एक Porcin Corneal Endothelial अंग संस्कृति मॉडल विभाजन Corneal बटन का उपयोग

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

यहाँ, porcin विभाजन corneal बटन की तैयारी और खेती के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है. इस organo-आम तौर पर खेती अंग संस्कृति मॉडल के भीतर सेल मृत्यु दर से पता चलता है के रूप में 15 दिनों, मानव दाता कॉर्निया के लिए तुलनीय, यह विषाक्त डेक्सट्रान जोड़ने के बिना गैर मानव कॉर्निया की लंबी अवधि की खेती की अनुमति पहले मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Steinhorst, N. A., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons. J. Vis. Exp. (152), e60171, doi:10.3791/60171 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

कॉर्निया endothelial कोशिकाओं पर प्रायोगिक अनुसंधान कई कठिनाइयों के साथ जुड़ा हुआ है. मानव दाता कॉर्निया दुर्लभ हैं और प्रयोगात्मक जांच के लिए शायद ही कभी उपलब्ध के रूप में वे सामान्य रूप से प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक हैं. Endothelial सेल संस्कृतियों अक्सर अच्छी तरह से vivo स्थितियों में अनुवाद नहीं है. गैर-मानव कॉर्निया की जैव संरचनात्मक विशेषताओं के कारण, खेती के दौरान स्ट्रॉमल सूजन पर्याप्त कॉर्निया एंडोथेलियल सेल हानि लाती है, जिससे एक विस्तारित अवधि के लिए खेती करना मुश्किल हो जाता है। डेक्सट्रन जैसे डेवेलिंग एजेंटों का उपयोग इस प्रतिक्रिया को प्रतिक्रिया करने के लिए किया जाता है। हालांकि, वे भी महत्वपूर्ण endothelial सेल हानि का कारण. इसलिए, एक पूर्व vivo अंग संस्कृति मॉडल desining एजेंटों की आवश्यकता नहीं स्थापित किया गया था. एक स्थानीय कसाईखाना से सुअर आँखें विभाजित कॉर्निया बटन तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया. आंशिक कॉर्निया ट्रेफिकेशन के बाद, कॉर्निया (एपिथेलियम, बोमन परत, स्ट्रोमा के कुछ हिस्सों) की बाहरी परतों को हटा दिया गया था। यह काफी लंबे समय तक खेती की अवधि के दौरान बड़े पैमाने पर स्ट्रॉमल सूजन और Descemet की झिल्ली तह द्वारा प्रेरित corneal endothelial सेल नुकसान कम कर देता है और endothelial सेल परत के सामान्य संरक्षण में सुधार. इसके बाद पूर्ण कॉर्निया ट्रेफिकेशन के बाद शेष नेत्र बल्ब और खेती से विभाजित कॉर्निया बटन को हटा दिया गया। एंडोथेलियल सेल घनत्व को तैयार करने के बाद 15 दिनों के अनुवर्ती समय पर मूल्यांकन किया गया था (यानी, दिन 1, 8, 15) प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए। तैयारी तकनीक का इस्तेमाल किया endothelial सेल परत कम stromal ऊतक सूजन द्वारा सक्षम का एक बेहतर संरक्षण की अनुमति देता है, जो मानव दाता कॉर्निया के लिए तुलनीय विभाजन कॉर्निया बटन में धीमी और रैखिक गिरावट दर में परिणाम. के रूप में इस मानकीकृत organo आम तौर पर पहली बार के लिए खेती अनुसंधान मॉडल कम से कम दो सप्ताह के लिए एक स्थिर खेती की अनुमति देता है, यह मानव दाता corneas के लिए विभिन्न बाहरी कारकों के भविष्य की जांच के लिए एक मूल्यवान विकल्प के साथ संबंध है उनके संबंध कॉर्निया एंडोथेलियम पर प्रभाव.

Introduction

कॉर्नियल प्रत्यारोपण प्रक्रियादुनिया में सबसे अधिक प्रदर्शन प्रत्यारोपण ों में से1हैं . चूंकि मानव दाता कॉर्निया की भारी कमी है, इसलिए मानव कॉर्निया में कॉर्निया एंडोथेलियल कोशिकाओं को संबोधित करने वाले प्रायोगिक अनुसंधान 1प्रदर्शनकरना मुश्किल है। हालांकि, सिंचाई समाधान और आंख के भीतर इस्तेमाल अन्य पदार्थों की शुरूआत, नेत्र विस्कोलोच उपकरणों, साथ ही शल्य चिकित्सा उपकरणों और तकनीकों (जैसे, phacoemulsification उपकरणों और तकनीक, अल्ट्रासाउंड ऊर्जा) की आवश्यकता है नैदानिक उपयोग से पहले कॉर्निया endothelium पर उनके प्रभाव के बारे में वैध और व्यापक जांच.

मानव दाता कॉर्निया के लिए कुछ विकल्प अनुसंधान के लिए मौजूद हैं. पशु अनुसंधान मॉडल बहुत मूल्यवान हैं, लेकिन एक ही समय में बहुत संसाधन खपत और तेजी से नैतिक रूप से पूछताछ की. इन विट्रो सेल संस्कृतियों का एक प्रमुख दोष मानव आँख के लिए उनके सीमित अनुवाद है. सेल संस्कृतियों से प्राप्त परिणाम विवो स्थितियों में असंगत हो सकते हैं, क्योंकि कोशिकाओं को एंडोथेलियल मेसेन्काइमल संक्रमण (ईएमटी) से गुजरना पड़ सकता है, जिसके परिणामस्वरूप कोशिका ध्रुवता के नुकसान और कोशिका आकार और जीन में परिवर्तन के कारण फाइब्रोब्लास्ट जैसे आकृति विज्ञान में परिणाम हो सकते हैं अभिव्यक्ति2|

जबकि पिछले पूर्व vivo मॉडल केवल 120 एच तक की खेती की अवधि की सूचना दी, एक उपन्यास तैयारी तकनीक कम से कम 15 दिनों के लिए ताजा सुअर कॉर्निया culturing द्वारा एक porcine corneal endothelial अंग संस्कृति मॉडल स्थापित करने के लिए हाल ही में शुरू किया गया था3 ,4,5,6. यदि कॉर्निया उपकला और स्ट्रोमा के कुछ हिस्सों को खेती से पहले कॉर्निया से (लगभग 300 डिग्री मीटर) हटा दिया जाता है, तो स्ट्रोमा की सूजन को विभाजित कॉर्निया बटन में कम कर दिया जाता है जिसके परिणामस्वरूप कम एंडोथेलियल सेल नुकसान और एक अच्छी तरह से बनाए रखा गया एंडोथेलियल होता है 15 दिनों तक की कोशिका परत, जबकि गैर-विभाजन कॉर्निया बटन असमान स्ट्रॉमल सूजन और Descemet की परतों के गठन के कारण महत्वपूर्ण एंडोथेलियल सेल हानि दिखाते हैं। नेत्र बैंकों आमतौर पर इस तरह के प्रत्यारोपण से पहले कॉर्निया की सूजन को कम करने के लिए डेक्सट्रन के रूप में osmotic desofin एजेंटों का उपयोग करें। तथापि, इन एजेंटों को बढ़ी हुई एन्डोथेलियल सेल हानि7,8,9को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया था .

यह लेख एक विस्तृत कदम दर कदम प्रोटोकॉल में इस मानकीकृत पूर्व vivo अनुसंधान मॉडल कल्पना करने के लिए भविष्य जांचकर्ताओं विभाजन कॉर्निया बटन का उपयोग corneal endothelium पर अनुसंधान करने के लिए सक्षम करने के लिए करना है. इस मॉडल के पदार्थों और आंखों के भीतर इस्तेमाल किया तकनीक का परीक्षण करने के लिए एक सीधी विधि का प्रतिनिधित्व करता है, इस तरह के नेत्र चिपचिपा लोचदार उपकरणों के रूप में, सिंचाई समाधान, और अल्ट्रासाउंड ऊर्जा, या अन्य प्रक्रियाओं जहां corneal endothelium ब्याज की है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यह प्रोटोकॉल हमारी संस्था के नैतिक दिशानिर्देशों का पालन करता है। हमारी संस्था की नैतिक समीक्षा समिति के संविधियों के अनुसार प्रयोगों से पहले कोई नैतिक अनुमोदन प्राप्त नहीं करना था, क्योंकि सभी पोरसिन कॉर्निया स्थानीय बूचड़खाना से प्राप्त किए गए थे।

1. अंग संस्कृति

  1. सुअर आँखें तैयार करें.
    1. स्थानीय कसाईखाना से, सुअर आँखें कि शीघ्र ही पोस्टमार्टम हटा दिया गया है, लेकिन थर्मल उपचार से पहले प्राप्त करते हैं. प्रयोगशाला के लिए आंखों के परिवहन और उन्हें कुछ ही घंटों के भीतर प्रक्रिया। परिवहन के दौरान, प्रसंस्करण से पहले कमरे के तापमान (लगभग 21 डिग्री सेल्सियस) पर आंखों रखें।
    2. आंखों की कैंची और कोलिब्री संदंश का उपयोग करके कीटाणुशोधन से पहले सभी कक्षीय adnexes (आंख की मांसपेशियों, कंजक्टिवा, वसा ऊतक) निकालें। अलग और स्पष्ट आघात, बाहरी क्षति (जैसे, चाकू में कटौती), या दिखाई corneal opacities के साथ सभी आँखें त्यागें.
    3. एक बाँझ कप में 5% आयोडीन-पीबीएस-समाधान (1:20) को फॉस्फेट बफर ्ड नमकीन (पीबीएस) घोल के 57 एमएल में 7.5% पोविडोन आयोडीन के 3 एमएल जोड़कर तैयार करें। इसके अलावा 60 एमएल शुद्ध पीबीएस युक्त एक अलग बाँझ कप तैयार करें।
      नोट: इस्तेमाल किया आयोडीन-पीबीएस समाधान और कप के आकार की कुल राशि कॉर्निया विच्छेदन किया जा करने के लिए की संख्या पर निर्भर करता है। पांच से छह आंखों को ठीक से कीटाणुरहित होने के लिए 5% आयोडीन-पीबीएस-समाधान के लगभग 60 एमएल की आवश्यकता होती है।
    4. आंखों की सतह को ठीक से कीटाणुरहित करने के लिए कुल 5 मिनट के लिए 5%-आयोडीन-पीबीएस समाधान में पांच से छह आंखें रखें। ध्यान से आंखों की सतह पूरी तरह से जलमग्न है और आयोडीन समाधान में पूरी तरह से कीटाणुरहित सुनिश्चित करने के लिए हर मिनट हलचल।
    5. 5 मिनट के बाद, शुद्ध पीबीएस से भरा तैयार कप के लिए कीटाणुरहित आंखों को स्थानांतरित करें। फिर, ध्यान से आयोडीन-पीबीएस समाधान सुनिश्चित करने के लिए हलचल आंखों की सतह से दूर धोया जाता है।
      नोट: कीटाणुरहित आंखों के संदूषण को रोकने के लिए एक साफ बेंच पर इस कदम को करें।
  2. सेल संस्कृति प्लेटें तैयार करें.
    नोट: लगातार laminar हवा के प्रवाह के साथ एक साफ बेंच पर निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन।
    1. भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के Thaw 2 एमएल. एक कुंद cannula का उपयोग कर FCS के साथ एक सिरिंज (5 एमएल) भरें. एक सिरिंज फिल्टर के माध्यम से सिरिंज खाली (0.22 मीटर) डेक्सट्रन मुक्त संस्कृति मध्यम मैं (कम से कम आवश्यक मध्यम [एमईएम] अर्ल के लवण के साथ 80 एमएल में एफसीएस के संभावित जीवाणु संदूषण को रोकने के लिए, पेनिसिलिन / ऐम्फोटेरिकन बी [250 ग्राम/एमएल], हेप्स बफर [1 एम] [50x], NaHCO3, और आसुत पानी)। मिश्रण भी सब्सट्रेट वितरण सुनिश्चित करने के लिए उत्तेजित।
    2. सब्सट्रेट मिश्रण के 3 एमएल के साथ एक 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से भरें.
  3. विच्छेदन और ऊष्मायन प्रदर्शन.
    नोट: एक साफ बेंच पर इस कदम को निष्पादित करें। कॉर्निया एंडोथेलियम को किसी भी उपकरण से न छुएं।
    1. पीबीएस के साथ कप से कॉर्निया का सामना करना पड़ कॉर्निया के साथ आंख बल्ब धारक में एक आँख बल्ब स्थानांतरण और यह एक नेत्र शल्य माइक्रोस्कोप के नीचे जगह है. विच्छेदन के लिए स्थिति में आंख को ठीक करने के लिए आंख के बल्ब धारक पर कुछ चूषण को थोड़ा लागू करने के लिए 0.9% NaCl से भरा सिरिंज का उपयोग करें।
    2. एक ट्रेफिन (जेड 7-5 मिमी) का उपयोग करें जिसमें मानकीकृत अंतर्लय होता है, जो यह सुनिश्चित करता है कि ट्रेफ़िन्ड गहराई 300 डिग्री मी से अधिक नहीं होगी, केंद्रीय कॉर्निया में सतही रूप से कटौती करने के लिए (चित्र 1)।
    3. कोलिब्रि बल्स और एक त्रिकोणीय ब्लेड के साथ एक एकल उपयोग स्केलपेल का उपयोग करने के लिए कटौती और stroma के माध्यम से क्षैतिज कॉर्निया के आंशिक रूप से trephined भाग को दूर. कॉर्निया उपकला, बोमन परत, और stroma का एक हिस्सा से मिलकर अलग कॉर्निया भाग को छोड़ दें।
      नोट: कड़ाई से क्षैतिज काटने दिशा बनाए रखने के लिए शेष stroma की एक भी मोटाई प्राप्त करने के लिए.
    4. सतही तौर पर प्रयोगों के दौरान स्ट्रॉमल पक्ष से एंडोथेल को अलग करने में सक्षम होने के लिए स्ट्रोमा में 10-0 सीवन (10-0 पॉलीमाइड 6) रखें (चित्र 1)। कॉर्निया एंडोथेलियम के प्रवेश को रोकें। यदि एंडोथेलियम प्रवेश कर रहा है तो नेत्र बल्ब को छोड़ दें।
      नोट: suturing सुई के साथ कॉर्निया endothelium के प्रवेश दिखाई देगा, के रूप में पूर्वकाल नेत्र कक्ष से तरल पदार्थ सीवन चैनल के माध्यम से रिसाव होगा.
    5. जब तक पूर्ववर्ती नेत्र कक्ष तक नहीं पहुंच जाता तब तक ट्रेफ़िन्ड कट को पूर्ण गहराई तक आगे बढ़ाने के लिए बिना किले के बिना ट्रेफिन का प्रयोग करें (चित्र 1) पूर्वकाल नेत्र कक्ष से रिसाव वाले प्रतिरोध और तरल पदार्थ में एक अलग बूंद को कॉर्निया के पूर्ण प्रवेश के बाद माना जा सकता है।
      नोट: एक हॉकी चाकू का प्रयोग करें यदि विभाजित कॉर्निया बटन ट्रेफिनेशन के बाद विभाजित कॉर्निया बटन के एक तरफ संलग्न रहता है।
    6. प्राप्त विभाजन कॉर्निया बटन स्थानांतरण, अब stroma का एक हिस्सा से मिलकर (चित्र 2), Descemet की झिल्ली, और corneal endothelium, संस्कृति माध्यम में (संस्कृति माध्यम मैं + FCS, अनुभाग 1.2 देखें) के साथ 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट में टैग की ओर नीचे का सामना करना पड़ रहा है, ताकि कॉर्निया endothelium का सामना करना पड़ रहा है.
      नोट: यदि एंडोथेलियल पक्ष नीचे का सामना करना पड़ रहा है, endothelium क्षतिग्रस्त हो सकता है.
    7. अनुवर्ती कार्रवाई के दौरान पहचान के लिए प्रत्येक विभाजित कॉर्निया बटन को एक अलग-अलग नंबर असाइन करें और तदनुसार सेल कल्चर प्लेट पर कुओं को लेबल करें।
    8. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 और 95% की एक रिश्तेदार हवा नमी के तापमान पर मानक शर्तों के तहत एक इनक्यूबेटर में भरा सेल संस्कृति प्लेटों इनक्यूबेट। संस्कृति माध्यम बदलें (संस्कृति माध्यम मैं + FCS) दिन 8 पर अगर 7 दिनों की एक ऊष्मायन अवधि से अधिक है.
      नोट: विभाजन कॉर्निया बटन का उपयोग कर ऊष्मायन प्रक्रिया अप करने के लिए 15 दिनों के लिए मान्य किया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: विभाजित कॉर्निया बटन प्राप्त करने के लिए porcin कॉर्निया का विच्छेदन. () कॉर्निया के ट्रेफिन के बाद एक टले के साथ एक ट्रेफिन का उपयोग करके 300 डिग्री मीटर की गहराई में कटौती करने और उपकला और स्ट्रोमल ऊतक के कुछ हिस्सों को हटाने के लिए , (बी) एक सीवन कॉर्निया के प्रवेश के बिना स्ट्रोमा में सतही रूप से रखा जाता है स्ट्रोमल पक्ष की बाद में पहचान के लिए एंडोथेलियम। () शेष कॉर्निया का पूर्ण ट्रेफिकेशन उसके बाद (डी) नेत्र बल्ब से प्राप्त विभाजन कॉर्निया बटन को हटाने के बाद किया जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. माइक्रोस्कोपी और एंडोथेलियम की परीक्षा

  1. बेदाग परीक्षा प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: बेदाग परीक्षा कई बार किया जा सकता है (उदा., दिन 1, 8, और 15 पर साप्ताहिक अनुवर्ती अप पर). हालांकि, बेदाग गिनती केवल endothelial सेल घनत्व के आकलन की अनुमति देता है, नहीं रूपात्मक मापदंडों.
    1. एक 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में hypotonic संतुलित नमक समाधान (hBSS, सामग्री की तालिकामें संरचना देखें) के 3 एमएल भरें। ध्यान से hBSS में एक एकल विभाजन कॉर्निया बटन जगह corneal endothelial कोशिकाओं की सूजन प्रेरित और सेल गिनती के लिए कोशिकाओं की दृश्यता में सुधार करने के लिए.
      नोट: सुनिश्चित करें कि endothelial पक्ष माइक्रोस्कोप की दिशा का सामना करना पड़ रहा है. यदि एक उल्टे चरण विपरीत सूक्ष्मदर्शी का उपयोग किया जाता है, endothelial पक्ष नीचे की ओर का सामना करना पड़ की जरूरत है. जबकि जगह में, संस्कृति प्लेट endothelial सेल क्षति को रोकने के लिए नहीं ले जाया जाना चाहिए.
    2. माइक्रोस्कोप से जुड़े कैमरे के साथ एंडोथेलियम की एक तस्वीर लेने से पहले कोशिकाओं को 1-2 मिनट के लिए फूलने दें। कॉर्निया एंडोथेलियम की वास्तविक स्थिति का एक प्रतिनिधि प्रभाव प्राप्त करने के लिए कम से कम तीन अलग-अलग क्षेत्रों की कम से कम तीन तस्वीरें लें। कॉर्निया endothelial सेल घनत्व और आकृतिक मापदंडों के बाद विश्लेषण के लिए 100 डिग्री की लंबाई पैमाने पर सच के साथ एक पैमाने पट्टी जोड़ें.
    3. परासरणी क्षति को रोकने के लिए, अधिकतम 5 मिनट के बाद एचबीएससे से विभाजित कॉर्निया बटन को हटा दें और इसे संस्कृति माध्यम3में वापस स्थानांतरित करें।
  2. दागी परीक्षा प्रदर्शन.
    नोट: दाग प्रयोगों समाप्त, के रूप में दाग पदार्थों का इस्तेमाल किया cytotoxic हैं. इसलिए, धुंधला केवल रूपात्मक पैरामीटर के आकलन के लिए अवलोकन अवधि के अंत में किया जा सकता है (सुधार के आंकड़े, rosette संरचनाओं, alizarin लाल दाग कोशिकाओं).
    1. धुंधला प्रक्रिया के लिए एक 0.25% trypan नीले समाधान और 0.2% alizarin लाल एस समाधान तैयार करें।
      1. 0.25% trypan नीले समाधान के लिए, एक 0.9% NaCl समाधान के साथ 0.4% trypan नीले समाधान पतला.
        नोट: उदाहरण के लिए, एक 0.25% trypan नीले समाधान के 20 लाख प्राप्त करने के लिए, 0.9% NaCl समाधान के 7.5 एमएल के साथ 0.4% trypan नीले समाधान के 12.5 लाख पतला. trypan नीले समाधान कई हफ्तों या महीनों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है.
      2. एक 0.2% alizarin लाल एस समाधान प्राप्त करने के लिए लगातार सरगर्मी और हीटिंग समारोह के साथ एक चुंबक सरगर्मी प्लेट पर 50 डिग्री सेल्सियस के लिए हीटिंग के तहत एक 0.9% NaCl समाधान के 50 एमएल में alizarin लाल एस पाउडर के 100 मिलीग्राम भंग। संभावित वेग को निकालने के लिए, प्राप्त समाधान फ़िल्टर करें. तदनुसार सोडियम हाइड्रॉक्साइड या हाइड्रोक्लोरिक एसिड जोड़कर एलिजारिन लाल एस घोल को पीएच 4-2 में समायोजित करें।
        नोट: alizarin लाल एस समाधान के प्रत्येक आवेदन से पहले सुनिश्चित करें कि पीएच 4.2 करने के लिए सही है और समाधान में कोई वेग नहीं कर रहे हैं। समाधान कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है. समाधान को 4 सप्ताह से अधिक समय तक संग्रहीत न करें.
    2. endothelial कोशिकाओं को दाग के लिए ऊपर की ओर का सामना करना पड़ endothelial पक्ष के साथ पेट्री व्यंजन में विभाजित कॉर्निया बटन रखें. धीरे धीरे 90 s के लिए कॉर्निया endothelium पर ड्रॉप द्वारा 0.25% trypan नीले समाधान ड्रॉप ड्रिप करने के लिए एक पिपेट का प्रयोग करें।
      नोट: ट्रिपन नीले एक पारगम्य झिल्ली के साथ क्षतिग्रस्त corneal कोशिकाओं की पहचान की अनुमति देता है क्योंकि यह उनके नाभिक दाग.
    3. ध्यान से एक छोटे गिलास बीकर में 0.9% NaCl में विभाजित कॉर्निया बटन 3x कुल्ला. फिर, धीरे धीरे 90 s के लिए कॉर्निया endothelium पर ड्रॉप द्वारा 0.2% alizarin लाल एस समाधान ड्रॉप ड्रिप करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
      नोट: Alizarin लाल एस Descemet की झिल्ली दाग है, जो undamaged corneal endothelial कोशिकाओं में सेल सीमाओं को उजागर करने में मदद करता है और नष्ट कोशिकाओं को उजागर करने के लिए जब अंतर्निहित Descemet झिल्ली दिखाई देता है. इसके अलावा, यह बड़े नष्ट क्षेत्रों की आसान पहचान सक्षम बनाता है।
    4. दाग कॉर्निया endothelium की जांच के लिए खंड 2.1 में बेदाग गिनती के लिए समझाया चरणों का पालन करें.

3. कॉर्निया endothelial सेल घनत्व और आकृतिक मापदंडों का विश्लेषण

  1. एक ग्राफिक्स संपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर चित्रों पर परियोजना गिनती वर्गों (सामग्री की तालिका).
    1. सॉफ्टवेयर खोलें और फ़ाइल का चयन करके कॉर्निया endothelium की एक छवि खोलें | ओपन ] का चयन करें.
    2. छवि पर 100 डिग्री उ की ओर लंबाई को स्केल करने के लिए एक सत्य के साथ एक वर्ग परियोजना।
      नोट: देखने सॉफ्टवेयर चित्र पर वर्गों की गणना के प्रोजेक्टिंग के लिए अनुमति देता है, तो अनुभाग 3.1.2 के निम्न चरणों पर ध्यान नहीं दिया जा सकता है। वर्ग की ओर लंबाई माइक्रोस्कोप के कैमरे के साथ लिया छवियों के संकल्प पर निर्भर करता है और पैमाने पट्टी के साथ गणना की जा सकती है.
      1. माइक्रोस्कोप के साथ ली गई तस्वीर से स्केल बार क्रॉप करें: टूल बार पर आयताकार मार्की टूल का चयन करें या Mदबाएँ, फिर स्केल बार को बॉर्डर करें, फिर संपादित करें का चयन करें | Ctrl + Xको क्रॉ या दबाएँ.
      2. क्लिक करें फ़ाइल ] नया (या Ctrl + Nदबाएँ). आगामी विंडो पर दस्तावेज़ प्रकार ड्रॉप-डाउन सूची में क्लिपबोर्ड का चयन करें. दिखाए गए पिक्सेल की संख्या गिनती वर्ग की ओर लंबाई है। अन्य चित्रों के लिए संगत पिक्सेल नोट करें और ठीकक्लिक करें.
      3. फ़ाइल का चयन करें ] नया (या Ctrl + N). स्केल बार की लंबाई के अनुसार आगामी विंडो में गणना वर्ग की चौड़ाई और लंबाई (पिक्सेल में) डालें. पृष्ठभूमि रंग व्हाइटका चयन करें, फिर ठीकदबाएं.
      4. का चयन करें क्लिक करें ] सभी का चयन करें (या Ctrl + A). संपादित करें का चयन करें ] प्रतिलिपि बनाएँ (या Ctrl + C).
      5. 3.1.1 चरण में खोले गए कॉर्निया एंडोथेलियम की छवि का चयन करें। संपादित करें का चयन करें ] कॉर्निया एंडोथेलियम की तस्वीर पर वर्ग डालने के लिए (या Ctrl + V) चिपकाएँ (या Ctrl + V)
      6. वर्ग की परत का चयन करें और पारदर्शिता को समायोजित करें। परत का चयन करें | परत शैली | मिश्रण विकल्प | 30% के लिए अस्पष्टता सेट करें | ठीकहै .
      7. 100 उ उ की साइड लंबाई को स्केल करने के लिए सत्य के साथ अनुमानित वर्ग के साथ छवि को सहेजें. विश्लेषण के लिए आवश्यक अन्य चित्रों के साथ दोहराएँ.
  2. एंडोथेलियल सेल घनत्व और आकृतिक पैरामीटर का आकलन करें।
    1. ImageJ (संस्करण 1.50i) में अनुमानित वर्गों के साथ छवियों को खोलें और वर्ग के भीतर कोशिकाओं की गणना करने के लिए CellCounter प्लगइन का उपयोग करें। ImageJ खोलें, फ़ाइल का चयन करें | खोलें (या Ctrl + O) ] छवि का चयन करें.
      नोट: ImageJ और CellCounter प्लगइन मुफ्त के लिए उपलब्ध हैं ऑनलाइन डाउनलोड.
    2. Plugins का चयन करें | सेल [काउंटर ] सेल काउंटर ] प्रारंभ करें. एंडोथेलियल कोशिकाओं की गणना करें और परिणाम रिकॉर्ड करें। वर्ग के दो पक्षों पर, कोशिकाओं है कि वर्ग के किनारे से काट रहे हैं गिनती. अन्य दो पक्षों पर कटौती कोशिकाओं गिनती मत करो.
    3. विभिन्न क्षेत्रों से कॉर्निया प्रति कम से कम छह वर्गों का विश्लेषण करें (जैसे, तीन चित्र, चित्र प्रति दो वर्गों) और औसत कॉर्निया endothelial सेल घनत्व प्रति वर्ग (100 डिग्री2) का निर्धारण. एन्डोथेलियल सेल घनत्व प्रति 100 डिग्री2 से 1 मिमी2 को 100 से गुणा करके बढ़ाएं।
  3. रूपात्मक परिवर्तनों के मूल्यांकन के लिए, सुधार के आंकड़ों की गणना करें (तीन के बजाय कोशिकाओं/सेल सीमाओं की संयुक्त बैठक), रोज़ेट संरचनाओं (विशेषता रोसेट के आकार की उपस्थिति, एक नष्ट कोशिका के आसपास पांच या अधिक रेडियल रूप से व्यवस्थित कोशिकाओं ), या alizarin लाल क्षेत्रों (नष्ट कोशिकाओं) अनुमानित वर्गों में.
    नोट: वैकल्पिक रूप से, यह अधिक प्रतिनिधि परिणाम प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से संरक्षित नमूनों में रूपात्मक विश्लेषण के लिए बड़े वर्गों (उदाहरण के लिए, 200 x 200 डिग्री2)का उपयोग करने के लिए उपयोगी हो सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्रस्तुत विच्छेदन तकनीक का अर्थ स्ट्रॉमल ऊतक को आंशिक रूप से हटाने से होता है, जिसके परिणामस्वरूप एक पतली कॉर्निया का नमूना होता है और इस प्रकार कम स्ट्रॉमल सूजन(चित्र 1 और चित्र 2)। कम स्ट्रॉमल सूजन कम कतरनी और चुटकी बलों को प्रेरित करती है जो कॉर्निया एंडोथेलियम पर नकारात्मक प्रभाव डालती हैं, जिससे कम एंडोथेलियल सेल हानि दर6होती है। स्प्लिट कॉर्निया बटन गैर-विभाजन कॉर्निया बटन और पूरे कॉर्निया बटन की तुलना में खेती के 15 दिनों के बाद एक काफी बेहतर संरक्षित endothelial सेल परत दिखाने के लिए, जो कम endothelial सेल हानि और सुधार की एक कम संख्या को दर्शाता है आंकड़े ($ 4 कोशिकाओं / सेल सीमाओं तीन के बजाय संयुक्त), rosette संरचनाओं (पांच या अधिक रेडियल एक ही स्थान में बैठक कोशिकाओं), और alizarin लाल (नष्ट) कोशिकाओं के बाद 15 दिन6.

15 दिनों की अवधि में, विभाजित कॉर्निया बटन 4.90% (एन $ 40, चित्र 3) के एक औसत साप्ताहिक प्रतिशत endothelial सेल नुकसान के साथ endothelial सेल घनत्व में लगातार गिरावट दिखा. पहले दिन से शुरू होने वाले पहले दिन 4,033 डिग्री 146/163 कोशिकाओं/मिमी2 (मध्य - 25%/75% क्वार्टाइल) के एंडोथेलियल सेल घनत्व के साथ, सेल घनत्व घटकर 3,850 डिग्री 167/233 कोशिकाओं/मिमी2 दिन 8, और 3,650 डिग्री 200/233 कोशिकाओं/2 मिमी दिन 15 पर कम हो गया। निर्धारित सेल नुकसान पहले और दूसरे सप्ताह के लिए समान थे. दिन 1 $8, 4.00 ] 2.17/1.93% (मध्य ] 25%/75% चतुर्थक); दिन 8 $15, 4.88 ] 5.52/4.42%; दिन 1$15, 8.64 ] 4.32/2.71%). इस प्रकार दी गई गिरावट दर पिछले अध्ययनों में10,11,12में मानव दाता कॉर्निया में सूचित दर के समान है .

15 दिन में एंडोथेलियल सेल परत के दाग के बाद आकृतिक पैरामीटरों का मूल्यांकन किया गया (द र् 28, चित्र 4)। सुधार के आंकड़े विलय सेल सीमाओं के 7.18 $ 2.36/2.90% (मध्य $ 25%/75% चतुर्थक) बना। जांच किए गए नमूनों में 1.11 डिग्री 1.11/15.56 रोजेट संरचनाओं/मिमी2 (मध्य - 25%/75% क्वार्टाइल) का औसत मौजूद था, जबकि 13.33 - 4.44/11.67 एलिजारिन लाल दाग कोशिकाओं/मिमी2 (मध्य - 25%/75% क्वार्टाइल) बार-बार सेल नुकसान के रूप में सामने आ रहा था।

चित्र 5 एचबीएसमें सूक्ष्म मूल्यांकन के दौरान कॉर्निया एंडोथेलियम के प्रतिनिधि चित्र प्रदान करता है (चित्र 5) और ट्राइपैन ब्लू और एलिजारिन लाल एस के साथ धुंधला करने के बाद (चित्र 5बी) । एचबीएस में एंडोथेलियल सेल घनत्व का मूल्यांकन कई बार किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, दिन 1, 8, और 15) पर, जबकि दाग नमूनों को रूपात्मक पैरामीटर के आकलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (सुधार के आंकड़े, रोज़ेट संरचनाओं, एलिज़रिन लाल दाग कोशिकाओं) या सबसे धुंधला पदार्थों के cytotoxic गुणों के कारण प्रयोगों के अंत में endothelial सेल घनत्व का निर्धारण.

यदि विभाजित कॉर्निया बटन रखे जाते हैं और एंडोथेलियल पक्ष के साथ दुर्घटना का सामना करते हैं, तो व्यापक अंत:स्थलीय कोशिका क्षति की अपेक्षा की जानी चाहिए (चित्र 6) । गैर-विभाजन कॉर्निया बटन स्ट्रोमल सूजन के कारण एंडोथेलियल कोशिका हानि में काफी वृद्धि होती है, जिससे Descemet की झिल्ली खेती के 15 दिनों से अधिक तह होती है (चित्र 6बी), जबकि विभाजित कॉर्निया बटन काफी हद तक संरक्षित दिखाते हैं खेती के 15 दिनों के बाद कॉर्निया एंडोथेलियम, बिखरे हुए समयनिष्ठ एलिजारिन लाल दाग क्षेत्रों द्वारा इंगित किया गया है जो एकल नष्ट कोशिकाओं का संकेत देता है (चित्र 6ब्)

Figure 2
चित्र 2: गैर विभाजित कॉर्निया बटन और विभाजित कॉर्निया बटन के Schematic चित्रण. पॉर्थील ऊतक और स्ट्रोमल ऊतक के प्रमुख भागों सहित पॉर्सिन कॉर्निया के 300 डिग्री मीटर को हटाने के बाद, विभाजन कॉर्निया बटन की मोटाई पूरे में कम स्ट्रॉमल सूजन के कारण कॉर्निया एंडोथेलियम के बेहतर संरक्षण के पक्ष में कम हो जाती है। 15 दिनों तक की खेती। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: Endothelial सेल घनत्व (ECD) 15 दिनों से अधिक विभाजित कॉर्निया बटन की. स्प्लिट कॉर्निया बटन (द र् 40) में लगातार गिरावट देखी गई। दिन पर ईसीडी 1, 4,033 - 146/163 कोशिकाओं / मिमी2 (मध्य ] 25%/75% चतुर्थक); दिन 8, 3,850 ] 167/233 कोशिकाओं / दिन 15, 3,650 ] 200/233 कोशिकाओं / डेटा को मध्याध्याका के रूप में दर्शाया गया है - 25%/75% चतुर्थक, मूंछ ें या तो न्यूनतम और अधिकतम या 1.5 इंटरक्वार्टाइल रेंज (IQR) का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: कक्ष क्षति और पुनर्व्यवस्थित प्रक्रियाओं के अतिरिक्त मूल्यांकन के लिए Morphological पैरामीटर. खेती के 15 दिनों के बाद 400x आवर्धन में कॉर्निया एंडोथेलियम की सूक्ष्म तस्वीरें और trypan नीले और alizarin लाल एस दिखा के साथ धुंधला () सुधार के आंकड़े (तीर, चार या अधिक कोशिकाओं की संयुक्त बैठक / तीन),(बी) रोज़ेट संरचनाओं (डॉटेड सर्कल, पांच या अधिक आसन्न कोशिकाओं की विशेषता गुलाब के साथ केंद्रीय घटता सेल) और (सी) alizarin लाल दाग कोशिकाओं (डैश्ड हलकों, नष्ट कोशिकाओं)। डेटा (द र् 28) को औसत के रूप में दर्शाया गया है - 25%/75% चतुर्थक। whiskers या तो न्यूनतम और अधिकतम या 1.5 इंटरक्वार्टाइल रेंज (IQR) का प्रतिनिधित्व करते हैं. सर्किलों IQR के भीतर नहीं outliers का प्रतिनिधित्व करते हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: बेदाग और दाग कॉर्निया endothelium. एंडोथेलियल सेल परत जैसा सूक्ष्म मूल्यांकन (400x आवर्धन) के दौरान देखा गया है () हाइपोटोनिक संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) एंडोथेलियल सेल सूजन के कारण और इस प्रकार बेहतर सेल दृश्यता और (बी) ट्रिपैन ब्लू के साथ धुंधला करने के बाद और alizarin लाल एस कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

Figure 6
चित्रा 6: (A) के कॉर्निया endothelium के अवलोकन तस्वीरें एक विभाजन कॉर्निया बटन उल्टा खेती की, (बी) एक गैर विभाजित कॉर्निया बटन, और (सी) धुंधला करने के बाद एक विभाजन corneal बटन. तस्वीरों में ट्राइपैन ब्लू और एलिजारिन लाल एस () व्यापक कॉर्निया एंडोथेलियल सेल क्षति (लाल क्षेत्र) के साथ धुंधला होने के बाद कॉर्निया एंडोथेलियम को दिखाया गया है , जो विभाजन कॉर्निया बटन के बाद विकसित कॉर्निया बटन के साथ खेती की जाती है। खेती के सप्ताह. (बी)15 दिनों की खेती (लाल धारियाँ) के बाद डेसेमेट की झिल्ली तह और स्ट्रॉमल सूजन के कारण गैर-विभाजन कॉर्नियल बटन में एंडोथेलियल कोशिका क्षति में उल्लेखनीय वृद्धि हुई है। (सी) विभाजन कॉर्निया बटन खेती के 15 दिनों के बाद एक अच्छी तरह से संरक्षित endothelial सेल परत दिखाने के लिए केवल समय पर नष्ट कोशिकाओं alizarin लाल दाग क्षेत्रों में देखा दिखा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल porcin विभाजित corneal बटन है, जो अनुसंधान प्रयोजनों के लिए एक मानकीकृत और कम लागत पूर्व विवो कॉर्निया endotheal अंग संस्कृति मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है की तैयारी के लिए एक विधि प्रदान करता है6. पोरसिन विभाजन कॉर्निया बटन ने दो सप्ताह की अवधि6,10,11, नेत्र बैंकों में उगाए गए मानव दाता कॉर्निया में पाए जाने वाले एंडोथेलियल सेल हानियों के तुलनीय एंडोथेलियल सेल घनत्व में कमी दिखाई 12.

गैर विभाजित कॉर्निया बटन के साथ ही पूरे porcin corneoscleके नमूने पर श्रेष्ठता पहले से दिखाया गया था6. उस अध्ययन में, दिन 1, 8 और 15 में तीन समूहों की तुलना की गई। सभी समूहों के कॉर्निया एंडोथेलियम (corneoscleral बटन, गैर विभाजित कॉर्निया बटन, विभाजित corneal बटन) 1 दिन अच्छी हालत में था, एक अच्छी तरह से संरक्षित endothelial सेल परत6द्वारा प्रतिनिधित्व किया. हालांकि, स्ट्रॉमल सूजन के कारण, डेससेमेट की झिल्ली की तह पूरे कॉर्नियास्क्लेर नमूनों के एंडोथेलियम के बड़े क्षेत्रों को नष्ट कर दिया, ताकि 8 और 15 दिनों में कॉर्निया एंडोथेलियल सेल घनत्व का एक प्रतिनिधि मूल्यांकन नहीं किया जा सके। हालांकि गैर विभाजित कॉर्निया बटन के endothelium अच्छी तरह से 15 दिन तक संरक्षित किया गया था, कुछ Descemet झिल्ली परतों भी मौजूद थे. हालांकि corneoscleral नमूनों की तुलना में गैर विभाजित कॉर्निया बटन के endothelial सेल परत बेहतर हालत में था, विभाजित कॉर्निया बटन के endothelial सेल परत अभी तक बेहतर हालत में था. यह मात्रात्मक और गुणात्मक मापदंडों में देखा जा सकता है, क्योंकि खेती के 15 दिनों के भीतर एंडोथेलियल सेल हानि काफी अधिक थी (च $ 0.041) गैर-विभाजन कॉर्नियल बटन में (-575 ] 25/250 कोशिकाओं/मिमी2) विभाजित कॉर्निया बटन की तुलना में (-417 ] 138/179 कोशिकाओं / मिमी2), जो एक और अधिक नियमित षट्भुज सेल पैटर्न में स्पष्ट निर्धारित आकृतिक विशेषताओं के अनुकूल है, कम सुधार के आंकड़े और rosette संरचनाओं, साथ ही कम नष्ट कोशिकाओं (एलिजरीन लाल क्षेत्रों) विभाजन में कॉर्निया बटन6| प्रतिशत अंत:स्तरीय कोशिका हानि इन निष्कर्षों की पुष्टि करती है, क्योंकि गैर-विभाजन और विभाजित कॉर्निया बटन में 15 दिनों के भीतर प्रतिशत कोशिका हानिक्रमशः14.89% और 10.2% (पी $ 0.032) है। चूंकि इस विधि को 15 दिनों तक की अवधि के लिए मान्य किया गया था , यह प्रकाशित अध्ययनों की तुलना में लंबी अवलोकन अवधि की अनुमति देता है (72 से 120 ज )3,4,5.

endothelial सेल परत के संरक्षण में सुधार, आम खेती प्रोटोकॉल भी नेत्र बैंकों में इस्तेमाल लागू करने, पूरी तरह से कॉर्निया stroma की कम सूजन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, के बाद से एक बड़ा हिस्सा (300 मीटर) stroma के पहले हटा दिया जाता है खेती6,13. सामान्यत : स्ट्रोमा खेती के दौरान अत्यधिक प्रफुल्लित हो जाता है क्योंकि इसकी जलरागी गुण - गुण और स्ट्रोमल ऊतक14,15 केभीतर एम्बेडेड अणु होते हैं . सूजन, जो कतरनी और चुटकी बलों और Descemet की झिल्ली तह, जो भी corneal endothelium और endothelial कोशिका हानि पर यांत्रिक तनाव का कारण बनता है प्रेरित करता है, stroma6,10के आंशिक हटाने के बाद कम कर रहे हैं. नेत्र बैंकों के विपरीत, जो अक्सर प्रत्यारोपण से पहले मानव दाता कॉर्निया को निष्क्रिय करने के लिए डेक्सट्रान जैसे परासरणी एजेंटों का उपयोग करते हैं , विभाजित कॉर्निया बटन को परासरणी विलवणीकरण16,17की आवश्यकता नहीं होती है । के रूप में संस्कृति माध्यम डेक्सट्रन के साथ पूरक corneal endothelial कोशिकाओं द्वारा अवशोषित करने के लिए और वृद्धि हुई सेल हानि प्रेरित करने के लिए जाना जाता है7,8,9, 18,19 ,20, डेक्सट्रान (या अन्य परासरणी एजेंटों) के बिना विभाजित कॉर्निया बटन की खेती संभव6के रूप में कई नकारात्मक विषाक्त कारकों के रूप में समाप्त . संस्कृति माध्यम प्रस्तुत विधि में किसी भी additives के साथ पूरक नहीं है के रूप में, किसी भी जोड़ा पदार्थ की वजह से कोई विषाक्त प्रभावों की उम्मीद कर रहे हैं, जो इस मॉडल नए पदार्थों की biocompatibility परीक्षण की जांच के लिए मूल्यवान बनाता है.

हालांकि corneal endothelium एक बहुत ही नाजुक सेल परत है और विभाजन corneal बटन की तैयारी मध्यम शल्य कौशल और कोमल हैंडलिंग की आवश्यकता है, इस तकनीक के साथ काम करने के लिए और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए एक मानकीकृत विधि हो सकता है के बारे में एक बहुत ही उचित समय सीमा के भीतर कॉर्निया endothelium पर विभिन्न कारकों के प्रभाव. फिर भी, इस प्रोटोकॉल में कुछ कदम हैं जहां कॉर्निया एंडोथेलियम खतरे में है। जाहिर है क्षतिग्रस्त या अपारदर्शी आँखों को ध्यान से पहचान की और शुरुआत में खारिज करने के लिए संभव पूर्वाग्रहों को रोकने की जरूरत है. इसके अलावा, corneal endothelium हमेशा trephination, विच्छेदन, निष्कर्षण, और हैंडलिंग के दौरान अछूता छोड़ दिया जाना चाहिए (जैसे, संस्कृति प्लेट के लिए आंख से स्थानांतरित, संस्कृति प्लेट से संस्कृति प्लेट, आदि) के लिए विभाजन कॉर्निया बटन के क्रम में किसी भी रोकने के लिए यांत्रिक क्षति. जब stroma में सतही सीवन रखकर, endothelium संभवतः प्रवेश किया जा सकता है अगर सुई गलती से बहुत दूर गहराई में डाला जाता है. यदि हां, तो पूर्वकाल नेत्र कक्ष से ध्यान देने योग्य तरल पदार्थ सीवन चैनल के माध्यम से गुजर रहा होगा और इसी आंख को खारिज करने की जरूरत है। इसे रोकने के लिए, सुई को स्ट्रोमा के भीतर सतही रूप से रखा जाना चाहिए। इसके अलावा, सावधानी सख्ती से स्केलपेल का उपयोग क्षैतिज corneal बटन विभाजित करने के लिए लिया जाना चाहिए. असमान काटने खेती के दौरान असमान सूजन में परिणाम होगा, संभवतः वृद्धि हुई endothelial सेल नुकसान के कारण.

एचबीएस में बेदाग कॉर्निया एंडोथेलियल कोशिकाओं की परीक्षा आमतौर पर मानव दाता कॉर्निया में की जाती है। एचबीएस3में विभाजित कॉर्निया बटन के चुने हुए परीक्षा समय के लिए एंडोथेलियल कोशिकाओं की परासरणी सूजन के कारण महत्वपूर्ण कोशिका क्षति का कोई प्रमाण नहीं है . हालांकि धुंधला सेल सीमाओं की दृश्यता को बढ़ाता है, unstained गिनती21दाग गिनती की तुलना में endothelial सेल घनत्व के काफी अलग परिणाम में परिणाम नहीं है. बेदाग गिनती का स्पष्ट लाभ यह है कि यह प्रयोगों के दौरान कई अनुवर्ती परीक्षाओं की अनुमति देता है, जबकि धुंधला पदार्थ आमतौर पर साइटोटॉक्सिक होते हैं और अवलोकन अवधि को समाप्त करते हैं। दाग दारों की गिनती, हालांकि, एंडोथेलियम की आकृतिक विशेषताओं का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण बनी हुई है। Trypan नीले क्षतिग्रस्त कोशिकाओं है कि अक्सर unstained गिनती में undamaged लग रहे हैं के नाभिक पर प्रकाश डाला गया. Alizarin लाल एस स्पष्ट रूप से Descemet झिल्ली, जो endothelial सेल घनत्व के आकलन की सुविधा और कॉर्निया एंडोथेलियम के रूपात्मक सुविधाओं के विश्लेषण की सुविधा के द्वारा सेल सीमाओं और क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की दृश्यता को बढ़ाता है , जैसे सुधार के आंकड़े, रोज़ेट संरचनाओं, और एलिजारिन लाल दाग कोशिकाओं (चित्र 4)।

एक पूर्व विवो मॉडल के रूप में विभाजित corneal बटन की एक प्रमुख सीमा यह है कि, बस इन विट्रो मॉडल में की तरह, वे corneal endothelial कोशिकाओं पर बाहरी प्रभावों की जांच के लिए ही उपयुक्त हैं. इसलिए, विवो मॉडल में आंख और कॉर्निया एंडोथेलियम पर प्रभाव के साथ प्रणालीगत रोगों और शर्तों पर अनुसंधान के लिए अपूरणीय हैं। भले ही, इस तैयारी तकनीक corneal endothelium पर विभिन्न बाहरी कारकों के प्रभाव के परीक्षण के लिए वैध डेटा उत्पन्न कर सकते हैं (उदाहरण के लिए, नए पदार्थों की जैव संगतता परीक्षण में)22. लाइव पशु प्रयोगों की संख्या को कम करने के लिए 3R-सिद्धांत (बदलाव, कमी, शोधन) के बाद, यह विधि विट्रो सेल संस्कृतियों में अंतर को और अधिक बंद करने के लिए एक पर्याप्त अनुसंधान मॉडल प्रदान करती है, जहां परिणाम अक्सर में असंगत होते हैं मनुष्यों में vivo स्थिति, और पशु अनुसंधान, जो पर्याप्त प्रयासों की आवश्यकता है और तेजी से नैतिक चिंताओं को जन्मदेती है 23.

उनके गुणों और उपलब्धता के कारण, सुअर आँखें अनुसंधान प्रयोजनों के लिए मानव आँखों के लिए केवल पर्याप्त विकल्प लग रहे हो. गैर मानव primates से Corneas नैतिक कारणों और उपलब्धता के कारण एक अच्छा विकल्प नहीं हैं, हालांकि इन जानवरों मनुष्यों के लिए निकटतम प्रजातियों रहे हैं. दूसरी ओर, छोटे जानवरों की आँखें बस कुशल कॉर्निया हटाने की अनुमति देने के लिए बहुत छोटे हैं. सुअर आँखें आकार में मानव आंखों के लिए तुलनीय हैं और कॉर्निया endothelial कोशिकाओं के समान गुण दिखाने के लिए, जो भी आनुवंशिक रूप से संशोधित porcin कॉर्निया24के संभावित भविष्य xenotransplantation से निपटने के अनुसंधान में परिलक्षित होता है, 25,26. इसके अलावा, बूचड़खानों के एक उप-उत्पाद होने के नाते, वे प्राप्त करने के लिए आसान कर रहे हैं।

अंत में, porcin कॉर्निया का उपयोग प्रस्तुत विधि कॉर्निया endotheal कोशिकाओं पर लागत कुशल अनुसंधान को सक्षम करने के लिए एक अत्यधिक reproduible organo-आमतौर पर खेती अनुसंधान मॉडल प्रदान करता है. भविष्य जांचकर्ताओं विभाजन corneal बटन का उपयोग करने के लिए इस तरह के नए पदार्थ, शल्य तकनीक, उपकरण, और अन्य संभव बाहरी प्रभावों जहां corneal endothelium महान ब्याज की है जैसे विभिन्न कारकों के प्रभाव का विश्लेषण कर सकते हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

प्रस्तुत अनुसंधान मॉडल की स्थापना के एम यू-इनोवेटिव (एफकेजेड: 13GW0037F) द्वारा संघीय शिक्षा और अनुसंधान जर्मनी के मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Subject
Pig eyes local abbatoir
Substances
Alizarin red S Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016 Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x) Gibco, USA
Fetal calf serum Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution own production
Hypotonic balanced salt solution own production per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9% B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution own production
Trypan blue 0.4% Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well) Corning Inc., USA
Colibri forceps Geuder AG, Germany
Corneal scissors Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder L. Klein, Germany
Eye scissors Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm Whatman, USA
Hockey knife Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL Schott AG, Germany
Magnetic stir bar Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm) Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder Geuder AG, Germany
Petri dishes VWR International, USA
Pipette tips Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL) Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm own production
Tying forceps Geuder AG, Germany
Weighing paper neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope Olympus, Japan
CellSens Entry (software) Olympus, Japan
Cold-light source Schott AG, Germany
Incubator Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal VWR International, USA
Photoshop CS2 Adobe Systems, USA
Precision scale Ohaus Europe GmbH, Switzerland

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134, (2), 167-173 (2016).
  2. Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56, (2), 1228-1237 (2015).
  3. Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245, (1), 143-147 (2007).
  4. Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246, (3), 369-372 (2008).
  5. Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, (5), 753-758 (2015).
  6. Kunzmann, B. C., et al. Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes. Cell and Tissue Banking. 19, (3), 269-276 (2018).
  7. Redbrake, C., et al. A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture. Current Eye Research. 16, (5), 405-411 (1997).
  8. Zhao, M., et al. Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas. Ophthalmic Research. 48, (2), 124-133 (2012).
  9. Filev, F., et al. Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm. Cell and Tissue Banking. 18, (1), 91-98 (2017).
  10. Pels, E., Schuchard, Y. Organ-culture preservation of human corneas. Documenta Ophthalmologica. 56, (1-2), 147-153 (1983).
  11. Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas. Cornea. 14, (3), 300-310 (1995).
  12. Linke, S. J., et al. Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank. Acta Opthalmologica. 91, (6), 571-578 (2013).
  13. Schroeter, J., et al. Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis für Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks]. Ophthalmologe. 106, (3), 265-276 (2009).
  14. Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. The swelling pressure of the corneal stroma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1, 158-162 (1962).
  15. Xuan, M., et al. Proteins of the corneal stroma: importance in visual function. Cell and Tissue Research. 364, (1), 9-16 (2016).
  16. Sperling, S. Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation. Acta Opthalmologica. 57, (2), 269-276 (1979).
  17. Schroeter, J. Endothelial Evaluation in the Cornea Bank. Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).
  18. Pels, E., Schuchard, Y. The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas. Cornea. 3, (3), 219-227 (1985).
  19. van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture. Archives of Ophthalmology. 101, (12), 1920-1926 (1983).
  20. Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46, (3), 816-822 (2005).
  21. Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Staining of endothelial cells does not change the result of cell density. Cell and Tissue Banking. 20, (2), 327-328 (2019).
  22. Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells. Current Eye Research. (2019).
  23. Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sandøe, P. The 3Rs principle - mind the ethical gap! ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. 333-336 (2012).
  24. Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, (4), 475-482 (2011).
  25. Kim, M. K., Hara, H. Current status of corneal xenotransplantation. International Journal of Surgery. 23, (Pt B), 255-260 (2015).
  26. Fujita, M., et al. Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human. Ophthalmic Research. 49, (3), 127-138 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics