Ensayo Desafiador durotaxis de una sola célula para evaluar el control mecánico del movimiento celular y los eventos de señalización relacionados

Biology

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Summary

Las fuerzas mecánicas son importantes para controlar la migración celular. Este protocolo demuestra el uso de hidrogeles elásticos que se pueden deformar utilizando una micropipeta de vidrio y un micromanipulador para estimular las células con un gradiente de rigidez local para provocar cambios en la estructura celular y la migración.

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Svec, K. V., Patterson, J. B., Naim, N., Howe, A. K. Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events. J. Vis. Exp. (150), e59995, doi:10.3791/59995 (2019).

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Abstract

Durotaxis es el proceso por el cual las células detectan y responden a gradientes de tensión. Para estudiar este proceso in vitro, se debe manipular la rigidez del sustrato subyacente a una célula. Mientras que los hidrogeles con rigidez calificada y ensayos de migración a largo plazo han demostrado ser útiles en estudios de durotaxis, las respuestas inmediatas y agudas a los cambios locales en la tensión del sustrato permiten el estudio centrado de los movimientos celulares individuales y los eventos de señalización subcelular. Para probar repetidamente la capacidad de las células para detectar y responder a la rigidez del sustrato subyacente, se utiliza un método modificado para la aplicación de gradientes agudos de mayor tensión a las células individuales cultivadas en hidrogeles deformables que permite tiempo real la resistencia y la dirección de los gradientes de rigidez impartidos sobre las células en cuestión. Además, al afinar los detalles y parámetros del ensayo, como la forma y las dimensiones del micropipeta o la posición relativa, la colocación y la dirección del degradado aplicado, el ensayo se puede optimizar para el estudio de cualquier tipo de celda sensible y sistema. Estos parámetros se pueden modificar para cambiar de forma fiable el estímulo aplicado y ampliar la funcionalidad y versatilidad del ensayo. Este método permite el examen tanto del movimiento durotáctico a largo plazo como de cambios más inmediatos en la señalización celular y la dinámica morfológica en respuesta a la rigidez cambiante.

Introduction

En las últimas décadas, la importancia de las propiedades mecánicas del entorno de una célula ha ganado un reconocimiento creciente en la biología celular. Diferentes tejidos y matrices extracelulares tienen diferentes rigidezes relativas y, a medida que las células migran por todo el cuerpo, navegan por estos cambios, utilizando estas propiedades mecánicas para guiarlos1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. Las células utilizan la rigidez de un tejido dado para informar su comportamiento móvil durante procesos como el desarrollo, la cicatrización de heridas y la metástasis del cáncer. Sin embargo, los mecanismos moleculares que permiten la sensación y respuesta a estas entradas mecánicas siguen siendo en gran medida desconocidos1,2,3,4,5, 6 , 7.

Para estudiar los mecanismos a través de los cuales las células responden a las señales ambientales físicas, se debe manipular la rigidez o rigidez de las células adherentes subyacentes del sustrato. En 2000, Chun-Min Lo, Yu-Li Wang y sus colegas desarrollaron un ensayo8 por el cual la respuesta móvil de una célula individual a las señales mecánicas cambiantes podría ser probada directamente mediante el estiramiento de la matriz extracelular deformable (ECM) recubierto de poliacrilamida hidrogeles en los que se dolaron las células. Las células exhiben una preferencia significativa por migrar hacia sustratos más rígidos, un fenómeno que llamaron "durotaxis".

Desde el informe original en 2000, se han empleado muchas otras técnicas para el estudio de durotaxis. Los gradientes de rigidez escarpados se han fabricado mediante la fundición de geles sobre características rígidas como cuentas de poliestireno9 o postes de polímero rígido10 o polimerizando el sustrato alrededor de los bordes de una cubierta devidrio1 para crear mecánica ' escales». Alternativamente, los hidrogeles con gradientes de rigidez más superficiales pero fijos han sido fabricados por una variedad de métodos como gradientes de reticulador creados por dispositivos microfluídicos12,13 o gotas de solución de hidrogel lado a lado de rigidezdiferente 8, o hidrogeles con retitulador fotoreactivo tratado con exposición a la luz UV calificada para crear un gradiente de rigidez lineal14,15. Estas técnicas se han utilizado con gran efecto para investigar el movimiento celular durotáctico en masa con el tiempo. Sin embargo, normalmente estas características se fabrican antes del revestimiento de celdas y sus propiedades permanecen consistentes en el transcurso del experimento, confiando en el movimiento aleatorio de las celdas para el muestreo de gradientes mecánicos. Ninguna de estas técnicas es susceptible a la observación de cambios rápidos en el comportamiento celular en respuesta a estímulos mecánicos agudos.

Con el fin de observar las respuestas celulares a los cambios agudos en el entorno mecánico, los ensayos de durataxis de una sola célula ofrecen varias ventajas. En estos ensayos, las células individuales reciben un estímulo mecánico agudo al alejar el sustrato subyacente de la célula con una micropipeta de vidrio, introduciendo así un gradiente direccional de tensión de matriz celular. A continuación, se observan cambios en el comportamiento móvil, como la velocidad o la dirección de la migración, mediante microscopía de contraste de fase de células vivas. Este enfoque facilita la observación directa de las relaciones de causa y efecto entre los estímulos mecánicos y la migración celular, ya que permite una manipulación rápida e iterativa de la dirección y magnitud del gradiente de tensión y la evaluación de los consiguientes respuestas celulares en tiempo real. Además, este método también se puede utilizar para estimular mecánicamente las células que expresan proteínas de fusión fluorescentes o biosensores para visualizar los cambios en la cantidad, actividad o localización subcelular de proteínas sospechosas de estar involucradas en la mechanosensing y durotaxis.

Esta técnica ha sido empleada por grupos que estudian durotaxis8,16 y se describe aquí ya que ha sido adaptada por el Laboratorio Howe para estudiar el comportamiento durotáctico de las células cancerosas de ovario SKOV-3 y los mecanismos moleculares que subyacente durotaxis17. Además, se describe un método modificado para la fabricación de hidrogeles con una sola capa uniforme de microesferas fluorescentes cerca de la superficie de cultivo celular; esto facilita la visualización y optimización de gradientes de tensión generados por micropipette y puede permitir la evaluación de la contractilidad celular mediante microscopía de fuerza de tracción.

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Protocol

1. Fabricación de hidrogeles de poliacrilamida desformables con microesferas fluorescentes integradas

NOTA: Las instrucciones describen la polimerización de un hidrogel de 25 kPa de 22 m de diámetro y de aproximadamente 66 m de espesor. Todos o cada uno de estos parámetros se pueden modificar y las direcciones para hacerlo se pueden encontrar en el Cuadro 1 y en las notas17.

  1. Activación de platos con fondo de vidrio o tapas
    1. Prepare la solución de trabajo de silano de unión para la activación de una placa de imágenes con fondo de vidrio o una cubierta que se ajuste a una cámara de imágenes de células vivas. Mezclar 950 éL de etanol al 95%, 50 ml de ácido acético glacial y 5 l de silano de unión (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane).
      NOTA: El uso de un cubreobjetos inferior más grande en comparación con la cubierta superior dará espacio adicional para trabajar al preparar el gel y facilitará la colocación de la micropipeta de vidrio en pasos posteriores. Además, si utiliza un cubreobjetos en lugar de una placa de imágenes con fondo de vidrio, limpie la cubierta como se describe en la siguiente sección.
    2. Activar la superficie del vidrio durante 20 s con una varita corona e inmediatamente superponer 50 l de la solución de trabajo de silano de unión. Deje que la solución se seque durante 10 min.
    3. Enjuagar dos veces con 95% de etanol, luego dos veces con isopropanol y luego dejar que los cubreobjetos se sequen al aire durante aproximadamente 20 minutos.
      NOTA: El vidrio activado se puede almacenar durante un máximo de una semana en un desecador.
  2. Limpieza de los cubrecubiertas superiores
    1. Limpie los cubreobjetos superiores de 22 mm incubando en 2% de HCl a 70 oC durante 30 min, luego lave en ddH2O durante 10 min dos veces.
    2. Incubar los cubreobjetos en una solución de concentrado de limpieza de cubeta del 2% en ddH2O a 50 oC durante 30 min, luego lavar en ddH2O durante 10 min dos veces.
    3. Incubar los labios de las cubiertas en ddH2O a 90 oC durante 30 min, luego en etanol 70% a 70 oC durante 10 min, y luego secar al aire a 60 oC durante un mínimo de 2 h.
      NOTA: Los cubreobjetos limpios se pueden almacenar indefinidamente en un desecador limpio.
  3. Microesfera fluorescente / deposición de perlas en los cubreobjetos superiores
    1. Sonicar la solución de stock de microesferas fluorescentes durante 1 h en un baño de agua ultrasónico. Hacer una solución de perlas de trabajo diluyendo el stock de perlas 1:200 en 100% etanol y sonicar de nuevo durante 1 h.
    2. 15 minutos antes de que la solución de perlas haya terminado de sonicar, limpie a fondo los revestimientos colocándolos verticalmente en un soporte de cubierta de cerámica y tratando con plasma de aire de habitación durante 3 minutos en un limpiador de plasma demesa.
    3. Para facilitar el manejo y evitar el deslizamiento de la cubierta durante los pasos posteriores, coloque un pedazo de parafilm en una tapa de 60 mm de petri o en un recipiente similar. Coloque el cubreobjetos en el estabilizador y toque ligeramente hacia abajo, asegurando un buen contacto entre el parafilm y el cubreobjetos.
    4. Para un cubreobjetos de 22 mm, agregue 150 s de la solución de cordón de trabajo a la parte superior de la cubierta. Aspirar inmediatamente la solución de etanol desde el lado de la cubierta, dejando las perlas en la cubierta. Deje que el cubreobjetos se seque al aire.
      NOTA: La cantidad de solución de perlas de trabajo añadida debe ser de 4 l/cm2 y se puede escalar para adaptarse a cualquier resbalón de tamaño.
  4. Hidrogeles de fundición con perlas fluorescentes incrustadas
    1. Preparar la solución de hidrogel de acrilamida y bis-acrilamida. Mezclar la solución de acuerdo con la Tabla1, luego añadir 2,5 s de 10% de APS y 0,5 l de TEMED. Mezcla bien. Pase inmediatamente al siguiente paso.
      NOTA: La mezcla de la solución de hidrogel se puede modificar para variar el módulo del Joven, o rigidez, del hidrogel cambiando la relación de acrilamida a bis-acrilamida como se muestra en la Tabla1. Estos valores han sido verificados para su uso en el laboratorio Howe utilizando microscopía de fuerza atómica, pero deben ser confirmados dentro de su institución.
    2. Inmediatamente después de hacer la solución de hidrogel, agregue una gota de 25 l al lado activado de la placa de fondo de vidrio o al cubreobjetos inferior, luego coloque inmediatamente el cubreobjetos recubierto de perlas en la solución, lado perla hacia abajo. El contacto con la caída con el otro lado de la cubierta seguido de una bajada lenta ayuda a evitar la captura de burbujas de aire dentro del hidrogel.
      NOTA: La altura del hidrogel debe estar dentro de la distancia de trabajo de la lente objetivo que se utilizará en el experimento posterior. Una altura de hidrogel de 66 m funciona bien para la mayoría de los sistemas. El tamaño del hidrogel se puede escalar añadiendo más o menos solución de hidrogel dependiendo del tamaño de la cubierta. Para calcular el volumen adecuado de la solución de hidrogel, utilice la ecuación para el volumen de un cilindro, V á r2h donde r es el radio de deslizamiento de cubierta y h es la altura de hidrogel deseada. Típicamente, este cálculo predice con precisión justa la altura real del hidrogel, medida por la preparación de un gel con cubiertas recubiertas de perlas en la parte superior e inferior y utilizando un microscopio confocal para medir la distancia entre los dos planos del cordón. Sin embargo, se ha observado que la altura real del hidrogel puede desviarse de este cálculo en 20 m (por ejemplo, dependiendo del espesor y fabricante de la cubierta superior de vidrio). Se recomienda la medición directa de la altura del gel utilizando el método descrito anteriormente.
    3. Deje que el gel polimerice durante 30 minutos, luego retire suavemente el cubreobjetos superiores con fórceps. Añadir 50 mM HEPES pH 8.5 al plato puede facilitar la eliminación. Lavar durante 5 min en 50 mM HEPES pH 8,5 tres veces.
  5. Activación de hidrogel y recubrimiento de matriz extracelular
    1. Active la superficie del hidrogel incubando en hexanoato de 0,4 mM Sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidil 6-(4'-azido-2'-nitrofeniloamino) en 50 mM HEPES pH 8.5. Exponer inmediatamente a una lámpara de arco UV en un área cerrada.
      NOTA: Proteja Sulfo-SANPAH de la luz antes de la activación. Para una lámpara de 400 W, coloque el gel a 10 cm de distancia de la bombilla dentro de la caja de luz e ilumine durante 100 s. La solución Sulfo-SANPAH cambiará de naranja brillante a marrón oscuro.
    2. Lavar durante 5 min en 50 mM HEPES pH 8,5 tres veces.
      NOTA: Los geles hidratados pueden almacenarse a 4oC durante un máximo de una semana.
    3. Incubar el hidrogel activado en fibronectina de 20 g/ml en 50 mM de HEPES pH 8,5 durante 1 h a 37oC.
    4. Aspirar la solución de fibronectina y lavar durante 5 minutos en solución salina con fosfato (PBS) tres veces. Esterilice el hidrogel y la tapa del plato durante 15 minutos bajo luz UV en una campana de cultivo de tejido con un bajo volumen de PBS. Lavar una vez en PBS estéril.
      NOTA: Se pueden utilizar otros tipos de proteína ECM para recubrir el hidrogel, incluyendo colágeno y laminina.

2. Células de chapado

  1. Añadir 3 ml de medios que contengan 21.000 celdas para llenar un plato de 60 mm para una densidad celular final de 1000 celdas/cm2. Ajuste la densidad de sembrado según sea necesario para evitar el hacinamiento y permitir el libre movimiento de las células individuales.
  2. Permita que las células se recuperen a 37 oC durante al menos 4 horas y hasta 18 horas antes de la toma de imágenes. Prepárese para la toma de imágenes entrando con medios de diagnóstico por imágenes dos veces antes de agregar medios de diagnóstico por imágenes. Permita que las células se equilibren durante al menos 30 minutos antes de tomar imágenes.
    NOTA: Las condiciones de los medios de pantalla de antemano para determinar las condiciones que optimizarán la migración en la línea de celda que se está utilizando. Para las células SKOV-3, DMEM sin rojo fenol, que contiene 20 mM HEPES y 12,5 ng/ml factor de crecimiento epidérmico estimula la mayor cantidad de migración. Las condiciones óptimas para las células Ref52 son Tampón de Ringer con 10% de suero bovino fetal (FBS) y factor de crecimiento derivado de plaquetas de 25 ng/ml.

3. Preparación de micropipeta de vidrio: pipeta tirando y forja

  1. Tire de micropipetas de vidrio borosilicato de 100 mm de largo con un diámetro exterior de 1,0 mm y diámetro interior de 0,58 mm en un proceso de dos pasos para obtener un cónico de más de 2 mm que se reduce a 50 mm en el primer milímetro y se extiende a un tubo largo y paralelo de 10 m de diámetro en el último milímetro.
  2. Cargue el pipeta tirado en una microforja. Dé forma a la pipeta para tener una punta contundente de 15 m que se encierra en el extremo de una sección de 250 m doblada en un ángulo de 35o desde el resto de la tubería. El diámetro aproximado en la curva debe ser de alrededor de 30 m para dar fuerza a la punta.
    NOTA: Las dimensiones de la inclinación y la punta se pueden ajustar para aplicar correctamente la fuerza deseada (consulte el paso 5). Tirando de micropipetas a 65 oC para el primer paso para 3 mm, y 60 oC para el segundo paso produce las dimensiones descritas en el paso 3.1. Los resultados con diferentes tiradores de pipetas pueden variar.
  3. Esterilice el micropipeta en 70% de etanol antes de su uso.

4. Colocación del micromanipulador y la micropieta

  1. Retire la tapa del plato y cargue el plato en el escenario y el centro del microscopio. Utilice un objetivo de aumento 10X o similarmente bajo. Cubra el medio con aceite mineral para evitar la evaporación de los medios.
  2. Inserción de pipeta tirada
    1. Inserte el pipeta tirado en la vaina de la micropipette, apuntando el gancho hacia el plato. La punta del gancho será el punto más bajo cuando se baje al gel.
    2. Inserte la vaina en el micromanipulador y ajuste hasta que la punta del pipeteo esté centrada sobre la lente objetivo en ambas direcciones X e Y.
    3. Baje el pipeta usando un manipulador grueso hasta que solo toque la superficie del líquido.
  3. Usando contraste de fase o campo brillante, enfoca el microscopio en la capa de perlas en la parte superior del gel. Este será el plano de referencia.
  4. Asegurarse de que el objetivo no está en peligro de golpear la muestra o etapa, poner el foco por encima del gel para encontrar la punta de la micropipeta, utilizando pequeños ajustes del manipulador grueso en las direcciones X e Y para proyectar sombras en el plano focal. Sólo baje el micropipeta cuando esté seguro de que la punta misma del pipeteo está en el campo de visión.
  5. Asegúrese de que la punta contundente del micropipeta esté apuntando hacia abajo girando el pipeta en la vaina o girando la vaina en el micromanipulador hasta que la punta sea perpendicular al plano focal. Repita los pasos 4.4 y 4.5 según sea necesario. Concéntrese en la punta de la tubería.
  6. Enfóquese de nuevo a la capa superior del cordón del gel para medir qué tan lejos está el pipeteo de la superficie del gel. Enfóquese de nuevo en un plano que se encuentra a parte del gel y la punta de la tubería. Baje lentamente la tubería para llegar al plano focal intermedio.
  7. Repita el paso 4.6 hasta que se puedan apreciar sombras muy débiles de la punta del micropipeta cuando se enfoque en el hidrogel. Aumente a la siguiente ampliación más alta.
  8. Baje el micromanipulador hasta que las sombras y las refracciones de la punta misma del micropipeta se puedan apreciar dentro del plano focal de la capa de perlas.
  9. Aumente el aumento a lo que se utilizará en el experimento. Baje el pipeta hasta que se cierne justo por encima de la superficie del hidrogel.

5. Calibración del micromanipulador y la generación de fuerza

  1. En fase o campo brillante, baje el micropipeta flotante para tocar la superficie del hidrogel. Observe cómo el pipeteo se ve al contacto con el hidrogel. Continúe bajando el micropita en Z hasta que los ajustes en X e Y causen tracción y desviación del hidrogel en esas direcciones. Utilice las microesferas o células cercanas como marcas fiduciarias.
    NOTA: Si el micromanipulador está unido al brazo del condensador de fase o al banco y no a la etapa de la muestra en sí, desenganche siempre el gel antes de mover el escenario para evitar romper la tubería o perturbar las células. Si el pipeteo se rompe, vuelva al paso 3 y al paso 4.
  2. Encuentre un área desprovista de células para enganchar el gel. Tire de él en todas las direcciones y sentirse cómodo con la forma en que la micromanipulación se traduce en la deformación del gel.
  3. Tome imágenes fluorescentes del campo de cuentas sin manipulación, con el pipeta enganchando el gel, y con el pipeteo comprometido tirando del gel. Repita esto varias veces tomando buenas notas con respecto a las marcas de graduación en el micromanipulador, la forma en que la punta del pipeteo se ve en fase o campo brillante en cada etapa de tirar, y la distancia que la punta se mueve usando esa manipulación.
  4. Utilice ImageJ como se describió anteriormente16,17 para calcular los desplazamientos relativos de perlas y la fuerza aplicada a las perlas comparando el campo de cordón nulo con el campo de cordón sin compromiso de pipeta, el campo de cordón con el gel activado, y el gel tirado.
  5. Para afinar el estímulo tensal, compare la aplicación de la fuerza utilizando diferentes dimensiones de la punta de la micropipeta, distancias de la célula o distancia tirada por el micromanipulador desde el punto inicial de touchdown. El efecto de la dimensión de la punta de la micropipeta en la aplicación de la fuerza da una gran flexibilidad al usuario, pero también demuestra la necesidad de generar mapas de fuerza para nuevos micropipetas, incluso cuando las dimensiones y la forma se asemejan mucho a las puntas calibradas anteriormente.

6. Llevar a cabo el ensayo durotaxis

  1. Antes de realizar el experimento, practique la participación del gel cerca de una célula y observe la deformación de la célula cuando se reposiciona el micromanipulador.
  2. Supervise un grupo de celdas que tienen polaridad clara y parecen moverse durante 30 minutos para identificar las celdas que se mueven de forma dirigida.
  3. Elija una celda que se mueva en una sola dirección clara y monitorícela a la velocidad de fotogramas deseada durante 30 minutos adicionales.
  4. Si se desea la determinación de las fuerzas ejercidas sobre la célula o la tensión ejercida por la célula, capture las imágenes de campo del cordón en cada adquisición. Si la célula cambia su curso de dirección durante el monitoreo, elija una célula diferente para monitorear, ya que esto hará difícil determinar el efecto de la estimulación.
  5. Encienda el hidrogel aproximadamente a 50 m de distancia de la célula. Coloque el pipeta delante del lado cercano del borde delantero y mueva el micromanipulador de forma que el gel se deforme ortogonalmente a la dirección de viaje de la celda. Observe la célula a lo largo del tiempo a medida que responde al gradiente agudo y local de rigidez.
    NOTA: El tiempo proporcionado aquí es eficaz cuando se monitorean los fibroblastos SKOV3 o Ref52, sin embargo, el intervalo y el curso de tiempo general deben ajustarse para adaptarse al tipo de célula y al evento biológico que se observa. Si se empareja con microscopía de fluorescencia, detenga la adquisición de fluorescentes inmediatamente antes del paso 6.5., utilice el contraste de fase o el campo brillante para colocar la micropipeta y el tirón, y reinicie la adquisición de fluorescentes inmediatamente después.
  6. Si el pipeteo se desliza o si el degradado se relaja o suelta de otro modo, busque una nueva celda repitiendo los pasos 6.2 y 6.3.

7. Determinación de la respuesta migratoria dura

  1. Usando ImageJ19 u otro programa de análisis de imágenes, calcule el ángulo de giro dibujando una línea entre el centro del borde inicial de la celda a 0 min y 30 min monitor de poste (reflejando la trayectoria original de la celda) y otra línea entre el centro de el borde delantero justo antes y 80 minutos después de la estimulación y la medición del ángulo entre estas dos líneas.

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Representative Results

Mediante la preparación de micropipetas (Figura 1) y la normalización de la generación de fuerza de los tiradores (Figura2 y Figura 3) como se ha descrito anteriormente, se han identificado condiciones durasóptimas óptimas para varias líneas celulares. Utilizando esta técnica, como se describe en la Figura4, las células cancerosas de ovario SKOV-317 y los fibroblastos embrionarios de rata Ref52 (Figura5)se mueven hacia una mayor rigidez en los gradientes aplicados por un micropipeta de vidrio. Además de durotaxis, este método se puede utilizar para estudiar eventos de señalización dinámica utilizando biosensores y marcadores fluorescentes. Por ejemplo, la estructura y la señalización dentro de las estructuras de adhesión focal se puede observar tras la estimulación duratáctica. El sensor de tensión de la vinculina (VinTS) es un biosensor basado en FRET que se localiza en adherencias focales, permitiendo la observación fluorescente de la dinámica de adhesión focal y la medición de los cambios en la tensión dentro de esas estructuras19. Las células Ref52 que expresan transitoriamente VinTS en geles de poliacrilamida de 125 kPa muestran la formación de adherencias focales en la dirección de estiramiento durante el período de tiempo de 40 min (Figura6A). El análisis FRET20 revela que la vinculina localizada a adherencias focales experimenta un cambio inmediato en la tensión cuando se presenta con estimulación duratáctica aguda (Figura6B)ampliando la utilidad de este ensayo a la observación de subcelulares eventos de señalización en respuesta a la estimulación duratáctica.

Figure 1
Figura 1. Diagramas de micropipetas típicas tiradas (A) y forjadas (B). (A) Los micropipetas se extraen utilizando un protocolo de dos pasos para lograr un cónico de 1 mm a 10 mm de más de 2 mm. (B ) Los micropipetas se cargan en la microforja y sus puntas se doblan, encierran y acortan de modo que los últimos 250 m de la La micropipette se dobla en un ángulo de 35o y se estrecha de 30 a 30 m a una punta redondeada que mide 15 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Mejora del campo de cuentas después del recubrimiento de etanol en comparación con el método tradicional utilizando poli-L-lisina. Campos de cuentas hidrogel representativos de poli-L-lisina y etanol (EtOH) métodos de recubrimiento de cobertura por evaporación utilizando cuentas fluorescentes de color amarillo-verde, rojo y rojo oscuro. Barra de escala: 25 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Generación de mapa de fuerza para un estiramiento durotáctico ejemplo. (A) Posición de las microesferas fluorescentes antes y después (verde y rojo pseudocolor, respectivamente) deformando el hidrogel con un micropipeta (situado más allá del borde derecho del panel). Barra de escala: 25 m. Los vectores de desplazamiento (B) y el mapa de calor de desplazamiento (C) entre los campos de cordón nulo y tirado generados por los plugins de microscopía de fuerza de tracción en ImageJ resaltan el gradiente de la deflexión del cordón y la tensión de hidrogel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Esquema de ensayo durotaxis y determinación del ángulo de deflexión. (A) Se observa una celda durante al menos 30 minutos para determinar su trayectoria original. (B) El micropipeta se coloca ortogonalmente a la trayectoria de la célula, a 50 m del borde de la célula. El hidrogel es atacado por la micropipette de tal forma que mover la micropipeta ejercerá fuerza sobre la superficie del hidrogel. (C) El micropipeta se extrae 20 m de distancia de la célula, ortogonal a la trayectoria de la célula que crea un gradiente agudo, local de tensión (denotado en azul) que aumenta hacia la micropipette. (D) La celda se observa a lo largo del tiempo a medida que navega por el degradado aplicado. (E) En ImageJ o en un programa de análisis de imágenes, la trayectoria original (línea discontinua) está marcada por una línea dibujada desde el centro de la celda a través del centro del borde inicial en el primer fotograma. La trayectoria final (línea sólida) se marca con una línea dibujada después de que se permite que la celda navegue por el degradado de tensión aplicado. El ángulo entre estas dos líneas hacia el estímulo se denomina "ángulo de giro", marcado aquí por el .. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5. Los fibroblastos embrionarios de rata se mueven hacia regiones de mayor rigidez del sustrato en durotaxis. Curso de tiempo que muestra el movimiento durotáctico de una celda Ref52 10 min antes del tirón (panel 1), 1 min antes del tirón (panel 2), en el momento de tirar (panel 3), y 1 h después de tirar (panel 4). La flecha indica la dirección del estiramiento. Barra de escala: 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6. Localización de proteínas y actividad durante la estimulación duratáctica mediante marcadores fluorescentes o biosensores. Las células Ref52 que expresan transitoriamente el sensor de tensión de la vinculina (VinTS)19 migrando en geles de poliacrilamida de 125 kPa se presentan con estimulación duratáctica aguda. ( A ) Despuésdela estimulación, se forman nuevas adherencias focales en la dirección del estiramiento a medida que las células se reorientan a lo largo del gradiente de rigidez. Durante dos períodos de 10 minutos, a partir de 20 minutos antes de la estimulación mecánica y 21 min después de la estimulación, se monitorizaron la morfología celular (superior) y la formación de adherencia focal (abajo). El color rojo indica el primer punto de tiempo dentro del período de tiempo y el color verde indica el punto de tiempo 10 min más tarde. Las nuevas adherencias focales formadas dentro del período de 10 min se muestran en verde. Antes de la estimulación, se forman nuevas adherencias focales en la dirección del viaje. Después de la estimulación, se forman nuevas adherencias focales en la dirección del estiramiento. La flecha indica la dirección del estiramiento. Las puntas de flecha indican áreas con adherencias focales formadas durante ese período de 10 minutos. Barra de escala: 25 m. (B) El análisis FRET de fluorescencia VinTS indica un cambio en la tensión dentro de las adherencias focales proximal a durotactica. El contorno de la membrana celular antes y después del estiramiento resalta la deformación de la célula tras la estimulación. Las puntas de flecha indican ejemplos de adherencias focales que experimentan cambios en la relación FRET al estirar. Barra de escala: 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Rigidez deseada del hidrogel 3 kPa 25 kPa 125 kPa
7.5% Acrilamida 100 l 100 l 160 l
0.5% Bis-Acrilamida 10 l 100 l 100 l
ddH2O 287 l 197 l 137 l

Tabla 1. Soluciones de gel de acrilamida.

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Discussion

Aquí se muestra un ensayo repetible de durataxis de una sola célula que permite evaluar la capacidad de una célula para alterar su comportamiento de migración en respuesta a señales mecánicas agudas. Esta técnica también se puede utilizar en combinación con microscopía de fluorescencia y proteínas de fusión o biosensores apropiados para examinar la señalización subcelular y los eventos citoqueléticos en cuestión de segundos de estimulación mecánica o en un plazo más largo durante movimiento durotáctico. Comprender la relación de una célula con su entorno implica el estudio del impacto de los aspectos químicos y mecánicos de ese entorno. Aunque potencialmente difícil de dominar, este ensayo durotaxis puede ser ampliamente utilizado para entender la respuesta celular a los cambios en su microambiente mecánico.

Importancia con respecto a los métodos existentes

Como se mencionó anteriormente, este método de estimulación duratáctica basado en micropipetas es altamente manipulable, permitiendo un alto grado de control espaciotemporal sobre los estímulos mecánicos, una ventaja importante sobre otras técnicas, como la lineal o la preformada lineal o pasos-gradientes de rigidez. La magnitud y la dirección de los gradientes de deformación unitaria impartidos se pueden visualizar mediante el seguimiento del desplazamiento de las cuentas fluorescentes incrustadas en el hidrogel, cerca de la superficie de cultivo celular.

Restringir estos marcadores fiduciarios a una sola capa justo debajo de la superficie de cultivo aumenta la precisión de este seguimiento. Las microesferas situadas debajo del plano de desviación (impartidas por la micropipeta o, para la microscopía de fuerza de tracción, por contractilidad celular), como ocurriría con la mezcla uniforme de las microesferas a lo largo del hidrogel, se moverán menos que en el plano microesferas, lo que puede conducir a la subestimación de las fuerzas aplicadas. Además, esta modificación es más fácil de realizar y más fiable que los métodos en los que las perlas se superponen en una capa extremadamente delgada de poliacrilamida fundida en la parte superior de un gel preformado21 o llevada a la superficie del hidrogel por sedimentación asistida por gravedad22 y produce una dispersión más uniforme de las perlas a través del hidrogel que los métodos descritos anteriormente17,23.

Modificación y futuras aplicaciones

Los detalles de este ensayo se pueden modificar para adaptarse mejor a la línea de interés celular. Por ejemplo, se puede utilizar una variedad de moléculas de matriz extracelular (porejemplo, colágeno I, colágeno IV, laminina) u otros ligandos adhesivos para funcionalizar el hidrogel. Además, la rigidez inicial del hidrogel se puede elevar o bajar fácilmente ajustando la relación entre acrilamida y bis-acrilamida (ver Tabla 1). Al cambiar las dimensiones de la punta de la micropipeta y la magnitud del tirón, este ensayo se puede optimizar para impartir un estímulo durotáctico repetible y eficaz para el tipo de célula en cuestión.

Pasos críticos y solución de problemas

Sólo las células que siguen una trayectoria estable y lineal de migración antes de la manipulación del hidrogel deben ser estimuladas para asegurar que los cambios en la trayectoria se deban al estímulo mecánico y no a la fluctuación aleatoria. Se debe tener cuidado de fabricar una micropipeta de vidrio que enganche la superficie del hidrogel sin resbalar, pero no desgarra el gel cuando se tira. Es importante aplicar un estiramiento constante y constante al hidrogel durante el transcurso del experimento para obtener resultados limpios, lo que significa que el usuario debe practicarse en la colocación y movimiento de la micropipeta antes de encontrar una célula. Cualquier movimiento involuntario de la micropipeta que conduzca a cambios en el gradiente de tensión podría afectar la capacidad de la célula para durotax. Del mismo modo, la manipulación del gel debe practicarse con cada nueva micropipeta que se forja como ligeros cambios en la forma de la pipeta puede hacer que la interacción pipeteo/gel varíe.

Si no se coloca la micropipeta dentro del campo de visión microscópico antes de aumentar el aumento, se puede provocar la rotura accidental de la frágil punta de vidrio. Asegúrese de que se conoce la altura y la posición X-Y de la punta antes de bajar el micropipeta con el micromanipulador. Siempre controle la posición de la micropipeta para reducir el riesgo de rotura. Se recomienda que el aumento se reduce de nuevo a 10 veces por cada nueva micropipeta cargada en el micromanipulador, ya que ligeros movimientos del micromanipulador y la vaina de pipeta pueden dar lugar a grandes cambios aparentes en la posición de la recién cargada Micropipeta.

Antes de encontrar las células a observar, es importante probar primero el micropipeta para confirmar que enganchará el hidrogel como se esperaba y que es adecuado para aplicar el estiramiento deseado. Encontrar las dimensiones de la punta que se adapten al experimento y al tipo de célula es fundamental para el éxito en la aplicación de la estimulación duratáctica. El extremo del micropipeta debe ser lo suficientemente redondeado para que no se rompa a través del gel, pero no tan redondeado que no lo agarre. Si el pipeteo no tira de gel con eficacia, puede estar deslizándose a lo largo de la superficie. La forma de la punta del micropipeta puede ser demasiado redondeada para enganchar se acoplar correctamente con la superficie del gel. Las dimensiones en la punta misma del micropipeta deben ajustarse hasta que se pueda lograr un contacto firme y constante de forma consistente. En algunos casos donde la micropipeta se desliza a través de la superficie del gel, puede ser necesario bajar la micropipeta más en el hidrogel para obtener más tracción. Si la micropipeta se rompe a través del gel, la punta puede ser demasiado fina o demasiado afilada. El desgarro del gel también puede indicar que se está aplicando demasiada fuerza al tirar. La micropipette debe elevarse ligeramente para reducir la deformación del gel y tirando de distancias más cortas.

A menudo, si la célula o el borde de la célula es sacado de foco por la micropipeta, la punta del micropipeta se activa demasiado cerca de la célula o el estiramiento es demasiado contundente. Mueva el micropipeta más lejos de la celda, sólo deformando ligeramente la celda en los planos X-Y. Mover la célula fuera de foco no sólo hará que los eventos celulares sean imposibles de monitorear y causar aberraciones ópticas, pero hará que la célula experimente más estimulación que el gradiente de tensión de 2 dimensiones previsto.

Lo más importante es que es fundamental registrar y analizar solo las respuestas que tienen una manipulación duratáctica consistente con un error humano mínimo. Si la bajada de la punta es imprecisa o si se reposiciona el micropités, los resultados del experimento se nublarán. Dado que este ensayo es complejo y muchos pasos son propensos a errores, se debe tener cuidado en cada paso para evitar cambios involuntarios en la estimulación de las células. El error en cualquier paso puede dar lugar a una aplicación de estiramiento incoherente y resultados poco fiables.

Limitaciones

Hay limitaciones a esta técnica que deben ser consideradas. Lo más prominente, la forjificación precisa y la manipulación de los micropipetas de vidrio pueden presentar una curva de aprendizaje pronunciada para los nuevos usuarios. Además, la posición y magnitud de la extracción de hidrogel debe optimizarse para diferentes líneas celulares. El examen de los desplazamientos de perlas fluorescentes antes y después de la manipulación del hidrogel puede ayudar con este aspecto de la técnica. Además, mientras que la técnica permite una alta observación espaciotemporal del comportamiento durotáctico en células individuales, esto lo convierte en un ensayo de bajo rendimiento. Por lo tanto, es importante señalar que este ensayo también puede complementarse con otras técnicas con menor manipulabilidad pero mayor rendimiento, como el uso de hidrogeles con gradientes preformados de rigidez, para analizar el comportamiento durotáctico de mayor poblaciones de células a la vez. En resumen, el alto grado de control espaciotemporal de las señales mecánicas que ofrece el ensayo durotáctico de una sola célula lo hacen muy útil para analizar los mecanismos moleculares que contribuyen al comportamiento durotáctico de muchos tipos de células diferentes Condiciones.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Ninguno.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylamide 40 %  National Diagnostic EC-810
Ammonium Persulfate  Fisher BP179-25
BD20A High frequency generator Electro Technic Products 12011A 115 V - Handheld Corona Wand
Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( Sigma Aldrich M6514
Bis-acrylamide 2%  National Diagnostic EC-820
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Branson 2510 Ultrasonic Cleaner Bransonic 40 kHz frequency
Coarse Manipulator Narshige MC35A
DMEM Corning 10-013-CV
DMEM without phenol red Sigma Aldrich D5030
Dual-Stage Glass Micropipette Puller Narshige PC-10
Epidermal Growth Factor Peprotech AF-100-15
Ethanol Pharmco-aaper 111000200
Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) Gibco A31606-02
Fibronectin  EMD Millipore FC010
Fluospheres Carboxylate 0.2 um  Invitrogen F8810, F8807, F8811
Fugene 6 Roche 1815091 1.5 μg DNA / 6 μL fugene 6 per 35 mm dish
Glacial Acetic Acid Fisher Chemical A38SI-212
Glass Bottom Dish CellVis D60-60-1.5-N
Glass Coverslip Electron Microscopy Sciences 72224-01 22 mm, #1.5
HCl JT Baker 9535-03
Hellmanex III Special cleaning concentrate Sigma Aldrich Z805939 Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips
HEPES powder Sigma Aldrich H3375 Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5
Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light Uviton International UV0338
Isopropanol Fisher Chemical A417-4
Microforge Narshige MF900
Micromanipulator Narshige MHW3
Mineral Oil Sigma Aldrich M5904
Nanopure Life Science UV/UF System Barnstead D11931 ddH2O
Nikon Eclipse Ti Nikon
OptiMEM Invitrogen 31985062
Parafilm M Bemis Company, Inc PM-992
PBS 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4
Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) Sigma Aldrich P4056
Ref52 Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS
Ringer's Buffer 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4
SKOV-3 American Type Culture Collection Culture in DMEM + 10% FBS
Sulfo-SANPAH  Covachem  12414-1
Tabletop Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-32G
TEMED  Sigma Aldrich T9281-50

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