Låg kostnad gånganalys för beteendemässig fenotypning av musmodeller av neuromuskulär sjukdom

Behavior

Your institution must subscribe to JoVE's Behavior section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Footprint analys är en låg kostnad alternativ till digitaliserade gånganalys program för forskare kvantifiera rörelse avvikelser hos möss. På grund av sin snabbhet, enkelhet och longitudinella potential, är det idealiskt för beteendemässig fenotypning av musmodeller.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Wertman, V., Gromova, A., La Spada, A. R., Cortes, C. J. Low-Cost Gait Analysis for Behavioral Phenotyping of Mouse Models of Neuromuscular Disease. J. Vis. Exp. (149), e59878, doi:10.3791/59878 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mätning av Animal Locomotion är ett vanligt beteende verktyg som används för att beskriva fenotyp av en viss sjukdom, skada, eller läkemedels modell. Den låg kostnad metod för gånganalys visat här är ett enkelt men effektivt mått på gång avvikelser i murina modeller. Fotavtryck analyseras genom att måla en mus fötter med giftfri tvättbar färg och låta motivet att gå igenom en tunnel på ett pappersark. Utformningen av test tunneln utnyttjar naturliga mus beteenden och deras affinitet för små mörka platser. Steglängd, steg bredd och tå spridning av varje mus är lätt mätas med hjälp av en linjal och en penna. Detta är en väletablerad och tillförlitlig metod, och det genererar flera mått som är analoga med digitala system. Detta tillvägagångssätt är känsligt nog för att upptäcka förändringar i steg tidigt i fenotyp presentation, och på grund av dess icke-invasiva tillvägagångssätt, det gör det möjligt för testning av grupper över livslängd eller fenotypisk presentation.

Introduction

Förflyttning kräver komplexa neurologiska och muskuloskeletala koordination, och underskott i en enda aspekt av motoriska vägar kan producera observerbara gång avvikelser1,2. Gånganalys är ett kritiskt verktyg för forskare som testar musmodeller eftersom det ger kvantifierbara beteendemässiga data om hur en viss sjukdom, skada eller drog påverkar ett djurs rörelse3. Men digitaliserad gånganalys kräver köp av ett löpband, en kamera och tillhörande programvara, vilket kan vara oöverkomligt dyrt för forskare. Gånganalys används ofta intermittent för att spåra longitudinella förändringar i motorisk funktion, därav kan det vara svårt att motivera utgifterna om sporadiskt används4. Även om digitaliserade analyser kan ge mer detaljerade gång mätvärden än enkel fotavtryck analys, dessa mer komplexa åtgärder är inte alltid nödvändigt eller relevant för karakterisering av en beteendemässig fenotyp5.

Här presenterar vi en låg kostnad manuell footprint analysmetod som ett snabbt och känsligt alternativ till digitaliserade gånganalys program6,7. Manuell fotavtryck analys har visat sig upptäcka betydande gång skillnader i en mängd murina sjukdomsmodeller4,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16,17och i minst ett fall identifierade denna lågkostnads metodförändringar i gång som upptäcktes inte av en gemensam digitaliserad gånganalys program12. Den totala kostnaden för material är nominell, och den kan enkelt anpassas till andra gnagare forskningsmodeller.

Även om det finns många olika gång mätvärden från vilka data kan ritas, den metod vi beskriver fokuserar på tre specifika mätvärden: steglängd, steg bredd (alias "spårbredd"), och tå sprids. Det är viktigt att notera att de parametrar som ska bedömas bör bestämmas enligt modell för modell. Denna metod för gånganalys är inte avsedd att mäta kognitiv funktion, och det rekommenderas inte för studier som kräver komplexa biomekaniska mätningar av gång16.

Vi presenterar beteendemässiga data från en kohort av pre-och post-symptomatiska möss modellering X-länkade spinal och bulbar muskelatrofi (SBMA), en neuromuskulär sjukdom som kännetecknas av motor neuron degeneration och muskelatrofi. Dessa möss utvecklar progressiva underskott i gång som sammanfaller med uppkomsten av andra sjukdomsspecifika fenotyper. Detta visar metodens giltighet och specificitet och bekräftar att den på ett tillförlitligt sätt kan diskriminera drabbade och icke-drabbade djur.

De experimentella möss i denna studie var 2,5 (pre-symptomatisk) och 9-månaders-gammal (post-symptomatisk) BAC fxAR121 transgena möss på en C57BL/6 bakgrund (nexpt= 12). Denna modell har genererats i vårt labb och har blivit fullt karaktäriserad som en kraftfull musmodell av SBMA9. Icke-transgena littermates användes som kontroller (nCTRL= 8). SBMA är en sex-begränsad sjukdom som helt manifesteras i hanar bara, så manliga möss användes uteslutande för denna studie. Under planeringsstadiet måste forskarna ta hänsyn till de nationella hälso instituten som en biologisk variabel för att bestämma gruppstorlek och sammansättning18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla tester som utfördes med möss granskades och godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av Duke University. Personal som ansvarar för testning och poängsättning måste vara blind för djur genotyp eller försöks tillstånd tills gånganalys och bedömning av papper har slutförts för hela kohort.

1. beredning av provningsmaterial

  1. Genomföra tester med en tunnel byggd av 3 pre-cut klar akryl paneler som är 0,375 inches tjock. Montera tunneln genom limning paneler tillsammans med ett tätningsmedel som specifikt obligationer akryl och kommer inte att avge lukter när de torkas.
    1. För standardmöss med C57BL/6, Använd följande tunnel mätningar: 2,5 i. wide, 3 in. hög och 13 in. Long. Möss måste kunna bekvämt gå igenom tunneln och ta tillräckligt med steg (> 4) så att gång kan mätas.
  2. Konstruera mål kammaren med pre-cut grå akryl paneler 0,375 inches tjock, limmas ihop med samma tätningsmedel som används på tunneln. Interiören mätningar av kammaren är 4 i. bred, 4 i. lång, och 3 i. tall. Matcha öppnandet av denna kammare till öppnandet av tunneln (2,5 i. bred x 3,0 in. tall). Eftersom möss naturligt föredrar mörkare utrymmen till väl upplysta utrymmen, använda material som är ogenomskinlig och mörk i färg.
  3. Använd papper för att spåra steg som är tjocka och släta (akvarellpapper fungerar bra). Skär enskilda papper remsor vara något bredare och längre än bredden och längden på tunneln. Om du använder de tunnel dimensioner som beskrivs här, klippa papper till 15 i. lång med 3,5 i. wide.
  4. Använd två kontrasterande färger (t. ex., grönt och lila) av giftfri tvättbar vattenbaserad färg. Tilldela en färg för Hind-extremiteter, den andra för armar och ben. Möss kommer att slicka den återstående färgen från fötterna efter provningen, så den valda färgen måste vara helt giftfri.
  5. Använd två runda fat penslar, en för varje färg färg (~ 0,5 cm i diameter, avsmalnande/spetsiga borste spets).
  6. Välj en linjal med markeringar ner till millimeter, och en bromslist med mätningar ner till 0,1 mm. penna rekommenderas att skriva på scoring papper.
  7. Valfritt: för djur med hög ångest eller låg motivation, ge en beteendemässig incitament i mål kammaren. Detta kan inkludera små mängder av steriliserade solrosfrön (placeras i hem buren 2 dagar före provningen för att möjliggöra habituation). På dagen för testning, placera solrosfrön inne i mål kammaren för att uppmuntra möss att gå igenom utan att stanna.

2. insamling av uppgifter

  1. Om provningen utförs i ett separat rum, anpassa sig mössen till det nya rummet i 30 minuter och sedan starta beteende analyserna. Dessutom, eftersom möss är naturligt nattliga, se till att alla möss är helt vaken och alert i minst 5 minuter innan testning.
  2. Förbered testkonfigurationen genom att placera tunneln över papperet och markera papperet med mus-ID och testdatum. Placera mål kammaren i slutet av tunneln och Anslut båda de öppna ändarna. Tillsätt solrosfrön i slutet av tunneln (inne i mål kammaren) för motivation om det behövs.
  3. Ta bort musen för att testas från sin bur och greppa den stadigt genom sin Scruff, se till att greppa svansen för att stabilisera rörligheten för dess bakbenen.
  4. Måla framtassarna så hela undersidan av alla tår och mitten av foten är helt täckt av färg. Upprepa detta med en kontrasterande färg av färg på dess bakben tassar. Torka av alla färger som musen får på andra delar av kroppen med en ren fuktig trasa för att förhindra fläckar som kan störa datainsamlingen.
    Obs: Mushantering måste utföras av erfarna forskare för att minimera djurens stress.
  5. Placera musen i början av tunneln och låt den gå hela vägen in i mål kammaren, och sedan hämta musen, försiktigt torka av fötterna med en vattendämpad trasa, och returnera den till sin hem bur.
  6. Låt papper med fotavtryck torka helt innan scoring. Torka av provningsområdet och tunneln med etanol eller en likvärdig rengöringslösning mellan varje djur.

3. bedömningskriterier

  1. Använd steg som är konsekvent placerade med tydliga, icke-fläckiga fotavtryck för poängsättningen. Figur 1b är ett bra exempel på ett footprint sekvens som kan poängsättas. För att generera tillräckligt poängsättnings data måste det finnas minst 2 på varandra följande steg från varje fot, men 4-6 steg per fot rekommenderas. Ta inte med den första och sista fotavtryck på papperet, eftersom de är osannolikt att representera normal gång eftersom musen ändrar sin gånghastighet.
  2. Använd steglängd, steg bredd och tå sprids som tre olika mått på gång som kan analyseras med denna metod.
    Anmärkning: steglängd och bredd kräver tydliga sekventiella utskrifter där framfoten regionen är väl definierad i Paint. Toe spread kräver inte sekventiella utskrifter för scoring, bara tydliga utskrifter av den första och sista tårna på en enda fot. Men om ett visst fotavtryck inte ingår i mätningar av steglängd eller bredd, kan det inte göras för tå spridning. Alla tre måtten bedöms i centimeter.
    1. Definiera steglängd som avståndet mellan två sekventiella fotavtryck som skapats av samma fot (dvs. en steg) (figur 1A, 1b).
      1. Med en penna, rita en 2-4 mm cirkel runt framfoten regionen av både forelimb Footprints (identifieras genom tilldelad färg ovan) i en enda steg och dra en linje mellan dem med hjälp av en linjal.
      2. Spela in avståndet mellan två utskrifter från mitten av varje cirkel (dvs. mitten av varje fotdyna) som höger-fore 1 (RF1) eller Left-fore 1 (LF1).
      3. Upprepa för alla steg som kan poängsättas (RF2, LF2, RF3, LF3 och så vidare).
      4. Upprepa för höger och vänster Hind-lem fotavtryck.
      5. Genomsnittlig alla individuella inspelade steg avstånd för varje lem. För statistisk analys kan enskilda kohort medlemmar beräknas tillsammans.
    2. Definiera steg bredd som mått på avståndet mellan vänster och höger frambenen eller bakbenen (figur 1A, 1b).
      1. För att bedöma detta avstånd, rita och mäta en linje från den cirklade framfoten regionen av en Hind-lem som korsar vinkelrätt med linjen för steglängd på kontralaterala Hind-lem.
      2. Upprepa detta för alla bakben utskrifter som kan poängsättas, och sedan genomsnittet måtten. Beräkningsmetoden för steg bredd är densamma för för-och bakbenen.
    3. Definiera tåspridningen som avståndet mellan första och sista tårna på en enda framände-eller Hind-lem fotavtryck (figur 1a, 1b).
      1. Använd bromsok för att mäta avståndet mellan spetsen på första tåtrycket och spetsen på den sista tån utskriften.
      2. Upprepa för alla Hind-Limb utskrifter som kan poängsättas och genomsnittliga mätningarna. Beräkningsmetoden för tåspridning är densamma för för-och bakbenen.
  3. Om papperet inte kan poängsätts, låt djuret vila i 10 minuter innan du försöker igen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med tillräckligt antal djur, detta förfarande kan upptäcka gång skillnader mellan mus genotyper, inom samma stam över tiden. Figur 1b visar representativa spår av avtryck bilder som samlats i vårt labb, med hjälp av en musmodell av X-länkade spinal och bulbar muskelatrofi (SBMA), en neurodegenerativ störning som drabbar lägre motoriska nervceller och skelett muskler. Vi har tidigare rapporterat att manliga BAC fxAR121 transgena möss utveckla betydande viktminskning, nedskrivningar i Grip styrka, och förkortad steglängd vid post-symptomatiska åldrar jämfört med icke-transgena littermate kontroller9.

Här presenterar vi gånganalys resultat från en kohort av pre-symptomatiska (2,5 månaders ålder) och post-symptomatiska (9 månaders ålder) BAC fxAR121 transgena och littermate kontroll manliga möss (figur 2). Före sjukdomsdebut, BAC fxAR121 transgena möss visar liknande steglängd, steg bredd, och tå sprids jämfört med deras littermate icke-transgena kontroller. Efter sjukdomsdebut visar BAC fxAR121 transgena möss signifikant kortare steglängd (pforelimb= 0,001, pHind-lem= 0,009) (figur 2A). Liknande longitudinella analyser visade inga skillnader i stegbredden vid endera ålder som testades (p2.5 månader= 0,709, p9 månader= 0,204) (figur 2b). Post-symptomatiska BAC fxAR121 transgena möss har också betydligt smalare Hind tå spridning (p = 0,01) än åldersmatchade littermate kontroller (figur 2C). BAC fxAR121 möss modell en neuromuskulär sjukdom som främst drabbar bakbenen, så detaljerade åtgärder av forelimb gång inte samlades in. Vi uppmuntrar forskare som använder denna gånganalys metod att överväga fenotyp av deras musmodeller och välja forelimb eller Hind-lem gång mätvärden därefter.

Figure 1
Bild 1: gånganalys åtgärder och felsökning.
A. schematisk representation av gånganalys på möss, skildrar steglängd, steg bredd, och tå sprida information. B. representativt exempel på en gånganalys fotavtryck sekvens som kan poängsättas, föreställande mätning av alla tre parametrar. C. representativa exempel på problematiska gånganalys footprint sekvenser som inte kan poängsättas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: SBMA BAC fxAR121 transgena möss uppvisar en progressiv, neurodegenerativ gång fenotyp som kan upptäckas via gånganalys.
A. Trots inga skillnader vid pre-symptomatiska åldrar (2,5 månader, nCTL= 11, nexpt= 12), BAC fxAR121 möss utveckla signifikant minskad steglängd jämfört med deras icke-transgena littermate kontroller vid post-symptomatiska stadier (9 månader, nCTL= 8, nexpt= 12). B. inga förändringar upptäcktes i stegbredden vid någon ålder. C. SYMPTOMATISK SBMA BAC fxAR121 transgena möss visar signifikant minskad Hind lem tå sprids jämfört med icke-transgena littermate kontroller. N = 8-12/grupp. ANOVA med post-hoc Tukey test * p < 0,05, * * p < 0,01. Felstaplar representerar SEM. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Med hjälp av låg-kostnad gånganalys metod som beskrivs ovan, visar vi framgångsrik identifiering av flera parametrar för gång dysfunktion vid post-symptomatiska åldrar i BAC fxAR121 musmodell av SBMA. Minskningar i steglängd är förenliga med tidigare SBMA studier av musmodeller och mänskliga patienter9. Vi visar också för första gången att det finns betydande skillnader i Hind-lem tå sprids i symtomatisk SBMA möss jämfört med icke-transgena littermate kontroller. Intressant, minskningar Hind tå sprider kan orsakas av svaghet i Paw extensor muskler, täthet i Paw flexor muskler, eller dålig nerv innervation2,19, vilket också är förenligt med etiologi av SBMA.

Mössen bör lätt köra till mål kammaren på grund av deras naturliga beteendemässiga preferens för små mörka utrymmen, men vissa möss kan inte kontinuerligt röra sig genom tunneln. Om en mus hoppar, stannar eller svänger runt i tunneln (se exempel i figur 1c) upprepar du analysen efter en viloperiod på ett nytt poängsättnings papper. Resultaten kan vara salvageable om en mus stannar i början av tunneln eftersom det ofta kan försiktigt stack till att köra till målet rutan.

Tillämpa för mycket eller för lite färg till en mus fötter kan producera oanvändbara resultat. Överflödig färg kan leda till suddig eller förvrängd utskrifter, medan otillräcklig färg kan producera svaga eller oidentifierbart tryck (figur 1c). I båda fallen upprepar du analysen på ett rent bedömnings papper för att förhindra felaktiga mätningar.

Mycket unga möss (< 3 månader gamla) är mer benägna att hoppa framåt i tunneln, medan äldre (> 8 månader gamla) eller mycket fenotypiska möss är mer benägna att stoppa eller motstå framåtrörelse helt. Lägga till en beteendemässig stimulans (solrosfrön) i mål kammaren kan bidra till att minska frekvensen av problematiska beteenden genom att uppmuntra omotiverade möss att korsa tunneln utan att stanna.

Tunnelns dimensioner bör återspegla ämnes dimensionerna. Om du använder möss som är betydligt större eller mindre än en genomsnittlig labb mus (på grund av ålder, diet eller genetiska mutationer) rekommenderar vi att du ändrar tunnel-och mål kammarens dimensioner så att de matchar djurets storlek. I tunneln bör möss kunna gå bekvämt i en rak linje, men bör ha vissa svårigheter att vrida runt för att avskräcka detta beteende. Mål kammaren bör matcha höjden på tunneln och möss bör passa bekvämt inne i kammaren.

Forskare som använder tån-klippning identifieringsmetod för sina möss kanske inte kan samla in data på tå sprids, men andra åtgärder av gång som steglängd och steg bredd kan fortfarande samlas in. Toe-klippning påverkar inte signifikant gång på möss så länge som högst två tår klipps per mus20.

Denna gånganalys metod återspeglar inte kognitiv funktion, så det bör inte användas som ett mått på kognition. Andra som avser att använda denna metod bör överväga de neuromuskulära grupper som påverkas i deras musmodell, och sedan välja fore-eller Hind lem mått därefter. Denna metod för gånganalys rekommenderas inte för forskare som studerar smärta svar som kräver footpad injektioner, eller för studier som kräver biomekaniska åtgärder för förflyttning som inte kan beskrivas av fotspår ensam, som temporala mätningar av lem rörelse eller ledrotation21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka för djur identifierings hjälp. Detta arbete stöddes av bidrag från US National Institutes of Health (R01 7 RF1 AG057264 to A.R.L.S. och C.J.C. och R01 NS100023 till A. R. L. S) och Muskeldystrophy Association (grundläggande forskningsanslag till A.R.L.S., utvecklings bidrag till C.J.C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Caliper n/a n/a must have markings down to 0.1 mm
Craft Glue E6000 n/a
Footprint Paint (Tempera Paint) Artmind n/a must be non-toxic
Round Barrel Paintbrushes Symply Simmons n/a 0.5 cm diameter
Ruler n/a n/a must have markings down to millimeters
Scoring Paper (Watercolor Pads) Canson n/a cut to size
Tunnel and Goal Chamber Interstate Plastics n/a cut to size

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clarke, K. A., Still, J. Development and consistency of gait in the mouse. Physiology & Behavior. 73, (1-2), 159-164 (2001).
  2. Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13, 50 (2015).
  3. Carter, R. J., Morton, J., Dunnett, S. B. Motor coordination and balance in rodents. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 8 Unit 8 (2001).
  4. Tillerson, J. L., Caudle, W. M., Reveron, M. E., Miller, G. W. Exercise induces behavioral recovery and attenuates neurochemical deficits in rodent models of Parkinson's disease. Neuroscience. 119, (3), 899-911 (2003).
  5. Pallier, P. N., Drew, C. J., Morton, A. J. The detection and measurement of locomotor deficits in a transgenic mouse model of Huntington's disease are task- and protocol-dependent: influence of non-motor factors on locomotor function. Brain Research Bulletin. 78, (6), 347-355 (2009).
  6. Sugimoto, H., Kawakami, K. Low-cost Protocol of Footprint Analysis and Hanging Box Test for Mice Applied the Chronic Restraint Stress. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  7. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. Journal of Neuroscience. 19, (8), 3248-3257 (1999).
  8. Barlow, C., et al. Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86, (1), 159-171 (1996).
  9. Cortes, C. J., et al. Muscle expression of mutant androgen receptor accounts for systemic and motor neuron disease phenotypes in spinal and bulbar muscular atrophy. Neuron. 82, (2), 295-307 (2014).
  10. D'Hooge, R., et al. Neuromotor alterations and cerebellar deficits in aged arylsulfatase A-deficient transgenic mice. Neuroscience Letters. 273, (2), 93-96 (1999).
  11. Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113, (2), 123-130 (2002).
  12. Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. W. Treadmill gait analysis does not detect motor deficits in animal models of Parkinson's disease or amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Motor Behavior. 40, (6), 568-577 (2008).
  13. Harper, S. Q., et al. RNA interference improves motor and neuropathological abnormalities in a Huntington's disease mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, (16), 5820-5825 (2005).
  14. Lin, C. H., et al. Neurological abnormalities in a knock-in mouse model of Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 10, (2), 137-144 (2001).
  15. Sopher, B. L., et al. Androgen receptor YAC transgenic mice recapitulate SBMA motor neuronopathy and implicate VEGF164 in the motor neuron degeneration. Neuron. 41, (5), 687-699 (2004).
  16. Tillerson, J. L., Caudle, W. M., Reveron, M. E., Miller, G. W. Detection of behavioral impairments correlated to neurochemical deficits in mice treated with moderate doses of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Experimental Neurology. 178, (1), 80-90 (2002).
  17. Wheeler, V. C., et al. Early phenotypes that presage late-onset neurodegenerative disease allow testing of modifiers in Hdh CAG knock-in mice. Human Molecular Genetics. 11, (6), 633-640 (2002).
  18. Clayton, J. A., Collins, F. S. Policy: NIH to balance sex in cell and animal studies. Nature. 509, (7500), 282-283 (2014).
  19. Maricelli, J. W., Lu, Q. L., Lin, D. C., Rodgers, B. D. Trendelenburg-Like Gait, Instability and Altered Step Patterns in a Mouse Model for Limb Girdle Muscular Dystrophy 2i. PLoS One. 11, (9), e0161984 (2016).
  20. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab Animals. 44, (2), 88-103 (2010).
  21. Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis Cartilage. 24, (11), 1837-1849 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics