Biaxiaal basgeluid en passieve testen van het Muriene voortplantingssysteem met behulp van een Myograph-druk

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit protocol gebruikt een commercieel beschikbare druk myograph systeem te voeren druk myograph testen op de Murine vagina en cervix. Met behulp van media met en zonder calcium werden de bijdragen van de gladde spiercellen (SMC) basale Toon en passieve extracellulaire matrix (ECM) geïsoleerd voor de organen onder geschatte fysiologische omstandigheden.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

White, S. E., Conway, C. K., Clark, G. L., Lawrence, D. J., Bayer, C. L., Miller, K. S. Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph. J. Vis. Exp. (150), e60125, doi:10.3791/60125 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De vrouwelijke voortplantingsorganen, in het bijzonder de vagina en de cervix, zijn samengesteld uit verschillende cellulaire componenten en een unieke extracellulaire matrix (ECM). Gladde spiercellen vertonen een contractiele functie binnen de vaginale en cervicale wanden. Afhankelijk van de biochemische omgeving en de mechanische uitzetting van de orgel wanden, veranderen de gladde spiercellen de contractiele omstandigheden. De bijdrage van de gladde spiercellen onder fysiologische voorwaarden bij aanvang is geclassificeerd als een basale Toon. Specifieker, een basale Toon is de baseline gedeeltelijke vernauwing van gladde spiercellen in de afwezigheid van hormonale en neurale stimulatie. Bovendien biedt de ECM structurele ondersteuning voor de orgel wanden en fungeert het als reservoir voor biochemische signalen. Deze biochemische aanwijzingen zijn van vitaal belang voor verschillende orgel functies, zoals het aanzetten tot groei en het handhaven van homeostase. De ECM van elk orgaan bestaat voornamelijk uit collageenvezels (meestal collageen types I, III en V), elastische vezels en glycosaminoglycans/proteoglycans. De samenstelling en organisatie van de ECM dicteren de mechanische eigenschappen van elk orgaan. Een verandering in de ECM-samenstelling kan leiden tot de ontwikkeling van reproductieve pathologieën, zoals verzakking van het bekken of vroegtijdige cervicale remodellering. Bovendien kunnen veranderingen in ECM-microstructuur en stijfheid de activiteit van de gladde spiercellen en het fenotype veranderen, wat resulteert in het verlies van de contractiele kracht.

In dit werk worden de gerapporteerde protocollen gebruikt om de basale Toon en passieve mechanische eigenschappen van de nonpregnant Murine vagina en baarmoederhals op 4-6 maanden oud in Estrus te beoordelen. De organen werden gemonteerd in een in de handel verkrijgbare druk myograph en zowel druk-diameter en kracht-lengte tests werden uitgevoerd. Voorbeeldgegevens en gegevensanalyse technieken voor de mechanische karakterisering van de voortplantingsorganen zijn opgenomen. Dergelijke informatie kan nuttig zijn voor het construeren van wiskundige modellen en het rationaal ontwerpen van therapeutische interventies voor gezondheids pathologieën van vrouwen.

Introduction

De vaginale wand bestaat uit vier lagen, het epitheel, lamina propria, Muscularis en adventitia. Het epitheel bestaat voornamelijk uit epitheelcellen. De lamina propria heeft een grote hoeveelheid elastische en fibrillar collageenvezels. De Muscularis is ook samengesteld uit elastine en collageenvezels, maar heeft een toegenomen hoeveelheid gladde spiercellen. De adventitia bestaat uit Elastin, collageen en fibroblasten, zij het in gereduceerde concentraties in vergelijking met de voorgaande lagen. De gladde spiercellen zijn van belang voor biomechanisch gemotiveerde onderzoeksgroepen als ze een rol spelen in de contractiele aard van de organen. Als zodanig, kwantificeren van de gladde spier cel gebied breuk en organisatie is de sleutel tot het begrijpen van de mechanische functie. Eerdere onderzoeken suggereren dat de gladde spier inhoud binnen de vaginale wand voornamelijk wordt georganiseerd in de omtrek en lengteas. Histologische analyse suggereert dat de Fractie van de gladde spier gebied is ongeveer 35% voor zowel de proximale en distale delen van de muur1.

De baarmoederhals is een zeer collagene structuur, die tot voor kort werd gedacht te hebben minimale gladde spier celinhoud2,3. Recente studies, echter, hebben gesuggereerd dat gladde spiercellen kunnen een grotere overvloed en rol in de baarmoederhals4,5hebben. De baarmoederhals vertoont een gradiënt van gladde spiercellen. De interne OS bevat 50-60% gladde spiercellen waar de externe OS slechts 10% bevat. Muis studies, echter, verslag van de baarmoederhals worden samengesteld uit 10-15% gladde spiercellen en 85-90% vezelgebonden bindweefsel zonder vermelding van regionale verschillen6,7,8. Gezien het feit dat het muismodel verschilt van het frequent gemelde menselijk model, zijn verdere onderzoeken met betrekking tot de muis baarmoederhals nodig.

Het doel van dit protocol was om de mechanische eigenschappen van de Murine vagina en cervix te verhelmaken. Dit werd bereikt met behulp van een druk myograph-apparaat waarmee de beoordeling van mechanische eigenschappen in de omtrek en axiale richtingen tegelijkertijd met behoud van inheemse cel-matrix interacties en orgel geometrie. De organen werden gemonteerd op twee aangepaste canules en beveiligd met zijde 6-0 hechtingen. Druk-diameter tests werden uitgevoerd rond de geschatte fysiologische axiale stretch om te bepalen van de conformiteit en Tangent moduli9. Er werden tests van de kracht lengte uitgevoerd om het geschatte axiale rek te bevestigen en om ervoor te zorgen dat de mechanische eigenschappen in het fysiologische bereik werden gekwantificeerd. Het experimentele protocol werd uitgevoerd op de nonpregnant Murine vagina en baarmoederhals op 4-6 maanden oud in Estrus.

Het protocol is onderverdeeld in twee belangrijke mechanische test secties: basale Toon en passieve testen. Een basale Toon wordt gedefinieerd als de baseline gedeeltelijke vernauwing van gladde spiercellen, zelfs in de afwezigheid van externe lokale, hormonale en neurale stimulatie10. Deze Baseline contractiele aard van de vagina en baarmoederhals levert karakteristieke mechanische gedragingen die vervolgens worden gemeten door de druk myograph systeem. De passieve eigenschappen worden beoordeeld door het verwijderen van het intercellulaire calcium dat de baseline toestand van contractie handhaaft, resulterend in ontspanning van de gladde spiercellen. In de passieve toestand leveren collageen en elastinevezels de dominante bijdragen voor de mechanische eigenschappen van de organen.

Het model van de Murine wordt veelvuldig gebruikt om pathologieën in de reproductieve gezondheid van vrouwen te bestuderen. De muis biedt verschillende voordelen voor het kwantificeren van de evoluerende relaties tussen ECM en mechanische eigenschappen binnen het voortplantingssysteem11,12,13,14. Deze voordelen omvatten korte en goed gekarakteriseerde Oestrische cycli, relatief lage kosten, gemak van handling, en een relatief korte zwangerschaps tijd15. Bovendien is het genoom van laboratorium muizen goed in kaart gebracht en genetisch gemodificeerde muizen zijn waardevolle hulpmiddelen om mechanistische hypotheses16,17,18te testen.

In de handel verkrijgbare druk myograph systemen worden intensief gebruikt om de mechanische reacties van verschillende weefsels en organen te kwantificeren. Sommige opmerkelijke structuren geanalyseerd op de druk myograph systeem omvatten elastische slagaders19,20,21,22, aderen en weefsel engineered vasculaire grafts23,24, de slokdarm25, en de grote darmen26. De druk myograph-technologie maakt gelijktijdige beoordeling van eigenschappen in de axiale en omtrek richtingen mogelijk met behoud van de native Cell-ECM interacties en in vivo geometrie. Ondanks het uitgebreide gebruik van myograph systemen in zachte weefsel en orgel mechanica, een protocol met behulp van de druk myograph technologie was niet eerder ontwikkeld voor de vagina en cervix. Voorafgaand onderzoek naar de mechanische eigenschappen van de vagina en baarmoederhals werden beoordeeld uniaxially27,28. Deze organen ervaren echter multiaxiaal laden binnen het lichaam29,30, dus kwantificeren hun Biaxiale mechanische respons is belangrijk.

Bovendien, recent werk suggereert dat gladde spiercellen een mogelijke rol kunnen spelen bij pathologieën van weke delen5,28,31,32. Dit biedt een andere aantrekkingskracht van het gebruik van de druk myograph technologie, als het behoudt de inheemse cel-matrix interacties, waardoor afbakening van de bijdrage die gladde spiercellen spelen in fysiologische en pathofysiologisch Voorwaarden. Hierin stellen we een protocol voor om de multiaxiale mechanische eigenschappen van de vagina en de baarmoederhals te kwantificeren onder zowel basale Toon als passieve omstandigheden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Nulliparous 4-6 maanden vrouwelijke C57BL6J muizen (29,4 ± 6,8 gram) bij oestrus werden gebruikt voor deze studie. Alle procedures werden goedgekeurd door het Instituut Dierenzorg en gebruik Comité aan Tulane University. Na de bevalling werden de muizen één week voor euthanasie geacclimeerd en werden ze onder standaardomstandigheden ondergebracht (12 uur durende licht/donker cycli).

1. opoffering van de muis bij oestrus

  1. Bepaal de oestrische cyclus: de oestrische cyclus werd gemonitord door visuele beoordeling in overeenstemming met eerdere studies15,33,34. De oestrische cyclus bestaat uit vier fasen: proestrus, Estrus, metestrus, en diestrus. Tijdens de proestrus fase zijn de geslachtsdelen gezwollen, roze, vochtig en gerimpeld. De oestrus fase is rimply maar minder gezwollen, roze en vochtig. Metestrus en diestrus zijn beide gerapporteerd als exposeren geen zwelling en rimpel, ontbreekt in een roze tint, en droge34,35.
  2. Experiment uitvoeren bij Estrus: alle mechanische tests werden uitgevoerd terwijl de muizen op Estrus waren, omdat dit het gemakkelijkst te visualiseren is en een consistent en herhaalbaar tijdpunt biedt.
  3. Voor muizen die een basaal Toon testen ondergaan, euthanatie via guillotine. Voor muizen die alleen onder de passieve omstandigheden zijn getest, moeten ze worden geëerd met behulp van koolstofdioxide (CO2) inademing. De guillotine dient om de functie van gladde spiercellen van het voortplantingsstelsel te behouden, aangezien het co2 -gas de contractieve eigenschappen van de gladde spiercellen wijzigt36,37,38, 39,40,41,42. Het is noodzakelijk om de dissectie binnen 30 minuten uit te voeren om de kans op cel apoptosis te minimaliseren.

2. dissectie van het voortplantingssysteem

  1. Instellen: plaats een absorberend pad op het werkstation en vul een Petri schaaltje en spuit met 4 °C Hank de gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) oplossing. Gebruik een doekje voor het verwijderen van vetweefsel. Plaats de muis ventrale kant omhoog en plak de poten en staart. Draai de Microscoop lichtjes aan en zet micro-schaar, schaar, twee paar rechte pincet en twee paar gebogen pincet.
  2. Met behulp van schuine pincet en schaar, til de huid rond de buik en maak een incisie aan de basis van de buik, boven het schaambeen. De incisie moet ondiep genoeg zijn om de buikspier wand niet te prik. Doorgaan met het gebruik van de schaar te snijden bovenzijde naar de ribbenkast en diep door de buikspieren.
  3. Verwijder oppervlakkig vet door licht aan het vet te trekken met de gebogen pincet en micro-schaar. Vetweefsel zal licht heterogene reflecteren met een glitter achtig uiterlijk. Plaats alle verwijderde vetten en weefsels op het doekje. Identificeer zowel de baarmoeder hoorns als het schaambeen.
  4. Plaats een gesloten schaar tussen de vaginale wand en het schaambeen. Snijd voorzichtig het midden van het schaambeen (schaam symphyse). Plaats gebogen pincet aan beide uiteinden van het gesneden schaambeen. Trek beide snij uiteinden lateraal om een betere toegang tot de voortplantingsorganen mogelijk te maken.
  5. Verwijder de blaas en de urethra van de vaginale wand. Dit kan worden gedaan met behulp van rechte pincet en micro-schaar. Houd de blaas met rechte pincet om spanning te creëren en gebruik botte dissectie technieken om het omringende weefsel van de vagina te scheiden. Zodra de blaas en urethra zijn ontleed, snijd de basis en verwijder uit de lichaamsholte.
  6. Identificeer het voortplantingssysteem: de baarmoeder hoorns bifurcate van de cervix. De baarmoederhals kan worden geïdentificeerd uit de vagina als gevolg van verschillen in geometrie en stijfheid. De buitendiameter van de baarmoederhals is kleiner dan de vagina. De baarmoederhals is stijver dan de vagina en voelt vergelijkbaar met die van een kraal (Figuur 1).
  7. Gebruik inkt en remklauwen om 3 mm stippen langs de organen te markeren. Begin onder de eierstokken op de baarmoeder buizen en markeer dots ondeugdelijkheid om de cervix te bereiken. Gebruik de middelste baarmoederhals dot om een punts pad naar de vagina Introitus te beginnen.
  8. Laat de inkt drogen en scheiden van de voortplantingsorganen van het omringende vetweefsel, bindweefsel, en de dikke darm. Reinig de vagina zo dicht mogelijk bij de vaginale Introitus. Met behulp van een schaar, snijd rond de vaginale Introitus.
    Opmerking: het is mogelijk dat organen tijdens dit proces uitdrogen. Als dit een probleem is, kan een spuit gevuld met 4 °C HBSS worden gebruikt om vocht aan de organen toe te voegen.
  9. Snijd de baarmoeder hoorns onmiddellijk inferieur aan de eierstokken. Merk op dat de organen zich terugtrekken uit de lengte van de post-explant naarmate het bindweefsel wordt verwijderd en het orgel wordt hersteld. Plaats de ontleed voortplantingsorganen in een Petri schaaltje gevuld met 4 °C HBSS. Deze lengte wijziging kan worden gebruikt voor de berekening van de geschatte lengte in vivo (punt 5).
    Opmerking: we hebben vastgesteld dat het gebruik van HBSS op deze temperatuur tijdens het dissectie en de cannulatie heeft geen invloed op de levensvatbaarheid van de gladde spiercellen. Het handhaven van een pH van 7,4, echter, is noodzakelijk voor het behoud van de levensvatbaarheid van de gladde spiercellen. Bij deze temperatuur heeft de HBSS een pH-niveau van 7,4.
  10. Meet na een evenwichts periode van 15 minuten in een HBSS van 4 °C de ruimte tussen de stippen met behulp van de remklauwen. Noteer de metingen voor elke afstand in een spreadsheet. Deze waarden worden gebruikt voor het berekenen van de in vivo stretch ratio (oorspronkelijke lengte/explanted lengte).
  11. Stel het doekje in dat het verwijderde weefsel op de buikstreek bevat met het overtollige weefsel dat aan de binnenkant van de muis is gericht en laat het doekje weken in 4 °C HBSS. Wikkel de muis en overtollig weefsel in folie en leg ze in een Vries veilige zak om te worden bewaard bij-20 °C. Passief mechanisch gedrag op de vagina bleek niet significant verschillend na één Freeze-ontdooien cyclus43. Alle geteste organen werden onmiddellijk na euthanasie of na één vries-dooi cyclus gebruikt.

3. cannuleren

  1. Bepaal de juiste canule maat voor het orgel type. In een typische C57BL6J muis, de vagina maakt gebruik van canules die beide 3,75 mm in diameter en geklinken. De baarmoederhals gebruikt één canule 3,75 mm voor het vaginale uiteinde en een canule 0,75 mm in diameter voor het baarmoeder uiteinde (Figuur 2) de 0,75 mm canule is glad.
    Opmerking: de diameter maten die hierboven worden aangegeven, worden gebruikt voor typische nullipareuze 4-6 maanden C57BL6 muizen, C57BL6 x 129SvEv en niet-pareuze muizen van 7-9 maanden. Echter, bepaalde omstandigheden, zoals verzakking of zwangerschap, kan een grotere canule nodig.
  2. Monteer met elk orgaan de cervicale zijde op het gedeelte van de kracht omzetter van het cannulatie apparaat. Monteer het tegenovergestelde uiteinde van het orgel (vaginale of baarmoeder) op het micrometer gedeelte van het apparaat. Draai beide uiteinden vast met hechtingen.
  3. Vanwege het verschil in dikte en mate van contractiliteit onder de vagina en cervix, kunnen verschillende technieken worden gebruikt om de meest effectieve cannulatie uit te voeren. Voor de vagina, plaats 2 hechtingen tussen de 2ND en 3RD klinknagels van de canule in een "X" mode. Bij het cannuleren van de cervix, de canule is niet geklink, zodat het orgel is het best geplaatst aan de achterkant van de canule met 3 horizontale hechtingen aan de baarmoeder uiteinde en 4 hechtingen op de externe OS. Voor beide organen mag de maximumlengte niet groter zijn dan 7 mm tussen de hechtingen (Figuur 3).

4. Druk myograph instellen

  1. Om het druk myograph systeem in te stellen, zet u het testsysteem aan en vult u de reservoir fles met 200 mL HBSS (Figuur 4). Zet de hitte op "aan" en laat de HBSS in de reservoir fles opwarmen. Schakel vervolgens de Microscoop in en open het computerprogramma. Zorg ervoor dat het beeld van de gecanuleerde orgel, druk interface, flowmeter lezingen, en de sequencer functie tool zijn allemaal zichtbaar (Figuur 5).

5. basale Toon mechanische testen

Opmerking: de baarmoederhals vertoonde een fasische aard tijdens de beginstadia van het testen. Echter, dit verminderde na conditionering. Basaal Toon testen wordt gedaan met behulp van Krebs Ringer buffer (KRB) in het bekken van het DMT-apparaat. De buffer wordt belugeerd met 95% O2 en 5% Co2. Nadat de basale Toon portie is voltooid, calcium vrije KRB wordt gebruikt.

  1. Het vinden van de onbelaste geometrie: Strek het orgel zodat de muur niet in spanning is. Voor de vagina, observeer de groeven op de vaginale wand. Voor de baarmoederhals, snijd direct onder de inkt stippen die zich boven en onder de centrale baarmoederhals Mark. Dit bedenkt een herhaalbare methode voor een cervicale in-situ lengte van 6 mm44. Meet de lengte van hecht tot hecht met remklauwen
  2. Het vinden van de onbelaste druk (omhoog): Verhoog de druk van 0 tot 10 mmHg in stappen van 1 mmHg. Bepaal de druk waarin het orgel niet meer is ingestort. Dit kan worden bepaald als de grootste sprong in de buitendiameter bij een bepaalde druk, zoals tentoongesteld op de programmamonitor. Na het opnemen van de druk en de buitendiameter, Let op dit als het eerste punt waarin het orgel niet is samengevouwen en nul de kracht.
  3. Geschat in vivo stretch: Bereken de geschatte in vivo Stretch door de lengte gemeten in vivo te delen door de gemeten lengte na de installatie:
    Equation 1
  4. Voor conditionering van de druk diameter: Stel de druk in op 0 mmHg, de lengte tot de geschatte inEquation 2vivo lengte en het verloop tot 1,5 mmHg/s. Voer een sequentie uit die de druk van 0 mmHg naar de in vivo druk + gelost (tabel 1) houdt, vasthouden voor 30 seconden en neem de druk op 0 mmHg met een 30 seconden Hold-periode. Nadat u voor een totaal van 5 cycli hebt herhaald, drukt u op Stop in het computerprogramma en slaat u het bestand op.
  5. Het vinden van de experimentele in vivo stretch: Stel het orgel in op de geschatte in vivo lengte, terwijl bij de onbelaste druk en druk op Start. Evalueer de druk versus kracht waarden voor drukwaarden, variërend van de onbelaste druk tot de maximale druk (tabel 1). Druk op de knop stoppen in het computerprogramma en sla het bestand op.
    Opmerking: de gemeten rekwaarde wordt in situ berekend. Dit gaat gepaard met de beperking dat het alleen kan worden gemeten na het disarticuleren van de schaam-symphyse. Hierdoor gaat de natuurlijke Tethering verloren, wat de lengte kan wijzigen. De theoretische stretch is echter gebaseerd op de eerder geïntroduceerde theorie dat het orgel minimale veranderingen in werking zal ondervinden bij blootstelling aan fysiologische druk om energie te besparen45. In het Protocol, de gemeten in vivo stretch zal de rekwaarde berekend met behulp van de experimenteel geïdentificeerde lengte waarin er minimale verandering van kracht wanneer blootgesteld aan een fysiologische bereik van druk.
  6. Voor conditionering van de druk diameter: Stel de druk in op 0 mmHg, de lengte tot de experimentele in vivo lengte en de helling van 1,5 mmHg/s. Voer een sequentie uit die de druk van 0 mmHg naar de maximale druk + omhoog houdt, 30 seconden ingedrukt houdt en terug naar 0 mmHg met een advertentie 30 tweede Hold-periode. Nadat u dit hebt herhaald voor een totaal van 5 cycli, drukt u op de Stop -knop in de programma-interface en slaat u het bestand op.
    Opmerking: 5,4 is noodzakelijk voor het bereiken van een consistentere axiale krachtmeting met toenemende druk. Deze stap helpt bij het vinden van de juiste in vivo Stretch, die vaak wordt onderschat op basis van visuele aanwijzingen. 5,6 dient als voorzorgsmaatregel om hysterese te minimaliseren en een consistente, reproduceerbare, wiskundig interpreteerbare reactie van het orgel te bereiken.
  7. Kracht-lengte voor conditionering: Voer 1/3 Max druk + omhoog voor zowel de inlaat-als de uitlaatdruk. Stel het orgel in op-2% van de in vivo lengte en druk op Start. Pas de lengte aan + 2% in vivo lengte dan terug tot-2% bij 10 μm/s. Herhaal axiaal verlenging voor een totaal van 5 cycli. Druk op Stop in het computerprogramma en sla het bestand op.
  8. Equilibratie: stel met het orgel in de vastgestelde lengte in vivo zowel de inlaat-als de uitlaatdruk in op 1/3 van de maximale druk + omhoog. Evenwichts het orgel gedurende 10 minuten. Breng beide druk langzaam terug naar beneden tot 0 mmHg met de gradiënt ingesteld als 1,5 mmHg/s.
  9. Herevalueer de onbelaste geometrie: Stel het orgel in op de in vivo lengte en de druk op de onbelaste druk. Verlaag de axiale lengte naar de geschatte onbelaste lengte met een snelheid van 10 μm/s tot er een minimale verandering in de kracht is. Deze overeenkomstige lengte staat bekend als de onbelaste lengte, of waar het orgel niet in spanning of compressie is. Noteer de onbelaste lengte, de buitendiameter en de kracht waarde voordat u de kracht op nul legt.
    Opmerking: de vooraf verwijderde geometrie werd bepaald door visuele aanwijzingen, wat puur kwalitatief is. Een nieuwe evaluatie is noodzakelijk voor een kwantitatieve methode en om rekening te kunnen worden met mogelijke veranderingen in de lengte die zich tijdens de voor conditionering voordoen. Deze geometrie zal worden gebruikt in rubriek 8.
  10. Echografie instellen: gebruik het algemene Imaging-abdominale pakket om de organen in het testapparaat te visualiseren. (Figuur 6). Voor het testen, Minimaliseer artefacten van de onderkant van de druk myograph metalen bekken. Pas de canule aan op een hoogte die de maximale afstand van de bodem is met het weefsel dat nog steeds volledig wordt ondergedompeld in de testoplossing. Een aangepaste houder wordt 3D afgedrukt om de transducer in verticale positie te stabiliseren tijdens beeldvorming.
  11. Ultrasone beeldvorming: Identificeer de canule in de buurt van de kracht transducer en pas de fase van de Microscoop aan op beeld langs de lengte van het weefsel. Tijdens het testproces wordt de middelste regio langs de lengte bijgehouden (Figuur 6a, C). Na beeldvorming, Bekijk de afbeelding "Cine Store" lus die bestaat uit een reeks B-mode frames en identificeren van het frame met de grootste buitendiameter. De dikte berekeningen zullen worden gebruikt in rubriek 8.
  12. Druk diameter testen (-2% in vivo lengte): druk op Start en stel het orgel zo in dat het-2% van de in vivo lengte, zet de druk op 0 mmHg en gradiënt tot 1,5 mmHg/s. Verhoog de druk van 0 mmHg tot de maximale druk. Breng de druk terug naar beneden tot 0 mmHg met een 20 seconden Hold-periode. Herhaal dit gedurende 5 cycli.
  13. Druk diameter testen (in vivo lengte): druk op Start en stel het orgel zo in dat het zich op de vivo lengte bevindt, stel de druk in op 0 mmHg en gradiënt tot 1,5 mmHg/s. Verhoog de druk van 0 mmHg tot de maximale druk. Breng de druk terug naar beneden tot 0 mmHg met een 20 seconden Hold-periode. Herhaal dit gedurende 5 cycli.
  14. Druk diameter testen (+ 2% in vivo lengte): pas het orgel zo aan dat het + 2% in vivo lengte is, stel de druk in op 0 mmHg, en gradiënt tot 1,5 mmHg/s. Verhoog de druk van 0 mmHg tot de maximale druk en vervolgens terug naar beneden tot 0 mmHg met een 20 seconden Hold-periode. Herhaal dit gedurende 5 cycli. De drukgegevens van alle drie de lengtes zullen worden gebruikt in rubriek 8.
  15. Kracht-lengte testen (nominale druk): zet de druk op de onbelaste druk en het orgel op-2% van de in vivo lengte. Strek het orgel tot + 2% van de in vivo lengte en keer terug naar-2% de in vivo lengte bij een snelheid van 10 μm/s. Herhaal dit voor een totaal van 3 cycli.
  16. Kracht-lengte testen (1/3 maximale druk + omhoog): zet de druk op 1/3 van de maximale druk + omhoog en stel het orgel in op-2% de in vivo lengte. Na het indrukken van Start, strek het orgel tot + 2% de in vivo lengte en terug naar-2% de in vivo lengte met een snelheid van 10 μm/s. Nadat u voor een totaal van 3 cycli hebt herhaald, drukt u op Stop en slaat u de gegevens op.
  17. Kracht-lengte testen (2/3 maximale druk + omhoog): zet de druk op 2/3 van de maximale druk + omhoog en stel het orgel in op-2% de in vivo lengte. Druk op Start en strek het orgel tot + 2% de in vivo lengte en terug naar-2% de in vivo lengte met een snelheid van 10 μm/s. Nadat u voor een totaal van 3 cycli hebt herhaald, drukt u op Stop en slaat u de gegevens op.
  18. Kracht-lengte testen (maximale druk + omhoog): Stel de druk in op de maximale druk + omhoog en stel het orgel in op-2% de in vivo lengte. Met een snelheid van 10 μm/s, strek het orgel tot + 2% van de in vivo lengte en terug tot-2% in vivo lengte. Nadat u voor een totaal van 3 cycli hebt herhaald, slaat u de gegevens op. Alle Force-gegevens zullen worden gebruikt in sectie 8.
  19. Verwijder KRB testmedia en was met calcium vrije KRB. Vervang de media met calcium vrije KRB oplossing aangevuld met 2 mM EGTA. Inincuberen van het weefsel gedurende 30 minuten. Verwijder de oplossing en vervang de media door verse calcium vrije KRB.

6. passieve mechanische testen

Opmerking: als u begint met passieve testen start bij stap 1. Als basale Toon testen werd uitgevoerd voorafgaand aan passieve start bij stap 6. Als u begint met bevroren weefsel, laat dan een evenwichts periode van 30 minuten bij kamertemperatuur toe voordat het orgel wordt gecanuteerde.

  1. Het vinden van de onbelaste geometrie: Strek het orgel, zodat de wand van het orgel niet in spanning. Meet het gecanuleerde orgaan van hechtdraad tot hecht en noteer dit als de onbelaste lengte.
  2. Het vinden van de onbelaste druk: na het indrukken van Start, Verhoog de druk van 0 in 10 mmHg in stappen van 1 mmHg. Bepaal tijdens het doorlopen van dit proces de druk waarin het orgel niet in spanning zit. Met behulp van de computerprogramma monitor kan dit worden bepaald vanaf de grootste sprong in de buitendiameter. Na het Zeroing van de kracht, noteer deze druk, evenals de buitendiameter en noteer dit als het eerste punt waarin het orgel niet is ingestort.
  3. Geschat in vivo stretch: Bereken de geschatte in vivo Stretch door de lengte gemeten in vivo te delen door de gemeten lengte na de installatie.
  4. Druk diameter voor conditionering: na het indrukken van Start, stel de druk ingesteld op 0 mmHg, de lengte als de geschatte in vivo lengte, en gradiënt tot 1,5 mmHg/s. begin met het uitvoeren van een sequentie die de druk van 0 mmHg naar de maximale druk neemt en terug naar 0 Mmhg. Herhaal dit proces met 5 cycli met een 30 seconden Hold-tijd.
  5. Voorconditionering van de kracht lengte: Stel het orgel in op de lengte in vivo en voer de onbelaste druk in het computerprogramma handmatig in voor beide drukken. Nadat u op Start hebt gedrukt , stelt u het verloop in op 2 mmHg en de druk tot 1/3 van het maximum. Strek het orgel tot + 2% en terug tot-2% rek bij 10 μm/s. Herhaal deze cyclus voor een totaal van 5 keer en druk op Stop.
  6. Het vinden van de experimentele in vivo lengte: Zoek en plot kracht waarden bij-2% van de in vivo lengte, de in vivo lengte en + 2% van de in vivo lengte. Neem de krachten op gelijkmatig verdeelde druk variërend van 0 mmHg tot de maximale druk. De experimentele in vivo stretch is de stretch waarde die een relatief vlakke lijn vertoont over een drukbereik.
  7. Herhaal de druk diameter en axiale voorconditionerings stappen op de nieuwe in vivo lengte.
  8. Equilibratie: Stel de inlaat-en uitlaatdruk met het orgel in de vastgestelde lengte in vivo in op de onbelaste druk. Laat het orgel gedurende 15 minuten opnieuw in evenwicht worden. Breng na 15 minuten langzaam de inlaat-en uitlaatdruk terug tot 0 mmHg.
  9. Opnieuw te evalueren onbelaste configuratie: Breng het orgel naar de onbelaste lengte en herschat de onbelaste lengte. Noteer de onbelaste lengte en de buitendiameter terwijl de druk 0 mmHg, de onbelaste druk en 1/3 de maximale druk is. Nul de kracht bij de onbelaste druk. De diameter bij de onbelaste druk is de in vivo diameter.
    Opmerking: het opnieuw inschatten van de onbelaste lengte is noodzakelijk omdat kleine kunststof vervormingen eerder werden waargenomen in zachte biologische weefsels na conditionering. Deze onbelaste configuratie wordt gebruikt in sectie 8.
  10. Echografie: Voer ultrasone B-modus Imaging uit op de onbelaste lengte en druk.
  11. Druk diameter testen: met het orgel bij-2% van de experimenteel bepaald in vivo lengte en de druk bij 0 mmHg, druk op Start. Verhoog de druk van 0 mmHg tot de maximale druk en terug naar 0 mmHg. Houd de 2-0 mmHg stap gedurende 20 seconden ingedrukt. Nadat u in totaal 5 keer hebt herhaald, drukt u op de knop stoppen in de interface en slaat u het bestand op.
    Opmerking: Herhaal de experimentele in vivo lengte, + 2% van de experimentele in vivo lengte.
  12. Kracht-lengte testen: Stel de druk in op nominale druk en stel het orgel in op-2% van de in vivo lengte. Strek het orgel tot + 2% van de in vivo lengte en terug tot-2% van de in vivo lengte met een snelheid van 10 μm/s. Nadat u in totaal 3 keer hebt herhaald, slaat u de gegevens op. Herhaal dit voor 1/3 Max druk, 2/3 Max druk, en bij de maximale druk.
  13. Bereken de onbelaste dikte van ultrasone beelden B-modus beeld. Teken met behulp van imaging software een lijn om de penetratie diepte aan te duiden. Stel de schaal in op de lengte van de lijn (d.w.z. 2000 μm zoals afgebeeld in Figuur 6b en 6d).
  14. Wanddikte berekeningen: het gebruik van een computer software, traceren en meten van de binnen-en buitendiameter van het orgel. Teken en meet vervolgens een lijn tussen de diameters. Teken in totaal 25 Transmurale lijnen. Gemiddelde alle gegevenspunten en herhaal dit voor een totaal van 3 keer.

7. opruimen

  1. Zorg ervoor dat de druk 0 mmHg is en uitgeschakeld. Sluit de hoofd inlaat en uitlaat uit voor beide drieweg kleppen. Zuig de resterende vloeistof uit het bekken van de cannulatie inrichting.
  2. Verwijder het orgel uit het podium en vul de reservoir fles met gedeïoniseerd water. Spoel de canule met water met behulp van een injectiespuit. Sluit de slang aan om de canule te omzeilen.
  3. Draai de druk en de stroom aan, stel de inlaatdruk in op 200 mmHg, de uitlaatdruk tot 0 mmHg, gradiënt tot 10 mmHg/s, en laat de stroom 5 minuten lopen. Laat het systeem draaien terwijl de reservoir fles leeg is en laat de lucht gedurende 5 minuten lopen of totdat de lijnen droog zijn.

8. gegevensanalyse

  1. Voor het testen van de druk diameter verzamelt u gegevens van waar de druk begint te stijgen van de minimumwaarde tot het maximum. Voor het testen van de kracht-lengte, verzamelen van gegevens van net onder de maximale piek van kracht totdat de kracht gestopt.
  2. Open het gegevensbestand voor elke druk diameter test en selecteer het gemiddelde druk tabblad. Navigeer naar het laadgebied van de laatste Curve, 0 mmHg naar de maximale druk en zet de gegevens in een spreadsheet. Selecteer dezelfde regio op de buitendiameter, inlaatdruk, uitlaatdruk, kracht, temperatuur, pH en stroom tab die elk item in hetzelfde document plaatst.
  3. Open de gegevens voor elke test met de kracht lengte. Navigeer naar het laadgebied van de curve,-2% tot + 2%, en sleep de gegevens naar een spreadsheet. Selecteer dezelfde regio voor de andere gemeten variabelen en plaats elk item in hetzelfde werkblad.
  4. Voor de druk diameter en de kracht lengte test aftrekken de omhoog van alle drukwaarden.
  5. Gemiddelde de druk diameter gegevens elke 1 mmHg (d.w.z. 0 +/-0,5, 1 +/-0,5, 2 +/-0,5).
  6. Zoek het onbelaste volume van het orgel (V). Vergelijking 1 kan worden gebruikt om Vte vinden, gezien het feit dat R02 de onbelaste buiten straal is, gemeten door de Microscoop, L de onbelaste lengte is en H de onbelaste dikte is zoals gedetecteerd door de echografie. De aanname van incompressibility wordt benut, wat betekent dat het orgel het volume vervormt terwijl het wordt blootgesteld aan vervormingen.
    Opmerking: de onbelaste lengte wordt gemeten met remklauwen van hechtdraad tot hechtdraad. De onbelaste diameter wordt gemeten via de Microscoop, de camera en de software gevolgd door de berekening van de straal (Figuur 5) de onbelaste dikte wordt berekend op basis van de echografische beelden (Figuur 6).
    Equation 3Vergelijking 1
  7. Gebruik de aanname van incomprimeer baarheid door het onbelaste volume, de vervormd buitenste RADIUSEquation 4() en de lengteEquation 5() te gebruiken om de vervormde Equation 6 Binnenradius te bepalen.
    Equation 7Vergelijking 2
  8. Gebruik vergelijkingen 3, 4 en 5 voor het berekenen van elke stress, respectievelijk. In vergelijkingen 3-5 wordt P gedefinieerd als de intraluminale druk en Ft is de kracht gemeten door de transducer.
    Equation 8Vergelijking 3
    Equation 9Vergelijking 4
    Equation 10Vergelijking 5
  9. Plot de druk-diameter relatie, Force-Pressure relatie, omtrek stress-omtrek stretch relatie, en de axiale spanning en omtrek stretch waarden (Figuur 7, figuur 8). De stretch waarden kunnen worden berekend met behulp van de middenwand RADIUS. Berekeningen van de omtrek en axiale spanningen kunnen worden gevonden in de vergelijkingen 6 en 7, respectievelijk.
    Equation 11Vergelijking 6
    Equation 12Vergelijking 7
  10. Bereken de compliance in de buurt van het fysiologische drukbereik en in vivo stretch. De lagere druk gebonden (LPB) is 1 standaarddeviatie onder de gemiddelde gemeten druk. De bovenste druk gebonden (UPB) is 1 standaarddeviatie boven de gemiddelde gemeten druk9.
    Equation 13
  11. Bereken de tangens moduli om de materiaal stijfheid te kwantificeren. Identificeer de berekende omtrek spanning die overeenkomt met de lagere druk gebonden en de bovengrens. Plaats een lineaire lijn op de omtrek spanning-omtrek strek curve binnen het geïdentificeerde spanningsbereik in vivo lengte. Bereken de helling van de lijn9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Succesvolle analyse van de mechanische eigenschappen van de vrouwelijke voortplantingsorganen is afhankelijk van de juiste orgaan dissectie, cannulatie, en testen. Het is noodzakelijk om de baarmoeder hoorns zonder gebreken naar de vagina te planten (Figuur 1). Afhankelijk van het type orgel zal de canule grootte variëren (Figuur 2). De cannulatie moet worden uitgevoerd zodat het orgel niet kan bewegen tijdens het experiment, maar ook de wand van het orgel niet beschadigt tijdens de ingreep (Figuur 3). Falen van een van beide stappen zal resulteren in het onvermogen van het vat om druk te houden. De normalisatie van de testprocedure is essentieel voor het welslagen van het protocol om consistente en reproduceerbare resultaten te behalen.

Zodra het orgel is ontleed en gecanuleerde goed, macht op de druk myograph systeem. Het instellen van de druk myograph systemen omvat een controller eenheid, debietmeter, en podium (Figuur 4). De druk myograph systeem wordt gebruikt voor het bewaken van verschillende aspecten van het orgel als het ondergaat mechanische testen (Figuur 5). Een echo systeem, of gelijkwaardig, wordt gebruikt om de dikte van de organen in de onbelaste toestand te meten met en zonder basale Toon (Figuur 6). Na mechanische tests kan de raaklijn worden berekend voor de omtrek en axiale richtingen (tabel 2).

Zowel de basale Toon testen en passieve testen opleveren belangrijke mechanische eigenschappen van het voortplantingsstelsel, met en zonder de contractiele bijdrage van gladde spiercellen (Figuur 7, figuur 8). Schalen tussen de organen vereist een paar aanpassingen aan de protocollen (tabel 1), als de baarmoederhals en de vagina ervaring verschillende belastingen in vivo46-48. Dergelijke variaties kunnen worden gemonitord door middel van technieken zoals druk Catherization. Druk Catherization is een methode die eerder gebruikt voor het bewaken van de in vivo voorwaarden binnen de vagina en baarmoeder49-53. Modellen in de vorige studies variëren van muizen, konijnen en mensen. Dezelfde principes zouden ook van toepassing zijn op de cervicale en vaginale druk die specifiek zijn voor het muriene model. Hoewel, ongeacht welk orgaan wordt getest, zijn dezelfde materialen nodig voor de protocollen (tabel 3).

Figure 1
Figuur 1: Muriene dissectie diagram. De muis dissectie voor de voortplantingsorganen: zowel baarmoeder hoorns, cervix, en de vagina. In de figuur worden de blaas en de urethra verwijderd uit het voorste deel van de vagina. De darmen en buikspieren werden weerspiegeld superiorly. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: grootte vergelijking van de twee canule. Grootte vergelijking van de twee canules gebruikt voor de cannulatie van de voortplantingsorganen. De grotere canule (D = 3,75 mm) wordt gebruikt voor het vaginale weefsel (A). De kleinere canule (D = 0,75 mm) wordt gebruikt voor het cannuleren van cervicale weefsel (B). De cervicale canule is glad, terwijl de vaginale canule twee groeven heeft. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Cannulatie methode voor de vagina en de cervix. Vanwege de wisselende geometrie en dikte van de voortplantingsorganen, worden ze het meest effectief gecanuleerd in verschillende manieren. Voor de vagina, plaats twee hechtingen in een "X" mode. Bij het cannuleren van de cervix, plaats 3 horizontale hechtingen aan het baarmoeder uiteinde en 4 hechtingen op het externe besturingssysteem. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: instellen voor druk myograph-apparaat. De installatie van het DMT-apparaat gebruikt voor zowel basale als passieve testen. De DMT bestaat uit drie hoofd hubs: de stage (a), de controller Unit (B) en de flowmeter (C). Binnen de controller eenheid is er een reservoir fles en een afval fles. De reservoir fles wordt in eerste instantie gevuld met vloeistof die leeggaat als het experiment wordt uitgevoerd. De afval fles, die in eerste instantie leeg is, verzamelt de vloeistof die door het experiment loopt. De controller-eenheid interfaces met de DMT-software op de computer en regelt de druk, temperatuur en stroom. De controller eenheid leest de uitgangen van de kracht en de druk omvormers binnen het podium via een VGA-interface kabel. De fase component van het systeem bevat een inlaat-en uitlaatstroom van het systeem. De inlaat-en uitlaatstroom hebben overeenkomstige inlaat-en uitlaat spanningen gemeten door het systeem. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Afbeelding 5: bestand instellen op het druk myograph programma. Weergave van de computer software-opstelling. Een doos wordt getekend rond de regio van belang en de buitendiameter van het weefsel wordt optisch bijgehouden in real-time (a). Gegevens verkregen tijdens mechanische tests worden geregistreerd en weergegeven in real-time in de buitendiameter, inlaatdruk, uitlaatdruk, gemiddelde druk, kracht, temperatuur, pH en debiet tab (B). Binnen de druk interface druk (mmHg), gradiënt (mmHg/s) en debiet wordt geregeld. Verder wordt de axiale kracht (mN) gemeten door de in-line kracht transducer weergegeven. Debiet (μL/min) wordt gerapporteerd op het tabblad debietmeter (C). De druk volgorde wordt weergegeven en geregeld in de sequencer-tab (D). Gegevens die tijdens mechanische tests worden geregistreerd, worden in real-time geregistreerd en weergegeven in de buitendiameter, inlaatdruk, uitlaatdruk, gemiddelde druk, kracht, temperatuur, pH en debiet tab (E). Een representatieve druk diameter test van de vagina wordt weergegeven met de buitenste diameter als een functie van de tijd op de buitenste diameter tab. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Ultrasone beeldvorming. Ultrasone beeldvorming van de muriene voortplantingsorganen. Alle beelden werden genomen met behulp van het echografie systeem op de korte-as-B-modus. Een representatief beeld van de vagina bij de onbelaste lengte en druk (A). De dikte van de vaginale wand werd berekend in ImageJ. Er is een verticale lijn getekend langs de diepte schaal (mm) om het aantal pixels per μm te kalibreren. Het veelhoek gereedschap werd gebruikt om de binnen-en buitendiameter te traceren. Vervolgens werden Transmurale lijnen getekend om de dikte en het gemiddelde te berekenen (B). Dit werd 3 keer uitgevoerd. Een representatief beeld van de baarmoederhals bij de onbelaste lengte en druk (C). De wanddikte werd vervolgens berekend met behulp van afbeelding J en het veelhoek gereedschap op dezelfde manier als die van de vagina (D). Binnen het voortplantings complex wordt de buitendiameter op twee verschillende plaatsen gevolgd (E). Tijdens het beeldvormings proces wordt de transducer gestabiliseerd door een 3-D-gedrukte houder (F). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: representatieve resultaten voor vaginale testen. De representatieve mechanische testresultaten van de vaginale basale en passieve protocollen. Met de gegevens verkregen door het DMT-systeem kunnen verschillende mechanische relaties worden afgeleid. A) basale druk diameter, B) passieve druk diameter, C) basale kracht-druk, D) passieve druk, E) basale omtrek spanning-omtrek Stretch, F) passief omtrek spanning-omtrek Stretch, G) basale axiale spanning-omtrek Stretch, H) passieve axiale stress-omtrek stretch. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: representatieve resultaten voor cervicale tests. De representatieve mechanische testresultaten van de cervicale basale en passieve protocollen. Met de gegevens verkregen door het DMT-systeem kunnen verschillende mechanische relaties worden afgeleid. A) basale druk diameter, B) passieve druk diameter, C) basale kracht-druk, D) passieve druk, E) basale omtrek spanning-omtrek Stretch, F) passief omtrek spanning-omtrek Stretch, G) basale axiale spanning-omtrek Stretch, H) passieve axiale stress-omtrek stretch. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

In vivo druk Maximale druk 1/3 maximale druk 2/3 maximale druk Axiale Stretch Canule maat Aanbevolen aantal
van hechtingen
Vagina 7 mmHg 15 mmHg 5 mmHg 10 mmHg -2%, in vivo, + 2% 3,75 mm 2--in een "X" mode
Baarmoederhals 10 mmHg 200 mmHg 66 mmHg 133 mmHg -2%, in vivo, + 2% 0,75 mm voor het uiteinde van de baarmoeder
3,75 mm voor vaginale einde
3 horizontale hechtingen op
het baarmoeder uiteinde
4 hechtingen op de
vaginale externe OS

Tabel 1: samenvatting van de informatie voor het schalen van de mechanische testmethoden voor elk orgaan. De onbelaste drukwaarden werden gemeten met behulp van Catherization technieken onder anesthesie (4% Isofluraan in 100% zuurstof). Een ballon katheter werd gebruikt voor de vaginale metingen en een 2F katheter voor de cervix.

Vagina Baarmoederhals
Basale
Omtrek (kPa)
127,94 188
Basale
Axiaal (kPa)
56,8 75,44
Passieve
Omtrek (kPa)
246,03 61,26
Passieve
Axiaal (kPa)
112,74 19,26

Tabel 2: de representatieve resultaten voor de tangens moduli van de vagina en de cervix. De tangens moduli werden berekend voor zowel de basale als de passieve omstandigheden, alsook voor zowel de omtrek als de axiale richtingen. Alle geleverde metingen zijn in eenheden van kPa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het protocol in dit artikel geeft een methode voor het bepalen van de mechanische eigenschappen van de Murine vagina en cervix. De in dit protocol geanalyseerde mechanische eigenschappen omvatten zowel de passieve als de basale Toon omstandigheden van de organen. Passieve en basale Toon omstandigheden worden veroorzaakt door het veranderen van de biochemische omgeving waarin het orgel wordt ondergedompeld. Voor dit protocol bevat de bij de basale test betrokken media calcium. Testen van de basale Toon voorwaarde staat isolatie van de gladde spier cel mechanische bijdrage binnen de vrouwelijke voortplantingsorganen54,55. Bij het uitvoeren van passieve mechanische testen bevat de media geen calcium. Het gebrek aan calcium remt de gladde spiercellen van contracteren. Dit maakt het mogelijk om andere ECM-componenten te verheldering, zoals collageen en elastische vezels, die de passieve mechanische eigenschappen grotendeels dicteren. In combinatie met biochemische en histologische analyse, deze resultaten toelaten het verheldering van de relaties tussen ECM microstructurele samenstelling en mechanische functie. Dit maakt het mogelijk om de structurele en mechanische mechanismen van pathologieën die relevant zijn voor de reproductieve gezondheid van vrouwen te afbakenen.

Voorheen werden de vagina en de baarmoederhals uniaxiaal27,28getest. De vagina en de cervix tonen echter anisotrope eigenschappen en ervaren multiaxiaal laden in vivo29,30 . Vandaar dat de in dit document gebruikte myograph-systemen kwantitatieve informatie verschaffen over multiaxiale belasting die kan helpen bij het begrijpen van de etiologie van reproductieve pathologieën, evenals het daaropvolgende ontwerp van mogelijke behandelingen. Verder maakt de druk myografie het mogelijk om multiaxiale eigenschappen te beoordelen met behoud van de in vivo orgel geometrie en de native Cell-matrix interactie56 . In vivo hermodelleren de cellen de omringende ECM actief in reactie op veranderingen in biomechanische en biochemische signalen57,58,59. Het protocol dat hierin wordt gebruikt, is voordelig omdat het controle van latere veranderingen in bulk orgel eigenschappen mogelijk maakt onder fysiologisch relevante omstandigheden. Dit helpt bij het leveren van een platform voor het genereren van systematische datasets van multiaxiaal actieve en passieve mechanische eigenschappen. Verder kunnen de gegevens die in deze experimenten worden verzameld, worden gebruikt om microstructureel gemotiveerde niet-lineaire constitutieve modellen te formuleren en te valideren om de mechanische respons van de vrouwelijke voortplantingsorganen te beschrijven en te voorspellen in gezonde en pathologische toestanden16,60.

Een extra systeem component die voor het protocol voordelig was, was het gebruik van ultrasone beeldvorming om de dikte van de orgel wanden te meten. De dikte is cruciale informatie voor het berekenen van stress ervaren tijdens het testen ondergaan.

Bij elke experimentele opstelling zijn er enkele beperkingen aan deze procedure. Dit protocol beschouwt momenteel alleen de elastische reactie van de vagina en baarmoederhals en niet de viscoelastische reactie. Een mogelijke methode om deze beperking in de toekomst te beperken is het wijzigen van het bestaande protocol met kruip en stress ontspanning assays61. Een tweede beperking gaat ervan uit dat de organen onsamendrukbaar zijn. Binnen deze studie werd de dikte uitsluitend gemeten bij de onbelaste configuratie, zoals gemotiveerd door eerdere studies die aantonen dat nonpregnant muriene weefsel minimale veranderingen in volume vertoont tijdens osmotische belasting62. Bovendien hebben aanvullende studies onder dezelfde aanname van incompressibility44,60,63gewerkt. Idealiter zou een echografie worden uitgevoerd voor het geheel van het experiment om de noodzaak voor de incompressibility veronderstelling te verwijderen en om de eindige element modellen beter te informeren. Een laatste beperking is het ontbreken van gekwantificeerde in vivo cervicale druk om de laad protocollen te informeren. Literatuur suggereert dat de cervicale druk bij menselijke vrouwen 37 mmHg53is. Muizen, echter, kunnen vertonen verschillende cervicale druk van die van de mens. Een verschil in vaginale druk werd aangetoond tussen knaagdieren modellen en menselijke monsters64,65. Verdere studies zijn nodig om de druk in de niet-zwangere Murine cervix kwantificeren. Naar dit einde, intra-uteriene druk werd onlangs gemeld tijdens de zwangerschap49.

De commercieel beschikbare druk myograph systeem gebruikt in deze procedure meet de kracht eigenschappen van elastische, holle organen. Dit protocol is gemakkelijk aan te passen aan andere verschillende organen en weefsels door aanpassing van de chemische additieven in het bad, canule grootte en hechting dikte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen.

Acknowledgments

Het werk werd gefinancierd door de NSF CAREER Award subsidie #1751050.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2F catheter Millar SPR-320 catheter to measure cervical pressure
6-0 Suture Fine Science Tools 18020-60 larger suture ties
CaCl2 (anhydrous) VWR 97062-590 HBSS concentration: 140 mg/ mL
CaCl2-2H20 Fischer chemical BDH9224-1KG
KRB concentration: 3.68 g/L
Dextrose (D-glucose) VWR 101172-434 HBSS concentration: 1000 mg/mL
KRB concentration: 19.8 g/L
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 curved forceps
Dumont SS Forceps Fine Science Tools 11203-25 straight forceps
Eclipse Nikon E200 microscope used for imaging
Flow meter Danish MyoTechnologies 161FM flow meter within the testing apparatus
Force Transducer - 110P Danish MyoTechnologies 100079 force transducer
ImageJ SciJava ImageJ1 used to measure volume
Instrument Cases Fine Science Tools 20830-00 casing to hold dissection tools
KCl Fisher Chemical 97061-566 HBSS concentration: 400 mg/ mL
KRB concentration: 3.5 g/L
KH2PO4 G-Biosciences 71003-454 HBSS concentration: 60 mg/ mL
MgCl2 VWR 97064-150
KRB concentration: 1.14 g/L
MgCl2-6H2O VWR BDH9244-500G HBSS concentration: 100 mg/ mL
MgSO4-7H20 VWR 97062-134 HBSS concentration: 48 mg/ mL
Mircosoft excel Microsoft 6278402 program used for spreadsheet
Na2HPO4 (dibasic anhydrous) VWR 97061-588 HBSS concentration: 48 mg/mL
KRB concentration: 1.44 g/L
NaCl VWR 97061-274 HBSS concentration: 8000 mg/mL
KRB concentration: 70.1 g/L
NaHCO3 VWR 97062-460 HBSS concentration: 350 mg/ mL
KRB concentration: 21.0 g/L
Pressure myograph systems Danish MyoTechnologies 110P and 120CP Pressure myograph system:
prorgram, cannulation device,
and controller unit
Pressure Transducer Danish MyoTechnologies 100106 pressure transducer
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 91150-20 straight forceps
Student Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 micro-scissors
Tissue dye Bradley Products 1101-3 ink to measure in vivo stretch
Ultrasound transducer FujiFilm Visual Sonics LZ-550 ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency
VEVO2100 FujiFilm Visual Sonics VS-20035 ultrasound used for imaging
Wagner Scissors Fine Science Tools 14069-12 larger scissors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Capone, D., et al. Evaluating Residual Strain Throughout the Murine Female Reproductive System. Journal of Biomechanics. 82, 299-306 (2019).
  2. Danforth, D. The fibrous nature of the human cervix, and its relation to the isthmic segment in gravid and nongravid uteri. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 53, (4), 541-560 (1947).
  3. Hughesdon, P. The fibromuscular structure of the cervix and its changes during pregnancy and labour. Journal of Obstetrics and Gynecology of the British Commonwealth. 59, 763-776 (1952).
  4. Bryman, I., Norstrom, A., Lindblo, B. Influence of neurohypophyseal hormones on human cervical smooth muscle cell contractility in vitro. Obstetrics and Gynecology. 75, (2), 240-243 (1990).
  5. Joy, V., et al. A New Paradigm for the Role of Smooth Muscle Cells in the Human Cervix. Obstetrics. 215, (4), e471-e478 (2016).
  6. Xu, X., Akgul, Y., Mahendroo, M., Jerschow, A. Ex vivo assessment of mouse cervical remodeling through pregnancy via Na (23) MRS. NMR Biomedical. 23, (23), 907-912 (2014).
  7. Leppert, P. Anatomy and Physiology of cervical ripening. Clinical Obstetrics and Gynecology. 43, (43), 433-439 (2000).
  8. Schlembach, D., et al. Cervical ripening and insufficiency: from biochemical and molecular studies to in vivo clinical examination. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 144, S70-S79 (2000).
  9. Stoka, K., et al. Effects of Increased Arterial Stiffiness on Atherosclerotic Plaque Amounts. Journal of Biomechanical Engineering. 140, (5), (2018).
  10. Mohram, D., Heller, L. Ch. 7. Cardiovascular Physiology. The McGraw-Hill Companies. (2006).
  11. Yoshida, K., et al. Quantitative Evaluation of Collagen Crosslinks and Corresponding Tensile Mechanical Properties in Mouse Cervical Tissue during Normal Pregnancy. PLoS One. 9, e112391 (2014).
  12. Mahendroo, M. Cervical remodeling in term and preterm birth: insight from an animal model. Society for Reproduction and Fertility. 143, (4), 429-438 (2012).
  13. Elovitz, M., Miranlini, C. Can medroxyprogesterone acetate alter Toll-like receptor expression in a mouse model of intrauterine inflammation? American Journal of Obstetrics and Gynecology. 193, (3), 1149-1155 (2005).
  14. Ripperda, C., et al. Vaginal estrogen: a dual-edged sword in postoperative healing of the vaginal wall. North American Menopause Society. 24, (7), 838-849 (2017).
  15. Nelson, J., Felicio, P., Randall, K., Sims, C., Finch, E. A Longitudinal Study of Estrous Cyclicity in Aging C57/6J Mice: Cycle, Frequency, Length, and Vaginal Cytology. Biology of Reproduction. 27, (2), 327-339 (1982).
  16. Ferruzzi, J., Collins, M., Yeh, A., Humphrey, J. Mechanical assessment of elastin integrity in fibrillin-1-deficient carotid arteries: implications for Marfan Syndrome. Cardiovascular Research. 92, (2), 287-295 (2011).
  17. Mariko, B., et al. Fribrillin-1 genetic deficiency leads to pathological ageing of arteries in mice. The Journal of Pathology. 224, (1), 33-44 (2011).
  18. Rahn, D., Ruff, M., Brown, S., Tibbals, H., Word, R. Biomechanical Properties of The Vaginal Wall: Effect of Pregnancy, Elastic Fiber Deficiency, and Pelvic Organ Prolapse. American Urogynecological Society. 198, (5), (2009).
  19. Caulk, A., Nepiyushchikh, Z., Shaw, R., Dixon, B., Gleason, R. Quantification of the passive and active biaxial mechanical behavior and microstructural organization of rat thoracic ducts. Royal Society Interface. 12, (108), 20150280 (2015).
  20. Amin, M., Le, V., Wagenseil, J. Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult. Journal of Visualized Experiments. (60), e3733 (2012).
  21. Sokolis, D., Sassani, S., Kritharis, E., Tsangaris, S. Differential histomechanical response of carotid artery in relation to species and region: mathematical description accounting for elastin and collagen anisiotropy. Medical and Biological Engineering and Computing. 49, (8), 867-879 (2011).
  22. Kim, J., Baek, S. Circumferential variations of the mechanical behavior of the porcine thoracic aorta during the inflation test. Journal of Biomechanics. 44, (10), 1941-1947 (2011).
  23. Faury, G., et al. Developmental adaptation of the mouse cardiovascular system to elastin haploinsufficency. Journal of Clinical Investigation. 11, (9), 1419-1428 (2003).
  24. Naito, Y., et al. Beyond Burst Pressure: Initial Evaluation of the Natural History of the Biaxial Mechanical Properties of Tissue-Engineered Vascular Grafts in the Venous Circulation Using a Murine Model. Tissue Engineering. 20, 346-355 (2014).
  25. Sommer, G., et al. Multaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering. Acta Biomaterialia. 9, (12), 9379-9391 (2013).
  26. Sokolis, D., Orfanidis, I., Peroulis, M. Biomechanical testing and material characterization for the rat large intestine: regional dependence of material parameters. Physiological Measurement. 32, (12), 1969-1982 (2011).
  27. Martins, P., et al. Prediction of Nonlinear Elastic Behavior of Vaginal Tissue: Experimental Results and Model Formation. Computational Methods of Biomechanics and Biomedical Engineering. 13, (3), 317-337 (2010).
  28. Feola, A., et al. Deterioration in Biomechanical Properties of the Vagina Following Implantation of a High-stiffness Prolapse Mesh. BJOG: An International Journal of Obstetrics and Gynaecology. 120, (2), 224-232 (2012).
  29. Huntington, A., Rizzuto, E., Abramowitch, S., Prete, Z., De Vita, R. Anisotropy of the Passive and Active Rat Vagina Under Biaxial Loading. Annals of Biomedical Engineering. 47, 272-281 (2018).
  30. Tokar, S., Feola, A., Moalli, P., Abramowitch, S. Characterizing the Biaxial Mechanical Properties of Vaginal Maternal Adaptations During Pregnancy. ASME 2010 Summer Bioengineering Conference, Parts A and B. 689-690 (2010).
  31. Feloa, A., et al. Impact of Pregnancy and Vaginal Delivery on the Passive and Active Mechanics of the Rat Vagina. Annals of Biomedical Engineering. 39, (1), 549-558 (2010).
  32. Baah-Dwomoh, A., Alperin, M., Cook, M., De Vita, R. Mechanical Analysis of the Uterosacral Ligament: Swine vs Human. Annual Biomedical Engineering. 46, (12), 2036-2047 (2018).
  33. Champlin, A. Determining the Stage of the Estrous Cycle in the Mouse by the Appearance. Biology of Reproduction. 8, (4), 491-494 (1973).
  34. Byers, S., Wiles, M., Dunn, S., Taft, R. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS One. 7, (4), e35538 (2012).
  35. McLean, A. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. 67, e4389 (2012).
  36. Bugg, G., Riley, M., Johnston, T., Baker, P., Taggart, M. Hypoxic inhibition of human myometrial contractions in vitro: implications for the regulation of parturition. European Journal of Clinical Investigation. 36, (2), 133-140 (2006).
  37. Taggart, M., Wray, S. Hypoxia and smooth muscle function: key regulatory events during metabolic stress. Journal of Physiology. 509, 315-325 (1998).
  38. Yoo, K., et al. The effects of volatile anesthetics on spontaneous contractility of isolated human pregnant uterine muscle: a comparison among sevoflurane, desflurane, isoflurane, and halothane. Anesthesia and Analgesia. 103, (2), 443-447 (2006).
  39. de Souza, L., et al. Effects of redox disturbances on intentional contractile reactivity in rats fed with a hypercaloric diet. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 6364821 (2018).
  40. Jaue, D., Ma, Z., Lee, S. Cardiac muscarinic receptor function in rats with cirrhotic cardiomyopathy. Hepatology. 25, 1361-1365 (1997).
  41. Xu, Q., Shaffer, E. The potential site of impaired gallbladder contractility in an animal mode of cholesterol gallstone disease. Gastroenterology. 110, (1), 251-257 (1996).
  42. Rodriguez, U., et al. Effects of blast induced Neurotrauma on pressurized rodent middle cerebral arteries. Journal of Visualized Experimentals. (146), e58792 (2019).
  43. Rubod, C., Boukerrou, M., Brieu, M., Dubois, P., Cosson, M. Biomechanical Properties of Vaginal Tissue Part 1: New Experimental Protocol. Journal of Urology. 178, 320-325 (2007).
  44. Robison, K., Conway, C., Desrosiers, L., Knoepp, L., Miller, K. Biaxial Mechanical Assessment of the Murine Vaginal Wall Using Extension-Inflation Testing. Journal of Biomechanical Engineering. 139, (10), 104504 (2017).
  45. Van loon, P. Length-Force and Volume-Pressure Relationships of Arteries. Biorheology. 14, (4), 181-201 (1977).
  46. Fernandez, M., et al. Investigating the Mechanical Function of the Cervix During Pregnancy using Finite Element Models Derived from High Resolution 3D MRI. Computational Methods Biomechanical and Biomedical Engineering. 19, (4), 404-417 (2015).
  47. House, M., Socrate, S. The Cervix as a Biomechanical Structure. Ultrasound Obstetric Gynecology. 28, (6), 745-749 (2006).
  48. Martins, P., et al. Biomechanical Properties of Vaginal Tissue in Women with Pelvic Organ Prolapse. Gynecologic and Obstetrics Investigation. 75, 85-92 (2013).
  49. Rada, C., Pierce, S., Grotegut, C., England, S. Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In vivo. Journal of Visualized Experiments. (98), e52541 (2015).
  50. Lumsden, M. A., Baird, D. T. Intra-uterine pressure in dysmenorrhea. Acta Obstectricia at Gynecologica Scandinavica. 64, (2), 183-186 (1985).
  51. Milsom, I., Andersch, B., Sundell, G. The Effect of Flurbiprofen and Naproxen Sodium On Intra-Uterine Pressure and Menstrual Pain in Patients With Primary Dysmennorrhea. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 67, (8), 711-716 (1988).
  52. Park, K., et al. Vasculogenic female sexual dysfunction: the hemodynamic basis for vaginal engorgement insufficiency and clitoral erectile insufficiency. International Journal of Impotence Journal. 9, (1), 27-37 (1997).
  53. Bulletti, C., et al. Uterine Contractility During Menstrual Cycle. Human Reproduction. 15, 81-89 (2000).
  54. Kim, N. N., et al. Effects of Ovariectomy and Steroid Hormones on Vaginal Smooth Muscle Contractility. International Journal of Impotence Research. 16, 43-50 (2004).
  55. Giraldi, A., et al. Morphological and Functional Characterization of a Rat Vaginal Smooth Muscle Sphincter. International Journal of Impotence Research. 14, 271-282 (2002).
  56. Gleason, R., Gray, S. P., Wilson, E., Humphrey, J. A Multiaxial Computer-Controlled Organ Culture and Biomechanical Device for Mouse Carotid Arteries. Journal of Biomechanical Engineering. 126, (6), 787-795 (2005).
  57. Swartz, M., Tscumperlin, D., Kamm, R., Drazen, J. Mechanical Stress is Communicated Between Different Cell Types to Elicit Matrix Remodeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (11), 6180-6185 (2001).
  58. Rachev, A. Remodeling of Arteries in Response to Changes in their Mechanical Environment. Biomechanics of Soft Tissue in Cardiovascular Systems. 441, 221-271 (2003).
  59. Lee, E. J., Holmes, J., Costa, K. Remodeling of Engineered Tissue Anisotropy in Response to Altered Loading Conditions. Annals of Biomedical Engineering. 36, (8), 1322-1334 (2008).
  60. Akintunde, A., et al. Effects of Elastase Digestion on the Murine Vaginal Wall Biaxial Mechanical Response. Journal of Biomechanical Engineering. 141, (2), 021011 (2018).
  61. Griffin, M., Premakumar, Y., Seifalian, A., Butler, P., Szarko, M. Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing. Journal of Visualized Experiments. (118), e54872 (2016).
  62. Myers, K., Socrate, S., Paskaleva, A., House, M. A Study of the Anisotripy and Tension/Compression Behavior of Human Cervical Tissue. Journal of Biomechanical Engineering. 132, (2), 021003 (2010).
  63. Murtada, S., Ferruzzi, J., Yanagisawa, H., Humphrey, J. Reduced Biaxial Contractility in the Descending Thoracic Aorta of Fibulin-5 Deficent Mice. Journal of Biomechanical Engineering. 138, (5), 051008 (2016).
  64. Berkley, K., McAllister, S., Accius, B., Winnard, K. Endometriosis-induced vaginal hyperalgesia in the rat: effect of estropause, ovariectomy, and estradiol replacement. Pain. 132, s150-s159 (2007).
  65. van der Walt, I., Bø, K., Hanekom, S., Rienhardt, G. Ethnic Differences in pelvic floor muscle strength and endurance in South African women. International Urogynecology Journal. 25, (6), 799-805 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics