Изготовление стадии микроскопа для вертикального наблюдения с функцией контроля температуры

Engineering

Your institution must subscribe to JoVE's Engineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Здесь представлен протокол с использованием контролируемого температурой стадии микроскопа, который позволяет образец контейнера, который будет установлен на вертикальном микроскопе.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Matsukawa, Y., Ide, Y., Umemura, K. Fabrication of Microscope Stage for Vertical Observation with Temperature Control Function. J. Vis. Exp. (149), e59799, doi:10.3791/59799 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Образцы обычно помещаются на горизонтальную стадию микроскопа для микроскопического наблюдения. Однако, чтобы наблюдать влияние гравитации на образец или изучать поведение на плаву, необходимо сделать микроскоп этапом вертикальной. Для этого был разработан боковой перевернутый микроскоп, наклоненный на 90 градусов. Для наблюдения за образцами с помощью этого микроскопа, образцы контейнеров, таких как петри блюда или стеклянные слайды должны быть закреплены на сцене вертикально. Разработано и описано здесь устройство, которое может обеспечить безопасность контейнеров для образцов на месте на этапе вертикального микроскопа. Прикрепление этого устройства к этапу позволяет наблюдать за динамикой образца в вертикальной плоскости. Способность регулировать температуру с помощью силиконового резинового нагревателя также позволяет наблюдать за температурно-зависимым поведением образца. Кроме того, данные о температуре передаются на интернет-сервер. Настройки температуры и мониторинг амортизанов можно управлять удаленно с ПК или смартфона.

Introduction

Оптическая микроскопия является методом, используемым для увеличения наблюдаемых деталей через увеличение образца с линзами и видимым светом. В оптической микроскопии свет направляется на образец, затем передается, отражается или флуоресцентный свет захватывается увеличительными линзами для наблюдения. Различные типы микроскопа доступны, которые отличаются по дизайну для размещения различных применений и методов наблюдения. Различные конструкции включают в себя вертикально микроскоп, который структурирован, чтобы осветить образец снизу для наблюдения сверху, и перевернутый микроскоп, который освещает образец сверху для наблюдения снизу. Вертикально микроскопы являются наиболее распространенными и широко используемыми дизайном. Перевернутые микроскопы часто используются для наблюдения образцов, которые не могут позволить объектив близко на расстоянии от выше, таких как культивированные клетки приверженцев нижней части контейнера. Многие исследовательские группы сообщили наблюдений в широком диапазонеобластей с использованием перевернутых микроскопов 1,2,3,4,5,6,7. Многие дополнительные устройства были также разработаны, которые используют возможности перевернутые микроскопы8,9,10,11,12,13 .

В настоящее время, во всех обычных конструкций микроскопа, микроскоп этап горизонтальной и поэтому не подходит для наблюдения образцов производства движения в вертикальной плоскости, (из-за тяжести, плавучести, движения и т.д.). Для того чтобы эти наблюдения стали возможными, этап микроскопа и световой путь должны быть повернуты в вертикальные. Вертикальная стадия необходима для вертикального крепления стеклянных горок или образцов контейнеров, таких как посуда Петри на сцену. Для решения этой проблемы уже разработан боковой перевернутый микроскоп, наклоненный на 90 градусов. Однако присоединение образцов лентой или другими клеями не дает необходимой долгосрочной неподвижности. Описано здесь устройство, которое может достичь необходимой стабильности. Это устройство позволяет наблюдать за ходом образца в вертикальной плоскости. Установка кремниевого резинового нагревателя также позволила наблюдать влияние изменения температуры на поведение образца. Температурные данные передаются на интернет-сервер с помощью Wi-Fi, а настройки температуры и мониторинг амортизации могут управляться удаленно с ПК или смартфона. Насколько нам известно, этап, прикрепленный к наклонному микроскопу в сторону, наклонен на 90 градусов, еще не сообщалось в предыдущих исследованиях.

Стадия микроскопа состоит из трех алюминиевых пластин. Средняя алюминиевая пластина крепится к нижней алюминиевой пластине, которая крепится к сцене. Силиконовая резина, содержащая датчик температуры, крепится между средними и верхними алюминиевыми пластинами. Резиновые ленты используются для крепления образца. Когти крепятся в левой и правой четырех точках верхней алюминиевой пластины для обеспечения резинки. Схема управления температурным регулятором получает сигнал от датчика температуры, встроенного в силиконовую резину, и модулирует электроэнергию методом модуляции ширины импульса (PWM). Температура может быть постепенно увеличена до 50 градусов с шагом в 1 градус Цельсия. Это устройство полезно для приложений, в которых вертикальные движения образца могут быть зависимы от температуры.

В настоящем докладе приводятся примеры воздействия температуры на плавающее явление диатомовых. В качестве примеров диатомных исследований, измерений скорости осадочных отложений клеточных кластеров, анализа движения, ультратонких исследований структуры и т.д. были зарегистрированы14,15,16,17 , 18 лет , 19 лет , 20 , 21 год , 22 Г. , 23. Специфическая гравитация диатомовых организмов, плавающих в воде с фотосинтетическими организмами, немного выше, чем у воды, поэтому они, как правило, тонут; однако, они будут расти, если даже небольшая конвекция происходит. Для изучения этого явления, стеклянный слайд крепится вертикально к стадии микроскопа, и влияние повышения температуры на диатоме вертикального движения наблюдаются.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Дизайн

  1. Изготовление алюминиевых пластин
    1. Вырежьте 101-мм отверстие в центре алюминиевой пластины размеров 150 мм х 200 мм х 2 мм, которые будут использоваться в качестве передний пластины с лазерной обработки машины. Машинные когти в восьми точках, чтобы прикрепить две резинки по всей длине, или два по всей ширине этой пластины (см. Дополнительная рисунок 1A и дополнительная рисунок 2A).
    2. Вырежьте 130 мм отверстие в центре еще 150 мм х 200 мм х 5 мм алюминиевой пластины, которые будут использоваться в качестве средней верхней пластины с лазерной обработки машины. Машина восемь вырезов для крепления резинки в двух точках по всей длине, или два по всей ширине этой пластины (см. Дополнительная рисунок 1B и дополнительная рисунок 2B).
    3. Вырежьте 130 мм отверстие в центре 150 мм х 200 мм х 4 мм алюминиевой пластины, которые будут использоваться в качестве средней нижней пластины с лазерной обработки машины (см. Дополнительная рисунок 1C и дополнительная рисунок 2C).
    4. Вырезать 30 мм отверстие в центре 150 мм х 200 мм х 1,5 мм алюминиевой пластины, которые будут использоваться в качестве базовой пластины (см. Дополнительная рисунок 1D и дополнительная рисунок 2D).
  2. Изготовление двух алюминиевых пьедестала
    1. Вырежьте 30 мм отверстие в центре алюминиевой пластины (100 мм в диаметре, 3 мм толщина) и сделать выемку с одной стороны с размерами 42 мм в ширину х 30 мм глубиной (см. Дополнительная рисунок 3A).
    2. Вырежьте 30 мм отверстие в центре пластины в алюминиевой пластине (100 мм в диаметре, 4 мм толщина) и просверлить три 3 мм отверстия, расположенные 25 мм от центра, расположенные 120 "друг от друга (см. Дополнительная рисунок 3B).
  3. Изготовление трех прессованного пробкового диска
    1. Вырежьте 20-мм отверстие в центре прессованного пробкового диска (диаметр 100 мм, толщина 2 мм) с помощью водяной режущей машины. Сделайте один разрез 42 мм в поперечнике х 30 мм глубиной, затем один разрез 4 мм в ширину х 5 мм глубиной (см. Дополнительная рисунок 4A).
    2. Вырежьте 20-мм отверстие в центре прессованного пробкового диска диаметром 100 мм, толщиной 1 мм с помощью водяной режущей машины. Сделайте разрез 42 мм в поперечнике х 30 мм глубиной, разрез 4 мм в ширину х 40 мм глубиной (см. Дополнительная рисунок 4B).
    3. Вырежьте прессованную пробковую пластину из диска диаметром 100 мм шириной 42 мм и глубиной 30 мм. Требуются два листа толщиной 1 мм и один лист толщиной 2 мм (см. Дополнительную рис 4С).
  4. Изготовление силиконового резинового нагревателя
    1. Изготовить обогреватель с помощью диска диаметром 100 мм толщиной 2,5 мм кремниевой резины со встроенной проволокой Nichrome и вырезать 20-мм отверстие в центре диска (см. Дополнительная рисунок5).
  5. Соберите части, описанные в шагах 1.1-1.4, укладывая их, как показано на дополнительном рисунке 6.
  6. Для построения стадии микроскопа, обратитесь к дополнительной рисунок 6, поперечное сечение стадии микроскопа. Исправить Equation 1 Equation 2 и, Equation 3 Equation 4 затем и с винтами. Исправить Equation 4 Equation 5 и с винтами. Equation 2 Фиксировать Equation 6 Equation 5 Equation 6 и, Equation 7 Equation 3 Equation 7 и, и, и, Equation 8 и Equation 5 Equation 9 с клеем.

2. Очертания конструкции оборудования

  1. Подготовьте "блок питания и программирование цепи", как показано на дополнительномРисунке 7 . Поставка 12 V DC на контроллер нагревателя от терминала J4, подключенного к адаптеру переменного тока. Снижение напряжения с 12 V DC до 3,3 V DC для питания цепи с помощью регулятора, потому что напряжение питания процессора составляет 3,3 V DC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: USB 1 является терминалом для 5 V DC и серийным сигналом разработки ПК. Хотя 5 V DC не является существенным, он используется в качестве источника питания для программы процессора. Это также преобразуется в 3.3 V DC регулятором. J1 является терминалом сигнала управления во время программирования. Эта схема размещается в случае контроллера показано на дополнительном рисунке 8.
  2. Подготовьте "схему управления теплом", как показано на дополнительнойрисунке 7. Переключитесь на 12 V DC с No 5 (P канал MOS FET) и поставить его на обогреватель. No 5 является коммутационным элементом, который управляет 12 V DC с PWM, чтобы регулировать количество энергии, поставляемой на нагреватель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Схема включает в себя светодиод, чтобы визуально подтвердить, что напряжение поставляется в нагреватель. Этот сигнал привода (HEATER-C) является сигналом PWM от процессора. При обнаружении сигнала перегрева защитной схемой сигнал BREAKER переключается на LOW, и работа MOS-FET прекращается. Эта схема размещается в случае контроллера показано на дополнительном рисунке 8.
  3. Подготовьте "схему разъема для нагревателя", как показано на дополнительнойрисунке 7. Установите разъем USB для подключения к секции нагревателя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта схема размещена в случае контроллера показано в дополнительном Рисунок 8.
  4. Подготовьте "схему разъема для датчика температуры", как показано на дополнительном рисунке 7. Установите разъем (Euroblock сосуд 2P) для подключения датчика температуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта схема размещена в случае контроллера показано в дополнительном Рисунок 8.
  5. Для "A / D преобразователь", как показано на дополнительном Рисунке 7,используйте ADS 1015 в качестве устройства преобразования АД.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство преобразования АД преобразует значения датчика температуры и датчика обнаружения перегрева от напряжения к цифровым значениям. Это 12-разрядный мультиплексер AD преобразование устройства и подключен к процессору с интерфейсом I2C. Эта схема размещается в случае контроллера показано на дополнительном рисунке 8.
  6. Сделайте "защитную схему", как показано на дополнительном рисунке 7, подключив сигнал обнаружения перегрева (OHS) к инвертирующему ввоза усилителя OP. Сравните этот сигнал с напряжением резистора триммера, подключенного к неинвертирующему ввоза.
    1. Убедитесь, что, когда напряжение становится ниже, чем напряжение резистора триммера, выход усилителя OP идет HIGH, подключенный транслистор NPN No 2 поворачивает ON и сигнал BREAKER идет LOW.
    2. Убедитесь, что в то же время, No 4 оказывается ON и подключенный индикатор перегрева LED D6 загорается.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта схема размещена в случае контроллера показано в дополнительном Рисунок 8.
  7. Для "отображения раздел", как показано на дополнительной рисунок 7, используйте 192 х 64 точек для OLED. Подключайтесь к процессору через интерфейс I2C.
    1. Сбросить OLED, отделив GND OLED по сигналу CPU IO0 с помощью транзистора NPN No1, подключенного к GND OLED.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот OLED отображает различные типы информации. Эта схема размещается в случае контроллера показано на дополнительном рисунке 8.
  8. Для "LED и роторный кодер с переключателем нажатия" в дополнительном Рисунок 7, смонтировать роторный кодер припой, который функционирует как переключатель и включает в себя два светодиода.
    1. Подключите один светодиод к VCC для использования в качестве светодиода питания. Другой подключен к процессору для использования в качестве индикатора во время работы нагревателя.
    2. Используйте контакт переключателя нажатия для нагревателя START/STOP, который подключен к процессору. Подключите выходы A и B роторного кодера к вхотворему ввода io в прерывании процессора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта схема размещена в случае контроллера показано в дополнительном Рисунок 8.
  9. Для процессора на дополнительнойрисунке 7, используйте процессор WROOM - 02D.
    1. Выход от IO12, IO13 к "дисплей единицы", потому что интерфейс дисплея i2C стандарт. Подключите IO0 к "отображению" и сбросить OLED.
    2. Подключите IO15 к "блоку управления обогревателем" и управляйте мощностью, поставляемой в нагреватель по выходу PWM.
    3. Подключите IO2 к "LED и роторный кодер с переключателем толчок" и свет START led. Подключите IO4 и IO14 к "LED и роторный кодер с push-переключателем" и получите сигналы (REA и REB) от роторного кодера для определения установленной температуры. Подключите IO5 к "LED и роторный кодер с переключателем нажатия" и запустите/остановите нагреватель.

3. Схема разработки программного обеспечения

  1. Используйте Arduino CORE для WROOM - 02D для процессора в качестве контроллера для этой системы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве входных устройств используется переключатель start/stop, роторный кодер, датчик температуры (термистор). В качестве выходных устройств используются светодиод, дисплей символов (OLED) и обогреватель. Устройство связи использует Wi-Fi.
  2. Описание операции
    1. Обнаружить работу роторного кодера, как показано в светодиодной и роторной кодер с переключателем нажатия на дополнительном рисунке 7, хранить его в качестве установленной температуры, и отобразить его на OLED. Установите вхотовый терминал процессора, к которому подключены фазовые терминалы REA и REB в качестве терминала ввода прерывания, и обработайте вращение (вперед и обратное) вращающегося кодера путем прерывания. Установите его на 1 евро для вращения вперед и -1 для обратного вращения. Напишите установленную температуру на глобальную переменную и используйте ее для контроля температуры нагревателя. В то же время, обновить набор температурный дисплей OLED.
    2. Определите начало и остановку CPU IO 5 по выключателю start/stop (SW-S), как показано на процессоре дополнительной фигуры 7. Состояние переключателя start/stop — это процесс прерывания таймера каждые 50 мс.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку переключатель является сиюминутным переключателем, он меняет состояние старта/стопа, когда он толкается и освобождается. Это состояние хранится в глобальной переменной.
    3. Используйте термистор для датчика температуры. Прочитайте измеренные значения от датчика образца (refer to «схема разъема для соединения обогревателя» в Дополнительном Рисунке 7) в CPU после A/D преобразователя (см. к «преобразователь A/D» в Дополнительном Рисунке7). Поставка тока на обогреватель, включив порт IO15 в "ЦП" Дополнительного Рисунка 7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Есть два типа датчиков температуры. Один из них используется для измерения температуры образца и контроля нагревателя на установленной температуре, а другой крепится к нагревательи и используется для тепловой профилактики. Подключите термист к 3.3 V с помощью резистора и запишите изменение сопротивления как изменение напряжения. Удалите шум методом скользящей средней.
    4. Используйте термистор для датчика температуры профилактики. Обнаружение перегрева выполняется с помощью термистора (R2) ("схема разъема для подключения нагревателя" на дополнительном рисунке 7), и при превышении установленного значения ток нагревателя отключается ("защита цепи" на дополнительной рисунке 7).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот датчик включен в схему, а не через процессор. Этот датчик не зависит от процессора и по сравнению с значением сопротивления, установленным триммером резистора дифференциальным усилителем в аналоговой манере. Когда он обнаруживает, что температура превысила установленное значение, он вмешивается в переключатель FET, который контролирует ток к нагревательу и насильно останавливает текущую подачу. Цель состоит в том, чтобы предотвратить превышение температуры нагревателя определенным уровнем даже в ситуации, когда процессор не работает должным образом.
    5. Включите светодиод в "LED и роторный кодер с переключателем нажатия" дополнительного рисунка 7 по цП (в "ЦП" дополнительной фигуры 7), когда оборудование находится в эксплуатации.
    6. Отображение установленной температуры и измеренного значения OLED в "разделе отображения" Дополнительного рисунка 7 по цП (в "ЦП" Дополнительного Рисунка 7).
    7. Привод переключатель FET в "цепи управления теплом" дополнительного Рисунка 7 с PWM от процессора для управления нагревателем.
    8. Управление нагревателем с помощью PID, на основе измеренных температур, приобретенных датчиком температуры. Используйте библиотеку pid'v1.h Arduino для обработки PID.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процессор калибрует время, общается с сервером, передает данные и получает инструкции от сервера. Когда температура датчика превышает установленную температуру, ток к нагревательу устанавливается до 0, и превышение подавляется.
    9. Используйте встроенную функцию подключения Wi-Fi процессора и подключитесь к Интернету. Передача установить температуру, температуру нагревателя и т.д. на назначенный сервер по Wi-Fi.

4. Конфигурация системы

  1. Построить систему в соответствии с дополнительной рисунок 9.
  2. ОборудуйТе Wi-Fi с помощью контроллера.
  3. Используйте термистор в качестве датчика для измерения температуры. Подключите провод термистора к терминалу "SENSOR" на корпусе контроллера. Получайте температурный сигнал, измеряемый термистом.
  4. Подключите сцену микроскопа, включающую резиновый обогреватель и "HEATER" чехла контроллера, с помощью специального кабеля. Управляйте током к резиновому нагревательу.
  5. Измените установленную температуру с помощью ручки на контроллере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мониторинг журнала температуры, настройка температуры могут управляться удаленно от ПК или смартфона.
  6. Передача измеренной температуры, установленной температуры и временной информации при измерении с контроллера на сервер через Интернет. Время цикла измерения данных составляет 5 с, а время цикла для передачи данных на сервер составляет 1 мин.
  7. Регулярно выходите на сервер со стороны контроллера и перенесите данные измерений, хранящиеся в процессоре контроллера, на сервер для анализа и графика.
  8. Обратитесь к дополнительному материалу о том, как управлять сервером.

5. Дизайн бокового перевернутого микроскопа

  1. Закрепите две алюминиевые пластины толщиной 15 мм вертикально с винтами, чтобы создать базовое крепление.
  2. Прикрепите джиг (одно место) к горизонтальной части базового крепления.
  3. Поместите часть сцены микроскопа вертикально, прикрепите джиги (два места) к вертикальной части базовой подставки и зафиксите нижнюю часть микроскопа к базовой подставке.
  4. Закрепите сцену микроскопа винтами.

6. Метод работы

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, образец используется смесь bold модифицированных базальных пресноводных питательных питательных веществ культуры среды, метасиликат натрия, витамины и стерильной воды. 800 л этого образца разбавляют в 10 мл пресноводной среды.

  1. Метод наблюдения
    1. Введите 1000 л подготовленного образца в самодельную стеклянную камеру.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Самодельная стеклянная камера организует два слайд-очка параллельно и фиксирует их клеем. Нормальная чашка Петри имеет большую толщину и клетки убегают в углубленном направлении в камере, что затрудняет наблюдение с помощью микроскопа. Чтобы предотвратить это, создается камера с небольшим направлением глубины, что позволяет предотвратить побег клеток в углубленном направлении в камере. Низкая температура излечимых эпоксидной смолы клей используется для связи вокруг стекла, чтобы предотвратить образец снижается из камеры.
    2. Прикрепите к микроскопу отдельно подготовленную видеокамеру. Подключите видеокамеру с помощью специального адаптера объектива микроскопа и снимите образец.
    3. Используйте микроскоп с 10-x окуляром и 200-x целью.
    4. Прикрепите сцену вертикального микроскопа к микроскопу в четырех местах с 4-мм винтами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ссылка на дополнительную рисовку 1A и дополнительную рисунок 2A для дизайна чертежей алюминиевых пластин. В этом эксперименте был использован перевернутый микроскоп. Это было наклонено на 90 ", и изготовленный микроскоп этапбыл был прикреплен с винтами. Ссылка на рисунок 1.
    5. Закрепите образец двумя резинками, используя четыре когти, сделанные вдоль. Поместите образец на стадии микроскопа перпендикулярно поверхности земли.
    6. Установите температуру до 40 градусов по Цельсию с контроллером, показанным на дополнительном рисунке 8. Поверните ручку контроллера, чтобы установить температуру. Проверьте температуру набора на дисплее. Нажмите ручку, чтобы начать контроль температуры, и синий светодиод загорится. Нажмите ручку еще раз, чтобы выключить светодиод и остановить контроль температуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измеренная температура отображается в режиме реального времени, и нагреватель контролируется, чтобы достичь установленной температуры. Когда начинается контроль температуры, синий светодиод загорается и остается таковым во время работы нагревателя. Когда обогреватель перегревается, красные светодиодные фонари и нагреватель автоматически останавливаются.
    7. В дополнительной информации для работы сервера обратитесь к "Руководству по работе с сервером".
      ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется сервер для хранения данных. База данных сервера использует My-S'L.

7. Измерение распределения температуры поверхности резиновым обогревателем

  1. Измерьте распределение температуры поверхности резиновых нагревателей термографией для проверки равномерности температуры.
  2. Прикрепите сцену микроскопа, который включал резиновый обогреватель с подставкой.
  3. Измените температуру установки поверхности резинового обогревателя до 35 градусов по Цельсию, 45 градусов по Цельсию, 55 градусов по Цельсию и 65 градусов по Цельсию, и измерьте термографией спереди (обратитесь к дополнительной рисунку 10).

8. Тест реакции температуры

  1. Начните контроль температуры, установив установленную температуру образца до 30 градусов по Цельсию. Подождите, пока значение измерения достигнет 30 градусов по Цельсию и стабилизируется. Увеличьте предустановленную температуру поэтапно на 5 градусов по Цельсию от 30 градусов по Цельсию до 50 градусов по Цельсию и подождите, пока измеренное значение стабилизируется после соответствующей предустановленной температуры.
  2. Снижение заданных температур поэтапно на 5 градусов по Цельсию от 50 градусов по Цельсию до 30 градусов по Цельсию и обнаружить способность отслеживания измеренного значения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 2 показано распределение температуры резинового нагревателя. Температура поверхности резинового нагревателя была равномерной при каждой температуре. На рисунке 3 показана отзывчивость измеренной температуры для установки изменений температуры. Оранжевая линия показывает установленную температуру, а синяя линия показывает изменение температуры образца. Превышение измеренного значения для изменения настройки невелико, а отслеживание происходит быстро.

Diatom клетки были замечены, чтобы обеспечить конкретный пример использования этого устройства. Анализ траектории движущихся диатомовых клеток является полезным подходом к оценке подвижности диатомовых клеток. Однако, хотя нормальный перевернутый микроскоп наблюдает образец горизонтально, он не подходит для наблюдения за воздействием гравитации или плавающим движением в вертикальном направлении.

В этом эксперименте, этап микроскопа с регулятором температуры был прикреплен к перевернутому микроскопу, который был повернут 90 ". Успешно зафиксировали температурно-зависимое вертикальное движение диатомовых диатомов. С помощью этого метода, локус вертикального движения диатомовых был обнаружен, как показано на рисунке 4. В результате наблюдения у 100 человек диатомовых, средняя скорость составила 7,01 мкм/с при комнатной температуре и 470,1 м/с при температуре 40 градусов по Цельсию. Влияние тепловой конвекции на вертикальное плавающее явление диатомовых клеток было визуализировано путем прямого наблюдения.

Figure 1
Рисунок 1: Фотография устройства, прикрепленного к стадии микроскопа. Внешний вид устройства крепится к стадии микроскопа. Устройство крепится к стадии микроскопа четырьмя винтами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Распределение температуры резинового нагревателя. Распределение резинового нагревателя, измеряемого термографией. Температура нагревателя была изменена поэтапно с температуры окружающей среды до 35 градусов по Цельсию, 45 градусов по Цельсию, 55 градусов по Цельсию и 65 градусов по Цельсию. Температура равномерно распределялась по обогреватель при каждой температуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Ответственность температурного сигнала. Это показывает реакцию, когда установленная температура повышается с 30 градусов по Цельсию до 50 градусов по Цельсию и понижается с 50 градусов по Цельсию до 30 градусов по Цельсию. Установленная температура изменялась с шагом в 5 градусов по Цельсию. В стабильном состоянии измеренная температура находится в пределах 1,5 градусов по Цельсию от установленного значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Локус диатомного движения. Установлены вертикальные траектории движения диатомы из-за изменений температуры. Синие линии показывают траектории диатомовых клеток на 25 градусов по Цельсию для 27,06 с и на 40 градусов по Цельсию за 0,2 с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 1
Дополнительная рисунок 1: Дизайн рисунок алюминиевых пластин (с размерами). (A) Пластина 2 мм толщиной х 150 мм в ширину х 200 мм в длину, с по центром 101 мм диаметр отверстия, чтобы вставить резиновый обогреватель. Каждая кромка пластины имеет два machined когти, к которым резинки могут быть прикреплены к безопасным образцам на сцену. Чтобы прикрепить эту вертикальную стадию к микроскопу с 4-мм винтами, 4,2-мм винтовые отверстия просверливаются в четырех местах, симметрично окружающих центральное отверстие. (B) Пластина толщиной 5 мм х 150 мм в ширину х 200 мм в длину, с по центром 130 мм диаметр отверстия. Машинный вырез места, чтобы соответствовать когти местах на переднем плане, чтобы позволить вложение образца обеспечения резинки по всей сцене. Для крепления сцены к микроскопу, четыре 4,2 мм винт отверстия пробурены в соответствующих местах для тех, кто в переднем пластине. (C) Пластина 4 мм толщиной х 150 мм в ширину х 200 мм в длину, с по центром 130 мм диаметр отверстия. 30-мм пролет вырезан из центра правой 200-мм грани пластины, на глубину центрального отверстия. Эта цель выреза заключается в том, чтобы позволить крепление разъема нагревателя на правой стороне. В тех же положениях, что и в переднем плане, для крепления сцены к микроскопу просверливаются четыре винтовых отверстия калибра 4,2 мм. (D) Пластина 1,5 мм толщиной х 150 мм в ширину х 200 мм в длину, с центральным отверстием диаметром 30 мм. В тех же положениях, что и в переднем плане, для крепления сцены к микроскопу просверливаются четыре винтовых отверстия калибра 4,2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Дополнительная рисунок 2: Дизайн рисунок алюминиевых пластин (без размеров). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Дополнительная рисунок 3: Дизайн рисунок алюминиевых пьедеев. (A) Для установки на верхней стороне: диаметр 100 мм, толщина 3 мм. В центре просверливается отверстие диаметром 30 мм, а с одной стороны сделан вырез шириной 42 мм и глубиной 30 мм. (B) Устанавливается на нижней стороне: диаметр 100 мм, толщина 4 мм. Отверстие диаметром 30 мм просверливается в центре, и три отверстия 3 мм были помещены на 120 "друг к другу на расстоянии 25 мм от центра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Дополнительная рисунок 4: Дизайн чертежа прессованных пробковых дисков. ()Для установки на верхней стороне между кремниевым резиновым обогревателем и верхним алюминиевым пьедесталем: диаметр 100 мм, толщина 2 мм. В центре просверливается отверстие диаметром 20 мм, а в стороны диска с прямым углом делаются два разреза (ширина 42 мм х 30 мм, ширина 4 мм х 40 мм). (B) Устанавливается на нижней стороне между кремниевым резиновым обогревателем и нижним алюминиевым пьедесталем: диаметр 100 мм, толщина 1 мм. В центре просверливается отверстие диаметром 20 мм. (C) Эта поддержка 42 мм в ширину и 30 мм глубиной, и вырезать из окружности диска диаметром 100 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Дополнительная рисунок 5: Спецификация силиконового резинового нагревателя. Диаметр 100 мм, толщина - 2,5 мм. В центре просверливается отверстие диаметром 20 мм. Мощность питания 12 В, с 18 Вт грузоподъемности. Обогреватель состоит из провода Nichrome, с свинцовой проволокой, подключенной к электроду. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Дополнительная рисунок 6: Поперечное сечение стадии микроскопа. Это секционный вид стадии микроскопа. Алюминиевый пьедестал крепится к задней алюминиевой пластине, а резиновый обогреватель устанавливается на внешней поверхности. Прессованный пробка устанавливается для изоляции между резиновым обогревателем и алюминиевым пьедесталем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Дополнительная диаграмма 7: Подробная информация о схеме цепи. Это указывает на схему, встроенную в контроллер. Схема цепи разделена на девять частей в соответствии с отдельными функциями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 8
Дополнительная рисунок 8: Дизайн чертеж пластикового чехла контроллера. Размеры 143,9 мм длина х 85,3 мм глубина х 25 мм шириной. Ручка установки температуры, рабочая/перегревная лампа, и индикатор расположены на корпусе пластикового контроллера. Температура может быть установлена при просмотре индикатора, повернув установленную ручку. Нажатие этой ручки запускает регулятор температуры. Измеренная температура отображается в режиме реального времени, и нагреватель контролируется таким образом, чтобы он достиг и удерживает установленную температуру. Когда регулятор температуры включен, синий светодиод загорается и остается освещенным во время работы нагревателя. Когда обогреватель перегревается, красный светодиод включается и нагреватель автоматически останавливается. Нажатие ручки контроллера температуры снова остановит его. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 9
Дополнительная рисунок 9: Конфигурация системы. Стадия микроскопа с включенным контроллером соединена с резиновым нагревателем со специальным кабелем. Измеренные сигналы температуры образца получены, и ток к резиновому нагревательпередает передается контроллером. Измеренные сигналы от контроллера отправляются по беспроводной связи на сервер через интернет-маршрутизатор. Сервер компилирует данные измерений для анализа и графики. Мониторинг температурного журнала и настройки температуры можно управлять удаленно с помощью ПК или смартфона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 10
Дополнительная диаграмма 10: Измерение распределения температуры термографией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Анализ траектории движущихся диатомовых клеток является полезным подходом к оценке подвижности диатома. Однако, в то время как нормальный перевернутый микроскоп наблюдает образцы горизонтально, он не подходит для наблюдений за воздействием гравитации или плавающим движением в вертикальном направлении. Разработанная и описанная здесь стадия вертикального микроскопа с контролем температуры и прикрепленная к перевернутому микроскопу, который был повернут на 90 градусов. Эта стадия микроскопа с температурным контролем позволяет наблюдать температурно-зависимое вертикальное движение диатомных клеток.

Важным шагом в протоколе является конструкция схемы контроллера. Для обеспечения безопасности была реализована схема выключателя. Когда датчик отключен от образца или микроконтроллер не работает должным образом, ток к нагреватель отрезан схеме, отличающуюся от микроконтроллера.

Поскольку система управления приняла систему PID для управления током нагревателя, требуется метод икатер для поиска оптимального параметра PID. По сравнению с существующим методом удаленная работа и мониторинг возможны благодаря функции Wi-Fi, сбору данных на сервере и функции настройки температуры. Поскольку структура сценической части, прикрепленной к микроскопу, сложна, упрощение этой структуры требует дальнейшего исследования.

Это оборудование использует обогреватель для повышения температуры, но охлаждение не работает; поэтому установленная температура не может быть ниже комнатной температуры. Для охлаждения образцов до температуры ниже комнатной потребуются сложные охлаждающие устройства, которые рассматриваются для будущих работ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликтов, чтобы раскрыть.

Acknowledgments

Авторы не имеют подтверждений.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AC adapter 12V2A Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. AD-D120P200 Tokyo, Japan
ADS1015 Substrate Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. adafruit PRODUCT ID: 1083 Tokyo, Japan
Alminium Plate (Back Side Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 1.5mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Forefront Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 2mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Middle Lower Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 4mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Middle Upper Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 5mm Gifu, Japan
Aluminum Pedestal (Lower Plate) Inoval Co., Ltd. D 100mm×T 3mm (30Φ) Gifu, Japan
Aluminum Pedestal (Upper Plate) Inoval Co., Ltd. D 100mm×T 3mm (30Φ) Gifu, Japan
Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution Sigma-Aldrich Co. LLC B5282-500ML St. Louis, USA
Controller Case Marutsu Elec Co., Ltd. pff-13-3-9 Tokyo, Japan
CPU Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. ESP-WROOM-02D Tokyo, Japan
Inverted microscope Olympus Corporation CKX 53 Tokyo, Japan
Low temperature hardening epoxy resin adhesive ThreeBond Co., Ltd. TB2086M Tokyo, Japan
Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. 3296W-1-501LF Tokyo, Japan
OLED module Akihabara Inc. M096P4W Tokyo, Japan
Pressed Cork (For supporting electrode ) Tera Co., Ltd. W 42mm×L 30? Ishikawa, Japan
Pressed Cork (Lower Disk) Tera Co., Ltd. D 100mm×T 0.5mm (20Φ) Ishikawa, Japan
Pressed Cork (Upper Disk) Tera Co., Ltd. D 100mm×T 2.5mm (20Φ) Ishikawa, Japan
Rotary encoder with switch with 2 color LED Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. P-05772 Tokyo, Japan
Silicone rubber heater Three High Co., Ltd. D 100mm×T 2.5mm (20Φ) Kanagawa, Japan
Substrate Seeed Technology Co., Ltd. mh5.0 Shenzhen, China
Temperature sensor Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. NXFT15XH103FA2B050 Tokyo, Japan
Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V Marutsu Elec Co., Ltd. BR301 Tokyo, Japan
Universal Flexible Arm Banggood Technology Co., Ltd. YP-003-2 Hong Kong, China
USB cable USB-A - MicroUSB Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. USB CABLE A-MICROB Tokyo, Japan
Video Canera Sony Corporation HDR-CX590 Tokyo, Japan

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drum, R. W. Electron Microscope Observations of Diatos. Osterreichische Botanische Zeitschrift. 116, 321 (1969).
  2. McBride, T. P. Preparing Random Distributions of Datom Values on Microscope Slides. Limnology and Oceangraphy. 33, 1627-1629 (1988).
  3. Liu, X. Y., Lu, Z., Sun, Y. Orientation Control of Biological Cells Under Inverted Microscopy. IEEE-ASME Transactions on Mechatronics. 16, 918-924 (2011).
  4. Kahle, J., et al. Applications of a Compact, Easy-to-Use Inverted Fluorescence Microscope. American Laboratory. 43, 11-14 (2011).
  5. Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. 114-120 (2016).
  6. Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 10 (2017).
  7. Hedde, P. N., Malacrida, L., Ahrar, S., Siryaporn, A., Gratton, E. sideSPIM - selective plane illumination based on a conventional inverted microscope. Biomedical Optics Express. 8, 3918-3937 (2017).
  8. Crowe, W. E., Wills, N. K. A simple Method for Monitoring Changes in Cell Height using Fluorescent Microbeads and an Ussing-type Chamber for the Inverted Microscope. Pflugers Archiv-Europian journal of Physiology. 349-357 (1991).
  9. Bavister, B. D. A Minichamber Device for Maintaining a Constant Carbon-Dioxide in Air Atmosphere during Prolonged Culture of Cells on the Stage of an Inverted Microscope. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 24, 759-763 (1988).
  10. Makler, A. A New version of the 10-MU-M Chamber and its use for Semen Analysis with Inverted Microscope. Archives of Andrology. 13, 195-197 (1984).
  11. Xu, Z., et al. Flexible microassembly methods for micro/nanofluidic chips with an inverted microscope. Microelectronic Engineering. 97, 1-7 (2012).
  12. Datyner, N. B., Gintant, G. A., Cohen, I. S. Versatile Temperature Controlled Tissue Bath for Studies of Isolated Cells using an Inverted Microscope. Pflugers Archive- Europian Journal of Physiology. 403, 318-323 (1985).
  13. Claudet, C., Bednar, J. Magneto-optical tweezers built around an inverted microscope. Applied Optics. 44, 3454-3457 (2005).
  14. Yamaoka, N., Suetomo, Y., Yoshihisa, T., Sonobe, S. Motion analysis and ultrastructural study of a colonial diatom, Bacillaria paxillifer. Microscopy. 65, 211-221 (2016).
  15. Apoya-Horton, M. D., Yin, L., Underwood, G. J. C., Gretz, M. R. Movement modalities and responses to environmental changes of the mudflat diatom Cylindrotheca closterium (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 42, 379-390 (2006).
  16. Bannon, C. C., Campbell, D. A. Sinking towards destiny: High throughput measurement of phytoplankton sinking rates through time-resolved fluorescence plate spectroscopy. PLoS One. 12, 16 (2017).
  17. Clarkson, N., Davies, M. S., Dixey, R. Diatom motility and low frequency electromagnetic fields - A new technique in the search for independent replication of results. Bioelectromagnetics. 20, 94-100 (1999).
  18. Iwasa, K., Shimizu, A. Motility of Diatom, Phaeodactylum-Tricornutum. Experimental Cell Research. 74, (1972).
  19. Edgar, L. A. Mucilage Secretions of Moving Diatoms. Protoplasma. 118, 44-48 (1983).
  20. Edgar, L. A. Diatom Locomotion. Computer-Assisted Analysis of Cine Film British Phycological Journal. 14, 83-101 (1979).
  21. Iversen, M. H., Ploug, H. Temperature effects on carbon-specific respiration rate and sinking velocity of diatom aggregates - potential implications for deep ocean export processes. Biogeosciences. 10, 4073-4085 (2013).
  22. Riebesell, U. Comparison of Sinking and Sedimentation-Rate Measurements in a Diatom Winter Spring Bloom. Marine Ecology Progress Series. 54, 109-119 (1989).
  23. Drum, R. W., Hopkins, J. T. Diatom Locomotion - An Explanation. Protoplasma. 62, (1966).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics