מעקב אחר תמציות ביומיסקופיה באמצעות מיקרוסקופ Confocal וקדי

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

הפרוטוקול מתאר את הטיפוח של ממלכת הבין-מלכות המורכבת מקנדידה מיקרובינים ו סטרפטוקוקוס ומציג שיטה מבוססת-מיקרוסקופ מבוסס על הניטור של pH מואנים בתוך הביואמים האלה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Schlafer, S., Frost Kristensen, M. Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e60270, doi:10.3791/60270 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

בין הממלכה ביואמים המורכבת הן בתאי פטרייתי בקטריאלי מעורבים במגוון של מחלות הפה, כגון זיהומים אנדודונטיים, חניכיים, זיהומים רירית, בעיקר, עששת הילדות המוקדמת. בכל התנאים הללו, ה-pH במטריקס משפיע על אינטראקציות מארחות בחיידק ולכן התקדמות המחלה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה מבוססת על מיקרוסקופיה לניטור הדינמיקה של ה-pH בתוך ביויואמים של הממלכה הכוללת את הקנדידה ו סטרפטוקוקוס. הספקטרום של פליטת הפליטה הכפולה והתכונות המכתימה של בדיקת הטימטרי C-נהם-4 מנוצלים כדי לקבוע טיפות ב-pH באזורים של מסחטות של הביואמים. השימוש ב-pH טימטריה עם הגשוש דורש בחירה מדוקדקת של פרמטרי דימות, כיול יסודי של הצבע, וזהיר, מבוסס הסף על עיבוד הנתונים של התמונה. כאשר נעשה שימוש נכון, הטכניקה מאפשרת הערכה מהירה של pH החילוץ באזורים שונים של ביוilm, ובכך את הניטור של שני מעברי pH אופקי ואנכי לאורך זמן. בעוד שהשימוש במיקרוסקופיה מגבילה את ה-Z-פרופיל ל ביויואמים דקים של 75 יקרומטר או פחות, השימוש ב-pH מטימטריה מתאים באופן אידיאלי למחקר לא פולשני של גורם התקפה אלימה חשובה בתוך ביוילאמים חוצי הממלכה.

Introduction

ביומדי הממלכה, המורכב הן ממינים פטרייתיים וחיידקיים, מעורבים במצבים פתולוגיים בחלל הפה. קנדידה spp לעתים קרובות מבודדים זיהומים אנדודונטיים1 ומפני נגעים חניכיים2,3. בזיהומים רירית, מינים streptococcal מהקבוצה mitis הוכחו לשפר את היווצרות ביופלורין, הפלישה רקמות, והפצת הן בתוך מודלים מחוץ לארץ מורנין4,5,6,7. מעניין ביותר, מנשא אוראלי של קנדידה spp הוכח להיות משויך לשכיחות של עששת אצל ילדים8. כפי שמוצג במודלים של מכרסמים, קשר סימביוטי בין מוגני סטרפטוקוקוס ו קנביאנים אלביקנס מגביר את הייצור של פוליסכפידים של מסחטות ומוביל להיווצרות של ביואמים עבים יותר ויותר9,10.

בכל התנאים שהוזכרו לעיל, העששת המוקדמת בפרט, ה-pH של הביוilm הוא בעל חשיבות להתקדמות המחלה, והתפקיד הנודע של מטריצת הביוilm לפיתוח מיקרויוגניים11 שיחות למתודולוגיות המאפשרות לימוד שינויי pH בתוך ביואמים של הממלכה הצולבת. מיקרוסקופיה פשוטה ומדויקת גישות מבוססות לנטר pH בתוך חיידקי12 ו פטרייתי13 ביואילאמים פותחו. עם לצבוע את הצבע C-נהם-4 ואת הסף מבוסס התמונה לאחר העיבוד, ה-pH החילוץ יכול להיקבע בזמן אמת בכל שלושת הממדים של ביוilm14. לעומת טכניקות אחרות שפורסמו בניטור pH-מבוססי מיקרוסקופ ב-ביואמים, pH מטימטריה עם C-סנף-4 הוא פשוט וזול, כי זה לא דורש סינתזה של חלקיקים או תרכובות הכוללות צבע התייחסות15 או שימוש בשני הפוטון עירור16. השימוש בצבע אחד בלבד מונע בעיות עם מידור בדיקה, פלורסנט בכיוון, ו הלבנה סלקטיבית16,17,18 תוך שהוא עדיין מאפשר בידול אמין בין הפנים והחילוץ pH. בסופו של דבר, הדגירה עם הצבע מבוצעת לאחר הצמיחה של ביוilm, אשר מאפשר ללמוד הן מעבדה והן בתוך מקומיים מגודלים ביואמים.

מטרת העבודה הנוכחית היא להאריך את השימוש ב-pH מטימטריה ולספק שיטה ללימוד שינויי חומציות בביואמים מהממלכה. כהוכחה למושג, השיטה משמשת לניטור pH ב-ביואמים של מינים כפולים, המורכב מ -S. מיונים ו-C. אלביקנס חשופים גלוקוז.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול לאיסוף הרוק נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה של מחוז ארהוס (M-20100032).

1. טיפוח ביוגידים של הממלכה הצולבת

  1. הגדל את ה- DSM 20523 ו -C. אלביקנס ncpf 3179 על לוחות דם אגר ב 37 ° c בתנאים אירוביים.
  2. העברת מושבות יחיד של כל אורגניזם כדי לבדוק את הצינורות מלאים 5 מ ל של המוח עירוי של הלב (BHI). לגדול 18 h בתנאים אירוביים ב 37 ° c.
  3. צנטריפוגה את התרבויות לילה ב 1,200 x g עבור 5 דקות. להיפטר supernatant, להשעות מחדש את התאים מלוחים פיסיולוגיים ולהתאים את OD550 nm כדי 0.5 עבור C. אלביקנס (~ 107 תאים/ml) ו- S. מוסטנים (~ 108 תאים/ml). לדלל את ה-S. מ1:10 ההשעיה עם תמיסת מלח פיזיולוגי סטרילי (~ 107 תאים/mL).
  4. פיפטה 50 μL של פתרון הרוק סטרילי, מוכן על פי השיטה של דה ג'ונג et al.19, לתוך הבארות של תחתון אופטי 96-צלחת מיקרוסקופ. דגירה של 30 דקות ב 37 ° c. לשטוף את הבארות 3x עם 100 μL של תמיסת מלח פיסיולוגית סטרילית. . רוקן את הבארות
  5. הוסף 100 μl של C. אלביקנס השעיית כל טוב. מודקון ב 37 ° c עבור 90 דקות. לשטוף את 3x עם תמיסת מלח פיזיולוגי סטרילי.
    הערה: אל תרוקן את הבארות לחלוטין במהלך הכביסה. להשאיר מאגר של 20 μL כדי למנוע כוחות הטיה מוגזמת.
  6. הוסף 100 μL של סרום בלתי מופעל חום של שור העוברי (לא מופעל ב 56 ° צ' עבור 30 דקות) לכל טוב. מודטה ב 37 ° c עבור 2 כ. לשטוף את 3x עם תמיסת מלח פיזיולוגי סטרילי. לרוקן את הבארות, להשאיר מאגר של 20 μL.
  7. הוסף 100 μL של ההשעיה של S. מוסטנים (מוכן בשלב 1.3) לכל באר. הוסף 150 μL של BHI המכיל 5% סוכרוז. מודטה ב 37 ° c למשך 24 שעות או יותר. כאשר מטפחים ביואילאמים ישנים יותר, שנו את המדיום מדי יום ל-BHI טרי. בסוף שלב הצמיחה של הממלכה הצולבת, שטוף 5x עם תמיסת מלח פיסיולוגית סטרילית.

2. שטימטרי pH הדמיה

הערה: יש לבצע הדמיה ממוחשבת באופן מיידי לאחר השלמת הגידול ביומטרי.

  1. עבור הדמיה pH טימטרי, השתמש במיקרוסקופ הפוך לייזר סריקת מיקרוסקופ עם השמן 63 x או טבילה המים עדשה, קו 543 ננומטר לייזר, ו מערכת הדמיה ספקטרלית (כלומר, META גלאי) כדי לאפשר הדמיה של אותות פלורסנט חופפים. השתמש באינקובטור כדי לחמם את שלב המיקרוסקופ עד 35 ° c.
  2. הגדר את הגלאי כדי להבטיח זיהוי של זריחה ירוקה מ 576 ל608 ננומטר וזיהוי סימולטני של קרינה פלואורסצנטית אדומה מ 629-661 nm. לבחור כוח לייזר מתאים ולהשיג כדי למנוע חשיפה מעל ומחסור.
    הערה: חשיפת התמונות היא הטובה ביותר לראות תמונות לוח עם צביעה שווא.
  3. הגדר את גודל הנקב ל-1 יחידה אוורירית או פרוסה אופטית של ~ 0.8 μm. הגדר את גודל התמונה ל-512 x 512 פיקסלים ומהירות הסריקה ל-2. בחר קו ממוצע של 2, באמצעות האפשרות ממוצע.
    הערה: בתחילת סדרה של ניסויים, בדוק כי הגדרות המיקרוסקופ שנבחרו מספק ניגוד ברור בין תאים חיידקיים, קירות תא פטרייתי, מטריצת ביוilm, ו ציטופלסמה פטרייתי.
  4. הכינו 100 μl של תמיסת מלח פיזיולוגית סטרילית המכילה 0.4% (w/v) של גלוקוז, טיטרציה ל-pH 7. הכינו פתרון מניות של C-סנף -4 (1 מ"מ בדימתיל סולפוקסיד). להוסיף את הצבע לריכוז הסופי של 30 μM.
    התראה: לבשו כפפות ניטריל כשאתם מטפלים בצבע הטימטרי.
  5. לרוקן את אחת הבארות עם ביובין הממלכה, להשאיר מאגר של 20 μL. להוסיף את תמיסת מלח סטרילי המכיל גלוקוז ואת הצבע הטימטרי. מניחים את הצלחת 96-ובכן על מיקרוסקופ ולהתחיל הדמיה של הבין-ביוilm.
  6. השגת תמונות בודדות או מחסניות Z במיקומים שונים של הביוilm. סמן את מיקום ה-X-Y בתוכנת המיקרוסקופ כדי לעקוב אחר שינויי pH בשדות מסוימים של תצוגה לאורך זמן. במרווחי זמן קבועים, קח תמונות עם הלייזר כבוי כדי לתקן את היסט הגלאי.
  7. חזור על שלבים 2.4 – 2.6 לניתוח של כל ביו, גדל בבאר אחרת.

3. כיול של הצבע הטימטרי

הערה: כיול הצבע וההתאמה של עקומת כיול ניתן לבצע ביום שונה מאשר הדמיה ממוחשבת.

  1. הכינו סדרה של מאגר חומצה באורך של 50 מ"מ 2 (MES) ל-pH 4.0-7.8 בשלבים של 0.2 יחידות pH ב 35 ° c. פיפטה 150 μL של כל פתרון מאגר לתוך הבארות של הלוח האופטי התחתון 96-באר למיקרוסקופיה.
  2. להוסיף את הצבע על הבארות מלא מאגר של 96-ובכן צלחת לריכוז הסופי של 30 μM. . בסדר.
  3. חמם את מיקרוסקופ הבמה עד 35 ° c. לבחור את הגדרות המיקרוסקופ אותו כמו עבור הדמיה מטימטרית pH. מניחים את הצלחת 96-טוב על הבמה המיקרוסקופ. . תתמקד בתחתית הבארות לרכוש שתי תמונות (ערוץ ירוק ואדום) עבור כל פתרונות המאגר, 5 יקרומטר מעל החלק התחתון של הבאר. במרווחי זמן קבועים, קח תמונות עם הלייזר כבוי כדי לתקן את היסט הגלאי.
  4. בצע את ניסוי הכיול בטרילקאט.
  5. ייצוא כל התמונות כקבצי TIF. יבא אותם לתוכנת ניתוח תמונה ייעודית (כלומר, ImageJ20). הפחת את התמונות שצולמו עם הלייזר כבוי מהתמונות המתאימות של פתרונות המאגר על-ידי לחיצה על תהליך | מחשבון תמונה | חיסור).
    הערה: במקרה הצורך, חתוך את התמונות כדי לסלק פריטים בגבולות התמונה על-ידי ביצוע בחירה מלבנית באמצעות התמונה | חיתוך.
  6. חלק את התמונות ערוץ ירוק דרך תמונות ערוץ אדום ולחשב את עוצמות הזריחה הממוצעת בתמונות שנוצרו על ידי לחיצה על לנתח | היסטוגרמה.
  7. מתוך ניסויים בטרילקאט, יש להתוות את היחס הממוצע הירוק/אדום נגד ה-pH. השתמש בתוכנה ייעודית כדי להתאים פונקציה לנתוני הכיול (כלומר, MyCurveFit).

4. ניתוח תמונה דיגיטלית

הערה: ניתן לבצע ניתוח תמונה דיגיטלי בכל זמן שהוא לאחר כיול של הדמיה ממוחשבת לצבען ולהדמיית pH.

  1. אחסן את התמונות של הערוץ הירוק והאדום בתיקיות נפרדות ושנה את שמם של סדרות קבצים עם מספרים רציפים (לדוגמה, GREEN_0001). יבא את התמונות לתוך תוכנת ניתוח תמונה ייעודית (כלומר, ImageJ). לחץ על נתח | היסטוגרמה כדי לקבוע את עוצמת הזריחה הממוצעת בתמונות שצולמו באמצעות הלייזר ולהחסיר את הערך מתמונות הביוilm על-ידי לחיצה על תהליך | מתמטיקה | חיסור.
  2. יבא את שתי סדרות התמונות לתוכנה ייעודית לניתוח תמונה (כלומר, בדייני21). ביצוע פילוח מבוסס הסף של תמונות הערוץ האדום (קטע | פילוח אוטומטי | מסף מותאם אישית). הגדר את סף ' נמוך ' מעל העוצמה הפלואורסצנטית של הציטופלסמה פטרייתי ואת סף ' גבוה ' מתחת לאינטנסיביות של קירות התא פטרייתי ואת החיידקים.
    הערה: בעת בחירת גדלי סף מתאימים, רק אזורים מוכוללים מזוהים כאובייקטים.
  3. העבר את שכבת האובייקט של סידרת התמונות המקוטרת לסדרת התמונות של הערוץ הירוק. לשם כך, לחץ על פלח | העברת שכבת אובייקט.
    הערה: אם הניגוד בין אזורים המוחלשים והציטופלסמה פטרייתי חלש מדי בערוצי הצבע הבודדים, הוסף את סדרת התמונות של הערוץ הירוק לסדרת הערוצים האדומים לפני פילוח על-ידי לחיצה על Edit | מחשבון תמונה | נוסף. בצעו את הפילוח כמתואר תחת 4.2 והעבירו את שכבת האובייקט של סדרת התמונות המקודמות לסדרת התמונות הירוקה והערוץ האדום.
  4. השתמש בעורך האובייקטים כדי למחוק פיקסלים שאינם אובייקטים בסדרת התמונות של הערוץ האדום והירוק (מנרמל | עורך האובייקטים | בכל התמונות | מחק פיקסלים שאינם אובייקטים). התמונה מנוקה מתאים. בקטריאליים ופטרייתיים יצא את סדרת התמונות המעובדות כקובצי TIF.
  5. יבא את שתי סדרות התמונות ל-ImageJ. ImageJ מקצה עוצמה של 0 לכל הפיקסלים שאינם אובייקטים. הסר את הפיקסלים האלה על-ידי חלוקת סדרת התמונות האדומות (R1) בפני עצמה (תהליך | מחשבון תמונה | תמונה 1: R1; פעולה: חילוק; תמונה 2: R1) והכפלת סדרת התמונה הנוצרת (R2) עם סדרת התמונה האדומה המקורית (תהליך | מחשבון תמונה | תמונה 1: R1; פעולה: כפל; תמונה 2: R2). סדרת תמונה שלישית (R3) נוצר, זהה R1, למעט העובדה כי נאן מוקצה כל הפיקסלים עם עוצמה של 0 R1. המשך באותו אופן עם סדרת התמונות הירוקות.
  6. השתמש במסנן ' ממוצע ' (תהליך | מסננים | אומר | רדיוס | 1 פיקסל) בסדרת תמונות הערוץ האדום והירוק כדי לפצות על רעש הגלאי. חלק את סדרת תמונות הערוץ הירוק באמצעות סדרת תמונות ערוץ אדום (תהליך | מחשבון תמונה | תמונה 1: G3; פעולה: חילוק; תמונה 2: R3). סדרת התמונות שתיווצר (G3/R3) מציגה את היחס הירוק/אדום עבור כל הפיקסלים באובייקט.
  7. חישוב היחס הממוצע לכל תמונה (לנתח | היסטוגרמה). החלת צביעה שקרית לייצוג ויזואלי טוב יותר של היחס בתמונות (תמונה | טבלאות בדיקת מידאות). המר את היחס הירוק/אדום לערכי pH המעסיקים את הפונקציה הותאמה תחת 3.6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר 24 h ו 48 h, ביוציאמים עמידים בפני הממלכה התפתחו בצלחות הבאר. C. אלביקנס הראה דרגות שונות של צמיחה filamentous, ו S. מוסטנים יצרו אשכולות צפופים של עד 35 יקרומטר בגובה. תאים בודדים ושרשראות של S. מוסטנים מקובצים סביב מפרידי פטריות, וחללים בין-סלולאריים גדולים מצביעים על נוכחות של מטריצה מומסת (איור S1).

כיול של הצבע הטימטרי מניב עקומה א-סימטרית13,14. PH החילוץ ביויואמים ירד במהירות 5 דקות הראשון לאחר החשיפה לגלוקוז בשיעורים שונים בתחומים מיקרוסקופיים שונים של השקפה. לאחר מכן, חמצה האט, בדרך כלל מגיע לערכים של 5.5 – 5.8 אחרי 15 דקות (איור 1). שכפל ביואילאמים הראה התנהגות דומה, עם וריאציות קל רק pH ממוצע (איור S2).

הדיוק של חישובי ה-pH תלוי מאוד בבחירה זהירה של הגדרות תמונה במהלך הרכישה. עבור ביואילאמים המדובר, פרוסה אופטית של 0.8 יקרומטר הוכיחה להיות אידיאלי כדי להשיג את הניגודיות הטובה ביותר האפשרית בין אזורים מחלץ ופטריות ציטופלסמה (הדמות S3). יתר על כן, גודל פיקסל של 0.28 יקרומטר (איור S4), פיקסל זמן לשכון של 102.4 μs (איור S5), וממוצע קו של 2 (איור S6) סיפק ניגודיות טובה יחד עם זמן רכישת תמונה מקובלת של ~ 1 דקות. במהלך עיבוד תמונה, כל התאים חיידקי ופטרייתי הוסרו מן התמונות, בעוד רוב האזורים שמסביב החילוץ נכללו בניתוח ה-pH הבאים. בהתאם לבהירות התמונות, יש לבחור באותיות קטנות ותחתונות שונות (איור 2).

נתוני ה-pH המוצגים באיור 1 ואיור S2 נרשמו 5 יקרומטר מתוך ממשק שכבות המשנה. עם המרחק הגובר מן המצע, ובהתאם צפיפות התא של ביואיאמים, עוצמת הקרינה פוחתת, והתוצאה היא ניגוד נמוך בין תאים ומטריקס. עם זאת, ב ביואילאמים הדקים (~ 35 μm) גדל במחקר הנוכחי, הניגודיות בחלק העליון של הביוilm מאפשר ניתוח תמונה אמין (איור S7A).

Figure 1
איור 1: השימוש ב-pH מטימטריה בתוך ממלכת ביואמים חשופים לגלוקוז. (א) שדה ראייה בתוך מוכתם בחיידק ויטראז ' היה בעל מיקרוסקופ קונקטאני והאזור שמכוסה בתאים חיידקיים ופטרייתיים הוסר לפני ניתוח טימטרי. (ב) ה-pH במרחב החילוץ היה מחושב ודמיינו באמצעות טבלת בדיקת מחשבים (16 צבעים). קנה מידה ברים = 20 μm. (ג) ה-pH ב 24 הממלכה הצולבת ביוגיאמים ירד במהירות עם חשיפה לגלוקוז בקצב שונה מעט בתחומים שונים של השקפה. קווי שגיאה = סטיית תקן (SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מקטעי תמונה מבוססי הסף של הביויודים המוכתמים. בשל שינויי ה-pH המקומיים, עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית בשינויי הביואמים לאורך זמן. (א) ו-(ב) להראות את אותו שדה מיקרוסקופי של השקפה לאחר 1 דקות ו 15 דקות של חשיפה לגלוקוז, בהתאמה. במהלך פילוח תמונה, ספי גבוה ונמוך צריך להיבחר כראוי כדי לחסל את כל האזורים מכוסה על ידי תאים חיידקיים ופטרייתיים. (ג) אזורים כחולים חוסלו על-ידי הסף הנמוך (40), אזורים אדומים על-ידי הסף הגבוה (115). (ד) רק אזורים של מסחטות זוהו כאובייקטים (מוקפים בקווים כתומים). (ה) לאחר חיסול האזור המכוסה על ידי תאים מיקרוביאלית, ניתן לבצע את חישוב ה-pH במטריצה של הביוilm. קנה מידה של פסים = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplemental Figure 1
איור S1: השימוש האופייני לרוחב 24 שעות בממלכה מוכתם בצבע האומטרי. תאים רבים של C. אלביקנס הציגו צמיחה filamentous, בעוד S. התאים הצהובים הקימו אשכולות צפוף או מקומי סביב מיקוף פטרייתי כתאים בודדים או שרשראות. מרחבים בין-סלולאריים גדולים מצביעים על נוכחות של מטריצה בעלת היקף. קנה מידה של פסים = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplemental Figure 2
איור S2: פיתוח ה-pH ב 24 שעות הצלב הממלכה ביוילאמים חשופים גלוקוז. (א), (ב) ו-(ג) ה-pH נקבע בשלוש מתוך שלושה שכפול של ביוילאמים עבור 15 דקות לאחר החשיפה לגלוקוז. לאחר ירידה מהירה ב-pH בחמש הדקות הראשונות, חמצה האטה, ורמות של 5.5-5.8 הגיעו לאחר 15 דקות. שיעורי השקפה שונים במקצת נצפו בשדות תצוגה מיקרוסקופיים שונים (כל אחד מהם מיוצג בשורה). כיול של הגשוש הטימטרי בוצע רק פעם אחת. קווי שגיאה = SD. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplemental Figure 3
S3 דמות: השפעת עובי הפרוסה האופטית על ניגודיות התמונה. תמונות של ביומיאמים ויטראז ' נרכשו עם (A) בגודל חריר של 2 יחידות אווריריים ועובי פרוסה אופטית של 1.6 μm, ו (ב) 1 יחידה אוורירית ופרוסה אופטית של 0.8 μm. ביחידה אוורירית 1, כוח לייזר גבוה יותר/רווח היה נחוץ עבור רכישת תמונה, אבל הניגוד בין הציטופלסמה פטריות ואזורים החילוץ השתפר. קנה מידה של פסים = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplemental Figure 4
איור S4: השפעת הרזולוציה על ניגודיות התמונה. תמונות של ביומיאמים ויטראז ' נרכשו עם גודלי פיקסל של (A) 1.12 יקרומטר, (ב) 0.56 יקרומטר, (ג) 0.28 יקרומטר, (ד) 0.14 יקרומטר, ו-(ה) 0.11 יקרומטר. הפחתה של גודל הפיקסל מתחת 0.28 יקרומטר לא לשפר את הניגוד בין אזורים מסחטות ופטריות ציטופלסמה. קנה מידה של פסים = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplemental Figure 5
איור S5: השפעת מהירות הסריקה בניגוד לתמונה. תמונות של ביומיאמים ויטראז ' נרכשו בזמן לשכון פיקסל של (A) 12.8 μs, (ב) 25.6 μs, (ג) 51.2 μs, (ד) 102 μs, ו-(E) 164 μs. הגדלת להתעכב הפיקסל הזמן מעבר 102 μs לא לשפר את הניגוד בין אזורים מסחטות ו תאיים. קנה מידה של פסים = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplemental Figure 6
איור S6: השפעת חישוב ממוצע בניגוד לתמונה. תמונות של ביואמים ויטראז ' נרכשו עם קו ממוצעים (ממוצע) של (א) 1, (ב) 2, ו (ג) 4. קו ממוצע של 2 מספק את הפשרה הטובה ביותר בין הניגודיות לבין זמן הרכישה. קנה מידה של פסים = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplemental Figure 7
איור S7: ניגודיות התמונה בתוך ביויואמים בלבד וביואמים של הממלכה הצולבת. (א) החלק העליון של ביויותמים של הממלכה הצולבת היה התמונה 30 יקרומטר מהממשק. הניגוד בין האזורים המסריים והתאיים היה נמוך יותר מאשר בבסיס הבין-בסיסי, אך עדיין מספיק לניתוח pH מטימטרי. (ב) מונמינים בעלי כניסה לשימוש ב -pH-אלביקנס . לייזר כוח/להרוויח יכול להיות מוגבר כדי למטב את הניגוד בין קירות תא פטרייתי וציטופלסמה. (ג) בתוך הממלכה הצולבת, חיידקים פלורסנט בהירים מנעה עלייה נוספת של כוח לייזר/להרוויח. מכאן, הניגוד בין קירות התא פטרייתי הציטופלסמה פחות מבוטא מאשר בתוך ביוציאמים פטרייתי גרידא. קנה מידה של פסים = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקולים שונים לטיפוח של הממלכה הצולבת ביוגיאמים הקשורים C. אלביקנס ו סטרפטוקוקוס spp. תוארו בעבר9,22,23,24,25. עם זאת, הכיוונון הנוכחי מתמקד בתנאי גדילה פשוטים, לוח זמנים התואם לימי עבודה רגילים, הלחנה של מינים מאוזנים ופיתוח של מטריצה ביוציסטית מצומצמת. יתר על כן, 96-צלחות היטב היו מצופות בפתרון הרוק כדי לחקות את התנאים אוראלי של הדבקה במידה מסוימת.

השימוש ב-pH טימטריה עם C-נהם-4 הוא שיטה זולה למדידות מהירות של ביוilm pH, היתרונות והחסרונות שנדונו בפרוטרוט במקומות אחרים12,26. בקצרה, הטכניקה מאפשרת הערכה של pH במיקומים שונים בתוך ביוילאמים ובכך ניטור של מעברי pH אופקיים התפתחויות pH לאורך זמן27. ניתן להקליט גם פרופילי pH אנכיים, אך עומק החדירה מוגבל על-ידי שימוש במיקרוסקופיה. מכאן, pH טימטריה מייצגת מהיר יותר, תכליתי יותר, חלופה פולשנית פחות pH מיקרואלקטרודות, אשר כיום השיטה של הבחירה עבור Z-פרופיל של ביואמים עבה28. לעומת שיטות אחרות המבוססות על מיקרוסקופיה עבור הקלטות ה-pH בתוך הביואמים, ל-pH באמצעות C-סנאפ 4 יש את היתרון של העסקת רק כתם אחד. לכן, כמה בעיות שעלולות לנבוע התנהגות פלואורסצנטית משלים את האינטראקציה בין צבעים שונים הם להקיף26.

בתוך הממלכה החוצה, בידול מבוסס הסף בין ביומסה מיקרוביאלית לבין האזורים מסחטות מציב כמה בעיות בהשוואה לביואילאמים כי רק מהווים תאים חיידקיים או פטרייתי. התאים החיידקיים מהפנים את הצבע הטימטרי ומציגים אות פלורסנט בהיר בהשוואה למטריקס, אך גם בהשוואה לדפנות התאים הפטרייתיים. קירות תא פטרייתי מופיעים בהירים במקצת מאשר מטריצת הביוilm, אשר בתורו מראה פלואורסצנטית גבוה יותר מאשר הציטופלסמה פטרייתי. ביואילאמים המורכבים רק מתאים פטרייתיים, ניתן לרכוש תמונות באמצעות כוח לייזר גבוה/להרוויח, אשר מביא לניגודיות מספקת בין מטריצת הביו, לבין הציטופלסמה הפטרייתיים (איור S7B). כאשר החיידקים נמצאים, כוח לייזר/להרוויח חייב להיות מופחת כדי למנוע חשיפה יתר של תאים חיידקיים (איור S7C). מכאן, את הניגוד בין הציטופלסמה פטריות ואזורים מסחטות הוא לא מבוטא, ואת הגדרות התמונה כגון גודל חריר, גודל פיקסל, פיקסל לשכון זמן חייב להיבחר עם טיפול גדול לניתוח טימטרי.

באשר לכל הטכניקות המבוססות על מיקרוסקופ, איכות התמונה וזמן הרכישה הם בקורלציה הפיכה. ב הנוכחי ממלכת ביוילאמים, זמן הדמיה של ~ 30 s, באופן אידיאלי 1 דקות, היה צורך להשיג איכות מתאימה עבור ניתוח pH הבאים. בהשוואה, ביואילאמים כי רק חיידקים הנמל יכול להיות בתמונה עם איכות מספקת ב 10 או פחות29. לניתוח מיקרוסקופ של צמיחה, מבנה או קומפוזיציה, זמני הרכישה של 1 דקות אינם מהווים בעיה, ובמקרים רבים הדבר עשוי גם לחול על הקלטות pH. עם זאת, שינויי pH קיצוניים, כגון חמצה מהירה נצפתה מיד לאחר החשיפה גלוקוז (ΔpH > 1 יחידה/דקה), קשה לפקח על הממלכה בין ביואילאמים.

העבודה הנוכחית ממחישה כי הקלטות ה-pH הטימטרי עם C-נהם-4 הם בעלי ביואמים בעלי ממלכות מורכבות מ -S. שיזוף ו -c. אלביקנס. מחקרים עתידיים עשויים להעסיק את השיטה לניתוח שינויי החומציות בתוך ביואמים מקומיים עם גיוון מינים גדול יותר, במיוחד ביומאמים שגדלו באתרו (כלומר אצל ילדים עם עששת בגיל הרך)30. במחקר זה, ה-pH ביומאמים היה תחת פיקוח בתנאים סטטיים ולזמן תצפית מוגבלת של 15 דקות, מיד לאחר דופק הגלוקוז. התקדמויות נוספות עשויות לכלול את היישום של זרימת נוזל לחקות בתנאים באתרו יותר14,31,32. כמו-כן, ניתן להשתמש ב-pH-מטימטריה כדי ללמוד את ההשפעה של מצבים תזונתיים שונים בשינויי pH לטווח ארוך באמצעות ביואמים חוצי ממלכה ולתרום כדי להבהיר את ההשפעה של ביוilm pH על הרקמות המארחות המשמשות כבסיס. שוב, הדמינרליזציה של זגוגית השיניים בעששת מוקדם של הילדות עשויה לשמש דוגמה בולטת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

והוא מודה בתמיכה טכנית מעולה. המחברים מודים לרובנס-נטו לדיונים פוריים על ניתוח תמונות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blood agar plates Statens Serum Institut 677
Brain heart infusion Oxoid CM1135
Brain heart infusion + 5 % sucrose BDH laboratory supplies 10274
Candida albicans National Collection of Pathogenic Fungi NCPF 3179
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
daime: digital image analysis in microbial ecology Universität Wien N/A Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
Dimethyl sulfoxide Life Technologies D12345
Fetal bovine serum Gibco Life technologies 10270
GS-6R refrigerated centrifuge Beckman N/A
ImageJ National Institutes of Health N/A Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
Java Oracle N/A Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download
µ-Plate 96 Well Black Ibidi 89626
MyCurveFit MyAssays Ltd. N/A
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer Bioworld 700728
PHM210 pH-meter Radiometer Analytical
Plan-Apochromat 63x oil immersion objective Zeiss N/A NA=1.4
SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid Life Technologies S23920
Sterile physiological saline VWR 6404
Streptococcus mutans Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen DSM 20523
Vis-spectrophotometer V-3000PC VWR N/A
XL Incubator PeCON N/A
Zeiss LSM 510 META Zeiss N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siqueira, J. F., Sen, B. H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97, (5), 632-641 (2004).
  2. Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14, (1), 0210527 (2019).
  3. De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35, (3), 134-139 (2018).
  4. Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16, (2), 214-231 (2014).
  5. Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214, (6), 925-934 (2016).
  6. Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, (11), 7967 (2009).
  7. Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80, (2), 620-632 (2012).
  8. Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52, (1-2), 102-112 (2018).
  9. Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82, (5), 1968-1981 (2014).
  10. Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13, (6), 1006407 (2017).
  11. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92, (12), 1065-1073 (2013).
  12. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).
  13. Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18, (5), (2018).
  14. Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
  15. Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75, (23), 7426-7435 (2009).
  16. Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
  17. Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92, (11), (2016).
  18. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2, (1), 113-119 (2009).
  19. de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47, (5), 901-904 (1984).
  20. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  21. Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8, (2), 200-213 (2006).
  22. Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11, (3), 0150457 (2016).
  23. Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51, (8), 672-680 (2006).
  24. Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9, (11), 1242 (2017).
  25. Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).
  26. Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
  27. Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81, (4), 1267-1273 (2015).
  28. Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76, (7), 2326-2334 (2010).
  29. Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6, (9), 25299 (2011).
  30. Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, Clifton, N.J. 525-548 (2019).
  31. Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28, (2), 187-198 (2012).
  32. Stoodley, P. Biofilms: Flow disrupts communication. Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics