坐骨神経クラッシュ損傷のラットモデルにおける機能的評価のための3D運動学的解析

Neuroscience

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Summary

げっ歯類モデルを用いた基礎研究で機能評価を行う4台のカメラとデータ処理ソフトウェアを含む3次元モーションキャプチャ装置を用いた運動解析法を紹介します。

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Wang, T., Ito, A., Tajino, J., Kuroki, H., Aoyama, T. 3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury. J. Vis. Exp. (156), e60267, doi:10.3791/60267 (2020).

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Abstract

坐骨神経機能指数(SFI)と比較して、運動学的分析は、坐骨神経損傷げっ歯類モデルの機能的評価を行うためのより信頼性の高い、敏感な方法です。本プロトコルでは、ラット坐骨神経クラッシュ傷害モデルを用いた機能評価に3次元(3D)運動キャプチャ装置を用いた新規運動学的解析法について述べた。まず、ラットはトレッドミルウォーキングに精通しています。マーカーは、指定された骨のランドマークに取り付けられ、ラットは、所望の速度でトレッドミルの上を歩くように作られています。一方、ラットの後肢の動きは4台のカメラを使用して記録される。使用するソフトウェアに応じて、マーカートレーシングは自動モードと手動モードの両方を使用して作成され、必要なデータは微妙な調整の後に生成されます。3Dモーションキャプチャー装置を使用する運動解析のこの方法は、優れた精度と精度を含む多くの利点を提供します。包括的な機能評価では、さらに多くのパラメータを調査できます。この方法には、考慮が必要ないくつかの欠点があります:システムは高価であり、操作が複雑になり、皮膚のシフトに起因するデータ偏差を生じる可能性があります。それにもかかわらず、3Dモーションキャプチャー装置を用いた運動学的解析は、機能的前肢および後肢評価を行う上で有用である。今後、この方法は、様々な外傷および疾患の正確な評価を生成するためにますます有用になる可能性がある。

Introduction

坐骨神経機能性指数(SFI)は、機能的な坐骨神経評価を行うためのベンチマーク法である1。SFIは広く採用されており、ラット坐骨神経損傷に関する様々な機能評価研究で頻繁に使用されています2,3,4,5,6.その人気にもかかわらず、SFIには、オートマチネーション7、共同拘縮リスク、および足跡8の塗抹など、いくつかの問題があります。これらの問題は、その予後の値に深刻な影響を与えます9.したがって、SFIの代用として、代わりのエラーが発生しやすい方法が必要です。

そのような代替方法の1つは、運動学的分析である。これには、骨のランドマークやジョイントに取り付けられたトラッキングマーカーを使用した包括的な歩行分析が含まれます。キネマティック解析は、機能評価9にますます使用されています。この方法は、SFI11,12に起因する欠点を持たない機能評価10のための信頼性の高い敏感なツールとして徐々に認識されている。

このプロトコルでは、トレッドミル、4つの120 Hz充電式結合デバイス(CCD)カメラ、およびデータ処理ソフトウェアからなる3Dモーションキャプチャ装置を使用する一連の運動学的解析について説明します(資料表を参照)。この運動学的分析方法は、一般的なビデオ歩行または歩行分析13、14とは異なります。2 台のカメラは、1 つの側面から後肢の動きを記録するために、異なる方向に配置されます。続いて、後肢の3Dデジタルモデルがコンピュータグラフィックス9を使用して構築される。実際の四肢の寸法を厳密に再現することで、股関節、膝関節、足首関節、つま先関節などの指定関節角度を計算できます。また、ストライド/ステップ長や、スイング相に対するスタンス相の比率など、さまざまなパラメータを決定できます。これらの再構成は、2組のカメラによって送信されたデータから生成された後肢の完全に再構築された3Dデジタルモデルに基づいています。想像上の重心(CoG)軌道でさえ、自動的に計算することができます。

この3Dモーションキャプチャ装置を使用して、ラット坐骨神経クラッシュ傷害モデルの文脈における時間の経過に伴う機能的変化を明らかにする複数の運動学的パラメータを導入し、評価しました。

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Protocol

京都大学動物実験委員会により議定書が承認され、京都大学動物実験委員会ガイドライン(承認番号:MedKyo17029)に従ってすべての議定書が実施されました。

1. トレッドミル歩行でラットを知る

  1. トレッドミルの両側に2枚の透明なプラスチックシートを設置し、12週齢の雄のルイスラットをまっすぐ正面方向に歩かせ、電気ショックグリッドをオンにします。
  2. 各ラットにトレッドミルの上を歩いしてもらいます。トレッドミルを目的の速度(20cm/sまたは12 m/分)まで徐々に加速し、ラットをこの速度で5分間正常に歩かせます。歩行の各セッションの後、1-2分の休憩を与えます。このプロセスを 1 日あたり 3 倍、週 5 日、1 週間繰り返します。
    注:ステップ2の1週間前にトレッドミルを開始します。
  3. 12時間の明暗サイクルでケージあたり3群のラットを収容し、市販のラット食品と水道水アドリビタムに餌を与える。

2. 坐骨神経クラッシュ傷害の実施

  1. ラットを麻酔誘導室に入れ、5%のイソファフルラン吸入液を導入する。
  2. 0.15 mg/kg メデトミジン塩酸塩、2 mg/kg ミダゾラム、および2.5 mg/kgブトルファントール酸をラットに調製した組み合わせ麻酔薬の腹腔内注射を提供する。ペダル反射神経の欠如を確認してください。その後、左大きなトロシャンターから大腿の真ん中まで電気剃り手で領域を剃ります。
  3. 無菌布を広げ、その上にネズミを置き、左横の位置に置きます。同様に布の上に滅菌手術器具を置きます。
  4. より大きなトロシャンターから大腿の真ん中まで、外科的な10番目のブレードでまっすぐ切開します。次に、外科的止血を用いて四頭筋フェモリスと上腕二頭筋の間で鈍い解剖を行い、坐骨神経を露出させる。
  5. 2組のマイクロ鉗子で周囲の組織から坐骨神経を取り外し、標準的な外科的止血を使用して坐骨神経を10sで粉砕し、臀部の結節性のすぐ下の部位で2mmの長いクラッシュ傷害を作り出す。
  6. マイクロ鉗子のペアを使用して傷害の近位端で9-0ナイロン上神経ステッチを行い、4-0ナイロン縫合糸で筋肉と皮膚を閉じます。
  7. 0.3 mg/kgのアチパメゾール塩酸塩を用いて調製した麻酔アンタゴニストの腹腔内注射をラットに与え、10分以内に目を覚ます。ラットが麻酔から回復した後、ラットが尾の基部によって吊り下げされている間、左のつま先の動きを観察する。つま先が全く広がらない場合、手術は成功した。
  8. 12時間の明暗サイクルで手術後にラットを個別に収容し、市販のラット食品と水道水アドリビタムに餌を与える。

3. マーカーの取り付け

  1. 訓練されたラットを麻酔誘導室に入れ、5%のイソファフルラン吸入液を導入する。つま先をつまんでペダル反射の欠如を確認してください。
  2. 麻酔マスク(2%イソファフルラン吸入液)を用いてラットを連続的に麻酔します。ラットは安定した麻酔を受けるが、電気剃り器を使用して腰から両側性のマレオリまでの領域を剃る。
    注意:漏れイソファフルランに研究者をさらすことを防ぐために、マスクがラットの頭と顔をしっかりと覆っていることを確認してください。
    注:ラットの損傷を防ぐには、髪をできるだけやさしく剃ってください。
  3. 起こりやすい位置にラットを置きます。黒いマーカーペンを使用して、剃った皮膚の次の骨のランドマークをマークする:腰椎から仙骨椎骨までの棘を通る線、前部の上腸骨棘、大きなトロシャンター、膝関節、横性マレオリ、5番目中足骨食後関節、および第4指の先端。
    注: 二国間マーカーが軸対称であるかどうかを判断するために、スピントプロセスを通る線が使用されます。
  4. 腰椎から仙骨椎骨までの棘プロセスと第4のつま先の先端を除く、これらの骨のランドマークに半球マーカーを取り付けるために液体接着剤を使用してください。混乱を避けるために、他のすべてのランドマークに異なる色を使用します。4番目のつま先の先端にはピンクのインクが付いています。
    注意:オペレータの露出した皮膚に接着剤を滴下しないように注意してください。
  5. すべてのマーカーを配置した後、ラットをケージに戻します。麻酔から完全に回復するまで、ラットをトレッドミルに置かないでください。
    注:ラットが麻酔から完全に回復しない場合、意識の低下は正常な歩行に深刻な影響を与える可能性があります。

4. キャリブレーションとソフトウェアの設定

  1. トレッドミルの両側に透明なプラスチックシートを2枚設置し、キャリブレーションボックスをトレッドミルの中央に置きます。記録ソフトウェアを開き、ディスプレイのキャリブレーションイメージアイコン(補足ファイル1)をクリックします。
  2. 120 Hz CCD カメラを使用して 4 方向から 1 ~ 2 s のビデオを録画するには、[記録] アイコンをクリックします。録音アイコンをもう一度クリックして、録音を停止します。
    注:録画が停止すると、ビデオは自動的に保存されます。
  3. 計算ソフトウェアでビデオファイルを開きます。画面右下隅にある校正ボックスの特性点をクリックして、4つの画像の対応するマーカーにドラッグします。次に、保存アイコンをクリックします。
    メモ:キャリブレーションが完了した後は、カメラの位置を変更しないでください。

5. 歩行を記録する

  1. 校正ボックスをトレッドミルから取り出し、電気ショックグリッドをオンにし、完全に目を覚ますラットをトレッドミルに置きます。記録ソフトウェアを開き、ラットのシリアル番号、歩行速度、および主要なオペレータの名前など、ラットに関する基本情報を入力します。
  2. トレッドミルをオンにし、速度を20cm/sに設定します。ラットが速度に適応し、正常に歩くことができる後、ディスプレイの録音アイコンをクリックして、4台のカメラで歩くラットを記録します。十分なステップが記録されたら(>10)、もう一度アイコンをクリックして録音を停止し、トレッドミルをオフにします。
    注:録画が停止すると、ビデオは自動的に保存されます。
  3. 麻酔用の麻酔誘導室にラットを戻します。ラットが連続麻酔下にある間(麻酔マスクを介して投与される)、半球マーカーを取り除く。
    メモ:ラットに痛みを起こさないように、マーカーをできるだけ穏やかに取り外してください。
  4. 指定された時間(例えば、1週間、3週間、または手術後6週間)で、ステップ3.1〜5.3を繰り返してラットの運動学的測定を行う。運動学的測定は、実験の開始時に、手術を受けていないラット(すなわち、対照群)に対して1回だけ行う。

6. マーカートレース

  1. 計算ソフトウェアを開き、インターフェイスでビデオファイルを開きます。
  2. ビデオのプログレスバー上の両側コントロールバーをクリックしてドラッグし、10ステップのトレッドミル歩行記録のみが表示されるようにします(補足ファイル3)。特性点を画面右下隅の3Dモデルからカメラで撮影した4つの初期画像のそれぞれに対応するマーカーにドラッグします(補足ファイル4)。
  3. 自動トレースアイコンをクリックして、自動マーカー トレース プロセスを開始します (補足ファイル 5、補足ファイル 6)。システムがマーカーを正確にトレースしない場合は、「手動ディジタイズ」アイコンをクリックして手動トレースモード (補足ファイル 7)に切り替え、3D モデルのトレース特性点をクリックし、画像内の対応するマーカーをクリックします。
  4. マーカーをクリックしたら、画像がビデオの次のフレームに切り替わるようにします。マーカートレースプロセスが完了するまで、マーカーを連続してクリックします。完了したら、保存アイコンをクリックします。

7. キネマティック解析

  1. 分析ソフトウェアを開き、インターフェイスで処理されたビデオ ファイルを開きます。
  2. 設定アイコンをクリックし、足首の角度、つま先の角度、骨盤シフト(X軸とZ軸)などの指定パラメータを右のポップアップウィンドウの表示リストに追加します(補足ファイル8)。[OK]をクリックすると、パラメータの値の変化を表すカーブがインタフェースに表示されます。
  3. [計測]アイコンをクリックし、プルダウンメニューで[スムーズ処理]を選択します。ポップアップメニューに20 Hzと入力して、カーブ内の 20 Hz を超える周波数を除去します (補足ファイル 9)。
  4. インターフェイスには、ラットの歩行ビデオ、動的な 3D モデル、10 ステップサイクルからのパラメータの値変化を表す曲線、パラメータの平均値変化を表すカーブ、スタンスとスイングフェーズの比率を表すヒストグラムとスケマティック ダイアグラムの 5 つのパネルがあることを確認します (補足ファイル 10)。
  5. パラメータの平均値の変化を表す曲線のパネルを右クリックし、プルダウンメニューの「データ出力」(「補足ファイル 11」)を選択します。これにより、足首とつま先の角度、骨盤シフト、および10ステップサイクル周期の他の所望のパラメータを含む後肢関節角度の平均値が生成されます。

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Representative Results

ラット坐骨神経クラッシュ傷害モデルにおける時間の経過に伴う機能的変化を調べる4つのパラメータを選択した。これらは、スタンス・ツー・スイング相の比率、重心(CoG)の軌道、足首の角度、および'つま先オフ'フェーズ9におけるつま先角度であった。24匹のラットは、対照群(C)、第1(1w)、第3(3w)、および左坐骨神経クラッシュ傷害の6週目の4つの群のいずれかに無作為に割り当てられた。

3D運動解析により、10段階周期におけるスタンスまたはスイング相の平均比を自動的に計算し、インタフェース上に表した(図1A-D)。手術後にスタンス・ツー・スイング期の比率が回復したことがわかりました。

CoGは、3Dモーションキャプチャ装置によって仮想マーカーでトレースすることができる仮想点である。それは2つの前の上の腸骨の脊柱の2つの反側より大きいトロシャンターに接続する2本の線の交差点に位置する。したがって、コロナ平面(X軸とZ軸)のリアルタイム骨盤シフトは、3D構築された骨盤モデルとしてのCoGの同時シフトが使用される。このシフトは自動的に測定することもできます。CoG軌道は、10段階周期のX軸およびZ軸における骨盤シフト平均値の変化曲線として記載されている。通常の CoG 軌道の形状は、無限大記号 (∞) に似ています。手術後6週間(図2A-D)までCoG軌道形状はほぼ正常な形状に戻らないことがわかった。

ステップサイクル15の終末期スタンスの間に「つま先オフ」段階の正常な足首および足の先の角度が最大値に達するが、ラットが手術を受けた場合、これらのパラメータが誤って報告される可能性がある。それにもかかわらず、3D運動学的分析により、ビデオを参照して「つま先オフ」段階の角度を決定することができました。「つま先オフ」段階における足首またはつま先の角度の平均値は、10段階サイクルから計算した。その結果、「つま先オフ」段階の足首とつま先の角度が手術後に上向きに改善することが示唆された。(図3A-B)。

Figure 1
図1:二国間のスタンスとスイングフェーズ右のスイング (マゼンタ) 、右のスタンス (赤)、左のスイング (azure)、および左のスタンス (青) の各フェーズは、それぞれの色付きのバーで表されます。黄色のバーは二重支持フェーズを表します。パネルA-Dは、対照群(A)、1w(B)、3w(C)、および6w(D)群の10段階周期で各二国間スタンスおよびスイングフェーズを示す。C = コントロール。1w = 1週間後手術;3w = 3週間後手術;6w = 6週間後手術。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:CoG軌道パネルA-Dは、対照群(A)、1w(B)、3w(C)、および6w(D)群に対する10段階サイクル周期における代表的な平均CoG軌道を示す。C = コントロール。1w = 1週間後手術;3w = 3週間後手術;6w = 6週間後手術。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:足首と足の角度。パネルABは、コントロール グループの 10 個の "つま先オフ" フェーズにおける足首とつま先の角度の変化を示します (**p < 0.01, 対照群と比較して、 ** p<0.01, 隣接するグループと比較します。誤差範囲 = 平均値の標準誤差 (SEM) です。C = コントロール。1w = 1週間後手術;3w = 3週間後手術;6w = 6週間後手術。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

このプロトコルでは、安定した連続歩行ラットが運動学的分析の最も重要な要素である。トレッドミルの速度は20cm/sに設定されました。この歩行速度は、16のスペース制約なしにラットが動く場合、決して「高い」とは考えられない。それにもかかわらず、この速度は訓練されていないラットがトレッドミルを安定して歩くのには速すぎて、異常な歩行と不均一な動きをもたらす可能性があります。これらのイベントは、データの信頼性と信頼性に深刻な影響を与える可能性があります。しかし、トレッドミルの速度が20cm/s未満の場合、ラットは断続的に歩行を停止し、大きな偏差を生み出し、データの信頼性が低下する可能性があります。したがって、正確な運動学的分析を達成するためには、トレッドミル上のまっすぐな正面方向を着実に歩くことができるようにラットを訓練することは非常に重要です。

さらに、オペレータは運動解析プロセス中に再確認や微調整の必要性を無視すべきではありません。我々は、振幅相が正常ラットのステップサイクルの25%を占めていることを発見した。これは、スイングフェーズ中の後肢の動きが、カメラシステムが継続的かつ時間の経過とともに動きを正確にキャプチャできなかった時点まで加速したことを意味します。また、過度に明るいまたは薄暗い周囲光、透明なトレッドミルシートの汚れ、および歩行中に偶発的に発生する異常な移動パターンは、ラットに取り付けられたマーカーからのトレースラベルの誇張された偏差をもたらす可能性がある。これらの要因により、モーション キャプチャ プロセスの精度が低下する可能性があります。この問題に対処するために、マーカー トレース システムに手動調整が導入されました。手動調整を使用すると、明らかな偏差や微妙なモーション キャプチャの損失は、マーカー トレースプロセス中に直ちに修正できます。さらに、マーカートレースプロセスの欠陥を探し、修正するのに役立つ運動解析ソフトウェアを使用して処理された複数のパラメータの曲線の変化の再確認。再確認により、最も信頼性の高い信頼性の高いデータを生成することができました。

運動学的解析と比較して、SFIの欠点は、主に上記の要因によって生じる干渉からではなく、その低い精度と信頼性から導き出されます。以前の研究はまた、SFI法は、早期の傷害後の期間の間に適用されたときに信頼性も再現性も、17を指摘しました。一方、キネマティック解析の精度と信頼性の高さが広く認識されている。しかし、以前の多くのアプリケーションは、特に足首の角度10、15、18、19、20の指定された角度を観察し測定することしかできませんでした。2 次元 (2D) ビデオ解析の制限により、機能評価中の追加パラメータの調査が行なえます。

3次元運動解析は、SFIのすべての欠点を克服し、多くの追加パラメータの調査を可能にします。3Dデジタルモデルは、4台のカメラで撮影した画像から構築されています。したがって、この装置は、従来の2D運動法よりも正確にパラメータを測定または計算することができる。そのため、3Dモーションキャプチャ装置を用いた運動学的解析は、他の機能評価方法の代替候補として大きな約束を果たす。

ただし、3D 運動解析方法にはいくつかの制限があります。げっ歯類のトレーニング、マーカーの取り付け、検査プロセスのトレースは複雑で時間がかかります。再現性と信頼性の高いデータを得るためには、オペレータは必要な重要なステップを十分に理解している必要があります。げっ歯類の歩行中に生じる皮膚の変化は、特にデータ偏差21を生じやすい。さらに、3D運動解析装置の高コストは、その普及を妨げ、関連する研究での使用を制限する可能性があります。

これまでの研究では、3D運動学的解析は、ラット坐骨神経損傷モデル9、22の文脈で正確かつ有効な結果を達成したことを発見した。その結果、この方法は、中枢神経系および末梢神経系の障害および筋骨格疾患を含む後肢を含む様々な外傷または疾患状態の機能的評価に有用なツールであると考える理由がある。また、マーカー位置を変更することにより、この方法を使用して四肢の動きを機能的に評価してもよい。これらの仮説は、今後の実験によるさらなる検証を必要としますが、3Dモーションキャプチャ装置を用いた運動学的解析は、より有望な機能評価方法を刺激し、研究および臨床応用において重要な役割を果たす可能性があると考えています。

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Disclosures

著者たちは開示するものは何もない。

Acknowledgments

本研究は、JSPS KAKENHI助成金番号JP19K19793、JP18H03129、およびJP18K19739によって支援されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
9-0 nylon suture Bear Medic Corporation. T06A09N20-25
Anesthetic Apparatus for Small Animals SHINANO MFG CO.,LTD. SN-487-0T
ISOFLURANE Inhalation Solution Pfizer Japan Inc. (01)14987114133400
Kine Analyzer KISSEI COMTEC CO.,LTD. N.A. A analysis software
Liquid adhesive KANBO PRAS CORPORATION PT-B180
Micro forceps BRC CO. 16171080
Motion Recorder KISSEI COMTEC CO.,LTD. N.A. A recording software
Standard surgical hemostat Fine Science Tools, Inc. 12501-13
Surgical blade No.10 FEATHER Safety Razor CO., LTD 100D
Surgical hemostat World Precision Instruments 503740
Three-dimensional motion capture apparatus (KinemaTracer for Animal) KISSEI COMTEC CO.,LTD. N.A. A 3D motion analysis system that consists of cameras
Three-dimensional(3D) Calculator KISSEI COMTEC CO.,LTD. N.A. A marker tracing software
Treadmill MUROMACHI KIKAI CO.,LTD MK-685 a treadmill with affialiated the electrical schocker, transparent sheats and a speed control apparatus

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References

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