Modello calvariale di aumento osseo nel coniglio per la valutazione della crescita ossea e della neovascolarizzazione nei materiali di sostituzione ossea

Bioengineering

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Summary

Qui presentiamo un protocollo chirurgico nei conigli con l'obiettivo di valutare i materiali di sostituzione ossea in termini di capacità di rigenerazione ossea. Utilizzando cilindri PEEK fissati su teschi di coniglio, osteoconduzione, osteoinduzione, osteogenesi e vasculogenesi indotta dai materiali possono essere valutati su animali vivi o eutanasia.

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Marger, L., Barone, A., Martinelli-Kläy, C. P., Schaub, L., Strasding, M., Mekki, M., Sailer, I., Scherrer, S. S., Durual, S. Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials. J. Vis. Exp. (150), e59976, doi:10.3791/59976 (2019).

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Abstract

Il principio di base del modello calvariale del coniglio è quello di far crescere il nuovo tessuto osseo verticalmente sopra la parte corticale del cranio. Questo modello consente la valutazione dei materiali di sostituzione ossea per la rigenerazione ossea orale e craniofacciale in termini di crescita ossea e supporto neovascolare. Una volta che gli animali sono anestesizzati e ventilati (intubazione endotracheale), quattro cilindri in etere chetone (PEEK) sono avvitate sul cranio, su entrambi i lati delle suture mediane e coronali. Cinque fori intramedullari sono perforati all'interno dell'area ossea delimitata da ogni cilindro, consentendo l'afflusso di cellule del midollo osseo. I campioni di materiale vengono collocati nei cilindri che vengono poi chiusi. Infine, il sito chirurgico viene suturato e gli animali si risvegliano. La crescita ossea può essere valutata sugli animali vivi utilizzando la microtomografia. Una volta che gli animali sono eutanasia, la crescita ossea e la neovascolarizzazione possono essere valutate utilizzando microtomografia, immuno-istologia e immunofluorescenza. Poiché la valutazione di un materiale richiede la massima standardizzazione e calibrazione, il modello calvariale appare ideale. L'accesso è molto semplice, la calibrazione e la standardizzazione sono facilitate dall'uso di cilindri definiti e quattro campioni possono essere valutati simultaneamente. Inoltre, la tomografia viva può essere utilizzata e, in ultima analisi, si può prevedere una grande diminuzione degli animali da eutanasia.

Introduction

Il modello calvariale di aumento osseo è stato sviluppato negli anni '90 con l'obiettivo di ottimizzare il concetto di rigenerazione ossea guidata (GBR) nel dominio chirurgico orale e craniofacciale. Il principio di base di questo modello è quello di far crescere il nuovo tessuto osseo verticalmente sopra la parte corticale del cranio. A tale scopo, un reattore (ad esempio, titanio -dome, -cilindro o -gabbia) è fissato sul cranio per proteggere la rigenerazione ossea condotta da un innesto (ad esempio, idrogel, sostituto osseo, ecc.). Con l'aiuto di questo modello, le gabbie in titanio o ceramica1,2,3,4,5,6, gbR membrane7,8,9 ,10, fattori osteogenici11,12,13,14,15,16,17, nuovo osso sostituisce12,16,17,18,19,20,21,22,23 , 24 Mi lasa' di , 25 mi lato , 26 del sistema di , 27 mi lapiùdel , 28 mi la più del 24 , 29 o il meccanismo di neovascolarizzazione durante il processo di rigenerazione ossea30.

Dal punto di vista traslazionale, il modello calvariale rappresenta un difetto di una parete che può essere paragonato a un difetto di classe IV nella mascella31. L'obiettivo è quello di far crescere un nuovo osso sopra un'area corticale, senza alcun supporto laterale da pareti ossee endogene. Il modello è quindi estremamente rigoroso e valuta il reale potenziale dell'osteoconduzione verticale sulla parte corticale dell'osso. Se il modello qui descritto è principalmente dedicato alla valutazione dell'osteoconduzione nei sostituti ossei, l'osteogenesi e/o l'osteoinduzione possono essere valutati, così come vasculogenesi1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30.

Essenzialmente per motivi etici, pratici ed economici, il modello calvariale è stato sviluppato nel coniglio in cui il metabolismo osseo e la struttura sono abbastanza rilevanti rispetto all'uomo32. Dei 30 riferimenti citati in precedenza, l'80% ha utilizzato il modello calvariale del coniglio1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23,26,27,28,29,30,33, dimostrando così la rilevanza di questo modello animale. Nel 2008, il gruppo Busenlechner ha trasferito il modello calvariale al maiale, per consentire il confronto di otto sostituti ossei contemporaneamente20 (rispetto a due sostituti ossei con il coniglio). D'altra parte, il nostro gruppo ha trasferito il modello calvarialdi del coniglio alle pecore. In breve, le cupole di titanio sono state poste su teschi di pecora per caratterizzare l'osteoconduzione di un nuovo sostituto osseo stampato in 3D. Questi studi ci hanno permesso di sviluppare e padroneggiare il modello calvariale e la sua analisi16,21.

Gli ultimi tre studi citi16,20,21, insieme a diverse altre indagini12,17,18,19,22, 23,24,26,27,28,29, ha confermato il grande potenziale del modello calvariale come screening e caratterizzazione modellino. Tuttavia, anche se i risultati ottenuti sono stati abbastanza soddisfacenti, hanno anche evidenziato alcune limitazioni: (1) L'uso di cupole di titanio, che hanno impedito la diffusione dei raggi X e, a sua volta, l'uso di micro-CT dal vivo. Questi non potevano essere rimossi prima dell'elaborazione istologica, costringendo i ricercatori a incorporare i campioni nella resina poliettica (methacrita) di metiliato (PMMA). Le analisi risultanti sono state quindi in gran parte limitate alla topografia. (2) Costi finanziari elevati soprattutto a causa del costo degli animali e dei costi legati alla logistica, alla manutenzione e alla chirurgia degli animali. (3) Difficoltà nell'ottenere approvazioni etiche per gli animali di grandi dimensioni.

Un recente studio di Polo, et al.26 ha ampiamente migliorato il modello sul coniglio. Le cupole di titanio sono state sostituite da cilindri closable che potevano essere riempiti con un volume costante di materiale. Quattro di questi cilindri sono stati posizionati su teschi di coniglio. Al termine, i cilindri potevano essere rimossi in modo che le biopsie fossero prive di metalli, introducendo molta più flessibilità per quanto riguarda la lavorazione dei campioni. Il modello calvariale del coniglio è diventato interessante per i test simultanei con costi inferiori, facile gestione degli animali e facilitazione della lavorazione del campione. Approfittando di questi recenti sviluppi, abbiamo ulteriormente migliorato il modello sostituendo il titanio con PEEK per produrre cilindri, consentendo così la diffusione dei raggi X e l'uso della microtomografia su animali vivi.

In questo articolo, descriveremo i processi di anestesia e chirurgia e mostreremo esempi di uscite che possono essere ottenute utilizzando questo protocollo, cioè istologia (immuno-), istomorfometria, microtomografia viva ed ex vivo per valutare i meccanismi dell'osso rigenerazione e quantificare la nuova sintesi ossea supportata da materiali sostitutivi ossei.

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Protocol

In linea con i requisiti giuridici svizzeri, il protocollo è stato approvato da un comitato accademico e supervisionato dalle agenzie veterinarie cantonali e federali (autorizzazioni n. GE/165/16 e GE/100/18).

1. Dispositivi e animali specifici

  1. Cilindri
    1. Cilindri di macchina con linguette di stabilizzazione laterale fuori peek per avere diametro interno di 5 mm, diametro esterno di 8 mm e un'altezza di 5 mm (Figura 1).
    2. Tappi PEEK macchina con un design che permette di agganciare con precisione sulla parte superiore del cilindro (spessore 1 mm).
    3. Sterilizzare i cilindri e i tappi PEEK automatizzando l'autoclaving prima dell'intervento chirurgico.
  2. Viti
    1. Utilizzare microviti autoforanti (realizzati in titanio puro commerciale (grado 5)) per fissare i cilindri (1,2 mm di diametro, 4 mm di lunghezza). Sterilizzare da autoclaving prima dell'intervento chirurgico.
  3. Animali
    1. Acquistare conigli bianchi della Nuova èelanda di tre mesi (maschio o femmina), del peso di 2,5 kg ciascuno.
      NOTA: Abbiamo ottenuto conigli allevando presso l'Università di Ginevra.

2. Chirurgia

  1. Vassoio chirurgico
    1. Tenere bisturi, forbici, due pinze, ascensore periosteal, siringhe (1, 2, 5, 50 mL), motore chirurgico, borchie chirurgiche rotonde (0,8 mm di diametro), aghi, sterile salina, quattro cilindri, otto viti e cacciavite pronto.
  2. Trattamento preclinico
    1. Acclimatare gli animali una settimana prima dell'intervento.
    2. Fornire un antibiotico profilattico al giorno (5-10 mg/kg per bocca (PO)) a partire 2 h prima dell'intervento chirurgico fino a 3 giorni dopo l'intervento chirurgico.
  3. Anestesia e intubazione
    1. Sedano gli animali mediante iniezione intramuscolare (IM) di ketamina (25 mg/kg, 50 mg/mL, 0,5 mL/kg) - xylazin (3 mg/kg, 20 mg/mL, 0,15 mL/kg). Aspetta 20 min perché gli animali dormano
      profondamente (completa atonia muscolare).
      NOTA: Questa premedicazione consentirà un processo di intubazione semplice, veloce e indolore. L'analgesia profonda e l'anestesia sono indotte come descritto al punto 2.3.8.
    2. Inserire una cannula endovenosa (IV) nella vena marginale dall'orecchio e tenerla chiusa fino al completamento dell'intubazione.
      NOTA: Questa linea IV servirà a perfondere fentanil e propofol per analgesia profonda e anestesia, rispettivamente (vedere il passo 2.3.8).
    3. Mantenere l'anestesia fornendo il 5% di sevoflurane in ossigeno puro fino a quando non viene eseguita l'intubazione.
      NOTA: Questo passaggio è necessario solo se l'animale mostra segni di risveglio (movimenti oculari, contrazioni muscolari).
    4. Anestesizzare la trachea localmente spruzzando il 10% di lidocaina. Posizionare il coniglio in posizione prona e mantenere la testa in estensione verticale.
    5. Far scorrere il primo tubo endotracheale di piccolo diametro (2,5 mm) nella trachea del coniglio fino a quando il flusso d'aria non può essere udito nel tubo. Questo aprirà la larynx e faciliterà l'inserimento del tubo definitivo.
    6. Inserire una guida (catetere di intubazione) nel tubo per fissare la posizione del tubo nella trachea. Rimuovere il tubo di piccolo diametro e far scorrere il tubo endotracheale definitivo (4,9 mm) sulla guida.
    7. Rimuovere la guida e gonfiare il palloncino alla fine del tubo endotracheale per sigillare e bloccare il dispositivo nella trachea. Il tubo rimarrà in posizione, ma può essere fissato utilizzando un pizzo legato intorno alla fronte.  Ventilare immediatamente (7 mL/kg, frequenza di 40/min) l'animale con il 3% di sevoflurane in ossigeno puro.
    8. Perfusi (vena dell'orecchio) fentanil (0,01 mg/mL, 2–4 mL/h) per indurre analgesia, 2-4 mg/kg di (2%) propofol (20 mg/mL, 4-8 mL/h) per indurre l'anestesia e 4 mL/kg/h dell'acetato di Ringer per mantenere le condizioni iso-volumetriche.
    9. Posizionare una sonda di temperatura rettale. Monitorare anche la funzione cardiaca, temperatura e saturazione di ossigeno durante l'intero processo.
    10. Controllare la profondità dell'anestesia monitorando la respirazione autonoma; se l'animale mostra segni di respirazione autonoma, dispensa un piccolo bolo di propofol e fentanil.
  4. Preparazione del sito
    1. Posizionare il coniglio su un cuscinetto riscaldato (39 gradi centigradi) coperto da un materasso (per evitare ustioni) sul tavolo dell'intervento. Rasa il cuoio capelluto.
    2. Applicare un gel lubrificante sugli occhi per evitare irritazioni e secchezza. Disinfettare il sito strofinando la pelle con iodio povidone (10%). Quindi drappeggiare il coniglio con un drappo chirurgico sterile e ritagliare un'area di accesso per il cranio.
    3. Disinfettare il sito chirurgico con iodio povidone (10%) per la seconda volta. Applicare un gel lubrificante sugli occhi per evitare irritazioni e secchezza.
    4. Preparare un tavolo drappeggiato (drappo sterile) su cui posizionare il vassoio chirurgico completo.
  5. Apertura del sito chirurgico
    1. Anestesizzare localmente con un'iniezione sottocutanea (SC) di lidocaina 2% (1 mL) sul cranio.
    2. Incise attraverso la pelle (con un bisturi) lungo la linea sagittale calvariale, dalle orbite alla protuberanza occipitale esterna (lunghezza 4 cm). Assicurarsi che il periosteo sia inciso.
    3. Elevare delicatamente il periosteo (con un ascensore periosteal) su entrambi i lati dell'incisione. Risciacquare il sito con salina sterile.
  6. Posizionamento cilindro
    1. Individuare le suture mediane e coronali sul cranio (Figura 2A, B). Si noti che queste linee anatomiche formano una croce. I cilindri saranno posizionati in ciascuno dei quadranti definiti dalla croce, assicurando che il bordo del cilindro non sia sopra la sutura (Figura 2C).
    2. Posizionare il primo cilindro sul quadrante superiore sinistro (osso frontale sinistro) e provare a appoggiare il dispositivo. Fissare in posizione con una forte pressione della mano e avvitare un micro-vite, fino a quando la resistenza è sentito. Assicurarsi che la testa della vite sia a filo con la superficie della linguetta del cilindro.
    3. Ripetere la stessa procedura sull'altra linguetta per fissare il cilindro saldamente sul cranio. Assicurarsi che il cilindro sia fissato ermeticamente all'osso.
    4. Ripetere la procedura sul quarto superiore destro (osso frontale destro), nel quarto inferiore sinistro (osso parietale sinistro) e nel quarto inferiore destro (osso parietale destro).
  7. Foratura ossea di 5 fori intramedullari all'interno dell'area circoscritta dai cilindri (Figura 1)
    1. Forare un foro intramedullare sotto l'irrigazione salina (0,8 mm di diametro, 1 mm di profondità) con un bur rotondo sull'osso, al centro dell'area circoscritta dal cilindro. Assicurarsi che comanda un'emorragia.
    2. Forare altri due fori intramedullari lungo l'asse passando attraverso le due viti di tabulazione, ai bordi interni del cilindro. Lungo l'ascia perpendicolare, praticare altri due fori intramedullari ai bordi interni del cilindro. Assicurarsi che comanda un'emorragia.
    3. Ripetere l'operazione all'interno degli altri tre cilindri.
  8. Cilindri di riempimento con campioni di materiale e tamponatura (Figura 3)
    1. Preparare il materiale sostitutivo osseo desiderato secondo le istruzioni del produttore o le specifiche del materiale.
    2. Riempire il primo cilindro fino all'orlo con il campione di materiale e chiudere il cilindro montando il tappo. Ripetere il processo negli altri 3 cilindri.
  9. Chiusura di un sito chirurgico
    1. Chiudere la pelle sopra i cilindri con una sutura intermittente non riassorbibile.
    2. Applicare una medicazione spruzzabile sulla ferita.

3. Trattamento post-chirurgico

  1. Fermare l'analgesia e l'anestesia (propofol e fentanil perfusione arresto) e controllare il recupero della respirazione autonoma.
  2. Fermare la ventilazione una volta che l'animale ha recuperato la respirazione autonoma. Mantenere l'animale sotto ossigeno puro prima del risveglio completo.
  3. Iniettare buprenorfina cloridrica SC (0,02 mg/kg, 0,03 mg/mL, 0,67 mL/kg) e ripetere l'iniezione ogni 6 h per 3 giorni come analgesia post-chirurgica.
  4. Trasferire l'animale nella sua solita custodia con acqua e alimentazione completa.
  5. Rimuovere le suture dopo circa 10 giorni di guarigione della ferita.

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Representative Results

Il modello qui descritto è dedicato alla valutazione dell'osteoconduzione nei sostituti ossei. Possono essere valutate anche l'osteogenesi e/osteoinduzione di sostituti ossei (pre)cellularizzati o caricati con molecole bioattive, nonché vascologenesi1,2,3,4, 5 Del numero 3( , 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9 (in vie , 10 del sistema , 11 Del sistema di , 12 mila , 13 del sistema , 14 Del sistema , 15 Mi lasa del sistema , 16 , 17 mi lato , 18 mi lato , 19 del 12 , 20 anni , 21 Mieto , 22 Milia , 23 del 23 o , 24 Mi lasa' di , 25 mi lato , 26 del sistema di , 27 mi lapiùdel , 28 mi la più del 24 , 29 del 22 221 , 30. Può essere utilizzato uno studio cinetico, da 3 giorni fino a 3 mesi dopo l'intervento chirurgico a seconda dei meccanismi e delle uscite da analizzare. Una linea temporale classica che consente descrizioni a breve e metà tempo è: 2, 4, 6, 8 e 12 settimane. Si noti che un minimo di 6 campioni per punto temporale è obbligatorio per ottenere risultati significativi. Ogni campione da testare deve essere posizionato almeno una volta in ogni posizione sul cranio per ogni punto temporale (allocazione casuale). Infine, i campioni fittizi (ad esempio, i cilindri riempiti di sangue coagulato) devono essere inclusi nel protocollo34.

Una volta completato l'intervento chirurgico, la crescita ossea può essere monitorata in diversi punti temporali utilizzando la tomografia ossea sugli animali vivi. Un esempio è illustrato nella Figura 4A,B. Ulteriori analisi richiedono che gli animali siano sacrificati (iniezione per via endovenosa letale di 150 mg/kg pentobarbital (100 mg/mL). Dopo l'eutanasia, i campioni vengono sezionato e i cilindri vengono accuratamente rimossi (Figura 5). Le biopsie sono fissate con una soluzione di salina tampone fosfata e 4% formaldeide. La crescita ossea può quindi essere valutata utilizzando la microtomografia (Figura 4 C,D). I campioni possono anche essere trattati per la colorazione istologica (immune-). L'analisi istomorfometrica e le colorazioni specifiche sono quindi possibili completare l'analisi in modo più specifico (Figura6).

Figure 1
Figura 1: Specifiche dei cilindri PEEK. Due fori (0,8 mm di diametro) sono stati forati sulle schede di stabilizzazione laterali per l'avvitamento. Le posizioni dei 5 fori intramedullari (0,8 mm di diametro) da forare sul cranio all'interno dell'area delimitata dal cilindro sono contrassegnate con cerchi rossi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Immagine rappresentativa del cranio del coniglio e posizionamento dei cilindri. Immagini che mostrano le suture mediane e coronali sul teschio del coniglio delineando le ossa parietali e frontali sinistra-destra (A,B). Posizionamento dei cilindri su entrambi i lati delle suture (C). Barre di scala - 5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Immagine rappresentativa dei cilindri fissati, riempiti e incappucciati. Immagine che mostra quattro cilindri fissati sul cranio di un coniglio con viti in titanio. All'interno dell'area delimitata da ciascun cilindro, 5 fori intramedullari (0,8 mm di diametro, 1 mm di profondità) sono stati perforati sotto irrigazione con un bur rotondo per consentire la migrazione delle cellule ossee. I cilindri sono stati riempiti con diversi campioni sostitutivi ossei (volumi calibrati) prima del capping (viene mostrato solo un cilindro chiuso). Barra di scala - 5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Immagini rappresentative dell'analisi microtomografica (micro-CT). Con l'obiettivo finale di valutare la crescita ossea condotta da sostituti ossei, 4 cilindri sono stati fissati su un teschio di coniglio con viti in titanio e riempiti con materiali sostitutivi ossei. (A) Imaging live: scansione trasversale bidimensionale (14 min, 99 kV/88 a con una risoluzione di 20 m) di un cilindro a 12 settimane. (B) ricostruzione tridimensionale (3D) dall'analisi live micro-CT a 4 settimane (cerchi rossi: sostituti ossei nei cilindri; freccia rossa: controllo in cui il cilindro è riempito con sangue coagulato). (C,D) Dopo l'eutanasia (12 settimane), i cilindri sono stati rimossi prima della fissazione e dell'analisi micro-CT. (C) Scansione trasversale 2D (57 min, 99 kV/88 - A con una risoluzione di 10 m) di un cilindro e ricostruzione 3D del nuovo osso totale nel cilindro (D). Vengono mostrate le particelle sostitutive ossee (rosso), nuovo osso (verde) e il letto osseo (giallo). Barre di scala - 2 mm Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Immagini rappresentative di una biopsia a 4 settimane. Dopo l'eutanasia (4 settimane), i campioni sono stati sezionati a blocchi e i cilindri sono stati rimossi prima della fissazione nel 4% di formalina, analisi micro-TC e elaborazione istologica. Barra di scala 5mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Immagini rappresentative di sezioni (immuno-)istologiche. Con l'obiettivo finale di valutare la crescita ossea e la neovascolarizzazione condotta da sostituti ossei, 4 cilindri sono stati fissati su un teschio di coniglio con viti in titanio e riempiti con sostituti ossei. Dopo l'eutanasia (12 settimane), i cilindri sono stati rimossi prima della fissazione e della lavorazione istologica. (A) Colorazione Masson-Goldner (50x): il sostituto osseo appare come particelle di malva circondate da un nuovo osso in verde. (B) Le fette sono state scansionate ed elaborate per l'estrazione digitale del materiale sostitutivo osseo in modo che il nuovo osso (rosso) potesse essere quantificato facilmente. (C) Immunostaining di CD31 (frecce), un marcatore tipico delle cellule endoteliali e del processo di neovascolarizzazione. (D) Colorazione immunofluorescente (verde) di una zona altamente neovascolare in cui alcuni nuovi capillari esprimono espressa altamente CD31 (freccia). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il modello qui descritto è semplice e deve essere sviluppato abbastanza facilmente fino a quando tutti i passaggi sono seguiti e l'attrezzatura è adatta. Come il protocollo descritto è un metodo chirurgico, tutti i passaggi appaiono critici e devono essere seguiti correttamente. È fondamentale essere addestrati per esperimenti sugli animali, soprattutto nella manipolazione del coniglio e nell'anestesia. Non esitate a chiedere aiuto anestesista e veterinario professionale. È fondamentale insistere sul monitoraggio visivo quotidiano degli animali prima e dopo la rimozione della sutura. Anche se la pelle del cranio è spessa, abbondante e allentata, la fissazione dei cilindri induce grandi tensioni. Se le suture vengono rimosse troppo presto, la ferita potrebbe riaprirsi e richiederà un'altra settimana di sutura e un nuovo trattamento antibiotico. In caso di dishiscenza fuori dalla linea della ferita, il chirurgo dovrà considerare se la sutura è possibile o meno. In caso contrario, sarà necessario prendere in considerazione il rifiuto del campione.

Oltre ai passaggi critici descritti nella sezione relativa al protocollo, i dettagli riportati di seguito possono essere utili per la corretta implementazione di questo protocollo. Da un punto di vista tecnico, poiché i conigli utilizzati sono giovani e piccoli, è importante utilizzare un'intubazione in due fasi, come descritto nel protocollo. Il secondo tubo (e finale) è troppo grande per essere utilizzato nella prima intubazione, e c'è un rischio reale di "modo sbagliato" che può essere deleterio o addirittura fatale.
A seconda dei materiali testati, può essere interessante prelevare un campione di sangue fresco dalla linea dell'orecchio IV che è già posizionata. Questo potrebbe fornire un buon metodo per pre-infondere il materiale sostitutivo osseo con cellule naturali e fattori di crescita. Il sangue appena coagulato può anche fornire un campione di farsa ideale.

Il modo in cui vengono perforati i fori intramedullari dovrebbe essere molto utile per la futura elaborazione istologica e l'analisi istomormetrica. In effetti, fintanto che i fori sono (i) nella stessa posizione, (ii) le biopsie sono orientate in modo simile e (iii) il processo di taglio è standardizzato (cioè stesso spessore, stesso livello di taglio), i campi che vengono valutati sono equivalenti e il loro confronto è altamente pertinente. Per una questione di standardizzazione, può essere di reale interesse calibrare la quantità di volume di materiale per riempire il cilindro, e per prepararlo in anticipo, in modo sterile.

Da un punto di vista scientifico, a seconda dei prodotti o ipotesi testate, può essere importante evitare di posizionare i cilindri su suture ossee. Alcune cellule staminali specifiche sono presenti in queste strutture35, diverso dalle cellule staminali ossee mesenchys che sono coinvolte nei meccanismi di ossificazione intramembrana, cioè il processo di rigenerazione ossea incontrato nella zona orofacial. Pertanto, un pregiudizio reale può verificarsi in caso di smarrimento.

Uno dei principali vantaggi del modello calvariale è l'uso della microtomografia viva con cui la crescita ossea può essere seguita su un singolo animale come studio longitudinale. Questa strategia può ridurre in gran parte il numero di animali eutanasia e quindi rispettare la "regola 3R"36. A seconda del dispositivo microtomografo utilizzato (risoluzione, spazio disponibile per l'animale), si verificheranno variazioni in termini di strategia di anestesia (IV, gas, ecc.), così come nella risoluzione dell'immagine e la pertinenza dell'analisi risultante.
Usiamo abitualmente un microtomografo dedicato agli esperimenti sugli animali (ad esempio, Quantum GX) per i controlli di routine. Un esperimento tipico inizia con una sedazione, come descritto nel passaggio 2.3.1.A typical experiment starts with a sedation, as described in step 2.3.1. L'anestesia viene quindi mantenuta con il 2% di isoflurane in ossigeno puro. Questo permette all'animale di respirare con calma durante un tempo di scansione di circa 14 min (99 kV/88 a con una risoluzione di 20 m); ciò è sufficiente per controllare i parametri di base (innesto, fissazione del cilindro, analisi semiquantitativa della crescita ossea, ecc.). Quando si cerca un'analisi qualitativa e quantitativa precisa, sarà necessaria una messa a punto molto fine del tempo di scansione, della risoluzione, dell'anestesia e del posizionamento degli animali.

I modelli esistenti sviluppati per la valutazione dell'osteoconduzione, dell'osteogenesi, dell'osteoinduzione e della vasculogenesi, sono numerosi, soprattutto nel campo orofacial. A causa di considerazioni etiche ed economiche, il nostro scopo sarà limitato a coniglio o animali più piccoli. Oltre al cranio, le posizioni in cui il materiale può essere testato sono la mandibulla37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47, il diastema48 o le prese incisive (dopo l'estrazione dei denti)49,50,51. Ratti, topi, porcellini d'India e conigli possono essere utilizzati per ciascuno dei modelli descritti di seguito. In breve, un difetto critico viene perforato (o una presa viene creata dall'estrazione incisiva), riempita con il campione di materiale e quindi coperta da una membrana. A parte l'ovvio fatto che solo due campioni possono essere testati in ciascuna di queste posizioni (un campione per lato mandibile o per presa incisiva), le procedure chirurgiche sono anche in gran parte più difficili e invasive. Gli accessi al sito sono limitati e se si utilizza ratto o topi, la difficoltà è ulteriormente aumentata dalle dimensioni degli animali. Infine, la dimensione critica dei difetti (cioè dimensioni che non consentono una rigenerazione spontanea dell'osso) non è ben definita e varia da un animale all'altro.
Oltre a queste generalità, possono sorgere vincoli specifici a seconda della posizione anatomica sottoposta al difetto e alle successive analisi. Ad esempio, nel modello mandibolare, le radici dei denti sono presenti all'interno del difetto. Ciò può interferire con il materiale e modificare il processo di rigenerazione ossea. Il difetto potrebbe essere posto più disstally sul ramus, ma in quel caso, l'osso sarebbe molto sottile (due corticali apposti con uno spazio medullare estremamente sottile) e il volume del difetto risultante può essere troppo piccolo45,46, 47. Dati questi esempi di limitazioni e a seconda del modello, grandi deviazioni possono essere previste in termini di volume del materiale da testare, qualità e quantità di dati raccolti.

Poiché la valutazione di un materiale richiede un massimo di standardizzazione e calibrazione, il modello calvariale appare ideale. L'accesso è molto semplice, la calibrazione e la standardizzazione sono facilitate dall'uso di cilindri definiti e 4 campioni possono essere valutati simultaneamente. Inoltre, la tomografia viva può essere utilizzata e, infine, si può prevedere una grande diminuzione degli animali da eutanasia.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori sono in debito con Geistlich AG (Wolhusen, CH) e la fondazione di Osteologia (Lucerna, CH) (grant n.18-049) per il loro sostegno, così come Global D (Brignais, FR) per la fornitura delle viti. Un ringraziamento particolare va al dottor B. Schaefer di Geistlich. Siamo anche grati a Eliane Dubois e Claire Herrmann per la loro eccellente elaborazione istologica e i loro preziosi consigli. Infine, riconosciamo calorosamente Xavier Belin, Sylvie Roulet e l'intero team di Pr Walid Habre, "chirurgia sperimentale Dpt", per la loro notevole assistenza tecnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drugs
Enrofloxacine Baytril 10% Bayer Antibiotic
Fentanyl Bischel For analgesia
Ketalar 50mg/ml Pfizer Ketamine for anesthesia
Lidohex Bichsel Lubricating gel for the eyes
Opsite Smith and Nephew 66004978 Sprayable dressing
Povidone iodine 10%, Betadine Mundipharma anti-infective agent
Propofol 2% Braun 3538710 For anesthesia
Rapidocain 2% sintetica Local anesthesia
Ringer-acetate Fresenius Kabi Volume compensation
Rompun 2% Bayer Xylazin for anesthesia
Sevoflurane 5% Abbvie For anesthesia
Sterile saline Sintetica
Temgesic Reckitt Benckiser Buprenorphine hydrochloride, analgesia
Thiopental Inresa Ospediala For anesthesia
Xylocaine 10% spray Astra Zeneca For intubation
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Fresenius Vial pilot C Imexmed Infusion pump
Heated pad Harvard Apparatus
Suction dominant 50 Medela
Suction tubing Optimus Promedical 80342.2
Surgical motor Schick dental Qube Drilling of intramedullary holes
Ventilation Maquet Servo1
Name Company Catalog Number Comments
Material
Cylinders and caps Boutyplast Customized composition: PEEK (poly ether ether ketone)
Manual self-retaining shaft GlobalD ACT1K
Mobile handle for self-retaining shaft GlobalD MTM
Self- drilling screws GlobalD VA1.2KL4 cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3
Name Company Catalog Number Comments
Surgical tray
Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm Covidien 86233 For intubation
Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm Covidien 107-35G For intubation
Ethicon prolene 4-0 Ehticon 8581H Non-resorbable suture
Forceps Marcel Blanc BD027R 145 mm
Intubation catheter Cook medical Guide for intubation
Needlle holder Marcel Blanc BM008R
Needles BD Microlance3 Becton Dickinson 300300/304622 26G; 18G
Periosteal HU-Friedy P9X
Round surgical burs Patterson 78000 0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes
Scalpel Swann-Morton n°10 and n°15
Scissors Marcel Blanc 00657 180 mm
Syringes Omnifix Braun 4616057V 5ml, 10ml and 50ml
Venflon G22 Braun 42690985-01 Vasofix safety for the ear iv line

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