Calvarial-Modell der Knochenvergrößerung bei Kaninchen zur Beurteilung des Knochenwachstums und der Neovaskularisation in Knochensubstitutionsmaterialien

Bioengineering

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Summary

Hier stellen wir ein operationschirurgisches Protokoll bei Kaninchen vor, mit dem Ziel, Knochensubstitutionsmaterialien in Bezug auf die Knochenregenerationskapazitäten zu bewerten. Durch die Verwendung von PEEK-Zylindern, die an Kaninchenschädeln befestigt sind, können Osteokontintion, Osteoinduktion, Osteogenese und Vaskulogenese, die durch die Materialien induziert werden, entweder an lebenden oder eingeschläferten Tieren bewertet werden.

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Marger, L., Barone, A., Martinelli-Kläy, C. P., Schaub, L., Strasding, M., Mekki, M., Sailer, I., Scherrer, S. S., Durual, S. Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials. J. Vis. Exp. (150), e59976, doi:10.3791/59976 (2019).

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Abstract

Das Grundprinzip des Kaninchen-Kalvarialmodells ist es, neues Knochengewebe vertikal auf dem kortikalen Teil des Schädels zu züchten. Dieses Modell ermöglicht die Beurteilung von Knochensubstitutionsmaterialien für die mund- und craniofacial Knochenregeneration in Bezug auf Knochenwachstum und Neovaskularisationsunterstützung. Sobald die Tiere beästhetisiert und belüftet sind (Endotrachealintubation), werden vier Zylinder aus Polyetherketon (PEEK) auf den Schädel geschraubt, auf beiden Seiten des Medians und der koronalen Nähte. Innerhalb des durch jeden Zylinder begrenzten Knochenbereichs werden fünf intramedulläre Löcher gebohrt, die den Zufluss von Knochenmarkzellen ermöglichen. Die Materialproben werden in die Zylinder gelegt, die dann geschlossen werden. Schließlich wird die chirurgische Stelle vernärst, und die Tiere werden geweckt. Das Knochenwachstum kann an lebenden Tieren mittels Mikrotomographie beurteilt werden. Sobald Tiere eingeschläfert werden, können Knochenwachstum und Neovaskularisation mittels Mikrotomographie, Immunhistologie und Immunfluoreszenz bewertet werden. Da die Auswertung eines Materials eine maximale Standardisierung und Kalibrierung erfordert, erscheint das Kalvarimodell ideal. Der Zugang ist sehr einfach, Kalibrierung und Standardisierung werden durch den Einsatz definierter Zylinder erleichtert und vier Proben können gleichzeitig bewertet werden. Darüber hinaus kann eine Live-Tomographie verwendet werden, und letztendlich ist mit einem starken Rückgang der einzuschläfernden Tiere zu rechnen.

Introduction

Das kalvariale Modell der Knochenaugmentation wurde in den 90er Jahren mit dem Ziel entwickelt, das Konzept der geführten Knochenregeneration (GBR) im mund- und kraniofazianischen chirurgischen Bereich zu optimieren. Das Grundprinzip dieses Modells ist es, neues Knochengewebe vertikal auf dem kortikalen Teil des Schädels zu züchten. Dazu wird ein Reaktor (z. B. Titan-Dome, -Zylinder oder -Käfig) auf den Schädel fixiert, um die durch ein Transplantat durchgeführte Knochenregeneration (z. B. Hydrogel, Knochenersatz usw.) zu schützen. Mit Hilfe dieses Modells, Titan oder Keramik Käfige1,2,3,4,5,6, GBR Membranen7,8,9 ,10, osteogene Faktoren11,12,13,14,15,16,17, neuer Knochen ersatz12,16,17,18,19,20,21,22,23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 oder der Mechanismus der Neovaskularisation während des Knochenregenerationsprozesses30 wurden bewertet.

Aus translationaler Sicht stellt das Kalvarimodell einen Einwandfehler dar, der mit einem Fehler der Klasse IV im Kiefer31verglichen werden kann. Ziel ist es, neuen Knochen über einem kortikalen Bereich zu züchten, ohne seitliche Unterstützung durch endogene Knochenwände. Das Modell ist somit extrem streng und bewertet das reale Potenzial vertikaler Osteokongation über den kortikalen Teil des Knochens. Wenn das hier beschriebene Modell in erster Linie der Beurteilung von Osteokontinition in Knochenersatzstoffen gewidmet ist, können auch Osteogenese und/oder Osteoinduktion enthoben werden, sowie Vaskulogenese1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30.

Im Wesentlichen aus ethischen, praktischen und wirtschaftlichen Gründen wurde das kalvariale Modell beim Kaninchen entwickelt, bei dem der Knochenstoffwechsel und die Knochenstruktur im Vergleich zum Menschen durchaus relevantsind. Von den 30 oben genannten Referenzen verwendeten 80% das Kaninchen-Kalvarimodell1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23,26,27,28,29,30,33, was die Relevanz dieses Tiermodells demonstriert. 2008 übertrug die Busenlechner-Gruppe das Kalvarimodell auf das Schwein, um den Vergleich von acht Knochenersatzstoffen gleichzeitig20 zu ermöglichen (im Vergleich zu zwei Knochenersatzstoffen mit dem Kaninchen). Auf der anderen Seite hat unsere Gruppe das Kaninchen-Kalvarialmodell auf Schafe übertragen. Kurz gesagt, wurden Titankuppeln auf Schafschädel gelegt, um die Osteokontisierung eines neuen 3D-gedruckten Knochenersatzes zu charakterisieren. Diese Studien ermöglichten es uns, das kalvariale Modell und seine Analyse zu entwickeln und zu meistern16,21.

Die letzten drei studien zitiert16,20,21, zusammen mit mehreren anderen Untersuchungen12,17,18,19,22, 23,24,26,27,28,29, bestätigt das große Potenzial des Kalvarimodells als Screening und Charakterisierung modell. Obwohl die erzielten Ergebnisse recht zufriedenstellend waren, wiesen sie auch auf einige Einschränkungen hin: (1) Die Verwendung von Titankuppeln, die die Röntgendiffusion und damit die Live-Mikro-CT-Nutzung verhinderten. Diese konnten vor der histologischen Verarbeitung nicht entfernt werden, was die Forscher zwang, die Proben in Polyharz (Methylmethacrylat)-Harz (PMMA) einzubetten. Die daraus resultierenden Analysen beschränkten sich daher weitgehend auf die Topographie. (2) Hohe finanzielle Kosten, insbesondere wegen der Kosten der Tiere, und Kosten im Zusammenhang mit der Logistik, Wartung und der Operation der Tiere. (3) Schwierigkeiten bei der Erlangung ethischer Zulassungen für große Tiere.

Eine aktuelle Studie von Polo, et al.26 hat das Modell auf dem Kaninchen weitgehend verbessert. Titankuppeln wurden durch verschließbare Zylinder ersetzt, die mit einem konstanten Materialvolumen gefüllt werden konnten. Vier dieser Zylinder wurden auf Kaninchenschädel gelegt. Nach Fertigstellung konnten die Zylinder entfernt werden, so dass Biopsien metallfrei waren, was viel mehr Flexibilität bei der Probenverarbeitung einführte. Das Kaninchen-Kalvarialmodell wurde attraktiv für gleichzeitige Tests mit geringeren Kosten, einfache Tierhandhabung und Erleichterung der Probenverarbeitung. Unter Ausnutzung dieser jüngsten Entwicklungen haben wir das Modell weiter verbessert, indem wir Titan durch PEEK ersetzt haben, um Zylinder herzustellen, wodurch die Röntgendiffusion und der Einsatz von Mikrotomographie bei lebenden Tieren ermöglicht wurden.

In diesem Artikel werden wir die Anästhesie- und Operationsprozesse beschreiben und Beispiele für Outputs zeigen, die mit diesem Protokoll erzielt werden können, d.h. (Immun-)Histologie, Histomorphometrie, Live- und Ex-vivo-Mikrotomographie zur Bewertung der Mechanismen von Knochen und quantifizieren die neue Knochensynthese, die durch Knochenersatzmaterialien unterstützt wird.

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Protocol

Gemäß den schweizerischen Rechtsvorschriften wurde das Protokoll von einem akademischen Komitee genehmigt und von den kantonalen und bundesstaatlichen Veterinärbehörden überwacht (Zulassungen Nr. GE/165/16 und GE/100/18).

1. Spezifische Geräte und Tiere

  1. Zylinder
    1. Maschinenzylinder mit seitlichen Stabilisierungslaschen aus PEEK mit einem Innendurchmesser von 5 mm, einem Außendurchmesser von 8 mm und einer Höhe von 5 mm (Abbildung1).
    2. Maschine PEEK Kappen mit einem Design, das es ermöglicht, genau auf die Oberseite des Zylinders (Dicke 1 mm) zu klemmen.
    3. Sterilisieren Sie PEEK-Zylinder und Kappen durch Autoklavieren vor der Operation.
  2. Schrauben
    1. Verwenden Sie selbstbohrende Mikroschrauben (aus kommerziellem reinem Titan (Klasse 5)), um die Zylinder (1,2 mm Durchmesser, 4 mm Länge) zu fixieren. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren vor der Operation.
  3. Tiere
    1. Kaufen Sie drei Monate alte neuseeländische weiße Kaninchen (männlich oder weiblich) mit einem Gewicht von jeweils 2,5 kg.
      HINWEIS: Wir haben Kaninchen durch Zucht an der Universität Genf erhalten.

2. Chirurgie

  1. Chirurgische Schale
    1. Skalpelle, Scheren, zwei Zangen, Periosteal-Aufzug, Spritzen (1, 2, 5, 50 ml), OP-Motor, runde chirurgische Bohrer (0,8 mm Durchmesser), Nadeln, sterile Wäsche, vier Zylinder, acht Schrauben und Schraubendreher bereit halten.
  2. Präklinische Behandlung
    1. Akklimatisieren Sie die Tiere eine Woche vor der Operation.
    2. Geben Sie täglich ein prophylaktisches Antibiotikum (5–10 mg/kg durch Mund (PO)) ab 2 h vor der Operation bis zu 3 Tage nach der Operation an.
  3. Anästhesie und Intubation
    1. Beruhigen Sie die Tiere durch intramuskuläre (IM) Injektion von Ketamin (25 mg/kg, 50 mg/ml, 0,5 ml/kg) + Xylazin (3 mg/kg, 20 mg/ml, 0,15 ml/kg). Warten Sie 20 min, bis die Tiere schlafen
      tief (komplette muskulöse Atony).
      HINWEIS: Diese Prämedikation ermöglicht einen einfachen, schnellen und schmerzlosen Intubationsprozess. Tiefe Analgesie und Anästhesie wird induziert, wie in Schritt 2.3.8 beschrieben.
    2. Legen Sie eine intravenöse (IV) Kanüle aus dem Ohr in die Randvene und halten Sie sie geschlossen, bis die Intubation abgeschlossen ist.
      HINWEIS: Diese IV-Linie dient der Durchstechung von Fentanyl und Propofol für tiefe Analgesie bzw. Anästhesie (siehe Schritt 2.3.8).
    3. Halten Sie die Anästhesie aufrecht, indem Sie 5% Sevofluran in reinen Sauerstoff liefern, bis eine Intubation durchgeführt wird.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist nur notwendig, wenn das Tier Anzeichen des Erwachens zeigt (Augenbewegungen, Muskelkontraktionen).
    4. Anästhetisieren Sie die Luftröhre lokal durch Sprühen von 10% Lidocain. Stellen Sie das Kaninchen in eine anfällige Position und halten Sie seinen Kopf in vertikaler Verlängerung.
    5. Schieben Sie das erste Endotrachealrohr mit kleinem Durchmesser (2,5 mm) in die Kaninchentrachea, bis der Luftstrom im Rohr zu hören ist. Dadurch wird der Kehlkopf geöffnet und das Einführen des endgültigen Rohres erleichtert.
    6. Legen Sie eine Führung (Intubationskatheter) in das Rohr ein, um die Position des Rohres in die Luftröhre zu fixieren. Entfernen Sie das Rohr mit kleinem Durchmesser und schieben Sie das definitive Endotrachealrohr (4,9 mm) auf die Führung.
    7. Entfernen Sie die Führung und blasen Sie den Ballon am Ende des Endotrachealrohrs auf, um das Gerät zu versiegeln und in die Luftröhre zu blockieren. Die Röhre bleibt an Ort und Stelle, aber es kann mit einer Spitze um die Stirn gebunden gesichert werden.  Sofort belüften (7 ml/kg, Frequenz 40/min) das Tier mit 3% Sevofluran in reinem Sauerstoff.
    8. Kontinuierlich perfuse (Ohrvene) Fentanyl (0,01 mg/ml, 2–4 ml/h) zur Induzieren von Analgesie, 2–4 mg/kg (2%) Propofol (20 mg/ml, 4–8 ml/h) zur Induzieren von Anästhesie und 4 ml/kg/h Ringeracetat zur Aufrechterhaltung iso-volumetric-Bedingungen.
    9. Legen Sie eine rektale Temperatursonde auf. Überwachen Sie auch Herzfunktion, Temperatur und Sauerstoffsättigung während des gesamten Prozesses.
    10. Kontrolle der Tiefe der Anästhesie durch Überwachung der autonomen Atmung; Wenn das Tier Anzeichen einer autonomen Atmung zeigt, geben Sie einen kleinen Bolus Propofol und Fentanyl.
  4. Standortvorbereitung
    1. Legen Sie das Kaninchen auf ein beheiztes Pad (39 °C), das von einem Matratzenpad bedeckt ist (um Verbrennungen zu vermeiden) auf den Operationstisch. Rasieren Sie die Kopfhaut.
    2. Tragen Sie ein Schmiergel auf die Augen auf, um Reizungen und Trockenheit zu vermeiden. Desinfizieren Sie die Stelle, indem Sie die Haut mit Povidon-Jod (10%) schrubben. Dann drapieren Sie das Kaninchen mit einem sterilen chirurgischen Drap und schneiden Sie einen Zugangsbereich für den Schädel aus.
    3. Desinfizieren Sie die chirurgische Stelle mit Povidonjod (10%) ein zweites Mal. Tragen Sie ein Schmiergel auf die Augen auf, um Reizungen und Trockenheit zu vermeiden.
    4. Bereiten Sie einen drapierten Tisch (steriler Vorhang) vor, auf dem Sie die komplette chirurgische Schale platzieren können.
  5. Öffnung des Operationsstandortes
    1. Lokal mit einer subkutanen (SC) Injektion von Lidocain 2% (1 ml) auf den Schädel anästheisieren.
    2. Durch die Haut (mit einem Skalpell) entlang der kalvarialen sagittalen Linie, von den Umlaufbahnen bis zur äußeren okzipitalen Protuberanz (ca. 4 cm länge). Stellen Sie sicher, dass das Periost eingeschnitten ist.
    3. Heben Sie das Periost (mit einem Periosteal-Aufzug) auf beiden Seiten des Einschnitts vorsichtig an. Spülen Sie die Stelle mit steriler Saline.
  6. Zylinderplatzierung
    1. Finden Sie die medianen und koronalen Nähte auf dem Schädel (Abbildung 2A,B). Beachten Sie, dass diese anatomischen Linien ein Kreuz bilden. Die Zylinder werden in jedem der durch das Kreuz definierten Quadranten platziert, um sicherzustellen, dass sich die Kante des Zylinders nicht über der Naht befindet (Abbildung 2C).
    2. Legen Sie den ersten Zylinder auf den linken oberen Quadranten (linker Frontalknochen), und versuchen Sie, das Gerät flach zu legen. Fix ieren Sie in der Position mit starkem Handdruck und schrauben Sie eine Mikroschraube, bis Widerstand gefühlt wird. Stellen Sie sicher, dass der Schraubenkopf bündig mit der Oberfläche der Zylinderlasche ist.
    3. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren auf der anderen Lasche, um den Zylinder fest am Schädel zu fixieren. Stellen Sie sicher, dass der Zylinder hermetisch am Knochen befestigt ist.
    4. Wiederholen Sie den Vorgang im rechten oberen Viertel (rechter Frontalknochen), im linken unteren Viertel (linker Parietalknochen) und im rechten unteren Viertel (rechter Parietalknochen).
  7. Knochenbohrungen von 5 intramedullären Löchern innerhalb des durch die Zylinder umgrenzten Bereichs (Abbildung 1)
    1. Bohren Sie ein intramedulläres Loch unter der salinebewässerung (0,8 mm im Durchmesser, 1 mm in der Tiefe) mit einem runden Bohrer auf dem Knochen, in der Mitte des durch den Zylinder begrenzten Bereichs. Stellen Sie sicher, dass Blutungen auftreten.
    2. Bohren Sie zwei weitere intramedulläre Löcher entlang der Achse, die durch die beiden Lascheschrauben an den innen Kanten des Zylinders verläuft. Bohren Sie entlang der senkrechten Axt zwei weitere intramedulläre Löcher an den Innenkanten des Zylinders. Stellen Sie sicher, dass Blutungen auftreten.
    3. Wiederholen Sie den Vorgang innerhalb der drei anderen Zylinder.
  8. Füllzylinder mit Materialmustern und Verschließen (Abbildung 3)
    1. Bereiten Sie das gewünschte Knochenersatzmaterial gemäß Herstelleranweisungen oder Materialspezifikationen vor.
    2. Füllen Sie den ersten Zylinder bis zum Rand mit der Materialprobe und schließen Sie den Zylinder, indem Sie die Kappe bestücken. Wiederholen Sie den Vorgang in den 3 anderen Zylindern.
  9. Schließung des Operationswerks
    1. Schließen Sie die Haut über den Zylindern mit einer intermittierenden, nicht resorbierbaren Naht.
    2. Tragen Sie einen spritzbaren Verband auf die Wunde auf.

3. Postoperative Behandlung

  1. Stoppen Sie Analgesie und Anästhesie (Propofol und Fentanyl Perfusionsstillstand) Versorgung und überprüfen Sie die Wiederherstellung der autonomen Atmung.
  2. Stoppen Sie die Beatmung, sobald das Tier die autonome Atmung wiederhergestellt hat. Bewahren Sie das Tier unter reinem Sauerstoff, bevor Sie vollständig erwachen.
  3. Buprenorphinhydrochlorid SC (0,02 mg/kg, 0,03 mg/ml, 0,67 ml/kg) injizieren und die Injektion alle 6 Stunden als postoperative Analgesie alle 6 Stunden wiederholen.
  4. Übertragen Sie das Tier in sein übliches Gehäuse mit Wasser und vollständiger Fütterung.
  5. Entfernen Sie die Nähte nach ca. 10 Tagen Wundheilung.

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Representative Results

Das hier beschriebene Modell ist der Beurteilung von Osteokondemion in Knochenersatzstoffen gewidmet. Osteogenese und-oder Osteoinduktion von Knochenersatzstoffen entweder (vor)zellularisiert oder mit bioaktiven Molekülen beladen werden können, sowie Vaskulogenese1,2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30. Je nach den zu analysierenden Mechanismen und Outputs kann eine kinetische Studie von 3 Tagen bis zu 3 Monaten nach der Operation verwendet werden. Eine klassische Zeitleiste, die Beschreibungen zur frühen und mittleren Zeit erlaubt, ist: 2, 4, 6, 8 und 12 Wochen. Beachten Sie, dass mindestens 6 Stichproben pro Zeitpunkt erforderlich sind, um signifikante Ergebnisse zu erzielen. Jede zu prüfende Probe muss mindestens einmal in jeder Position pro Zeitpunkt auf den Schädel gelegt werden (zufällige Zuordnung). Schließlich müssen Scheinproben (z. B. mit geraguliertem Blut gefüllte Zylinder) in das Protokoll34aufgenommen werden.

Sobald die Operation abgeschlossen ist, kann das Knochenwachstum zu verschiedenen Zeitpunkten überwacht werden, indem knochentomographie an lebenden Tieren verwendet wird. Ein Beispiel ist in Abbildung 4A,Bdargestellt. Zusätzliche Analyse erfordert, dass Tiere geopfert werden (tödliche intravenöse Injektion von 150 mg/kg Pentobarbital (100 mg/ml). Nach der Euthanasie werden Proben geschnitten und Zylinder sorgfältig entfernt (Abbildung 5). Biopsien werden mit einer Lösung aus phosphatgepufferter Saline und 4% Formaldehyd fixiert. Das Knochenwachstum kann dann mittels Mikrotomographie beurteilt werden (Abbildung 4 C,D). Proben können auch für (immun-) histologische Färbung verarbeitet werden. Histomorphometrische Analysen und spezifische Färbungen sind dann möglich, um die Analyse genauer abzuschließen (Abbildung 6).

Figure 1
Abbildung 1: Spezifikationen der PEEK-Zylinder. Zwei Löcher (0,8 mm Durchmesser) wurden zum Verschrauben auf die seitlichen Stabilisierungslaschen gebohrt. Die Positionen der 5 intramedullären Löcher (0,8 mm Durchmesser), die auf dem Schädel innerhalb des durch den Zylinder begrenzten Bereichs gebohrt werden sollen, sind mit roten Kreisen markiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentatives Bild des Kaninchenschädels und Platzierung der Zylinder. Bilder, die die medianen und koronalen Nähte auf dem Kaninchenschädel zeigen, die die links-rechts parietalen und frontalen Knochen abundgenau machen (A,B). Platzierung der Zylinder auf beiden Seiten der Nähte (C). Skalenbalken = 5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentatives Bild der fixierten, gefüllten und gekapselten Zylinder. Bild zeigt vier Zylinder, die auf dem Schädel eines Kaninchens mit Titanschrauben befestigt sind. Innerhalb des von jedem Zylinder begrenzten Bereichs wurden 5 intramedulläre Löcher (0,8 mm Durchmesser, 1 mm Tiefe) unter Bewässerung mit einem runden Bohrer gebohrt, um die Migration von Knochenzellen zu ermöglichen. Die Zylinder wurden vor der Verkappung mit verschiedenen Knochenersatzproben (kalibrierte Volumen) gefüllt (nur ein geschlossener Zylinder wird angezeigt). Maßstabsleiste = 5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Bilder aus der mikrotomographischen (Mikro-CT) Analyse. Mit dem Endziel, das Knochenwachstum durch Knochenersatz zu bewerten, wurden 4 Zylinder mit Titanschrauben auf einem Kaninchenschädel befestigt und mit Knochenersatzstoffen gefüllt. (A) Live-Bildgebung: zweidimensionaler Querscan (14 min, 99 kV/88 A mit einer Auflösung von 20 m) eines Zylinders nach 12 Wochen. (B) dreidimensionale (3D) Rekonstruktion aus der Live-Mikro-CT-Analyse nach 4 Wochen (rote Kreise: Knochenersatz in Zylindern; roter Pfeil: Kontrolle, bei der der Zylinder mit geraguliertem Blut gefüllt ist). (C,D) Nach der Euthanasie (12 Wochen) wurden die Zylinder vor der Fixierung und Mikro-CT-Analyse entfernt. (C) 2D-Querscan (57 min, 99 kV/88 a mit einer Auflösung von 10 m) eines Zylinders und 3D-Rekonstruktion des gesamten neuen Knochens im Zylinder (D). Knochenersatzpartikel (rot), neuer Knochen (grün) und Knochenbett (gelb) werden angezeigt. Skalenbalken = 2 mm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Repräsentative Bilder einer Biopsie nach 4 Wochen. Nach der Euthanasie (4 Wochen) wurden probenweise und Zylinder vor der Fixierung in 4% Formalin, Mikro-CT-Analyse und histologische Verarbeitung entfernt. Maßstabsleiste = 5mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Repräsentative Bilder von (immun-)histologischen Abschnitten. Mit dem Endziel, Knochenwachstum und Neovaskularisation durch Knochenersatz zu bewerten, wurden 4 Zylinder mit Titanschrauben auf einen Kaninchenschädel fixiert und mit Knochenersatzstoffen gefüllt. Nach der Euthanasie (12 Wochen) wurden die Zylinder vor der Fixierung und histologischen Verarbeitung entfernt. (A) Masson-Goldner Färbung (50x): Knochenersatz erscheint als mauve Partikel umgeben von neuen Knochen in grün. (B) Die Scheiben wurden gescannt und für die digitale Extraktion von Knochenersatzmaterial verarbeitet, so dass der neue Knochen (rot) leicht quantifiziert werden konnte. (C) Immunostainierung von CD31 (Pfeile), einem typischen Marker von Endothelzellen und dem Neovaskularisationsprozess. (D) Immunfluoreszenzfärbung (grün) einer stark neovaskakulären Zone, in der einige neue Kapillaren CD31 (Pfeil) hochausdrücken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Das hier beschriebene Modell ist einfach und sollte ganz einfach entwickelt werden, solange alle Schritte befolgt werden und die Ausrüstung geeignet ist. Da es sich bei dem beschriebenen Protokoll um eine chirurgische Methode handelt, erscheinen alle Schritte kritisch und müssen ordnungsgemäß befolgt werden. Es ist wichtig, für Tierversuche ausgebildet zu werden, insbesondere im Umgang mit Kaninchen und anästhesie. Zögern Sie nicht, professionelle Anästhesistin und tierärztliche Hilfe zu bitten. Es ist wichtig, auf der täglichen visuellen Überwachung von Tieren vor und nach der Nahtentfernung zu bestehen. Auch wenn die Haut aus dem Schädel dick, reichlich und locker ist, führt die Fixierung der Zylinder zu großen Spannungen. Wenn die Nähte zu früh entfernt werden, kann die Wunde wieder öffnen und erfordert eine weitere Woche Naht und eine neue Antibiotika-Behandlung. Im Falle einer Dehiszenz aus der Wundlinie muss der Chirurg überlegen, ob eine Naht möglich ist oder nicht. Ist dies nicht der Fall, muss die Probenabweisung berücksichtigt werden.

Zusätzlich zu den im Protokollabschnitt beschriebenen kritischen Schritten können die folgenden Details bei der ordnungsgemäßen Implementierung dieses Protokolls hilfreich sein. Aus technischer Sicht ist es wichtig, eine zweistufige Intubation zu verwenden, wie im Protokoll beschrieben, da die verwendeten Kaninchen jung und klein sind. Die zweite (und letzte) Röhre ist zu groß, um in der ersten Intubation verwendet zu werden, und es besteht die reale Gefahr eines "falschen Weges", der schädlich oder sogar tödlich sein kann.
Je nach den getesteten Materialien kann es interessant sein, einige frische Blutproben aus der Ohr-IV-Linie zu nehmen, die bereits platziert ist. Dies könnte eine gute Methode bieten, um das Knochenersatzmaterial mit natürlichen Zellen und Wachstumsfaktoren vorzutragen. Frisch geringuliertes Blut kann auch eine ideale Scheinprobe sein.

Die Art und Weise, wie die intramedullären Löcher gebohrt werden, sollte für die zukünftige histologische Verarbeitung und histomorphometrische Analyse sehr hilfreich sein. Solange die Bohrungen (i) an der gleichen Stelle sind, (ii) die Biopsien ähnlich ausgerichtet sind und (iii) der Schneidprozess standardisiert ist (d.h. die gleiche Dicke, gleicher Schnittpegel), sind die bewerteten Felder gleichwertig und ihr Vergleich ist hochgradig Relevanten. Als Standardisierung kann es von echtem Interesse sein, die Volumenmenge des Materials zu kalibrieren, um den Zylinder zu füllen, und ihn im Voraus steril vorzubereiten.

Aus wissenschaftlicher Sicht kann es je nach den getesteten Produkten oder Hypothesen wichtig sein, die Zylinder nicht auf Knochennähte zu legen. Einige spezifische Stammzellen sind in diesen Strukturen35vorhanden, anders als die mesenchymalen Knochenstammzellen, die an den Mechanismen der intramembranösen Verknöcherung beteiligt sind, d.h. dem Knochenregenerationsprozess, der im oroziaden Bereich angetroffen wird. Daher kann es bei Fehlplatzierungen zu einer echten Verzerrung kommen.

Einer der Hauptvorteile des kalvarialen Modells ist die Verwendung von Lebender Mikrotomographie, bei der das Knochenwachstum bei einem einzelnen Tier als Längsschnittstudie verfolgt werden kann. Diese Strategie kann die Zahl der eingeschläferten Tiere weitgehend verringern und daher die "3R-Regel"36einhalten. Je nach verwendeter Mikrotomographenvorrichtung (Auflösung, Platz für das Tier) treten Abweichungen in Bezug auf die Strategie der Anästhesie (IV, Gas, etc.) sowie in der Bildauflösung und der Relevanz der resultierenden Analyse auf.
Wir verwenden routinemäßig einen Mikrotomographen für Tierversuche (z. B. Quantum GX) für Routinekontrollen. Ein typisches Experiment beginnt mit einer Sedierung, wie in Schritt 2.3.1 beschrieben. Die Anästhesie wird dann mit 2% Isofluran in reinem Sauerstoff aufrechterhalten. Dadurch kann das Tier während einer Scanzeit von ca. 14 min (99 kV/88 A mit einer Auflösung von 20 m) ruhig atmen. dies reicht aus, um die Grundparameter (Engraftment, Zylinderfixierung, semiquantitative Analyse des Knochenwachstums usw.) zu überprüfen. Bei der Suche nach einer präzisen qualitativen und quantitativen Analyse ist eine sehr feine Abstimmung von Scanzeit, Auflösung, Anästhesie und Tierpositionierung erforderlich.

Bestehende Modelle zur Beurteilung von Osteokontheton, Osteogenese, Osteoinduktion sowie Vaskulogenese sind zahlreich, vor allem im orofazialen Bereich. Aus ethischen und wirtschaftlichen Gründen wird unser Zweck auf Kaninchen oder kleinere Tiere beschränkt sein. Neben dem Schädel sind die Orte, an denen das Material getestet werden kann, die Mandibulla37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47, die Diastema48 oder die prägnanten Sockel (nach Zahnextraktion)49,50,51. Ratten, Mäuse, Meerschweinchen und Kaninchen können für jedes der unten beschriebenen Modelle verwendet werden. Kurz gesagt, wird ein kritischer Defekt gebohrt (oder eine Steckdose wird durch prägnante Extraktion erzeugt), mit der Materialprobe gefüllt und dann von einer Membran abgedeckt. Abgesehen von der offensichtlichen Tatsache, dass an jedem dieser Standorte nur zwei Proben getestet werden können (eine Probe pro unterkieferbarer Seite oder pro prägnanter Buchse), sind die chirurgischen Eingriffe auch wesentlich schwieriger und invasiver. Der Zugang zum Gelände ist begrenzt und wenn man Ratten oder Mäuse verwendet, wird die Schwierigkeit um die Größe der Tiere weiter erhöht. Schließlich ist die kritische Größe der Defekte (d. h. Abmessungen, die keine spontane Knochenregeneration zulassen) nicht genau definiert und variiert von Tier zu Tier.
Neben diesen Allgemeineinheiten können je nach anatomischer Stelle und anschließender Analyse spezifische Einschränkungen entstehen. Im Unterkiefermodell sind beispielsweise Zahnwurzeln innerhalb des Defekts vorhanden. Dies kann das Material stören und den Knochenregenerationsprozess verändern. Der Defekt könnte distärer auf den Ramus gelegt werden, aber in diesem Fall wäre der Knochen sehr dünn (zwei Kortikale, die mit einem extrem dünnen medullären Raum befestigt sind) und das resultierende Defektvolumen kann zu klein sein45,46, 47. Angesichts dieser Beispiele von Einschränkungen und je nach Modell können große Abweichungen in Bezug auf das zu prüfende Materialvolumen, die Qualität und die Menge der erhobenen Daten erwartet werden.

Da die Auswertung eines Materials ein Maximum an Standardisierung und Kalibrierung erfordert, erscheint das Kalvarimodell ideal. Der Zugang ist sehr einfach, Kalibrierung und Standardisierung werden durch den Einsatz definierter Zylinder erleichtert und 4 Proben können gleichzeitig bewertet werden. Darüber hinaus kann eine Live-Tomographie verwendet werden, und schließlich kann mit einem starken Rückgang der einschlähungsbelichten Tiere gerechnet werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren sind der Geistlich AG (Wolhusen, CH) und der Osteology Foundation (Lucerne, CH) (Zuschuss Nr. 18-049) für ihre Unterstützung sowie Global D (Brignais, FR) für die Bereitstellung der Schrauben dankbar. Ein besonderer Dank geht an Dr. B. Schaefer aus Geistlich. Wir danken auch Eliane Dubois und Claire Herrmann für ihre hervorragende histologische Verarbeitung und ihre wertvollen Ratschläge. Abschließend würdigen wir Xavier Belin, Sylvie Roulet und das gesamte Team von Pr Walid Habre, "experimentelle Chirurgie Dpt", für ihre bemerkenswerte technische Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drugs
Enrofloxacine Baytril 10% Bayer Antibiotic
Fentanyl Bischel For analgesia
Ketalar 50mg/ml Pfizer Ketamine for anesthesia
Lidohex Bichsel Lubricating gel for the eyes
Opsite Smith and Nephew 66004978 Sprayable dressing
Povidone iodine 10%, Betadine Mundipharma anti-infective agent
Propofol 2% Braun 3538710 For anesthesia
Rapidocain 2% sintetica Local anesthesia
Ringer-acetate Fresenius Kabi Volume compensation
Rompun 2% Bayer Xylazin for anesthesia
Sevoflurane 5% Abbvie For anesthesia
Sterile saline Sintetica
Temgesic Reckitt Benckiser Buprenorphine hydrochloride, analgesia
Thiopental Inresa Ospediala For anesthesia
Xylocaine 10% spray Astra Zeneca For intubation
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Fresenius Vial pilot C Imexmed Infusion pump
Heated pad Harvard Apparatus
Suction dominant 50 Medela
Suction tubing Optimus Promedical 80342.2
Surgical motor Schick dental Qube Drilling of intramedullary holes
Ventilation Maquet Servo1
Name Company Catalog Number Comments
Material
Cylinders and caps Boutyplast Customized composition: PEEK (poly ether ether ketone)
Manual self-retaining shaft GlobalD ACT1K
Mobile handle for self-retaining shaft GlobalD MTM
Self- drilling screws GlobalD VA1.2KL4 cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3
Name Company Catalog Number Comments
Surgical tray
Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm Covidien 86233 For intubation
Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm Covidien 107-35G For intubation
Ethicon prolene 4-0 Ehticon 8581H Non-resorbable suture
Forceps Marcel Blanc BD027R 145 mm
Intubation catheter Cook medical Guide for intubation
Needlle holder Marcel Blanc BM008R
Needles BD Microlance3 Becton Dickinson 300300/304622 26G; 18G
Periosteal HU-Friedy P9X
Round surgical burs Patterson 78000 0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes
Scalpel Swann-Morton n°10 and n°15
Scissors Marcel Blanc 00657 180 mm
Syringes Omnifix Braun 4616057V 5ml, 10ml and 50ml
Venflon G22 Braun 42690985-01 Vasofix safety for the ear iv line

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References

  1. Anderud, J., et al. Guided bone augmentation using a ceramic space-maintaining device. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology and Oral Radiology. 118, (5), 532-538 (2014).
  2. Lundgren, A. K., Lundgren, D., Hammerle, C. H., Nyman, S., Sennerby, L. Influence of decortication of the donor bone on guided bone augmentation. An experimental study in the rabbit skull bone. Clinical Oral Implants Research. 11, (2), 99-106 (2000).
  3. Lundgren, D., Lundgren, A. K., Sennerby, L., Nyman, S. Augmentation of intramembraneous bone beyond the skeletal envelope using an occlusive titanium barrier. An experimental study in the rabbit. Clinical Oral Implants Research. 6, (2), 67-72 (1995).
  4. Slotte, C., Lundgren, D. Impact of cortical perforations of contiguous donor bone in a guided bone augmentation procedure: an experimental study in the rabbit skull. Clinical Implant Dentistry and Relat Research. 4, (1), 1-10 (2002).
  5. Tamura, T., et al. Three-dimensional evaluation for augmented bone using guided bone regeneration. Journal of Periodontal Research. 40, (3), 269-276 (2005).
  6. Yamada, Y., et al. Correlation in the densities of augmented and existing bone in guided bone augmentation. Clinical Oral Implants Research. 23, (7), 837-845 (2012).
  7. Chierico, A., et al. Electrically charged GTAM membranes stimulate osteogenesis in rabbit calvarial defects. Clinical Oral Implants Research. 10, (5), 415-424 (1999).
  8. Ikeno, M., Hibi, H., Kinoshita, K., Hattori, H., Ueda, M. Effects of the permeability of shields with autologous bone grafts on bone augmentation. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 28, (6), e386-e392 (2013).
  9. Ito, K., Nanba, K., Murai, S. Effects of bioabsorbable and non-resorbable barrier membranes on bone augmentation in rabbit calvaria. Journal of Periodontology. 69, (11), 1229-1237 (1998).
  10. Lee, Y. M., et al. Enhanced bone augmentation by controlled release of recombinant human bone morphogenetic protein-2 from bioabsorbable membranes. Journal of Periodontology. 74, (6), 865-872 (2003).
  11. Fugl, A., et al. S-nitroso albumin enhances bone formation in a rabbit calvaria model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 43, (3), 381-386 (2014).
  12. Ikeno, M., Hibi, H., Kinoshita, K., Hattori, H., Ueda, M. Effects of self-assembling peptide hydrogel scaffold on bone regeneration with recombinant human bone morphogenetic protein-2. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 28, (5), e283-e289 (2013).
  13. Ito, K., et al. Effects of ipriflavone on augmented bone using a guided bone regeneration procedure. Clinical Oral Implants Research. 18, (1), 60-68 (2007).
  14. Jung, R. E., Hammerle, C. H., Kokovic, V., Weber, F. E. Bone regeneration using a synthetic matrix containing a parathyroid hormone peptide combined with a grafting material. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 22, (2), 258-266 (2007).
  15. Minegishi, T., et al. Effects of ipriflavone on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvaria. Journal of Oral Science. 44, (1), 7-11 (2002).
  16. Moussa, M., et al. Medium-Term Function of a 3D Printed TCP/HA Structure as a New Osteoconductive Scaffold for Vertical Bone Augmentation: A Simulation by BMP-2 Activation. Materials. 8, (5), 2174-2190 (2015).
  17. Thoma, D. S., Kruse, A., Ghayor, C., Jung, R. E., Weber, F. E. Bone augmentation using a synthetic hydroxyapatite/silica oxide-based and a xenogenic hydroxyapatite-based bone substitute materials with and without recombinant human bone morphogenetic protein-2. Clinical Oral Implants Research. 26, (5), 592-598 (2014).
  18. Busenlechner, D., et al. Resorption of deproteinized bovine bone mineral in a porcine calvaria augmentation model. Clinical Oral Implants Research. 23, (1), 95-99 (2012).
  19. Busenlechner, D., et al. Paste-like inorganic bone matrix: preclinical testing of a prototype preparation in the porcine calvaria. Clinical Oral Implants Research. 20, (10), 1099-1104 (2009).
  20. Busenlechner, D., et al. Simultaneous in vivo comparison of bone substitutes in a guided bone regeneration model. Biomaterials. 29, (22), 3195-3200 (2008).
  21. Carrel, J. P., et al. A 3D printed TCP/HA structure as a new osteoconductive scaffold for vertical bone augmentation. Clinical Oral Implants Research. 27, (1), 55-62 (2016).
  22. Murai, M., et al. Effects of different sizes of beta-tricalcium phosphate particles on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvarium. Dental Materials Journal. 25, (1), 87-96 (2006).
  23. Nishida, T., et al. Effects of bioactive glass on bone augmentation within a titanium cap in rabbit parietal bone. Journal of Periodontology. 77, (6), 983-989 (2006).
  24. Nyan, M., et al. Feasibility of alpha tricalcium phosphate for vertical bone augmentation. Journal of Investigating and Clinical Dentistry. 5, (2), 109-116 (2012).
  25. Polimeni, G., et al. Histopathological observations of a polylactic acid-based device intended for guided bone/tissue regeneration. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 10, (2), 99-105 (2008).
  26. Polo, C. I., et al. Effect of recombinant human bone morphogenetic protein 2 associated with a variety of bone substitutes on vertical guided bone regeneration in rabbit calvarium. Journal of Periodontology. 84, (3), 360-370 (2013).
  27. Slotte, C., Lundgren, D., Burgos, P. M. Placement of autogeneic bone chips or bovine bone mineral in guided bone augmentation: a rabbit skull study. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 18, (6), 795-806 (2003).
  28. Tamimi, F. M., et al. Bone augmentation in rabbit calvariae: comparative study between Bio-Oss and a novel beta-TCP/DCPD granulate. Journal of Clinical Periodontology. 33, (12), 922-928 (2006).
  29. Torres, J., et al. Effect of solely applied platelet-rich plasma on osseous regeneration compared to Bio-Oss: a morphometric and densitometric study on rabbit calvaria. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 10, (2), 106-112 (2008).
  30. Yamada, Y., et al. Angiogenesis in newly augmented bone observed in rabbit calvarium using a titanium cap. Clinical Oral Implants Research. 19, (10), 1003-1009 (2008).
  31. Cordaro, L., Terheyden, H. ITI Treatment Guide. Wismeijer, D., Chen, S., Buser, D. 7, Quintessence. (2014).
  32. Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: A review. European Cells & Materials. 13, 1-10 (2007).
  33. Min, S., et al. Effects of marrow penetration on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvarium. Journal of Periodontology. 78, (10), 1978-1984 (2007).
  34. Braun, T. M. Ch. 4. Osteology guidelines for oral and maxillofacial regeneration Preclinical models for translational research. Giannobile, W. V., Nevins, M. Quintessence publishing. 31-43 (2011).
  35. Doro, D. H., Grigoriadis, A. E., Liu, K. J. Calvarial Suture-Derived Stem Cells and Their Contribution to Cranial Bone Repair. Frontiers in Physiology. 8, 956 (2017).
  36. Russel, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. Universities Federation for Animal Welfare. (1959).
  37. Asvanund, P., Chunhabundit, P. Alveolar bone regeneration by implantation of nacre and B-tricalcium phosphate in guinea pig. Implant Dentistry. 21, (3), 248-253 (2012).
  38. Gielkens, P. F., et al. Gore-Tex as barrier membranes in rat mandibular defects: an evaluation by microradiography and micro-CT. Clinical Oral Implants Research. 19, (5), 516-521 (2008).
  39. Lioubavina, N., Kostopoulos, L., Wenzel, A., Karring, T. Long-term stability of jaw bone tuberosities formed by "guided tissue regeneration". Clinical Oral Implants Research. 10, (6), 477-486 (1999).
  40. Mardas, N., Kostopoulos, L., Stavropoulos, A., Karring, T. Osteogenesis by guided tissue regeneration and demineralized bone matrix. Journal of Clinical Periodontology. 30, (3), 176-183 (2003).
  41. Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Mardas, N., Nyengaard, J. R., Karring, T. Deproteinized bovine bone used as an adjunct to guided bone augmentation: an experimental study in the rat. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 3, (3), 156-165 (2001).
  42. Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Nyengaard, J. R., Karring, T. Deproteinized bovine bone (Bio-Oss) and bioactive glass (Biogran) arrest bone formation when used as an adjunct to guided tissue regeneration (GTR): an experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 30, (7), 636-643 (2003).
  43. Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Nyengaard, J. R., Karring, T. Fate of bone formed by guided tissue regeneration with or without grafting of Bio-Oss or Biogran. An experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 31, (1), 30-39 (2004).
  44. Stavropoulos, A., Nyengaard, J. R., Kostopoulos, L., Karring, T. Implant placement in bone formed beyond the skeletal envelope by means of guided tissue regeneration: an experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 32, (10), 1108-1115 (2005).
  45. Thomaidis, V., et al. Comparative study of 5 different membranes for guided bone regeneration of rabbit mandibular defects beyond critical size. Medical Science Monitor. 14, (4), (2008).
  46. Zhang, J. C., et al. The repair of critical-size defects with porous hydroxyapatite/polyamide nanocomposite: an experimental study in rabbit mandibles. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 39, (5), 469-477 (2010).
  47. Zhang, X., et al. Osteoconductive effectiveness of bone graft derived from antler cancellous bone: an experimental study in the rabbit mandible defect model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 41, (11), 1330-1337 (2012).
  48. Bronoosh, P., et al. Effects of low-intensity pulsed ultrasound on healing of mandibular bone defects: an experimental study in rabbits. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44, (2), 277-284 (2015).
  49. Gomes, F. V., et al. Low-level laser therapy improves peri-implant bone formation: resonance frequency, electron microscopy, and stereology findings in a rabbit model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44, (2), 245-251 (2014).
  50. Lalani, Z., et al. Spatial and temporal localization of secretory IgA in healing tooth extraction sockets in a rabbit model. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 62, (4), 466-472 (2004).
  51. Osorio, L. B., et al. Post-extraction evaluation of sockets with one plate loss--a microtomographic and histological study. Clinical Oral Implants Research. 27, (1), 31-38 (2014).

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