Author Produced

Ultraviyole-C (UV-C) Hasarına Yanıt Olarak Birincil Fare Oküler Yüzey Hücrelerinde/Kök Hücrelerinde Oksidatif Hasarın Değerlendirilmesi

* These authors contributed equally
JoVE Journal
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu protokol, fare oküler yüzey hücrelerinden canlı birincil kültürlerde reaktif oksijen türlerinin (ROS), canlı hücrelerin ve ölü hücrelerin eşzamanlı olarak tespitini göstermektedir. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iyodür ve Hoechst boyama ros, ölü hücreleri ve canlı hücreleri değerlendirmek için kullanılır, sırasıyla, görüntüleme ve analiz izledi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bose, B., Kapoor, S., Sen, U., Nihad AS, M., Chaudhury, D., Shenoy P, S. Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage. J. Vis. Exp. (156), e59924, doi:10.3791/59924 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Oküler yüzey çeşitli çevresel faktörler nedeniyle düzenli aşınma ve yıpranmaya maruz kılmaktadır. UV-C radyasyonuna maruz kalmak iş sağlığı açısından tehlike oluşturur. Burada, fare oküler yüzeyinden UV-C radyasyonuna birincil kök hücrelerin maruz kalma gösteriş. Reaktif oksijen türleri (ROS) oluşumu oksidatif stres/hasar ın derecelerinin okunmasıdır. Deneysel bir in vitro ayarda, oksidatif stres nedeniyle oluşan ölü hücrelerin yüzdesini değerlendirmek de gereklidir. Bu yazıda, UV-C maruz kalan fare primer oküler yüzey kök hücrelerinin 2',,7'-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) boyama ve dcfda boyama floresan görüntüleridayalı bunların nicelliği gösterecektir. DCFDA boyama doğrudan ROS üretimine karşılık gelir. Ayrıca sırasıyla propidium iyodür (PI) ve Hoechst 3332 ile eşzamanlı boyama ve DCFDA (ROS pozitif) ve PI pozitif hücrelerin yüzdesi ile ölü ve canlı hücrelerin sayısallaştırılmasını gösteriyoruz.

Introduction

Göz yüzeyi (OS) fonksiyonel bir birim ağırlıklı olarak dış tabaka ve kornea glandüler epitel oluşan, lachrymal bezi, meibomian bezi, konjonktiva, göz kapağı marjları ve innervasyonları bir parçası bu transduce sinyalleri1. Şeffaf kubbe şeklindeki kornea tabakası retinaüzerine ışık odaklanır. Bu avasküler doku epitel hücreleri, keratositler ve endotel hücreleri ve kollajen ve glikozaminoglikanlar 2 gibi hücresel bileşenler gibi hücresel bileşenlerden oluşur2. Alan da besinlerin çoğunu kaynağı gözyaşları tarafından boşaltılır. İşletim sistemi anatomik konumu genellikle parlak ışık, mikroplar, toz parçacıkları ve kimyasallar gibi çeşitli sert bileşenlere maruz, dış çevre ile doğrudan temas olması için zorlar. Bu faktör işletim sistemi fiziksel yaralanmalara yatkındır ve çeşitli hastalıklara yatkın hale getirir.

Oksidatif stres reaktif oksijen türlerinin üretimi arasındaki dengesizlik nedeniyle kaynaklanır (ROS) ve endojen antioksidan savunma mekanizmaları3. ROS, moleküler oksijenden (O2)mitokondriyal oksidatif fosforilasyon4ile elde edilen reaktif moleküller ve serbest radikaller olarak sınıflandırılır. Eski grup hidrojen peroksit (H2O2),singlet oksijen (1O2) gibi radikal olmayan türlerden oluşur ve ikincisi süperoksit anyonlar (O2-), ve hidroksil radikalleri(•OH) gibi türleri içerir. Bu moleküller normal hücresel süreçlerin yan ürünleridir ve rolleri sinyal transdüksiyonu, gen ekspresyonu ve konaksavunması5 gibi önemli fizyolojik fonksiyonlarda rollenmiştir. Ros gelişmiş bir üretim patojen invazyonu, ksizbiyotikler ve ultraviyole maruz kalma gibi faktörlere yanıt olarak üretildiği bilinmektedir 4. ROS'un bu aşırı üretimi, nükleik asitler, proteinler velipidler6 gibi moleküllerin zarar görmesine yol açan oksidatif strese yol açar.

Doğal güneş ışığı, UV radyasyonunun en baskın kaynağı, UV-A (400-320 nm), UV-B (320-290 nm) ve UV-C (290-200 nm)7oluşur. Dalga boyu ve spektral enerjiler arasında ters bir korelasyon bildirilmiştir. Doğal UV-C ışınları atmosfer tarafından emilir rağmen, cıva lambaları ve kaynak aletleri gibi yapay kaynaklar yayarlar ve bu nedenle, bir mesleki tehlike oluşturmaktadır. Gözlere maruz kalma belirtileri fotokeratit ve fotokeratokonjonktivit8içerir. ROS üretimi UV kaynaklı hücresel hasar inflicting önemli mekanizmalardan biridir9. Mevcut çalışmada, UV-C'ye maruz kalan fare primer oküler yüzey hücrelerinde/kök hücrelerinde 2',7'-Diklorodihidrofloresesein diasetat (DCFDA) boyama yöntemi kullanılarak ROS saptanması gösterilmiştir. Yeşil floresan floresan mikroskopi ile yakalandı. Hücreler, canlı ve ölü hücreleri lekelemek için iki boya, Hoechst 33342 ve kırmızı propidium iyodür ile karşı lekeli idi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Deney İsviçre albino fare gözünden elde edilen primer göz hücreleri/kök hücreler üzerinde gerçekleştirildi. Bu deney için hayvanların göz hasat için kullanımı Kurumsal Hayvan Etik Komitesi, Yenepoya (Üniversite olarak kabul) (IEAC onay numarası, 6a.19.10.2016) tarafından onaylanmıştır.

1. Reaktiflerin hazırlıkları

NOT: Fare oküler yüzeyinden birincil hücrelerin/kök hücrelerin türemesi bu protokolün kapsamı dışındadır. Bu nedenle, UV-C maruziyet dozları, ROS, canlı ve ölü hücreleri ve bunların nicel değerlendirmek için reaktif hazırlık göstermek. Reaktiflerin ilgili hacimleri için tablo 1'e bakınız (nihai boyama çözeltisi elde etmek için eklenecek %10 fetal büyükbaş serum, DCFDA, Hoechst ve propidium iyodür stok çözeltileri).

  1. DMSO'nun 5,13 mL'inde 25 mg DCFDA tozu eriterek 10 mM DCFDA'lık bir stok çözeltisi hazırlayın. Aliquot 250 μL her kehribar renkli 1,5 mL tüpler ve -20 °C'de saklayın.
  2. 25 mg şişenin tüm içeriğini 2,5 mL deiyonize su içinde eriterek 10 mg/mL (16.23 mM çözelti) Hoechst 33342'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. Kehribar renkli mikrosantrifüj tüplerde 100 μL'lik aliquotlar yapın ve 2-6 °C'de 6 aya kadar saklayın. Uzun süreli depolama için -20 °C'de saklayın.
  3. Deiyonize suda 1 mg/mL propidium iyodür, her biri 1,5 mL sarı renkli tüplerde aliquot 1 mL bir stok çözeltisi hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.

2. Hücre kaplaması ve UV-C radyasyon tedavisi

  1. Kaplama önce, bizim laboratuvarda izole fare birincil oküler yüzey hücreleri ayrıştırMak (yayınlanmamış sonuçlar; bu hücreler kornea epitel bir karışımıdır, stromal hücreler ve keratositler) nazik bir hücre ayrıştırma ajanı kullanarak (Malzeme Tablosu).
  2. Plaka 0.2 x 106 fare primer oküler yüzey hücreleri 35 mm 0.2% bazal membran matris kaplı hücre kültürü yemekleri 2.5 mL tam medya. Bir gecede %5 CO2 ve nemlendirilmiş inkübatörde 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    NOT: Fare oküler yüzeyinden birincil hücreleri gruplamak için komple ortam% 20 FBS içeren DMEM yüksek glikoz oluşur, 1% Pen-strep, 1% Glutamax, 1% esansiyel olmayan amino asit (NEAA), 1% sodyum piruvat, ve 0.1% β-mercaptoetanol.
  3. Hücreleri çeşitli dozlarda UV-C'ye maruz bırakmadan önce, maksimum ortam hacmini atın ve sadece ince bir ortam tabakasının (~500°L) hücrelerle temas halinde kalmasını bekleyin, sadece onları kapsayacak kadar.
  4. Bulaşıkları teker teker UV-C kaynağına/odasına (hibridizasyon fırını/UV çapraz bağlantı nın alt haznesine) götürün; Malzeme Tablosu). Tabağı odaya yerleştirin ve yemeğin kapağını çıkarın. Yemeğin açık kapak konumu, hücrelerin UV-C maruziyeti sırasında maksimum UV-C dozunu almasını sağlar.
  5. Hücreleri farklı sınıflarda/DOZLARDA UV-C'ye maruz bırak: 1 J/m2, 100J/m2, 1,000 J/m2 ve 10.000 J/m2.
  6. UV-C maruziyetinden sonra, her yemeğin kapağını hemen değiştirin ve UV-C kaynak odasından çıkarın.
  7. Yemeklerin her birini laminar hava akışı başlığına getirin ve 2 mL taze tam ortam la yemeklerin her birini doldurun.
  8. Hücreleri 37 °C CO2 kuluçka makinesinde 3 saat kuluçkaya yatırın. UV-C maruziyeti sonrası üç saatlik kuluçka, erken etkileri görselleştirmek ve ölçmek için en uygun şeydir.

3. Canlı hücre boyama ortamının hazırlanması

  1. UV-C maruziyeti sonrası 3 saatlik hücre kuluçkasının son 15 dakikasında boyama ortamını taze hazırlayın.
  2. %10 FBS-DMEM içeren boyama ortamının 10 mL'si %1 Kalem-Strep ile 37 °C arasında tamamlanır.
  3. 10 mM DCFDA 5 μL ekleyin; 5 μL 10 mg/mL Hoechst çözeltisi ve 200 μL 1 mg/mL propidium iyodür. DCFDA, Hoechst ve PI'nin son konsantrasyonları 10 mL boyama ortamlarında sırasıyla 5 μM, 5 g/mL ve 20 g/mL'dir.

4. UV-C maruz fare primer oküler hücrelerin DCFDA boyama

  1. UV-C maruz fare primer oküler hücrelerinin çeşitli dozlarda inkübasyon 3 saat sonra, 35 mm yemeklerden medya aspire.
  2. Yanlardan her bir tabak için taze hazırlanmış DCFDA boyama ortamı 2 mL ile yeniler.
  3. Canlı hücre boyama için 37 °C CO2 kuluçka makinesinde karanlıkta 15 dakika boyunca hücreleri boyama makinesiyle kuluçkaya yatırın.

5. DCFDA (ROS), Hoechst ve PI lekeli hücrelerin görüntülenmesi

  1. Kuluçka tamamlandıktan sonra, boyama ortamını atın.
  2. Hücrelere taze tam ortam ekleyin ve ters floresan mikroskop / hücre görüntüleyici(Tablo Malzemeler)altında hücreleri gözlemlemek. Fotoğraf istenilen alanları: parlak alan, mavi floresan, kırmızı floresan, yeşil floresan.
    NOT: Mavi floresan lekeli hücreler çekirdekleri, yeşil floresan ROS üreten hücreler için ve kırmızı floresan PI pozitif ölü hücreleri gösterir.

6. Görüntüleme teknikleri kullanılarak lekeli hücrelerin (Hoechst-Blue, PI-Dead ve Green-ROS) sayısallaştırılması

  1. Ters floresan mikroskobun/hücre görüntüleyicisi altında yakalanan görüntüleri niceliklendirme için ImageJ'e aktarın.
  2. Sayım için her kanalı (örneğin, mavi (Nuclei/Hoechst), yeşil (ROS), kırmızı (Ölü/PI pozitif)) kullanarak görüntülerin her birini teker birer açın. Pozlanmamış denetimden başlayın ve sırayla 1, 100, 1.000 ve 10.000 J/m-2'yegeçin.
  3. Alanların her biri için yazılım menüsünde çapraz olarak işaretlenmiş hücre sayma aracını kullanan hücreleri saymak [mavi pozitif (Hoechst pozitif; çekirdekler), kırmızı pozitif (PI pozitif; ölü hücreler); yeşil pozitif (ROS)] her bir görüntüye karşılık gelen Tedavi.
  4. Alanların her birinde belirli sinyallerin her birine tıklayarak sayın. Örneğin, mavi/Hoechst lekeli çekirdeklere tıkladığınızda belirli bir alandaki toplam çekirdek sayısı verecektir.
  5. Sonuçları UV hasarına göre hücre ölüm yüzdesi olarak hesaplayın (PI pozitif hücre sayısı x 100 Hoechst pozitif hücrelerin sayısına bölünür) ve ROS üretiminin UV hasarına göre yüzdesi (DCFDA pozitif hücrelerin sayısı x 100 Hoechst pozitif hücrelerin sayısına bölünür).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DCFDA hücrelerde ROS tespit etmek için bir gösterge olarak kullanılan floresan kimyasal olarak azaltılmış bir formu renksiz bir boya. Bu boya hücrelerin içinde sıkışıp alır ve kolayca floresan diklorodihidrolüorescein okside edilir (DCF), hangi yeşil floresan yayan. Bu floresan floresan mikroskopi ile tespit edilebilir. Hücreler şu şekilde görüntülenebilir ve ROS birikimi ile ilişkilendirilebilir: (i) ROS'suz canlı hücreler yüksek mavi floresan yontabilir; (ii) ROS birikimi ile canlı hücreler düşük yeşil floresan ile yüksek mavi floresan yontmak; ve (iii) ROS birikimi ile ölü hücreler yüksek kırmızı ve yüksek yeşil floresan ile düşük mavi floresan yontmak.

UV-C'nin 1 J/m2'sine maruz kalan kontrol hücreleri ve hücrelerDCFDA/ROS ve PI pozitif hücreler göstermedi. UV-C maruz kalan kontrol sadece Hoechst boyama(Şekil 1)tarafından belirtildiği gibi nükleer boyama gösterdi. Ancak UV-C maruz kalmamış kontrol hücrelerinde PI veya DCFDA pozitif hücreler görülmedi(Şekil 1).

UV-C'nin 100 J/m2'sine maruz kalan hücrelerde düşük ROS ve PI pozitif hücreler sergilenmiştir. 100 J/m2 dozuv-C'ye maruz kaldıktan sonra fare oküler yüzeyinden gelen primer hücreler DCFDA ve PI'nin yaklaşık %5'ini birlikte boyandığını göstererek hücrelerin %5'inde ROS ve hücre ölümünün oluşumunu göstermiştir(Şekil 1).

UV-C'nin 1.000 J/m2'sine maruz kalan hücrelerde %60-%70 ROS ve PI pozitif hücreler sergilenmiştir. 1.000 J/m2 dozuv-C'ye maruz kaldıktan sonra fare oküler yüzeyinden gelen primer hücreler DCFDA ve PI'nin yaklaşık %70 eş boyamasını göstererek hücrelerin %70'inde ROS ve hücre ölümünün oluşumunu göstermiştir(Şekil 1).

UV-C'nin 10.000 J/m2'sine maruz kalan hücrelerde %100 ROS pozitif hücreler ve ~%100 hücre ölümü sergilenmiştir. Fare oküler primer hücrelere maruz kaldığında en yüksek UV-C dozu (10.000 J/m2)%100 hücre ölümü (PI pozitif hücreler) ve ROS oluşumuna (DCFDA boyama) yol açmış ve böylece bu uv-c dozunun en yüksek öldürücülüğünü gösterir(Şekil 1).

1 J/m2 UV-C radyasyonu ile tedavi edilen hücreler de ROS birikimi ni göstermedi ve bu dozdaki canlı hücrelerin yüzdesi kontrol hücrelerininkiyle karşılaştırılabilirdi. Hücreler 100 J/m2'deönemli miktarda hücre ölümü ve ROS birikimi gösterdi. En yüksek miktarda ROS birikimi ve hücre ölümü 10.000 J/m2 UV-C radyasyonu ile tedavi edilen hücrelerde gözlendi.

Sayısal sonuçlar (ROS üretimi yüzdesi ve bölüm 6.3 altında verilen formüller uyarınca hücre ölüm yüzdesi) çubuk grafiği şeklinde çizilmiştir(Şekil 2). Y ekseni hücrelerin yüzdesini temsil ederken X ekseni UV-C dozlarını temsil eder. Yeşil çubuk ROS yüzdesini temsil eder ve kırmızı çubuklar uv-c radyasyonunun farklı dozlarda hücre ölümünü temsil eder(Şekil 2). ROS ve ölü hücrelerin yüzdesi UV-C dozlarında %0, %0, %10, %70 ve %100 sırayla idi: maruz kalmamış kontrol, 1 J/m2, 100 J/m2,1,000 J/m2 ve 10,000 J/m2, sırasıyla(Şekil 2).

Figure 1
Şekil 1: Fare oküler yüzeyprimerhücrelerinin çeşitli dozlarda UV-C maruz kompozit canlı hücre görüntüleri (Pozlanmamış kontrol, 1, 100, 1.000, 10.000 J/m2). Bu görüntüler farklı filtreler altında çekildi: parlak alan (hücre morfolojisi için), mavi (Hoechst nükleer leke), yeşil (ROS üretimi) ve kırmızı (propidium iyodür lekeli ölü hücreler). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Primer fare oküler yüzey hücrelerinin çeşitli dozlarda UV-C radyasyonuna maruz kaldıktan sonra ROS üretimi yüzdesi ve ölü hücrelerin yüzdesi hesapladıktan sonra elde edilen niceliksel sonuçları gösteren çubuk grafikler. X ekseni UV-C dozlarını, Y ekseni ise hücrelerin yüzdesini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bileşen Birim
%10 Fetal Büyükbaş Serum içeren DMEM 9790 μL
DCFDA stok çözümü 5 μL
Hoechst 33342 stok çözümü 5 μL
Propidium iyodür stok çözeltisi 200 μL

Tablo 1: Boyama çözeltisinin hazırlanması için gerekli reaktifler.

Sorun Olası nedenler Sorun giderme Yorum
Hücreler yüksek ila en yüksek UV dozu ile tedavi edildiğinde hiçbir veya çok az ROS veya PI pozitif hücreler lekelenir i. Eski bir boyama çözeltisi kullanımı. i. Taze hazırlanmış boyama solüsyonu kullanın. i. Daha önce hazırlanmış boyama çözeltisi hücrelerin yanlış boyanmasını yol açar.
ii. Aşırı etkili kültür çanak hücreleri tarafından UVC hasarı kurtarma ile sonuçlanan. ii. Her 35 mm hücre kültürü çanak sadece 0,2 milyon hücre plaka ve UVC dozlarına maruz kalmadan önce fazla 12 saat için hücrelerin büyümesine izin asla. ii. Aşırı konkordeto hücreleri UVC hasarı kurtarabilir, ve dolayısıyla hiçbir veya çok AZ ROS ve PI pozitif hücreleri görselleştirilmiş olacaktır.

Tablo 2: Sorun giderme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan DCFDA boyama yöntemi, UV-C radyasyonu ile tedavi edilen fare primer göz canlı hücrelerinde ROS'un görüntülenmesine olanak sağlar. Bu boyama yönteminin bir avantajı da araştırmacılar UV-C hemen etkilerini incelemek için izin olmasıdır (3 saat uvc sonrası maruz kalma) canlı hücreler ve ROS pozitif yüzdesi için eşzamanlı numaralandırma, yanı sıra, ölü hücreler. Ayrıca, boyama yöntemi canlı hücreler üzerinde kullanıldığından, hücreler UV-C radyasyonunun gecikmiş etkilerinin incelenmesi için daha uzun bir süre (birkaç gün) aynı ortamda kuluçkaya yayılabilir. Bu nedenle, bu boyama yöntemi mümkün ROS nesil görselleştirmek için yapar (yeşil) ve aynı anda ters floresan mikroskop altında canlı hücrelerde canlı, apoptotik ve ölü hücre popülasyonları ayırt. Ancak, belirli koşullar altında, ROS pozitif ve PI pozitif hücreleri elde beklentisine rağmen, görselleştirme başarısız olabilir. Bu gibi durumlarda sorun giderme önerilir (Tablo 2).

En iyi sonuçları elde etmek için bu protokol doğru şekilde yapılmalıdır. Optimal sonuçlar, spesifik UV-C dozunun doğru bir şekilde okunması sonucu oluşan yeşil floresan sinyalin/ROS'un dna hasarının doğru bir şekilde okunması olarak bir korelasyon olduğunu göstermektedir. Başka bir deyişle, bu adımı gerçekleştirmek için, UV-C maruziyeti sırasında hücrelerle temas eden ortam hacmi, UV-C dozu gerekli hasarı ortaya çıkarmak için başarısız olacak kadar çok olmamalıdır. Bu nedenle, medya en az hacimli tutmak için esastır, diyelim ki 500 μL başına 35 mm çanak, sadece tüm belirtilen dozlarda UV-C maruziyeti sırasında hücreleri kapsayacak kadar. İkinci olarak, ortam hacmi o kadar az olmamalıdır ki hücreler UV-C maruziyeti sırasında kurur. Son olarak, uv-C hücrelerin maruz hemen sonra, hücreler daha fazla zarar ve ROS üretimi önlemek için, optimal hacim (örneğin 2 mL) taze medya ile tepesinde olmalıdır.

Bu tekniğin bir sınırlama üretilen ROS türüdür. UV-C doz aralıklarına yanıt olarak spesifik ROS tipini saptamak için diğer ek tahliller yapılmalıdır. Bu tür tahliller hücre içi hidroksil radikalin değerlendirilmesi içerir(•OH), hücre içi süperoksit radikalleri, hücre içi reaktif azot türleri, mitokondriyal hidroksil radikaller, mitokondriyal süperoksitler, ve hidrojen peroksit canlı hücrelerde ticari olarak kullanılabilir kitleri kullanarak. Bu tekniğin bir diğer sınırlaması ise 10 J/m2'nin altındaki ve 10.000 J/m2'ninüzerindeki dozlarda yüzde ROS oluşumunun saptanabilirliğidir. Görünüşe göre, fare oküler yüzeyinden birincil hücre / kök hücreleri 10 J / m2daha az UV-C dozlarına maruz kaldığında hiçbir ROS pozitif hücreleri görünür oldu . Aksine, hücreler 10.000 J/m2'ninüzerindeki UV-C dozuna maruz kaldığında %100 ROS pozitif hücreler görülebilir. Bu nedenle, diğer tahliller (örneğin, enzim analizi, oksidatif stres belirteçlerinin ölçümü gibi 8-hidroksideoksiguanozin (8-OHdG) (DNA hasar belirteci) ve çeşitli dozlarda DNA hasar proteinlerinin batı leke analizi çeşitli düzeylerde hücresel /moleküler hasarların kapsamını/türünü anlamak yararlı olabilir. Bu tekniğin üçüncü bir sınırlama çeşitli hücre tipleri arasında üretilen ROS UV-C dozlarının korelasyon olduğunu. Bunun doğrulanması gerekiyor.

Şu anda, DCFDA kitleri ros tespiti için ticari olarak kullanılabilir ya mikroskopi veya akış sitometri kullanarak10,11. Ancak, bu tür kitleri pahalı ve kaynak kısıtlı ülkelerde araştırma laboratuvarları tarafından karşılanamaz. Bu nedenle, bu protokol ticari olarak satılan yöntemlere benzer bir verimlilik ile çok yararlıdır. İkinci olarak, dcfda / ROS üretimi ile birlikte propidium iyodür ölü hücre lekedahil ettik. Bu nedenle, ROS pozitif ve ölü hücrelerin canlı hücre izleme aynı anda bu yöntem kullanılarak yapılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar bio-Rad Laboratories India Private Limited'den makaleye sponsor olduğu için fon desteği aldılar.

Acknowledgments

Yazarlar, altyapı tesisleri için Yenepoya Araştırma Merkezi, Yenepoya (Üniversite olarak kabul edilir) desteği kabul.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) Sigma D6883 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.
Cell culture dish (35 mm) Eppendorf SA 003700112 Sterile dishes for culturing the cells.
DMEM High Glucose HiMedia AT007 Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.
Fetal Bovine Serum, EU Origin HiMedia RM99955 One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.
GlutMax Gibco, Thermo Fisher Scientific 35050061 Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.
HL-2000 Hybrilinker UVP Hybridization oven/UV cross linker
Hoechst 33342 Sigma B2261 Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.
Matrigel Corning Basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids (100X) Gibco, Thermo Fisher Scientific 11140050 Used as a supplement to increase the cell growth and viability.
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) Gibco, Thermo Fisher Scientific 15140122 Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.
Propidium Iodide Sigma P4170 Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.
TryplE Express Thermo Fisher Scientific Gentle cell dissociation agent
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-rad

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gipson, I. K. The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48, (10), 4391-4398 (2007).
  2. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmoogy. 66, (2), 190-194 (2018).
  3. Betteridge, D. J. What is oxidative stress. Metabolism. 49, (2), Suppl 1 3-8 (2000).
  4. Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signaling. 24, (5), 981-990 (2012).
  5. Nita, M., Grzybowski, A. The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).
  6. Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active. Developmental Biology. 320, (1), 1-11 (2008).
  7. Behar-Cohen, F., et al. Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear. Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).
  8. Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem. Journal of Postgraduate Medicine. 64, (1), 40-46 (2018).
  9. de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species. Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).
  10. Degl'Innocenti, D., et al. Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity. Toxicology. 411, 110-121 (2019).
  11. Li, Z., et al. APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion. Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics