Præklinisk model for kardiel donation efter kredsløbssygdomme død

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokol viser en enkel og fleksibel tilgang til evaluering af nye konditionerings midler eller strategier til at øge muligheden for kardiel donation efter kredsløbssygdomme død.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Aceros, H., Joulali, L., Borie, M., Ribeiro, R. V., Badiwala, M. V., Der Sarkissian, S., Noiseux, N. Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death. J. Vis. Exp. (150), e59789, doi:10.3791/59789 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Efterspørgslen efter hjertetransplantation er stigende; ikke desto mindre er organtilgængelighed begrænset på grund af en pauby af egnede donorer. Organ donation efter kredsløbssygdomme død (DCD) er en løsning til at løse denne begrænsede tilgængelighed, men på grund af en periode med langvarig varm iskæmi og risikoen for vævsskade, dens rutine brug i hjertetransplantation er sjældent set. I dette manuskript giver vi en detaljeret protokol, der nøje efterligner aktuel klinisk praksis i forbindelse med DCD med kontinuerlig monitorering af hjertefunktionen, der giver mulighed for at evaluere nye kardioprotektive strategier og interventioner for at mindske iskæmi-reperfusion skade.

I denne model, DCD-protokollen er initieret i bedøvet Lewis rotter ved at stoppe ventilation til at inducere kredsløbssygdomme død. Når systolisk blodtryk falder til under 30 mmHg, påbegyndes den varme iskæmiske tid. Efter en forudindstillet, varm iskæmisk periode skylles hjerter med en normothermic cardioplegic-opløsning, indkøbes og monteres på et Langendorff ex vivo-hjerte perfusions system. Efter 10 min første reperfusion og stabilisering evalueres hjertets Rekonditionering kontinuerligt for 60 min ved brug af intraventrikulært tryk overvågning. En hjerte skade er vurderet ved at måle hjertetroponin T og infarkt størrelse er kvantificeret ved histologisk farvning. Den varme iskæmisk tid kan moduleres og skræddersys til at udvikle den ønskede mængde af strukturelle og funktionelle skader. Denne enkle protokol giver mulighed for evaluering af forskellige kardioprotektive konditionerings strategier, der indføres på tidspunktet for kardioplegi, Initial reperfusion og/eller under ex vivo perfusion. Resultaterne fra denne protokol kan gengives i store modeller, hvilket letter den kliniske oversættelse.

Introduction

Solid organtransplantation i almindelighed og hjertetransplantation, især, er stigende på verdensplan1,2. Standardmetoden for organ indkøb er donation efter hjernens død (DBD). I betragtning af de strenge inklusionskriterier for DBD er mindre end 40% af de tilbudte hjerter accepteret3, hvilket begrænser tilbuddet i lyset af stigende efterspørgsel og udvidelse af orgel ventelisten. For at løse dette problem, er brugen af organer doneret efter kredsløbssygdomme død (DCD) betragtes som en potentiel løsning4.

I DCD donorer, dog, en et fase efter seponering af pleje og en periode med ubeskyttet varm iskæmi inden genoplivning er uundgåelige5. Den potentielle organskade efter kredsløbssygdomme død kan føre til organ dysfunktion, forklarer modvilje mod rutinemæssigt at vedtage DCD hjertetransplantationer. Det er rapporteret, at kun 4 centre bruger DCD hjerter klinisk, med strenge kriterier, der omfatter meget korte varme iskæmi gange og unge donorer uden kroniske patologier6,7. Af etiske og juridiske årsager kan begrænset eller ingen kardioprotektive interventioner anvendes i donorer forud for kredsløbssygdomme død5,8,9. Således er enhver afbødning for at lindre iskæmi-reperfusion (IR) skade begrænset til kardioprotective behandlinger initieret under tidlig reperfusion med cardioplegic opløsninger, og ikke giver mulighed for korrekt funktionel vurdering. Ex vivo hjerte perfusion (evhp) og Rekonditionering af DCD hjerte ved hjælp af dedikerede platforme er blevet foreslået som en alternativ løsning og studerede af forskellige lærde10,11,12,13 . EVHP tilbyder en unik mulighed for at levere post konditionerings midler til DCD Hearts for at forbedre funktionel genopretning. Men for effektiv klinisk oversættelse er der stadig mange tekniske og praktiske spørgsmål, som skal løses, og dette forstærkes yderligere af manglende konsensus om en række perfusions-og funktionelle kriterier til bestemmelse af transplantat evne6, 8.

Heri rapporterer vi udviklingen af en reproducerbar præklinisk lille dyredcd-protokol kombineret med et ex vivo-hjerte perfusions system, der kan anvendes til at undersøge organ post konditionering initieret på tidspunktet for udtagning, under Initial reperfusion, og /eller i hele EVHP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyresundheds-og forsøgsprotokoller blev udformet til vejledning i pleje og anvendelse af forsøgsdyr og blev godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-anvendelse i Center hospitalier de l'Université de Montréal Research Center.

1. indledende forberedelser

  1. Tænd for vandbadet for at opvarme cardioplegi-leveringssystemet (figur 1a) og Langendorff ex vivo-perfusions systemet (figur 1b). Indstil vandtemperaturen til 38,5 °C for en løsnings temperatur på 37 °C. Opsætnings fotografier kan ses i supplerende figur 1a, B.
  2. Forbered 1 L kardioplegisk opløsning. Der tilsættes 1 mL 2% lidocainhydrochlorid og 10 mL 2 mM KCl (slutkoncentration 20 mM) til 1 L plasma-Lyte A (140 mM na, 5 mM K, 1,5 mM mg, 98 mM CL, 27 mM acetat, 23 mM gluconat). Ret pH til 7,4 ved hjælp af 6 N HCl.
    Forsigtig: Denne model er meget følsom over for pH. En forkert pH-korrektion (uden for det fysiologiske område på 7,3-7,4) eller pH-ustabile opløsninger kan kompromittere forsøget eller give upålidelige data.
  3. Forbered 4 L Krebs opløsning (113 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1,6 mM NaH2po4, 1,25 mm CaCl2, 1 mm mgcl2∙ 6h2O, 5,5 mm D-glucose, 25 mm NaHCO3). Substrat masser pr 1 L opløsning bør være som følger: 6,1 g NaCl, 0,3355 g KCl, 0,2035 g MgCl2∙ 6h2O, 0,192 g af Nah2po4, 0,1387 g af CaCl2, 0,99 g af D-glucose, 2,1 g af NaHCO3 , slutvolumen på 1 L i ultrarent deioniseret vand. Tilføj NaHCO 3 sidste for at undgå nedbør. Opløsningen filtreres ved hjælp af et 0,22 μm filter og opbevares natten over. Ret pH til 7,4, når opløsningen er på 37 °C, og boble med 5% CO2/95% O2.
  4. Fyld Langendorff-kredsløbet med Krebs-opløsningen, og start system pumpen. Sørg for, at der ikke er bobler tilbage inde i slangen. Juster den peristaltiske pumpehastighed til 80 rpm (svarende til 1 L/min). Ved hjælp af to-vejs stophanen justeres flowet for at opretholde et langsomt dryp gennem aorta kanylen, indtil hjertet er fastgjort (figur 1b). Hold en prøve af krebs opløsning (15 mL) i en 50 mL conic tube på is til hjerte transport.
  5. Fyld cardioplegi-leveringssystemet med den kardioplegiske opløsning. Når boblerne er fjernet, skal du skifte kredsløbet til saltvand ved hjælp af en 3-vejs stophane (figur 1a). Juster dryp hastigheden. Saltvand skal langsomt dryppe fra spidsen af kateteret for at sikre, at ingen kardioplegisk opløsning injiceres før dyrets død.

2. tilberedning af dyr

  1. Ved hjælp af et inhalations kammer, fremkalde anæstesi med 3% isofluran. Når dyret ikke reagerer, udføre en intraperitoneal injektion af ketamin (75 mg/kg) og xylazin (5 mg/kg) eller tilsvarende egnet bedøvelse, efter lokale regler, at opretholde anæstesi for resten af proceduren. Sørg for dybden af anæstesi ved ingen reaktion på tåen knivspids og øjenspalten refleks.
  2. Intubate dyret ved hjælp af et 14 G, 2-tommer I.V. kateter. Start ventilation ved 50 vejrtrækninger pr. minut, med luftvejs tryk begrænset til 20 cmH2O.
  3. Placer dyret på en varmepude sat til "medium" og dække med en absorberende pad til at opretholde kropstemperaturen. Indsæt en rektal temperatursonde og fastgør en depotplaster Pulse pulsoximeter sensor til en af fødderne. Fastholde rektal temperatur ved 37 °C under hele proceduren.
  4. Vaskulær adgang
    1. Lav en 3 til 4 cm mellemlinie hud indsnit i halsen ved hjælp af en saks. Ved hjælp af stump spids buet saks, stump dissekere det subkutane væv og udsætte den rigtige sternohyoid muskel. Ved hjælp af ikke-traumatisk pincet flyttes musklen lateralt, indtil den højre halspulsåre (Pulsating), jugulære vene (ikke-pulserende) og vagus nerven (hvid) identificeres visuelt (supplerende figur 2a). Adskil forsigtigt vagus nerven fra halspulsåren ved hjælp af stump spids buet saks.
    2. Heparin (2.000 IE/kg) indsprøjtes via den højre jugulære vene. Tryk på injektionsstedet efter kanyle retraktion for at undgå lækage af blod.
    3. Brug buede pincet, passere to 5-0 silke suturer omkring halspulsåren. Fastgør en distale sutur fast for at udlægge halspulsåren på det overlegne aspekt af den udsatte arterie. Hold den proksimale sutur ubundet. Træk af den proksimale sutur vil blive anvendt til blødningskontrol i næste trin (supplerende figur 2b). Afstanden mellem suturer bør være ca. 2 cm.
    4. Ved hjælp af et stereomicroskop for bedre visualisering skal du forsigtigt lave et 1 mm snit med mikrokirurgi saks over den forreste væg af halspulsåren. Indsæt et 22 G, 1-tommers lukket I.V. kateter mod aortabuen. Kateteret er forbundet til en 2-vejs stophane, der giver mulighed for tilslutning til en tryktransducer til konstant overvågning, med mulighed for indsprøjtning af saltvand eller kardioplegi via cardioplegi delivery system (figur 1a).

3. initiering af kardiel donation efter protokol af kredsløbssygdomme (DCD)

Bemærk: En komplet protokol tidslinje kan ses i figur 2.

  1. Re-Asses bedøvelses dybden ved at udføre en tå knivspids og evaluere øjenspalten refleks. Hvis der observeres en reaktion, udføres en intraperitoneal injektion af ketamin (37,5 mg/kg) og xylazin (2,5 mg/kg). Revurdere efter 5 minutter. Hvis der ikke observeres et svar, fortsættes proceduren. Tracheal clamp bør kun udføres i tilstrækkeligt bedøvet dyr.
  2. Sluk for ventilatoren og extubate dyret. Brug myg pincet, klemme luftrøret. Dette øjeblik betragtes som starten på den et fase. Begynd at tælle den funktionelle, varme iskæmiske tid (WIT), når det systoliske maksimale blodtryk falder til under 30 mmHg, eller hvis der kommer asystjal eller ventrikelflimren, uanset hvad det er først (figur 3).
    Bemærk: Skadesgrad bør være proportional med vid. Eksperimenter er nødvendige for at optimere WIT tid i henhold til bedøvelsesmiddel anvendes, dyr stamme, køn og vægt valgt. I kontroldyr, umiddelbart efter carotis vaskulær adgang er sikret, kardioplegi injiceres og hjertet indkøbes som beskrevet i næste trin (figur 2). Starten af perfusion med cardioplegi betragtes som enden af vid.
  3. I slutningen af vid, udføre en mediale sternotomi. Hold thorax åben ved hjælp af en Alm retractor. Brug en saks til at åbne den ringere Vena cava og begge Atria for at undgå myokardial udspiling eller kardioplegi recirkulation (supplerende figur 3). Klem aorta over membranen. Gennem den tidligere kateteriserede carotidarterie, indgyde cardioplegic opløsning ved et konstant tryk på 60 mmHg i 5 min ved hjælp af cardioplegi delivery system. Infusions trykket kan ændres ved at ændre højden af vandsøjlen.
  4. Ved afslutningen af kardioplegic infusion, dissekere den stigende proksimale aorta fra lungearterien ved hjælp af buede pincet (supplerende figur 4a). Skær aorta distale til venstre subclavia arterie. Sørg for en aorta længde på mindst 0,5 cm ved kanylering til Langendorff-apparatet.
  5. Hold hjertet fra aorta, Fuldfør kardiektomi ved at adskille hjertet fra lunge vener og andre thorax strukturer (supplerende figur 4b). Hurtigt, nedsænkes hjertet i til is-kold Krebs løsning til hurtig transport til ex vivo-systemet. Hold dissektion og transporttider så korte som muligt (5 min).

4. ex vivo hjerte Perfusions system (EVHP) og Kardiologisk funktionel vurdering

  1. Åbn aorta lumen ved hjælp af pincet. Deair aorta ved at fylde lumen med dryppende Krebs løsning for at undgå at tvinge bobler ind til krans karrene. Sænk kanylen ind i aorta, pas på ikke at passere aorta roden eller beskadige aortaklappen foldere. Fastgør opsætningen med en lille klemme.
  2. Brug 2-vejs stophanen til at øge strømmen for at søge efter mulige lækager i aorta. Hvis ingen er detekteret, stramt ordne aorta til kanyle ved hjælp af en 2-0 silke sutur. Helt åbne strømmen til kanyle. Opretholde aorta trykket ved et fysiologisk Tryk på 60-70 mmHg (justeret ved at ændre højden af systemet). På nuværende tidspunkt indledes den indledende reperfusion og stabiliseringstiden. Aorta trykket kan ændres i henhold til investigators eksperimentelle plan.
  3. Drej hjertet, så bunden af hjertet (Atria) står over for trykføleren. Udvid den venstre ventrikel atrieflimåbning ved at dissekmere de pulmonale vener. Indsæt latex ballonen forbundet med en tryksensor. Sørg for, at ballonen er fuldt placeret inde i ventriklen ved visuel inspektion. Fyld langsomt ballonen med saltvand, indtil diastolisk tryk (EDP) er indstillet til 15 mmHg. Justér efter behov for at holde EDP-konstanten (forudbestemt fysiologisk EDP). EDP kan justeres i henhold til forsøgs målene for hver investigator.
  4. Indsæt pacing elektroden i den forreste flade af hjertet (højre ventrikel udstrømning tarmkanalen). Undgå punktering af krans karrene. Når spontan slå er observeret, påbegynde pacing ved 300 slag pr. min. den påkrævede spænding kan variere mellem eksperimenter og rotte stammer.
  5. Efter 10 minutters stabilisering, initiere kontinuerlig intraventrikulært trykmåling optagelse. Dette øjeblik betragtes som begyndelsen af rekonditionerings-og vurderingsfasen (tid 0), der vil vare 1 time (figur 2). Rekonditionering kan forlænges, men der forventes et tidsafhængig fald i kontraktilitet i alle hjerter.
  6. Ved starten af renovering, indsamle hjerte spildevand falder fra hjertevener i 5 min for baseline koronar flow vurdering og biokemiske analyser. For troponin T Gentag hver 15 min (gange 0, 15, 30, 45 og 60 min). For andre analyser er individualisering af indsamlings tider nødvendig (Figur 2).

5. på erfaring

  1. Fjern hjertet fra Langendorff-apparatet.
  2. Ved hjælp af en lige høj kulstofstål klinge (microtome klinge eller lignende), fjerne bunden af hjertet (herunder aorta og pulmonal arterie).
  3. Med højre ventrikel vendt nedad, skæres tværgående ventrikulære slides af 1-2 mm tykkelse. I en repræsentativ sektion (normalt den tredje) punktafgifter højre ventrikel og snap fryse den venstre ventrikel. Denne prøve kan anvendes til biokemiske analyser.
  4. Nedsænk de resterende sektioner i til frisklavet 5% 2, 3, 5-triphenyl-tetrazoliumchlorid i kommerciel fosfatbuffer saltvand pH 7,4 i 10 min ved 37 °C. Levedygtige væv er farvet rød mursten.
  5. Vask to gange med fosfatbuffer saltvand pH 7,4 og fastgør med 10% formalin ved 4 °C natten over. Vask to gange med fosfat bufferet saltvand pH 7,4 og hold hver skive nedsænket.
  6. Trække overskydende væske og vægt hvert dias. Tag digitale farvebilleder af begge sider. Brug planimetriske analyser til at beregne procent infarkt størrelse og korrigere for skive og total ventrikel vægt. Farvning svinder med tiden. Billeder skal tages så hurtigt som muligt.

6. data analyser

  1. Gem alle trykdata i en ny fil pr. dyr.
  2. For tryk analyser skal du vælge mindst 200 trykcyklusser pr. tidspunkt. Analyser kan udføres off-line (efter afslutning af forsøget) ved hjælp af dedikeret software (dvs., LabChart). Fælles kardiovaskulære parametre til rådighed omfatter: maksimal genereret tryk, diastolisk tryk, + DP/dt (stejleste hældning under opstød af tryk kurven, en indikator for ventrikel kontraktile evne),-DP/dt (stejleste hældning under nedslaget af tryk kurven, en indikator for ventrikel afslapning kapacitet) blandt andre.
    Bemærk: for troponin-analyser forventes en stigning i troponin-frigivelse ved reperfusion. Efter 1 time af reperfusion i EVHP systemet, kan troponin niveauer falde til baseline, understreger behovet for omhyggelig timing i indsamlingen og håndteringen af disse prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter extubation falder blodtrykket hurtigt i et forudsigeligt mønster (figur 3). Forventet tid til døden er mindre end 5 min.

Figur 4 viser en gennemsnitlig tryk/tidskurve ved starten af rekonditioneringen efter 0, 10 og 15 min. Contractile funktion vil forbedre over tid. Brugen af korte perioder med vid vil give mulighed for kontraktilitet at vende tilbage til normal, og morfologiske skader vil ikke kunne detekteres (figur 5 og figur 6).

Proof-of-concept-brug af et konditionerings middel tilsat med cardioplegi og i stabiliseringsfasen viser, at skaden genereret af 15 min af WIT i denne model er modtagelig for modulation af cardioprotective agenter (figur 4, figur 5 og Figur 6).

Figure 1
Figur 1: påkrævede udstyrs skemaer. Minimumskrav til a)cardioplegia delivery system og a (B) Langendorff ex vivo hjerte perfusions system. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: protokol tidslinje. Tidslinje fra tidspunktet for ring indtil slutningen af protokollen. I kontroldyrene initieres kardioplegi uden DCD eller varm iskæmisk tid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Intracarotid blodtryk/tids plot. Typisk udvikling af intracarotid blodtryk efter extubation. Varm iskæmi tid stjerner når peak systolisk blodtryk falder til under 30 mmHg, eller hvis asystjal eller ventrikelflimren vises, hvad der kommer først. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: ex vivo gennemsnitlig Beat-to-beat ventrikel tryk tidskurve. Billede afledt af analyser af data taget efter 10 minutters stabilisering og perfusion (tid 0 i figur 2) med eller uden brug af et eksperimentelt farmakologisk kardioprotektivt konditionerings middel. Iskæmisk tid refererer til varme iskæmiske gange (WIT). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: ex vivo-nyttiggørelse og funktionelle analyser. A) kontinuerlig ventrikel tryktids kurve efter 10 minutters stabilisering og perfusion med eller uden brug af et eksperimentelt farmakologisk kardioprotektivt konditionerings middel. Pilene viser artefakter på grund af manuel ændring af EDP. B) maksimal (+ DP/DT) og minimal (-DP/DT) trykændring i LV vs. tids plot afledt af (A) viser en tidsafhængig forbedring i kontraktilitet uden behandling (grøn linje). Kort WIT (rød linje) eller behandlede (gule) hjerter viser et mønster, der ligner kontrolgruppen (blå linje). Data punkter er middelværdien af mindst 200 individuelle beats. Streger viser standardfejlen for middelværdien af hvert datapunkt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6:2, 3, 5-Triphenyl-tetrazoliumchlorid farve ved afslutningen af eksperimenter. Infarkt område observeret efter forskellige varme iskæmiske tider (WIT) og brugen af en farmakologisk kardioprodutiv konditionerings middel. Mursten rød: levedygtige væv. Lysegul: ikke-levedygtigt væv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: opsætning fotografi. A) fotografi, der viser opsætningen af cardioplegi-leveringssystemet. Nummereret udstyr svarer til: cardioplegia beholder (1), boble fælde (2), tryksensor og kateter (3), peristaltisk pumpe (4), polygraph forbundet med trykføleren (5) og lille animalsk ventilator (6). B) fotografi, der viser opsætningen for Langendorff ex vivo-hjerte perfusions systemet. Nummereret udstyr svarer til: Perfusate container (1), konditionerings middel container (2) og hjertekammer (3). Venligst klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 2: hals dissektion. A) fotografering, der viser den eksponerede jugulære vene (pil) før heparin injektion. (B) viser den dissekterede carotidarterie (pil) med de suturer, som er anbragt til blødningskontrol. Venligst klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 3: åbning af Atria for at forhindre recirkulation. A) fotografering, der viser åbningen af den venstre atrieflimning (1). På baggrunden er aorta (2) spændt over mellem gulvet (3). (B) viser åbningen af den højre atrieflimning (1). Venligst klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 4: indkøb af hjerte. A) fotografering, der viser brugen af buede pincet til at adskille aorta (pil) og lungearterien. B) fotografering, der viser hjertets dissektion og indkøb. Hjertet er hold af aorta ved hjælp af pincet. Venligst klik her for at downloade dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen præsenteres her introducerer en enkel, bekvem og alsidig model af hjertets DCD, der giver mulighed for at vurdere hjertets funktionelle opsving, vævsskader og brugen af post-condition cardioprotective agenter til at forbedre inddrivelse af donor hjerter ellers kasseres til transplantation. EVHP-systemer (ex vivo Heart perfusion Systems) er blevet optimeret til at give en platform til evaluering af hjertets funktion og giver en enestående mulighed for at levere og afprøve modificerede opløsninger suppleret med farmakologiske agenser efter konditionering for at bevare og reparere DCD hjerter i små15 og store dyr16,17 modeller af hjertets DCD. Ikke desto mindre er protokollerne ofte utilstrækkeligt detaljerede og ikke altid klinisk relevante, hvilket gør klinisk oversættelse vanskelig.

I DCD-modellerne mangler ex vivo DCD-modeller som den, der er beskrevet af Sanz18, en et fase. Ved at inducere hjertestop ved at stoppe mekanisk ventilation, det sympatiske nervesystem er over aktiveret, fører til en "catecholamin Storm"19. Denne stigning i katekolaminer modificerer donororganernes karakteristika og har været forbundet med en reduceret funktionel status for eksperimentelle DCD-organer19. Desuden, den progressive tilbagegang i funktion forud for asystjal fører til højre ventrikel udspiling og deraf følgende skade. I vores protokol har vi induceret kredsløbssygdomme ved hjælp af en klinisk relevant Kvælnings model, som bevarer disse reaktioner.

To vigtigste in vivo kardiale DCD-modeller er beskrevet i litteraturen: åben brystet15 og lukkede brystet20 modeller. Hjertets fysiologi ændres ved den åbne bryst tilgang ved at reducere den mekaniske lunge/hjerte interaktion og preload. Desuden, i åbne bryst procedurer, kroppens varmetab accelereres, yderligere påvirker funktionelle resultater21. Derfor er det at foretrække at opretholde en lukket brystet tilgang forhindrer varmetab. En anden raffinement er at minimere variabiliteten af tid til kredsløbssygdomme død. Kearns et al. rapporterede, at tiden til døden (tid til ikke-pulsatile eller gennemsnitligt blodtryk mindre end 30 mmHg) var mellem 3 til 11 min. I 10 og 20 min WIT, 40% og 60% af hjerter ikke genvinde funktion, henholdsvis på en ex vivo arbejder hjerte apparat, gør data fortolkning vanskeligere15. Et alternativ til at reducere tiden til kredsløbssygdomme død er at bruge paralytiske agenter20; ikke desto mindre peger nogle beviser mod direkte kardielle virkninger af vecuronium, på grund af dets virkninger på sympatisk og parasympatisk innervation22. For at øge reproducerbarhed, valgte vi for trakeal fastspænding, kombineret med en præcis arteriel tryk monitorization, giver mulighed for en mere homogen et tid (< 5 min). Det er kendt, at organskader starter før tidspunktet for kredsløbssygdomme død; med nogle forfattere overvejer et cut-off systolisk blodtryk under 50 mmHg som begyndelsen af funktionelle vid6, forklarer modvilje mod transplantationsorganer efter en lang periode form tilbagetrækning af livsbevarende foranstaltninger indtil reperfusion. I denne protokol følger den anvendte vid-definition den nuværende eksperimentelle standard15, ikke desto mindre er der behov for yderligere undersøgelser for at afklare det nøjagtige sæt af hæodynamiske parametre, der markerer induktion af organskader for at forbedre vid beregning, hvilket giver bedre information om klinisk praksis.

Infusion af kardioplegisk opløsning ved konstant fysiologisk tryk og temperatur giver en unik mulighed for at initiere hjerte konditionering og vævs beskyttelse med enhver farmakologisk agens eller på anden måde. Tekniske raffinementer omfatter fastspænding af thorax aorta, begrænse perfusion til hjertet og dermed reducere mængden af løsning, der er nødvendige for hvert essay. Når hjertet er på EVHP-systemet, er standardiseret funktionel evaluering nødvendig. Det har vist sig, at brugen af et evhp-system har potentialet til at forbedre genoplivning af hjerter, der tidligere ikke blev betragtet som planteres23,24. Det er interessant, at det klinisk tilgængelige evhp-system kun evaluerer hjertets levedygtighed ved hjælp af serielle laktat målinger8,23. Laktat målinger er ikke relateret til hjertets ydeevne af DCD hjerter24,25, således yderligere målinger for at evaluere transplantat evne er nødvendige. Denne eksperimentelle opsætning giver mulighed for en komplet funktionel evaluering, herunder genereret tryk og myokardial kontraktilitet målinger, herunder + dP/dT og-dP/dT, giver mulighed for en mere grundig evaluering af hjertets funktion før den endelige transplantation afgørelse træffes. Desuden er målinger af hjertetroponin, en markør for myokardiel skade direkte korreleret til iskæmisk infarkt størrelse26, og frigivelse kinetik er relateret til omfanget af hjerteiskæmi i et Langendorff iskæmi/reperfusion system. Især, med lange iskæmiske tider (60 min), troponin niveauer vedligeholdes efter 1 h reperfusion, mens LDH og kreatinin kinase signifikant fald, og er ikke relateret til omfanget af hjerte skade27,28, således anvendelsen af serielle troponin-foranstaltninger sikrer en fuldstændig vurdering af organ levedygtigheden før transplantation. En stor forstyrrende variabel i hjertets funktionelle evaluering er hjertefrekvensen. Spontan puls er omvendt relateret til længden af iskæmi29, og hjertefrekvensen korrelerer direkte med + DP/dt i isolerede rotte hjerter30 og i dyremodeller31. Interessant, i nyligt offentliggjorte arbejde på gnaver modeller af DCD hjerter og evhp conditioning, pacing blev ikke anvendt og hjertefrekvens var variable og registreres i deres protokoller15,18,20. For at opretholde fysiologisk puls blev pacing brugt, når hjertet havde genvundet rytmisk sammentrækning. Den valgte 300 BPM frekvens svarer til dem af sunde, ikke-stressede rotter32.

Begrænsninger af denne protokol omfatter brugen af flygtige anæstesi til induktion. Disse agenser har vist sig at give iskæmisk konditionering33. Ikke desto mindre, den korte tid af inhaleret bedøvelse brug havde ingen observerbare virkning i denne protokol og progressiv myokardial dysfunktion var stadig noteret med stigende WIT. Brugen af normothermic cardioplegi kan også ses som en begrænsning. Ved hjælp af normothermic cardioplegi giver optimal oversættelse fra in vitro-betingelser, der anvendes til udvikling af farmakologiske konditionerings midler, da cellerne normalt vedligeholdes ved 37 °C. Ikke desto mindre, i dette setup cardioplegi temperatur kan let reguleres i henhold til kravene i investigator. På den anden side kan brugen af en Langendorff præparat versus en arbejds hjerte forberedelse til renovering også ses som en begrænsning. Den arbejdende hjerte forberedelse giver mulighed for kontinuerlig optagelse af et tryk/volumen loop12,15, med kontrolleret præ og afterload, giver mulighed for en komplet funktionel evaluering. Den største fordel ved en Langendorff præparat er, at det opretholder et konstant aorta-og perfusions tryk, især under første reperfusion, når genereret tryk er minimal. Derudover er evaluerings opsætningen enklere for Langendorff hjertet sammenlignet med en fungerende hjerte forberedelse. Ikke desto mindre kan dette setup omdannes til en arbejds hjerte forberedelse, hvis det skønnes nødvendigt. Alternativt kan kardiel Reanimation udføres på stedet ved hjælp af normothermic regional perfusion, hvor hjertets ydeevne måles direkte ved brug af et Millar kateter34, så omfattende hæodynamiske og Myokardie funktionelle evaluering inden udtagning af organer. Hos mennesker er både in situ-og ex vivo-rekonditionerings strategier blevet beskrevet6, og derfor giver udviklingen af begge modeller mulighed for eksperimentelle sammenligninger, der kan oversættes til optimering af klinisk praksis. Endelig kan den lille størrelse og høje puls i denne dyremodel betragtes som en begrænsning på grund af de potentielle tekniske vanskeligheder, der observeres under udførelsen af disse eksperimenter, og de uundgåelige fysiologiske forskelle mellem rotte og menneskelige hjerter. Hvis EVHP evaluering er allerede standardiseret, en forsker kan blive fortrolig med denne teknik ved at udføre så lidt som 3 eksperimenter. På den anden side giver brugen af denne lille dyremodel mulighed for bekvem screening til en rimelig pris, der reserverer større og dyrere dyremodeller såsom svine modellen til terapier med et højt menneskeligt translationelt potentiale.

Afslutningsvis, den protokol, der er beskrevet her tager hensyn til den bedste praksis, der stammer fra flere grupper forske DCD hjerter. Denne protokol giver fuld kontrol over vid, hvilket giver mulighed for en omfattende strukturel og funktionel evaluering af kardioprotektive konditionerings behandlingsstrategier i rotter. Denne protokol kan opskaleres og overføres til store dyremodeller, gør det muligt at omsætte forskningsresultater til klinisk virkelighed og i sidste ende tillader udvikling af nye terapier øge kvaliteten og tilgængeligheden af livreddende organer meget behov for Patienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne rapporterer ingen ejendomsret eller kommerciel interesse i nogen produkt nævnt eller koncept diskuteret i denne artikel.

Acknowledgments

Dele af dette arbejde blev støttet af et gavmildt bidrag fra Fondation Marcel et Rolande Gosselin og Fondation hr. Stefane Foumy. Nicolas Noiseux er forsker i FRQ-S.

Forfatterne ønsker at takke Josh Zhuo Le Huang, Gabrielle GasCon, Sophia Ghiassi og Catherine Scalabrini for deres støtte i dataindsamlingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride. 1 L bag Baxter Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system.
14 G 2" I.V catheter Jelco 4098 To act as endotracheal tube.
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Milipore-Sigma T8877 Vital coloration
22 G 1" I.V catheter BD 383532 I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization
Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr Skalar 50-3147 Additional forceps for tissue manipulation
Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4" Skalar 22-9027 Tissue retractor used to maintain the chest open.
Bridge amp ADinstruments FE221 Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement
Calcium chloride Milipore-Sigma C1016 CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution
D-(+)-Glucose Milipore-Sigma G8270 D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution
DIN(8) to Disposable BP Transducer ADinstruments MLAC06 Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer
Disposable BP Transducer (stopcock) ADinstruments MLT0670 Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement
dPBS Gibco 14190-144 Electrolyte solution without calcium or magnesium.
Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4" Skalar 66-2740 Additional forceps for tissue manipulation
Formalin solution, neutral buffered, 10% Milipore-Sigma HT501128 Fixative solution
Heating Pad Sunbean 756-CN
Heparin sodium 1,000 UI/mL Sandoz For systemic anticoagulation
Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0% Fisher scientific A144-500 Diluted 1:1 for pH correction
Ketamine Bimeda Anesthetic. 100 mg/mL
LabChart ADinstruments Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled
Left ventricle pressure balloon Radnoti 170404 In latex. Size 4.
Lidocaine HCl 2% solution AstraZeneca Antiarrhythmic for the cardioplegic solution
Magnesium Chloride ACS ACP Chemicals M-0460 MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution
Micro pressure sensor Radnoti 159905 Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon
Pacemaker Biotronik Reliaty Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm.
pH bench top meter Fisher scientific AE150
Physiological monitor Kent Scientific Physiosuite For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure
Plasma-Lyte A Baxter Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia
Potassium Chloride Milipore-Sigma P4504 KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution
Potassium Chloride 2 meq/ml Hospira Part of the cardioplegic solution
PowerLab 8/30 Polygraph ADinstruments Electronic polygraph
Silk 2-0 Ethicon A305H Suture material for Langendorff apparatus
Silk 5-0 Ethicon A302H Suture material for carotid
Small animal anesthesia workstation Hallowell EMC 000A2770 Small animal ventilator
Sodium bicarbonate Milipore-Sigma S5761 NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Chloride Milipore-Sigma S7653 NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Hydroxide pellets ACP chemicals S3700 Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction
Sodium phosphate monobasic Milipore-Sigma S0751 NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution
Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2" Skalar 22-1240 Small scisors for atria and cava vein opening
Tissue slicer blades Thomas scientific 6727C18 Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol
Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8" CardinalHealth 8881511235 For heparin injection
Veterinary General Surgery Set Skalar 98-1275 Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps
Veterinary Micro Set Skalar 98-1311 Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening
Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system Radnoti 120101BEZ Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock
Xylazine Bayer Sedative. 20 mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gass, A. L., et al. Cardiac Transplantation in the New Era. Cardiology in Review. 23, (4), 182-188 (2015).
  2. von Dossow, V., Costa, J., D'Ovidio, F., Marczin, N. Worldwide trends in heart and lung transplantation: Guarding the most precious gift ever. Best Practice & Research. Clinical Anaesthesiology. 31, (2), 141-152 (2017).
  3. Hornby, K., Ross, H., Keshavjee, S., Rao, V., Shemie, S. D. Non-utilization of hearts and lungs after consent for donation: a Canadian multicentre study. Canadian Journal Of Anaesthesia. 53, (8), 831-837 (2006).
  4. Manyalich, M., Nelson, H., Delmonico, F. L. The need and opportunity for donation after circulatory death worldwide. Current Opinion In Organ Transplantation. 23, (1), 136-141 (2018).
  5. Shemie, S. D., et al. National recommendations for donation after cardiocirculatory death in Canada: Donation after cardiocirculatory death in Canada. CMAJ : Canadian Medical Association Journal. 175, (8), S1 (2006).
  6. Page, A., Messer, S., Large, S. R. Heart transplantation from donation after circulatory determined death. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7, (1), 75-81 (2018).
  7. Monteagudo Vela, M., Garcia Saez, D., Simon, A. R. Current approaches in retrieval and heart preservation. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7, (1), 67-74 (2018).
  8. Dhital, K. K., Chew, H. C., Macdonald, P. S. Donation after circulatory death heart transplantation. Current Opinion In Organ Transplantation. 22, (3), 189-197 (2017).
  9. McNally, S. J., Harrison, E. M., Wigmore, S. J. Ethical considerations in the application of preconditioning to solid organ transplantation. Journal of Medical Ethics. 31, (11), 631-634 (2005).
  10. Rao, V., Feindel, C. M., Weisel, R. D., Boylen, P., Cohen, G. Donor blood perfusion improves myocardial recovery after heart transplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 16, (6), 667-673 (1997).
  11. Ramzy, D., et al. Cardiac allograft preservation using donor-shed blood supplemented with L-arginine. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 24, (10), 1665-1672 (2005).
  12. Xin, L., et al. A New Multi-Mode Perfusion System for Ex vivo Heart Perfusion Study. Journal of Medical Systems. 42, (2), 25 (2017).
  13. Messer, S., Ardehali, A., Tsui, S. Normothermic donor heart perfusion: current clinical experience and the future. Transplant International. 28, (6), 634-642 (2015).
  14. Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). Academic Press. 77-108 (2016).
  15. Kearns, M. J., et al. A Rodent Model of Cardiac Donation After Circulatory Death and Novel Biomarkers of Cardiac Viability During Ex vivo Heart Perfusion. Transplantation. 101, (8), e231-e239 (2017).
  16. Sandha, J. K., et al. Steroids Limit Myocardial Edema During Ex vivo Perfusion of Hearts Donated After Circulatory Death. The Annals of Thoracic Surgery. 105, (6), 1763-1770 (2018).
  17. Iyer, A., et al. Increasing the tolerance of DCD hearts to warm ischemia by pharmacological postconditioning. American Journal of Transplantation. 14, (8), 1744-1752 (2014).
  18. Sanz, M. N., et al. Cardioprotective reperfusion strategies differentially affect mitochondria:studies in an isolated rat heart model of donation after circulatory death (DCD). American Journal of Transplantation. (2018).
  19. Van de Wauwer, C., et al. The mode of death in the non-heart-beating donor has an impact on lung graft quality. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 36, (5), 919-926 (2009).
  20. Quader, M., et al. Determination of Optimal Coronary Flow for the Preservation of "Donation after Circulatory Death" in Murine Heart Model. ASAIO journal (American Society for Artificial Internal Organs : 1992). 64, (2), 225-231 (2018).
  21. Priebe, H. J. The acute open-chest model. British Journal Of Anaesthesia. 60, (8 Suppl 1), 38-41 (1988).
  22. Narita, M., et al. Cardiac effects of vecuronium and its interaction with autonomic nervous system in isolated perfused canine hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 19, (6), 1000-1008 (1992).
  23. Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. Lancet (London, England). 385, (9987), 2585-2591 (2015).
  24. Messer, S. J., et al. Functional assessment and transplantation of the donor heart after circulatory death. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35, (12), 1443-1452 (2016).
  25. White, C. W., et al. Assessment of donor heart viability during ex vivo heart perfusion. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, (10), 893-901 (2015).
  26. Mayr, A., et al. Cardiac troponin T and creatine kinase predict mid-term infarct size and left ventricular function after acute myocardial infarction: a cardiac MR study. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 33, (4), 847-854 (2011).
  27. Remppis, A., et al. Intracellular compartmentation of troponin T: release kinetics after global ischemia and calcium paradox in the isolated perfused rat heart. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27, (2), 793-803 (1995).
  28. Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. Characterization of the Langendorff Perfused Isolated Mouse Heart Model of Global Ischemia-Reperfusion Injury: Impact of Ischemia and Reperfusion Length on Infarct Size and LDH Release. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 21, (3), 286-295 (2016).
  29. Dornbierer, M., et al. Early reperfusion hemodynamics predict recovery in rat hearts: a potential approach towards evaluating cardiac grafts from non-heart-beating donors. PloS One. 7, (8), e43642 (2012).
  30. Henry, P. D. Positive staircase effect in the rat heart. The American Journal of Physiology. 228, (2), 360-364 (1975).
  31. Markert, M., et al. Evaluation of a method to correct the contractility index LVdP/dt(max) for changes in heart rate. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66, (2), 98-105 (2012).
  32. Azar, T., Sharp, J., Lawson, D. Heart rates of male and female Sprague-Dawley and spontaneously hypertensive rats housed singly or in groups. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50, (2), 175-184 (2011).
  33. Bonney, S., Hughes, K., Eckle, T. Anesthetic cardioprotection: the role of adenosine. Current Pharmaceutical Design. 20, (36), 5690-5695 (2014).
  34. Ali, A. A., et al. Rat model of veno-arterial extracorporeal membrane oxygenation. Journal of Translational Medicine. 12, 37 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics