Análise Cinética 3D para a Avaliação Funcional no modelo de rat da lesão ciática de esmagamento nervoso

Neuroscience

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Summary

Introduzimos um método de análise cinemática que usa um aparelho de captura de movimento tridimensional contendo quatro câmeras e software de processamento de dados para realizar avaliações funcionais durante pesquisas fundamentais envolvendo modelos de roedores.

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Wang, T., Ito, A., Tajino, J., Kuroki, H., Aoyama, T. 3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury. J. Vis. Exp. (156), e60267, doi:10.3791/60267 (2020).

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Abstract

Em comparação com o Índice Funcional Ciático (SFI), a análise cinemática é um método mais confiável e sensível para a realização de avaliações funcionais de modelos de roedores ciáticos de lesões nervosas. Neste protocolo, descrevemos um novo método de análise cinética que usa um aparelho de captura de movimento tridimensional (3D) para avaliações funcionais usando um modelo de lesão de esmagamento de esmagamento de nervos ciático de ratos. Primeiro, o rato é familiarizado com a caminhada da esteira. Os marcadores são então anexados aos marcos ósseos designados e o rato é feito para andar na esteira na velocidade desejada. Enquanto isso, os movimentos posteriores dos membros do rato são registrados usando quatro câmeras. Dependendo do software utilizado, as traçações de marcadores são criadas usando modos automáticos e manuais e os dados desejados são produzidos após ajustes sutis. Este método de análise cinemática, que usa um aparelho de captura de movimento 3D, oferece inúmeras vantagens, incluindo precisão superior e precisão. Muitos mais parâmetros podem ser investigados durante as avaliações funcionais abrangentes. Este método tem várias deficiências que requerem consideração: O sistema é caro, pode ser complicado de operar, podendo produzir desvios de dados devido à mudança de pele. No entanto, a análise cinemática usando um aparelho de captura de movimento 3D é útil para realizar avaliações funcionais de membros anteriores e posteriores. No futuro, esse método pode se tornar cada vez mais útil para gerar avaliações precisas de vários traumas e doenças.

Introduction

O Índice Funcional Ciático (SFI) é o método de referência para a realização de avaliações de nervo ciático funcional1. O SFI tem sido amplamente adotado e é frequentemente utilizado dentro de vários estudos de avaliação funcional sobre lesões nervosas ciáticas de ratos2,3,4,5,6. Apesar de sua popularidade, há vários problemas com a SFI, incluindo automutilação7, risco de contratura conjunta e difamação das pegadas8. Esses problemas afetam seriamente seu valor prognóstico9. Portanto, um método alternativo, menos propenso a erros, é necessário como substituto para o SFI.

Um desses métodos alternativos é a análise cinemática. Isso inclui análise abrangente de marchas usando marcadores de rastreamento ligados a marcos ou articulações ósseas. A análise cinemática é cada vez mais utilizada para avaliações funcionais9. Este método está sendo reconhecido progressivamente como uma ferramenta confiável e sensível para avaliação funcional10 sem as deficiências atribuídas ao SFI11,12.

Neste protocolo, descrevemos uma série de análises cinemáticas que usam um aparelho de captura de movimento 3D composto por uma esteira, quatro câmeras de dispositivo acoplado carregado de 120 Hz (CCD) e software de processamento de dados (ver Tabela de Materiais). Este método de análise cinemática difere da análise geral de vídeo ou marcha13,14. Duas câmeras estão posicionadas em direções diferentes para registrar movimentos posteriores de membros de um único lado. Posteriormente, um modelo digital 3D do membro posterior é construído usando computação gráfica9. Podemos calcular ângulos articulares designados, como quadril, joelho, tornozelo e articulação do dedo do pé, recapitulando de perto as dimensões reais dos membros. Além disso, podemos determinar vários parâmetros, como passo/passo e a razão da fase de postura para a fase de oscilação. Essas reconstruções são baseadas em um modelo digital 3D completamente reconstruído dos membros posteriores, gerado a partir de dados transmitidos por dois conjuntos de câmeras. Mesmo a trajetória do centro imaginário de gravidade (CoG) pode ser calculada automaticamente.

Usamos este aparelho de captura de movimento 3D para introduzir e avaliar vários parâmetros cinémáticos que revelam mudanças funcionais ao longo do tempo no contexto do modelo de lesão de esmagamento do nervo ciático do rato.

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Protocol

O protocolo foi aprovado pelo comitê de experimentação animal da Universidade de Kyoto, e todas as etapas do protocolo foram realizadas de acordo com as Diretrizes do Comitê de Experimentação Animal, universidade de Kyoto (número de aprovação: MedKyo17029).

1. Familiarizar ratos com caminhada de esteira

  1. Coloque duas folhas de plástico transparentes em ambos os lados da esteira para deixar um rato Lewis, de 12 semanas, andar em direção reta e frontal, e depois ligar a rede de choque elétrico.
  2. Ter cada rato andando na esteira. Acelera gradualmente a esteira para a velocidade desejada (20 cm/s ou 12 m/min) e deixe o rato andar normalmente a esta velocidade por 5 min. Após cada sessão de caminhada, forneça uma pausa de 1 a 2 min. Repita esse processo 3x por dia, 5 dias por semana, por 1 semana.
    NOTA: Comece a esteira andando 1 semana antes da etapa 2.
  3. Abrigar ratos em grupos de três por gaiola com um ciclo de 12h claro-escuro e alimentá-los comida comercial de ratos e água da torneira ad libitum.

2. Realizar a lesão ciática de esmagamento nervoso

  1. Coloque o rato em uma câmara de indução de anestesia e introduza 5% de solução de inalação isoflurane.
  2. Forneça uma injeção intraperitoneal de uma combinação anestésica preparada com cloridrato de medetomidina de 0,15 mg/kg, 2 mg/kg midazolam e 2,5 mg/kg de tartrate butórbico ao rato. Verifique se há falta de reflexos do pedal. Em seguida, raspe uma área do trochanter maior esquerdo para o meio da coxa com uma barbeador elétrica.
  3. Espalhe um pedaço de pano asséptico, coloque o rato nele, e coloque-o na posição lateral esquerda. Coloque instrumentos cirúrgicos estéreis no pano também.
  4. Crie uma incisão reta do trochanter maior para o meio da coxa com uma lâmina cirúrgica nº 10. Em seguida, realize uma dissecação contundente entre femoris quadríceps e femorse de bíceps usando um hemostata cirúrgico para expor o nervo ciático.
  5. Retire o nervo ciático do tecido circundante com dois pares de microfóceps e esmague o nervo ciático por 10 s, usando um hemostatcirúrgico padrão, para criar uma lesão de esmagamento de 2 mm de comprimento no local diretamente abaixo da tuberosidade glútea.
  6. Realize um ponto epineural de nylon 9-0 na extremidade proximal da lesão usando um par de microfóceps e, em seguida, feche o músculo e a pele com suturas de nylon 4-0.
  7. Forneça uma injeção intraperitoneal de um anestésico antagonista preparado com 0,3 mg/kg de cloridrato atipamezol ao rato, para acordá-lo dentro de 10 minutos. Depois que o rato se recupera da anestesia, observe os movimentos dos dedos do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo enquanto o rato é suspenso pela base de sua cauda. Se o dedo do pé não se espalhar, a cirurgia foi bem sucedida.
  8. Abrigar os ratos individualmente após a cirurgia com um ciclo de 12h claro-escuro e alimentá-los comida comercial de ratos e água da torneira ad libitum.

3. Anexando os marcadores

  1. Coloque o rato treinado em uma câmara de indução de anestesia e introduza uma solução de inalação isoflurano de 5%. Verifique se há falta do reflexo do pedal beliscando o dedo do pé.
  2. Permita que o rato seja continuamente anestesiado usando uma máscara anestéstica (2% solução de inalação isoflurane). Enquanto o rato recebe anestesia estável, raspe uma área da parte inferior das costas para o malleoli bilateral usando uma máquina elétrica.
    ATENÇÃO: Para evitar expor os pesquisadores ao isoflurano vazando, certifique-se de que a máscara cubra firmemente a cabeça e o rosto do rato.
    NOTA: Para evitar ferimentos no rato, raspe o cabelo o mais suavemente possível.
  3. Coloque o rato na posição propensa. Use uma caneta marcadora preta para marcar os seguintes marcos ósseos na pele raspada: Uma linha através dos processos espinhosos do lombar às vértebras sacral, as espinhas superiores anteriores, as maiores trocana, as articulações do joelho, o malleoli lateral, o quinto metatarsofralangeais articulações, e a ponta do quarto dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo.
    NOTA: A linha através dos processos espinhosos é usada para determinar se os marcadores bilaterais são axilares simétricos.
  4. Use um adesivo líquido para anexar marcadores hemisféricos a esses marcos ósseos, exceto pela linha através dos processos espinhosos da lombar às vértebras sacadas, e a ponta do quarto dedo do pé. Use cores distintas para todos os outros marcos para evitar confusão. A ponta do quarto dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do de
    ATENÇÃO: Tome cuidado para não pingar adesivo na pele exposta do operador.
  5. Depois de colocar todos os marcadores, coloque o rato de volta na gaiola. Não coloque o rato na esteira até que se recupere totalmente da anestesia.
    NOTA: A consciência reduzida pode influenciar seriamente a caminhada normal se o rato não se recuperar totalmente da anestesia.

4. Calibração e configuração de software

  1. Coloque duas folhas de plástico transparentes em ambos os lados da esteira e coloque a caixa de calibração no meio da esteira. Abra o software de gravação e clique no ícone Calibração Imagem no visor (Arquivo Complementar 1).
  2. Clique no ícone Gravação para gravar 1-2 s de vídeo de quatro direções usando câmeras CCD de 120 Hz. Clique no ícone de gravação novamente para parar a gravação.
    NOTA: O vídeo será salvo automaticamente quando a gravação parar.
  3. Abra o arquivo de vídeo no software de cálculo. Clique e arraste os pontos característicos dos modelos 3D da caixa de calibração no canto inferior direito da tela para os marcadores correspondentes nas quatro imagens, que são automaticamente transformados a partir do vídeo no padrão de calibração (Arquivo Suplementar 2). Em seguida, clique no ícone Salvar.
    NOTA: Não altere as posições das câmeras após a conclusão da calibração.

5. Gravando a caminhada

  1. Tire a caixa de calibração da esteira, ligue a grade de choque elétrico e coloque o rato totalmente acordado na esteira. Abra o software de gravação e insira as informações básicas sobre o rato, incluindo seu número de série, velocidade de caminhada e o nome do operador principal.
  2. Ligue a esteira e coloque a velocidade em 20 cm/s. Depois que o rato se adapta à velocidade e é capaz de andar normalmente, clique no ícone Gravação no visor para gravar o rato ambulante com as quatro câmeras. Uma vez que passos suficientes sejam gravados (>10), clique no ícone novamente para parar de gravar e desligue a esteira.
    NOTA: O vídeo será salvo automaticamente quando a gravação parar.
  3. Coloque o rato de volta na câmara de indução da anestesia para anestesia. Enquanto o rato estiver anestesia contínua (administrada através da máscara anestéstica), remova os marcadores hemisféricos.
    NOTA: Remova os marcadores o mais gentilmente possível para evitar causar dor ao rato.
  4. No horário designado (por exemplo, 1 semana, 3 semanas ou 6 semanas após a cirurgia), realize a medição cinemática no rato repetindo as etapas 3.1-5.3. Faça a medição cinemática apenas uma vez, no início do experimento, para os ratos que não receberam cirurgia (ou seja, o grupo controle).

6. Rastreamento de marcadores

  1. Abra o software de cálculo e abra o arquivo de vídeo na interface.
  2. Clique e arraste a barra de controle bilateral na barra de progresso do vídeo para garantir que apenas um registro de caminhada de esteira de 10 etapas seja exibido ( Arquivo Complementar3). Clique e arraste cada ponto característico do modelo 3D no canto inferior direito da tela até o marcador correspondente em cada uma das quatro fotos iniciais dos vídeos que foram tiradas pelas câmeras ( ArquivoComplementar 4).
  3. Clique no ícone de rastreamento automático para iniciar o processo automático de rastreamento de marcadores ( Arquivo Suplementar5, Arquivo Suplementar 6). Se o sistema não rastrear com precisão um marcador, clique no ícone Digitalize Manualpara alternar para o modo de rastreamento manual (Arquivo 7 Suplementar),clique no ponto característico de rastreamento no modelo 3D e, em seguida, no marcador de resposta na imagem.
  4. Uma vez que o marcador seja clicado, certifique-se de que a imagem mude para o próximo quadro do vídeo. Agora clique continuamente no marcador até que o processo de rastreamento de marcadores seja concluído. Uma vez terminado, clique no ícone Salvar.

7. Análise cinemática

  1. Abra o software de análise e, em seguida, abra o arquivo de vídeo processado na interface.
  2. Clique no ícone Configuração e selecione e adicione parâmetros designados como o ângulo do tornozelo, ângulo de dedo do pé e mudança pélvica (eixos X e Z) para a Lista de Exibição na janela pop-up à direita (Arquivo Suplementar 8). Clique em OK,para que as curvas que representem as mudanças de valor nos parâmetros apareçam na interface.
  3. Clique no ícone Measurement e selecione o processamento suave em seu menu pull-down. Digite 20 Hz na janela pop-up para remover frequências superiores a 20 Hz dentro das curvas (Arquivo Suplementar 9).
  4. Certifique-se de que existam cinco painéis na interface: o vídeo ambulante do rato, o modelo 3D dinâmico, curvas que representam mudanças de valor nos parâmetros do ciclo de 10 etapas, curvas que representam mudanças médias de valor nos parâmetros, e histogramas e diagramas esquemáticas que representam a razão da postura e fase de balanço(Arquivo Complementar 10).
  5. Clique no painel para obter curvas que representem alterações médias de valor nos parâmetros e selecione A Saída de Dados no menu pull-down ( Arquivo Complementar11). Isso produzirá os valores médios dos ângulos articulados posteriores dos membros, incluindo os ângulos do tornozelo e do dedo do dodo do dedo do dedo, mudança pélvica e quaisquer outros parâmetros desejados em períodos de ciclo de 10 etapas.

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Representative Results

Selecionamos quatro parâmetros para investigar mudanças funcionais ao longo do tempo em um modelo de lesão de esmagamento de esmagamento nervoso ciático. Estas foram a razão da fase stance-to-swing, trajetória central de gravidade (CoG), ângulos do tornozelo e ângulos do dedo do dedo do dedo do dedo do do dodo do dedo do do dodo do dedo do do dodo do dedo do do dodo do dedo do do dodo do dedo do dodo do dedo do dodo do dedo. Vinte e quatro ratos foram aleatoriamente atribuídos a um dos quatro grupos: o grupo controle (C), ratos na primeira (1w), terceira (3w) e sexta (6w) semana após a lesão de esmagamento nervoso esquerdo.

Por meio da análise cinética 3D, a proporção média da fase de postura ou oscilação no ciclo de 10 etapas foi automaticamente calculada e representada na interface (Figura 1A-D). Descobrimos que a proporção da fase de postura-swing foi recuperada após a cirurgia.

O CoG é um ponto virtual que pode ser rastreado com um marcador virtual pelo aparelho de captura de movimento 3D. Está localizado no ponto cruzado de duas linhas que ligam qualquer uma das duas espinhas ilíacas superiores anteriores aos seus maiores trochanters contralaterais. Assim, a mudança pélvica em tempo real no plano coronal (eixos X e Z) resulta em uma mudança simultânea do CoG como um modelo pélvico construído em 3D é usado. Essa mudança também pode ser automaticamente medida. A trajetória do CoG é descrita como a curva de mudança da mudança pélvica, valor médio nos eixos X e Z do ciclo de 10 etapas. A forma normal da trajetória de CoG se assemelha ao sinal infinito (⁄). Descobrimos que a forma da trajetória do CoG não voltou a uma forma aproximadamente normal até 6 semanas após a cirurgia (Figura 2A-D).

Os ângulos normais do tornozelo e do pé na fase "dedo do pé" atingem o valor máximo durante a postura terminal do ciclode passos 15,mas esses parâmetros podem ser falsamente relatados se o rato tiver sido operado. No entanto, a análise cinética 3D nos permitiu determinar os ângulos na fase "dedo do dedo do do dodo do do dodo do do dodo do dedo do do dodo do dedo" referindo-se ao vídeo. O valor médio do tornozelo ou ângulo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dodo do dedo do dedo do do dodo do dedo do dodo do dedo do dedo do dedo do dodo Os resultados sugeriram que os ângulos do tornozelo e do pé, na fase de "dedo do pé" melhoraram em direção ascendente após a cirurgia. (Figura 3A-B).

Figure 1
Figura 1: Postura bilateral e fase de balanço. As fases de swing direito (magenta), posição direita (vermelha), esquerda swing (azure) e postura esquerda (azul) são representadas por suas barras respectivamente coloridas. Barras amarelas simbolizam fases de duplo suporte. Os painéis A-D mostram cada postura bilateral e fase de balanço em períodos de ciclo de 10 etapas para os grupos de controle (A),1w(B),3w(C)e 6w(D). C = controle; 1w = 1 semana pós-cirurgia; 3w = 3 semanas após a cirurgia; 6w = 6 semanas após a cirurgia. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 2
Figura 2: Trajetórias cog. Os painéis A-D mostram trajetórias cog médias representativas durante períodos de ciclo de 10 etapas para o grupo controle (A),1w(B),3w(C)e 6w(D). C = controle; 1w = 1 semana pós-cirurgia; 3w = 3 semanas após a cirurgia; 6w = 6 semanas após a cirurgia. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 3
Figura 3: Tornozelo e ângulos do dedo do dodo do dedo do dodo. Os painéis A e B mostram mudanças ao longo do tempo nos ângulos do tornozelo e do dedo do dodo do dedo do dodo do dedo do dodo do dedo do do dodo do dedo do grupo, grupos de 1w, 3w e 6w (**p < 0,01, em comparação com o grupo controle, ** p<0,01, em comparação com o grupo adjacente. Barras de erro = erro padrão da média (SEM); C = controle; 1w = 1 semana pós-cirurgia; 3w = 3 semanas após a cirurgia; 6w = 6 semanas após a cirurgia. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

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Discussion

Neste protocolo, um rato estável e continuamente ambulante é o componente mais vital da análise cinemática. A velocidade da esteira foi fixada em 20 cm/s. Essa velocidade de caminhada não é considerada "alta" se os ratos se moverem sem restrições de espaço16. No entanto, essa velocidade é muito rápida para ratos destreinados andarem na esteira e provavelmente resultariam em uma marcha anormal e movimentos não uniformes. Esses eventos podem afetar seriamente a confiabilidade e a autenticidade dos dados. No entanto, velocidades de esteira inferiores a 20 cm/s podem fazer com que os ratos parem intermitentemente de andar, potencialmente produzindo grandes desvios e reduziu a confiabilidade dos dados. Portanto, treinar os ratos para poder andar constantemente em uma direção reta e frontal na esteira é extremamente importante se alguém conseguir uma análise cinética precisa.

Além disso, os operadores não devem ignorar as necessidades de reconfirmação e ajustes finos durante o processo de análise cinemática. Descobrimos que a fase de balanço representou 25% do ciclo de passos em ratos normais. Isso significa que os movimentos posteriores dos membros durante a fase de oscilação aceleraram ao ponto de o sistema de câmera não ser capaz de capturar com precisão os movimentos continuamente e ao longo do tempo. Além disso, luz ambiente excessivamente brilhante ou fraca, manchas nas folhas transparentes da esteira e padrões de movimento anormais que ocorrem incidentalmente durante a caminhada podem resultar em um desvio exagerado dos rótulos de rastreamento dos marcadores ligados aos ratos. Esses fatores poderiam reduzir a precisão do processo de captura de movimento. Ajustes manuais foram introduzidos no sistema de rastreamento de marcadores para resolver essa questão. O uso de ajuste manual, desvios evidentes ou perdas sutis de captura de movimento podem ser imediatamente corrigidos durante o processo de rastreamento de marcadores. Além disso, a reconfirmação de alterações nas curvas de múltiplos parâmetros processados usando o software de análise cinemática auxiliado na busca e correção de falhas no processo de rastreamento de marcadores. A reconfirmação também nos permitiu gerar os dados mais confiáveis e autênticos.

Em comparação com a análise cinemática, as deficiências do SFI são derivadas principalmente de sua baixa precisão e confiabilidade, em vez de interferências produzidas pelos fatores acima mencionados. Um estudo anterior também observou que o método SFI não é confiável nem reprodutível quando aplicado durante o período pós-lesãoinicial 17. Por outro lado, a alta precisão e confiabilidade da análise cinemática tem sido amplamente reconhecida. No entanto, muitas aplicações anteriores só eram capazes de observar e medir ângulos designados, especialmente ângulos do tornozelo10,15,18,19,20. As limitações da análise de vídeo bidimensional (2D) impedem a investigação de parâmetros adicionais durante avaliações funcionais.

A análise cinemática tridimensional supera todas as deficiências do SFI e permite a investigação de muitos parâmetros adicionais. O modelo digital 3D é construído a partir de imagens capturadas por quatro câmeras. Consequentemente, este aparelho pode medir ou calcular parâmetros com mais precisão do que os métodos cinémáticos 2D convencionais. Portanto, a análise cinemática que usa o aparelho de captura de movimento 3D mantém uma enorme promessa como um substituto potencial para outros métodos de avaliação funcional.

No entanto, o método de análise cinética 3D tem várias limitações. Treinar roedores, anexar marcadores e traçar processos de exame são complicados e demorados. Para obter dados reprodutíveis e confiáveis, o operador deve estar bem familiarizado com as etapas críticas necessárias. A mudança de pele que ocorre durante a caminhada de roedores é particularmente provável que produza desvios de dados21. Além disso, o alto custo dos equipamentos de análise cinética 3D pode impedir sua popularização e limitar o uso em estudos relevantes.

Estudos anteriores descobriram que a análise cinética 3D alcançou resultados precisos e válidos no contexto da lesão nervosa ciática do ratomodelo9,22. Consequentemente, temos razões para acreditar que esse método pode ser uma ferramenta útil para avaliações funcionais de vários estados de trauma ou doença que envolvem os membros posteriores, incluindo distúrbios do sistema nervoso central e periférico e doenças musculoesqueléticas. Além disso, alterando o posicionamento do marcador, este método pode ser usado para avaliar funcionalmente os movimentos anteriores dos membros. Embora essas hipóteses exijam uma verificação adicional através de experimentos futuros, acreditamos que a análise cinemática usando um aparelho de captura de movimento 3D pode inspirar métodos de avaliação funcional mais promissores e desempenhar um papel importante na pesquisa e aplicações clínicas.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este estudo foi apoiado pelo JSPS KAKENHI Grant Number JP19K19793, JP18H03129 e JP18K19739.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
9-0 nylon suture Bear Medic Corporation. T06A09N20-25
Anesthetic Apparatus for Small Animals SHINANO MFG CO.,LTD. SN-487-0T
ISOFLURANE Inhalation Solution Pfizer Japan Inc. (01)14987114133400
Kine Analyzer KISSEI COMTEC CO.,LTD. N.A. A analysis software
Liquid adhesive KANBO PRAS CORPORATION PT-B180
Micro forceps BRC CO. 16171080
Motion Recorder KISSEI COMTEC CO.,LTD. N.A. A recording software
Standard surgical hemostat Fine Science Tools, Inc. 12501-13
Surgical blade No.10 FEATHER Safety Razor CO., LTD 100D
Surgical hemostat World Precision Instruments 503740
Three-dimensional motion capture apparatus (KinemaTracer for Animal) KISSEI COMTEC CO.,LTD. N.A. A 3D motion analysis system that consists of cameras
Three-dimensional(3D) Calculator KISSEI COMTEC CO.,LTD. N.A. A marker tracing software
Treadmill MUROMACHI KIKAI CO.,LTD MK-685 a treadmill with affialiated the electrical schocker, transparent sheats and a speed control apparatus

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References

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