zusätzlich Erkannt Erkennen (-) Basal genauigkeit Lebenslauf
Durchschnitt ± SD (fmol) fmol Durchschnitt ± SD (fmol) Durchschnitt (fmol) % %
8-oxodGuo
373.00 ± 2,71 0 372.79 ± 50,6 - - 13.57 Uhr
373.98 ± 4.86 367 755,41 ± 107.92 381 103.93 14.29
374,84 ± 5,19 734 1069,57 ± 108.51 695 94,65 10.14
357.94 ± 15.05 Uhr 1469 1671,67 ± 44,27 1314 89,43 2,65
371.07 ± 2,43 2204 2272.01 ± 40,2 1901 86,25 1,77
1,N2-fo
0,54 ± 0,01 0 0,54 ± 0.09 Uhr - - 16,88
0,54 ± 0,01 1 1,47 ± 0,16 0,93 93.39 11.17
0,55 ± 0,01 5 5,30 ± 0,72 4,76 95,11 13.50 Uhr
0.53 Uhr ± 0,01 10 10.60 Uhr ± 0,39 10.06 100.63 3,67
0,54 ± 0,01 20 20.20 Uhr ± 0,93 19.66 Uhr 98,29 4,60
1,N6-maure-Ado
2,08 ± 0,10 0 2,29 ± 0,39 - - 17.05
2,05 ± 0,04 1 3,06 ± 0,47 1.01 Uhr 100.89 15.31 Uhr
1,99 ± 0,06 5 7,87 ± 1,66 5,88 117,60 21,10
2,03 ± 0,07 10 12.43 Uhr ± 1,25 10.41 Uhr 104.06 10.06
1,97 ± 0,03 20 22.42 Uhr ± 3,89 20.46 Uhr 102,29 17.34 Uhr

Tabelle 2. Methodengenauigkeit und Variationskoeffizient (CV) zur Quantifizierung von 8-oxodGuo, 1, N 2 - "DGuo und 1," N 6 -DAdo in DNA. Diese Tabelle wurde von Oliveira et al. 34 geändert.

Umgebungsluft PM2,5             N P-Wert
Durchschnitt ± SEM Durchschnitt ± SEM   
lunge
8-oxodGuo/108 dGuo 2124 ± 56,96 2466 ± 93,10 6 0,01
1,N2--: DGuo/108 dGuo Nd Nd - -
1,N6--/108 dAdo 1,41 ± 0,23 1,44 ± 0,13 7 Ns
leber
8-oxodGuo/108 dGuo 2848 ± 183,5 2949 ± 223.8 6; 5 Ns
1,N2--: DGuo/108 dGuo 7,79 ± 2.49 24,94 ± 5,21 4 0,02
1,N6--/108 dAdo 2,82 ± 0.30 Uhr 2,18 ± 0,25 6 Ns
niere
8-oxodGuo/108 dGuo 1854 ± 87,13 2363 ± 157.0 6 0,02
1,N2--: DGuo/108 dGuo Nd Nd - -
1,N6--/108 dAdo 1,09 ± 0,15 1,52 ± 0,12 7 0,04
(NS, Not Significant; ND, nicht erkannt)

Tabelle 3. Niveaus der DNA-Läsionen in A/J Mäuse-Gewebeproben. Die Mäuse waren der Umgebungsluft und der Umgebungsluft ausgesetzt, die in PM 2.5 angereichert wurde (PM2.5 konzentriert 30-mal). Die Mittel zwischen den beiden Gruppen (Umgebungsluft und PM2,5) wurden mit t test verglichen. Die Ergebnisse wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn der P-Wert unter 0,05 lag. Diese Tabelle wurde von Oliveira et al. 34 geändert.

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Discussion

Ein großes Problem, das in den 8-oxodGuo-Analysen mit HPLC-Methoden gefunden wird, ist die mögliche Induktion ihrer Formation während der Aufarbeitungsprozesse der DNA-Extraktion,derDNA-Hydrolyseund der Konzentration von DNA-Hydrolysaten 22,38. Um das Problem der 8-oxodGuo-Kunstbildung zu minimieren, wird empfohlen, alle DNA-Extraktions-, Speicher-und Hydrolysee-Lösungen mit Deferoxamin zu ergänzen, die Natrium-Jod-Chaotropic-Methode zu verwenden und Phenol bei der DNA-Extraktion zu vermeiden, da Ebenso beträgt die Verwendung von DNA-Mengen im Hydrolyseverfahren knapp 100 μg, um den Beitrag der falschen Oxidation zum Endergebnis39zu minimieren. Wir haben die oben genannten Empfehlungen berücksichtigt, mit Ausnahme der Verwendung der Natriumjod-Chaotropha-Methode zur DNA-Extraktion. Stattdessen haben wir aus Gründen der Einfachheit kommerzielle Lösungen für die DNA-Extraktion verwendet, um ihnen vor dem Gebrauch Deferoxamin hinzuzufügen. Darüber hinaus wurden die gewonnenen DNA-Hydrolysate direkt in eine erste Spalte des HPLC-ESI-MS/MS-Systems injiziert, um eine frühere Trennung von 8-oxodGuo von den normalen Nukleosiden zu erreichen. Unmittelbar vor der Elastizierung von 8-oxodGuo wurde ein Schalklappen verwendet, um die erste Säule in eine zweite Säule abzuleiten, wo eine weitere Trennung und Spitzenverengung erreicht wurde. Dieser Ansatz ermöglichte eine ausreichende Empfindlichkeit für eine 8-oxodGuo-Quantifizierung, die frei von Störungen ist. Der ähnlichste Ansatz zur Quantifizierung von 8-oxodGuo in der DNA wurde von Chao und Coworker22beschrieben, die eine Fallensäule für die Probenreinigung und 8-oxodGuo-Speicherung verwendeten, bevor sie die Probenlopution in die analytische Spalte benutzten, wobei ein Schaltventil zwischen Die Spalten. Alternativwurdeein Konzentrationsschritt von 8-oxodGuo durchgeführt, der aus Bruchteilen gesammelt wurde, die aus HPLC-Trennungen von DNA-Hydrolysaten vor HPLC-ESI-MS/MS-Analysen hervorgerufen wurden, was viel aufwändiger ist.

Berichtete Basalwerte von 8-oxodGuo im Nagetier Lungengewebe, basierend auf HPLC-Analysen,Bereichvon 180-450/108 dGuo23, 39,41,42, 43, 1.340-2120/108 DGuo44, oder ca. 3000/108 dGuo45,46, mitden niedrigsten Werten, die durch die DNA-Extraktionsmethoden durch die Verwendung von Natriumjod gewonnen werden. Der mittlere 8-oxodGuo-Pegel, der hier in der Lunge von Mäusen gefunden wurde, die der Umgebungsluft ausgesetzt waren, war 2124/108 dGuo. Der Pegel stieg auf 2466/108 dGuo bei den Tieren, die der Umgebungsluft ausgesetzt waren, die in PM 2.5 (Tabelle 3)34angereichert ist. Es ist möglich, dass die Empfindlichkeit für die Erkennung von Unterschieden zwischen den Gruppen verbessert werden könnte, indem die DNA mit der Natriumjod-Chaotropic-Methode extrahiert wird. In der vorliegenden Studie waren die mittleren 8-oxodGuo-Werte, die in Kontrollmäuse Lungen-, Nieren-und LeberDNA gefunden wurden, jeweils 2,0, 1,8 und 2,7-mal höher als der mittlere Basalspiegel (1047/108 DGuo), der vom Europäischen Normungsausschuss für Oxidative erhalten wurde. DNA-Schaden (ESCODD) in einer interlaborativen Bewertung von 8-oxodGuo in der DNA aus Standardproben von SchweinelLeber 38 extrahiert.

Die Haupteinschränkung für die Erkennung von 1, N6--und 1,N2-DGuo in der DNA ist die Methodenempfindlichkeit, da diese Läsionen auf sehr niedrigem Niveau auftreten. Die niedrigsten Werte von 1,N2-dGuo in der DNA,die von HPLC-ESI-MS/MS quantifiziert wurden, lagen im Bereich von 0,87-4 Läsionen pro 108 dGuo in einer menschlichen Zelllinie und Rattengewebe 25,47. Eine Möglichkeit, die Empfindlichkeit und Selektivität für ihre Quantifizierung zu verbessern, besteht darin, sie mit Hilfe einer festen Phasenextraktion aus großen Proben von DNA-Hydrolysaten zu konzentrieren. Dieser Aufräumschritt löst chromatographische Probleme, die durch Injektionen von mehr als 100 μg DNA-Hydrolysaten in HPLC-analytische Säulen entstehen könnten. Diesen Ansatz haben wir in der hier vorgestellten validierten Methode angewandt. Die in dieser Studie 34festgestellten Werte von 1, N6-dAdofallen in den Bereich, der in Studien mit ultraensider Immunoaffinität/32P-Postbeschriftung 48,49 , 50 , 51 und sind niedriger als die, die von anderen Gruppen beschrieben werden, die HPLC-ESI-MS/MS 21,23,24beschäftigen. In ähnlicher Weise entsprechen diehier34 gemeldeten 1, N 2-DGuo-Werte den niedrigsten Niveaus, die von Garcia 25 und Angeli26 mit HPLC-ESI-MS/MS gemeldet wurden.

HPLC-ESI-MS/MS-Systeme mit höherer Empfindlichkeit als die in dieser Studie verwendeten Geräte sind verfügbar. Der Einsatz solcher Systeme ermöglicht die Analyse kleinerer DNA-Mengen, die die Anwendung der hier vorgestellten Methoden auf Situationen ausweitet, in denen die Gewebeverfügbarkeit eine Einschränkung darstellt. Die hier vorgestellten Methoden können für die Quantifizierung anderer modifizierter deoxynucleoside angepasst werden, abhängig von der Verfügbarkeit ihrer Standards und isotopischen Standards. Eine Anpassung der chromatographischen Bedingungen wäre notwendig, um scharfe Spitzen aller in den Analysen enthaltenen Moleküle zu erreichen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, Proc. 2012/22190-3 und 2012/08616-8), CNPq (Proc. 454214/2014-6 und 429184/2016-6), CAPES, PRPUSP (Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPES; Proc. 573530/2008-4), NAP Redoxoma (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) und CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. F. Oliveira und A. A. F. Oliveira erhielt Stipendien von FAPESP (Proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) und CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). M. H. G. Medeiros, P. Di Mascio, P. H. N. Saldiva und A. P. M. Loureiro erhielten Stipendien von CNPq.

Einige Figuren und Tabellen, die in diesem Werk zu sehen sind, wurden ursprünglich in Oliveira A.A.F. et al.Genotoxische und epigenotoxische Wirkungen bei Mäusen veröffentlicht, die konzentrierten Feinstaub in der Umgebung ausgesetzt sind (PM 2.5) aus der Stadt São Paulo, Brasilien. Partikel-und Fasertoxikologie. 15, 40 (2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[15N5]-2’-deoxyadenosine Cambridge Isotope Laboratories NLM-3895-25
[15N5]-2’-deoxyguanosine Cambridge Isotope Laboratories NLM-3899-CA-10
acetonitrile Carlo Erba Reagents 412413000
alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa Sigma P5521
ammonium acetate Merck 101116
calf thymus DNA Sigma D1501
cell lysis solution QIAGEN 158908
chloroform Carlo Erba Reagents 412653
deferoxamine Sigma D9533
deoxyribonuclease I (DNase I) Bio Basic Inc DD0649
ethanol Carlo Erba Reagents 414542
formic acid Sigma-Aldrich F0507
HPLC-ESI-MS/MS system HPLC: Agilent 1200 series            ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).                                                            ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.
HPLC/DAD system Shimadzu Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)
HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 µm, C18) Phenomenex 00B-4446-B0
HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 µm, C18) Phenomenex 00F-4251-B0
HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 µm, C18) Phenomenex 00G-4252-E0
HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.) Phenomenex AJO-4287
isoamyl alcohol Sigma-Aldrich M32658
isopropyl alcohol (isopropanol) Carlo Erba Reagents A412790010
ketamine Ceva Commercial name: Dopalen
magnesium chloride Carlo Erba Reagents 349377
magnesium chloride Sigma M2393
methanol Carlo Erba Reagents L022909K7
phosphodiesterase I from Crotalus atrox Sigma P4506
protein precipitation solution QIAGEN 158912
proteinase K Sigma-Aldrich P2308
ribonuclease A Sigma R5000
sodium chloride Sigma-Aldrich S9625
SPE-C18 (Strata-X) Phenomenex 8B-S100-TAK
tris(hydroxymethyl)-aminomethane Carlo Erba Reagents 489983
xylazine Syntec do Brasil Commercial name: Xilazin

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