高分子表面上の吸着タンパク質層におけるトール様受容体媒介NF-kB/AP-1シグナル伝達を調べるマクロファージレポーター細胞アッセイ

Bioengineering

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Summary

このプロトコルは、生体材料インプラント微小環境をモデル化する様々なポリマー表面および吸着タンパク質層に応答して、マウスマクロファージ細胞株におけるTLR依存性NF-аb/AP-1転写因子活性を測定する迅速かつ間接的な方法を研究者に提供する。

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McKiel, L. A., Woodhouse, K. A., Fitzpatrick, L. E. A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces. J. Vis. Exp. (155), e60317, doi:10.3791/60317 (2020).

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Abstract

異物反応として知られる移植された生体材料に対する持続的な炎症宿主応答は、生物医学デバイスおよび組織工学構造の開発および実施において重要な課題である。先天性免疫細胞であるマクロファージは、装置の寿命にわたってインプラント部位にとどまるため、異物反応の主要なプレーヤーであり、この有害な宿主応答の理解を得るために一般的に研究されている。多くのバイオマテリアル研究者は、移植された材料に吸着したタンパク質層がマクロファージの挙動に影響を与え、その後宿主の応答に影響を与えることを示しています。本論文の方法では、ポリマー生体材料表面上の細胞損傷分子を含む吸着タンパク質層を用いたインビトロモデルを用いてマクロファージ応答を評価する。NF-аB/AP-1レポーターマクロファージ細胞株および関連する比色アルカリホスファターゼアッセイは、体内の生物材料表面に形成された複雑な吸着タンパク質層のモデルとして、血液タンパク質および損傷関連分子パターンを含む複雑な吸着タンパク質層に応答してNF-аB/AP-1転写因子活性を間接的に調べる迅速な方法として使用された。

Introduction

異物反応(FBR)は、移植された物質または装置(例えば、薬物送達装置、バイオセンサー)の性能に悪影響を及ぼし得る慢性宿主応答であり、炎症メディエーターの持続的放出を通じて、および移植された物質と周囲組織1との間の統合を妨げることによって。この自然免疫応答は、移植手順によって開始され、インプラント1の周りに先天性免疫細胞および線維性カプセル形成の長期存在によって特徴付けられる。物質ホスト応答の文脈の中で、マクロファージ材料相互作用は、ホスト応答の進行およびFBR1の開発に大きな影響を与える。マクロファージは、多様な自然免疫細胞集団であり、組織常駐マクロファージ集団または単球由来マクロファージとして血液のいずれかからインプラント部位にリクルートされる。彼らは移植直後にインプラント部位に蓄積し始め、数日以内にインプラント微小環境における主要な細胞集団となる。材料接着マクロファージは、マクロファージ融合によって形成される異物巨細胞(FBGC)とともに、インプラント2、3の寿命にわたって材料表面で持続し得る。その結果、マクロファージは、FBRの特徴的なステップを調整する役割に起因する異物反応の主要なプレーヤーであると考えられる:急性炎症反応、組織改造、および線維組織の形成1。

トール様受容体(TR)は、マクロファージを含む多くの免疫細胞によって発現されるパターン認識受容体のファミリーであり、炎症および創傷治癒において重要な役割を果たすることが示されている。病原体由来のリガンドに加えて、TRは、細胞壊死中に放出される損傷関連分子パターン(DamP)として知られる内因性分子に結合し、炎症性サイトカイン4の産生をもたらす炎症性シグナル伝達経路を活性化することができる。我々および他の人は、軟組織生物質注入手順中に生じた損傷が、血液タンパク質に加えて生体材料表面に吸着し、その後の細胞と物質間相互作用調節する、Dammpを放出することを提案している。マクロファージがインプラント上の吸着タンパク質層と相互作用すると、その表面TRは吸着したDRPを認識し、炎症性シグナル伝達カスケードを活性化し、NF-κBおよびAP-1転写因子活性化および炎症性サイトカインの産生につながる。我々は、マウスマクロファージがNF-κB/AP-1活性および腫瘍壊死因子α(TNF-α、 炎症性サイトカイン)は、吸着血清または血漿のみ(すなわち、DMPが存在しない)の表面と比較して様々なポリマー表面上のDAMP含有吸着タンパク質層に応答して、かつこの応答がTLR2によって主に媒介されることを、TLR4はより少ない役割を果たしている5。

このプロトコルで使用されるNF-κB/AP-1レポーターマクロファージ細胞株(材料表)は、マクロファージ5、7、8における相対的なNF-κBおよびAP-1活性を測定するための便利な方法である。TLR経路阻害剤と組み合わせて、この細胞株は、様々な刺激5、7、8に応答して炎症におけるTLR活性化およびその役割を調べるのに有用なツールである。レポーター細胞は、NF-κBおよびAP-1転写因子活性化9に際して分泌胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)を安定的に産生することができる改変マウスマクロファージ様細胞株である。比色酵素アルカリホスファターゼアッセイ(材料表)は、NF-κB/AP-1活性の間接尺度としてSEAP発現の相対量を定量するために使用することができる。NF-κBおよびAP−1は多くの細胞シグナル伝達経路の下流にあるように、特定のTLR(例えば、TLR2)またはTLRアダプタ分子(例えば、MyD88)を標的とする中和抗体および阻害剤は、特定の経路の役割を検証するために使用することができる。この記事で説明する方法論は、移植されたバイオマテリアルのインビトロモデルとして、血液タンパク質とDMPの両方を含む吸着タンパク質層を有する様々なポリマー表面に対するマウスマクロファージ応答におけるTLRシグナル伝達の寄与を評価するための簡単かつ迅速なアプローチを提供する。

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Protocol

1. 媒体および試薬の準備

  1. 線維芽細胞性媒体を調製する。ダルベッコの変性イーグル培地(DMEM)、胎児ウシ血清(FBS)の50mL、ペニシリン/ストレプトマイシン5mLを合わせます。4 °Cで最大3ヶ月間保管してください。
  2. レポーターマクロファージ成長媒体を50mLアリコートで調製する。DMEMの45 mL、FBSの5 mL、5 μg/mLマイコプラズマ除去試薬(材料表)、および200μg/mLフレオマイシンD1(材料表)を組み合わせます。4 °Cで最大3ヶ月間保管してください。
  3. レポーターマクロファージアッセイメディアを50mLアリコートで調製する。DMEMの45 mL、熱不活化FBS(HI-FBS)の5 mL、5μg/mLマイコプラズマ除去試薬、および200 μg/mLフレオマイシンD1を組み合わせます。4 °Cで最大3ヶ月間保管してください。

2. ポリ(メチルメタクリレート)で細胞培養表面をコーティング

  1. ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)を20mg/mL(例えば、クロロホルム5mL中のPMMA100mg)でクロロホルムに溶解し、20mLガラスシンチレーションバイアルに入る。磁気攪拌棒をバイアルに入れ、すべての固体が溶解するまで少なくとも2時間攪拌するようにする。
    注意:クロロホルムは吸入すると有害である。PVA手袋を着用しながら、ヒュームフードに溶剤を使用してください。
  2. スピンコーターでホウケイ酸ガラス顕微鏡スライドの中心にPMMA溶液のピペット400 μLを、3000 rpmで2分間回転させる。アッセイに必要なスライドの数と、水接触角測定用に3−5余分に準備します。スライドは、将来の使用のためにきれいなボックス(スプレーして70%エタノールで拭いた)に保管してください。
    注:スピンコーティングは、薄くて均一なコーティングを平らな面に付着させるためによく使用されます。スピンコーターは、遠心力を使用してコーティング溶液を表面に広げ、基板を高速で回転させます。
    1. ガラス表面がポリマーで完全にコーティングされていることを確認するために、ゴニオメータを使用して、余分なコーティングされたスライドの表面上の2つのランダムな位置で水の接触角度を測定します(すなわち、細胞培養に使用されているスライドではありません)。
      注:水接触角測定には、最も純度の高い水(例えば、ガラストリプル蒸留)のみを使用する必要があります。
  3. 生物学的安全キャビネット(BSC)では、滅菌鉗子を使用し、無菌技術に従ってPMMAコーティングスライドに8チャンバー粘着性井戸を取り付けます。粘着井戸の上部をしっかりと押して、強く取り付けられていることを確認します。一晩37°Cで付着した粘着性井戸でスライドをインキュベートし、シールを確保します。
    1. 各ウェルに200°Lの細胞培養グレード(エンドトキシンフリー)水を加えて、粘着性井戸のシールをテストします。室温(RT)で60分間インキュベートし、先に進む前に漏れを確認してください。水を吸引し、PMMAコーティングを乱さないように注意してください。
  4. エンドトキシンフリーの水をそれぞれに300μLのエンドトキシンを加え、1時間(3回)、12時間、24時間インキュベートしてから、残りの溶媒を除去します。
  5. 細胞培養に用いたスライドのエンドトキシン濃度を試験する。エンドトキシンフリー試薬水の200μLを各スライドの1ウェルに1時間インキュベートし、エンドポイント発色エンドトキシンアッセイを用いて抽出物中のエンドトキシン濃度を測定する(材料表)。
    注:以下のプロトコルは、材料の表に記載されている内毒素アッセイキットに固有です。
  6. この作業には、ピロゲンフリー(すなわちエンドトキシンフリー)認定されている水と消耗品(ピペットチップ、マイクロ遠心管、ウェルプレート)のみを使用してください。また、ポリマー被覆面の調製に使用されるガラス製品は、10を使用する前に乾熱殺菌(30分間250°C)を用いて脱ピロゲン化されるべきである。抽出液中の内毒素を測定すると、ここで説明するように、材料表面11、12上の内毒素の過量化をもたらし得る。したがって、ポリマーコーティングプロトコルを開発する場合は、コーティングされたサンプルを含むウェル内でエンドトキシンアッセイ反応(すなわち、試験サンプル[試薬水]またはスパイクコントロールのステップ2.5.4-2.5.6)を直接実行し、コーティングプロセス中にエンドトキシンの供給源が誤ってシステムに導入されないようにすることをお勧めします。
    1. すべての試験サンプル(すなわち、抽出物)および内毒素アッセイ試薬をRTに持ち込み、試薬水中のアッセイバッファーと内毒素標準で発色試薬を再構成し、使用する前に5分間溶解させ、穏やかに旋回させる。使用しないときは、すべてのボトルをパラフィンフィルムで覆います。
    2. 試薬水中で内毒素標準の連続希釈を行うことにより、アッセイの下限から上限までの5-8点標準希釈曲線を作成します。
    3. 試験試料中の内毒素アッセイの増強または阻害を制御するために、未使用の試験試料溶液中に既知の量の内毒素を希釈することにより陽性対照(スパイクコントロールまたはスパイクサンプルとも呼ばれる)を調製する。
      注:正のコントロールの濃度は、標準曲線の中央の標準と同じ濃度である必要があります。エンドトキシンスパイクの回収量(すなわち、陽性対照の濃度から未スパイク試験試料の濃度を差し引いたもの)がエンドトキシンスパイクの公称濃度の50〜200%以内であれば、抽出溶液はアッセイを有意に妨げないと考えることができる。
    4. 96 ウェルプレートの各ウェルに 50 μL の標準、サンプル、またはスパイク コントロールを複製または三重に追加します。試薬水を負のコントロールとして使用してください。
    5. すべての井戸に50μLの発色試薬を加えます。すべての井戸に試薬を素早く追加します。タイマーを使用して、すべてのウェルに試薬を追加するのにかかる時間を記録します。プレートを接着シールで覆い、37°Cでインキュベートします(インキュベーション時間はロット依存であり、発色試薬キットに含まれる分析証明書に記載されています)。または、すべての標準井戸で色の変化が見られるまで、インキュベーション中に15分ごとにプレートをチェックしてください。
    6. インキュベーション後、各ウェルに50%酢酸の25μL(ウェル当たり10%酢酸の最終濃度)を加えて反応を停止します。発色試薬と同じ順序で酢酸を添加した。405 nmのプレートリーダーを使用してプレートの吸光度を読み取ります。吸引液と廃棄プレート。
      注:酢酸添加は、発色試薬が服用したのと同じ時間をそれぞれのウェルに添加する必要があります(±30s)。
  7. 紫外線(UV)は、細胞培養実験の前に30分間スライドを殺菌する。

3. ポリジメチルシロキサンを用いた細胞培養表面のコーティング

  1. ポリジメチルシロキサン(PDMS)エラストマーを10:1重量比で混合する(塩基:硬化剤)。生物学的安全キャビネットでは、ポリジメチルシロキサン塩基のピペット約10mLを滅菌管に入れる。チューブを計量し、10%が追加されるまでゆっくりと硬化剤を追加します。
    注意:換気の良い場所でPDMS試薬を使用し、安全メガネをかけて目を合わせないようにしてください。
  2. 無菌血清ピペットチップで攪拌し、上下にピペットすることでエラストマーを徹底的に混合します。48ウェルプレートの各ウェルに約200μLの溶液を加えます。エラストマー溶液で井戸の完全なカバレッジを確保するために、ウェルプレートをゆっくりと傾けます。
  3. エラストマーを入れたウェルプレートを50cmHg、40°Cに設定した真空オーブンに入れます。ふたを取り外し、単一のふき取りで覆い、他の破片が井戸に落ちるのを防ぎます。少なくとも48時間インキュベートすることを許可します。
    1. 井戸が目視検査で完全にコーティングされていることを確認します。除去する前に、滅菌ピペットチップで穏やかに突き出すことによってエラストマーが完全に硬化していることを確認してください。
  4. 300 μLの70%エタノール(絶対エタノールとエンドトキシンフリー水で作られる)を加え、RTで1時間インキュベートし、エタノールを取り除き、エンドトキシンフリーの水を300μLを各ウェルに加え、1時間(3回)、12時間インキュベートしてエンドトキシンフリーの水を補給する。、および24時間を使用して、残りの溶媒を除去する。
    1. エンドトキシンフリー水を各プレートの3つのウェルに200μLインキュベートし、エンドポイント発色性エンドトキシンアッセイを用いて水抽出物のエンドトキシン濃度を測定する(ステップ2.5.1−2.5.6)。

4. フッ素ポリ(テトラフルオロエチレン)を用いたコーティング細胞培養表面

  1. フッ素化ポリ(テトラフルオロエチレン)(fPTFE)の1mg/mL溶液を20mLガラスシンチレーションバイアルに10mLのフッ素系溶媒[材料表])に加えます。磁気攪拌棒をバイアルに入れ、すべての固体が溶解するまで少なくとも24時間攪拌するようにします。
  2. ポリスチレン48ウェルプレートの各ウェルに約150μLのポリマー溶液を添加する(すなわち、処理された組織培養ではない)。ウェルプレートをゆっくりと傾けて、ポリマー溶液ですべての井戸の完全なカバレッジを確保します。蓋を交換してください。
    1. ウェルの効果的なfPTFEコーティングを確保するために、ガラスカバーリップはfPTFEでコーティングし、水接触角測定に使用する必要があります(ステップ4.3.1)。カバーリップを24ウェルプレートの井戸の中に置きます。カバースリップを含む各ウェルに約400μLのポリマー溶液を加えます。滅菌鉗子を使用してカバーリップを押し下げ、ポリマー溶液で完全に覆われていることを確認し、ウェルプレートを蓋で覆います。
  3. ポリマー溶液やカバーリップを入れたウェルプレートを、50cmHg、40°Cに設定された真空オーブンに入れます。ふたを取り外し、単一のふき取りで覆い、他の破片が井戸に落ちるのを防ぎます。少なくとも48時間インキュベートすることを許可します。
    1. 効果的なコーティングを確保するために、ゴニオメータでfPTFEコーティングされたカバーリップの水接触角度を測定します。
      注:水接触角測定には、最も純度の高い水(例えば、ガラストリプル蒸留)のみを使用する必要があります。
  4. 300 μLの70%エタノール(絶対エタノールとエンドトキシンフリー水で作られる)を加え、RTで1時間インキュベートし、エタノールを取り除き、エンドトキシンフリーの水を300μLを各ウェルに加え、1時間(3回)、12時間インキュベートしてエンドトキシンフリーの水を補給する。、および24時間を使用して、残りの溶媒を除去する。
    1. エンドトキシンフリー水を各プレートの3つのウェルに200μLで1時間インキュベートし、エンドポイント発色性エンドトキシンアッセイを用いてエンドトキシン濃度の水抽出物を測定する(ステップ2.5.1−2.5.6)。
  5. UVは、細胞培養実験の前に30分間ウェルプレートを殺菌します。

5. 3T3細胞からリサートを作る

  1. 複数のT150フラスコで3T3細胞を70%の合流に成長させる。細胞を剥離するには、吸引媒体、5mLのPBSで表面を洗浄し、PBSを吸引する。5 mL の動物起源のない組換え細胞解離酵素 (材料の表) を加え、37 °C で 3~5 分間インキュベートします。
  2. フラスコを前後にゆっくりと傾けて細胞を切り離します。5 mL の PBS を加え、細胞解離に使用する組換え酵素を中和します。継ぎ取った細胞をフラスコから遠心管に移し、ピペットで混ぜます。ヘモサイトメーターと細胞生存率色素を使用して生細胞数を実行します。
    注:PBSにおける希釈を介して中和できる細胞解離酵素を選択し、溶解物調製物中の血清系タンパク質の導入を回避した。トリプシンを使用して細胞を解剖する場合は、血清含有溶液で中和する必要があり、溶解物調製物に持ち越される血清タンパク質の量を減らすために追加のPBS洗浄を行う必要があります。
  3. 細胞を200 x gで5分間遠心分離し、PBSの元の体積(すなわち、10 mL x個のフラスコ)で細胞を吸引し、残りの媒体を洗い流します。繰り返します。
  4. 細胞を200 x gで5分間遠心分離し、上清を吸引する。1 x 106セル/mLの最終的な細胞濃度を達成するために必要なPBSの体積を追加します。試料が完全に凍結するまで(少なくとも2時間)、細胞溶液を-80°Cの冷凍庫に入れます。
  5. 37°水浴でセル溶液を解凍します。完全に解凍したら、溶液を-80°Cの冷凍庫に戻し、完全に凍結します。合計 3 つのフリーズ 解凍 サイクルに対してこの手順を繰り返します。
  6. 種々の希釈液(例えば、1/100、1/200、1/500、1/1000)で細胞リサート上でマイクロビシンコニン酸(BCA)アッセイを行い、タンパク質濃度を決定する。細胞リサートをタンパク質濃度468.75μg/mLに希釈し、アリコート、および将来の使用のために-80°Cで保存します。
    注:48ウェルプレート中の最終的なタンパク質濃度は125μg/cm2です(1ウェルの表面積に基づき、0.75cm2)。
  7. ウェスタンブロットを実行して、溶解物中のDMPの存在を評価し(例えば、ヒートショックタンパク質60[HSP60]、高移動度グループボックス1[HMGB1])、ローディングバッファに40-60 μgの溶解タンパク質をローディングして1.5mm厚の10%ポリアクリルアミドゲルにロードし、標準的なウェスタンブロットに従う手順。

6. マクロファージのNF-κB活性に対する吸着タンパク質層およびトール様受容体の影響評価

注:実験ワークフローとプレートレイアウトの概略については、それぞれ図1Aおよび補足図1を参照してください。

  1. レポーターマクロファージを適切なサイズのフラスコで70%の合流に成長させます。吸引媒体、PBSで表面を洗浄し、PBSを吸引する。組換え細胞解離酵素を加え、37°Cで8分間インキュベートします。
  2. フラスコの側面をしっかりとタップしてセルを切り離します。同じ量の増殖媒体(10%FBSを含む)を添加することにより、組換え細胞解離酵素を不活性化する。ヘモサイトメーターと細胞生存率色素を使用して生細胞数を実行します。
    注:細胞解離酵素における8分間のインキュベーション後のレポーターマクロファージの期待される生存率は90%である。
  3. 200 x gの遠心分離細胞を5分間吸引し、細胞を洗浄するためにPBSの元の容積で再サスペンドする。再び遠心分離し、アッセイ媒体(熱不活化FBSを含む)で7.3 x 105細胞/mLで細胞を再サスペンドする。
  4. 細胞懸濁液を3つの異なるチューブに分離する:TLR4阻害剤、抗TLR2、および未処理。RTで60分間、またはRTで30分間50μg/mL抗TLR2で1μg/mL TLR4阻害剤を有する細胞をインキュベートします。
  5. 200 μL の溶解物、10% FBS、10% 市販のマウス プラズマ (材料表)、またはタンパク質溶液の混合物を 48 ウェルプレート (または同等) に加え、タンパク質が所望の時間 (つまり、30 分、60 分、または 24 時間) 37 °C で吸入できるようにします。井戸からタンパク質溶液を吸引し、タンパク質溶液ごとに新鮮なパスツールピペットを使用し、250μLのPBSで表面を5分間洗浄します。合計 3 つのワッシュに対して繰り返します。
    注:このステップは、必要な吸着時間に応じて、プロトコルの早い段階で開始する必要があります。それに応じてプロトコルを調整します。
  6. TLR4阻害剤または抗TLR2を用いてインキュベーション期間を経て、ピペット細胞を再中断する。各ウェルに200°Lのセル溶液を加えます。
  7. TLR2陽性対照条件の場合は、Pam3CSK4 を最終濃度 150 ng/mL に加えます。TLR4陽性対照条件の場合は、リポ多糖(LPS)を最終濃度1.5μg/mLに加えます。細胞を37°Cで20時間インキュベートする。
  8. 各ウェルとプレートから20μLの上清を96ウェルプレートに複製してサンプル。20 μL アッセイ メディアの 3 つのウェルをバックグラウンド コントロールとして含めます。SEAPレポーターアッセイ試薬200μLを各ウェルに加えます。粘着シールでプレートを覆い、37°Cで2.5時間インキュベートします。
    注:インキュベーション時間は実験条件によって異なる場合があり、正と負のコントロールウェル間の吸光度の強い差に最適化する必要があります。
    1. 上清の残りを1.5mLチューブ(ウェル当たり)に移します。1,000 x gで10分間遠心分離機を使用し、破片をペレット化します。新しい1.5 mLチューブに上清を移し、-80°Cで保存します。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を介して炎症性サイトカイン(例えば、TNF−α、インターロイキン6)の存在について上清を分析する。
  9. 粘着プレートシールを取り外します。635 nmのプレートリーダーを使用してプレートの吸光度を読み取ります。吸引液と廃棄プレート。

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Representative Results

ポリマー被覆面の洗浄方法を試験し、コーティングの中断がないことを確認した。PMMA被覆顕微鏡スライドを70%エタノールに1時間浸漬してPMMAコーティング(図2、左パネル)を除去することが分かり、80重量%エタノール13におけるPMMAの溶解度に起因する可能性が高く、従ってPMMA被覆面を30分間のUV殺菌だけで洗浄した。コーティングのためのPMMAの濃度は、以前に最適化された5.1時間70%のエタノール浸漬をPDMSの洗浄に用い、UV光が鎖の分裂を引き起こし、PDMS14の表面湿潤特性に影響を与える可能性があるため、紫外線殺菌は無視された。70%エタノール浸漬および紫外線殺菌の両方がfPTFE被覆カバーリップの水接触角に影響を及ぼさなかった(図2、右パネル)のしたがって、2つの方法は、連続して、fPTFEコーティングをきれいにするために使用された。fPTFEコーティングの方法は、先にグレインジャー群15によって説明した。

3T3溶解物に対してウェスタンブロットを行い、複合分子混合物中にDAMP種が存在することを確認した。その結果、HMGB1とHSP60の両方が、よく文書化された2つのダプ16、17、溶解物中に存在していたことが示された(1B)。ポリマー表面上のリサートからのTLRリガンドの吸着は、レポーターマクロファージを培養することによって確認した(未処理、 TLR2中和、またはTLR4阻害)は、タンパク質吸着ポリマー表面上で20時間(すなわち、組織培養処理ポリスチレン[TCPS]、PMMA、PDMS、fPTFE)、そして酵素アッセイを用いたSEAP産生に基づくNF−аB/AP-1活性を間接的に評価する(図1および図3)。さらに、レポーターマクロファージは、吸着したFBSまたは血漿および事前吸着タンパク質(メディア)と比較して、吸着溶解物に対するNF−аB/AP−1活性を有意に増加させた(図4)。TLRリガンド合成トリアシル化リポペプチド(Pam3CSK4,TLR2リガンド)およびリポ多糖(LPS、TLR4リガンド)は、抗体または阻害剤を確認するための陽性対照として含まれ、アッセイは適切に働いていた。TLR2中和は、TLR4阻害と比較して溶解物を吸着するレポーターマクロファージのNF−аB/AP-1応答の著しく強い減少を示した。同様に、少量の溶解物を血清中で希釈(全タンパク質に基づく)は、血清単独と比較してNF−B/AP-1応答を有意に増加させ、ポリマー表面に依存する最も低い有効希釈を有する(図5)。これらの結果は、様々なポリマー表面上のレポーターマクロファージにおけるTLR依存性NF-а-b/AP-1活性を誘導する際に吸着溶解した溶解物由来分子の効力を示す。

Figure 1
図1:TCPS、PMMA、PDMS、およびfPTFEにおけるNF-аB/AP-1レポーターマクロファージのアルカリホスファターゼアッセイの方法および結果(A)レポーターマクロファージアルカリホスファターゼアッセイのワークフローの図。(B)DAMP種HMGB1およびHSP60の存在を確認するウェスタンブロットの溶解物は、β-アクチンをローディング制御として有する。(C)NF-аB/AP-1活性(吸光度で表される)メディア(陰性対照)で培養したレポーターマクロファージの活性(負の対照)、10%FBS、溶解物、およびPam3CSK4(TLR2リガンド、陽性対照)の20時間のデータは、1つの実験の結果を示し、平均±標準偏差(SD)として示す少なくとも2つの別々の実験からの結果を代表する。各実験は、条件ごとにn=3つの別々の井戸を使用し、各ウェルは酵素アッセイのために複製してめっきされた。一方向ANOVAおよびTukeyポストホックテストを用いて分析した。p < 0.001.この図は、マッキールとフィッツパトリック5からの許可を得て適応されています。著作権2018アメリカ化学会。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:PMMA-およびfPTFE被覆面の洗浄方法の最適化を、水接触角(WCA)を用いて評価した。測定は、少なくとも3つのカバースリップの2つの別々のスポットで行った。データは平均±SDとして表示されます。* p < 0.05.この図は、マッキールとフィッツパトリック5からの許可を得て適応されています。著作権2018アメリカ化学会。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:10%FBS(対照)、溶解物、および20時間の陽性対照で培養したレポーターマクロファージのTLR媒介NF-аB/AP-1活性(吸光度で表される)。(A)吸着分解物に対するレポーターマクロファージ応答に対するTLR2中和の影響陽性対照はパム(Pam3CSK4、TLR2リガンド)である。(B)吸着溶解物に対するレポーターマクロファージ応答に対するTLR4阻害の影響正の制御は LPS (TLR4 リガンド) です。データは、1つの実験の結果を示し、平均±SDとして示される少なくとも2つの別々の実験からの結果を代表する。各実験は、条件ごとにn=3つの別々の井戸を使用し、各ウェルは酵素アッセイのために複製してめっきされた。一方向ANOVAおよびTukeyポストホックテストを用いて分析した。** p < 0.01, *** p < 0.001.この図は、マッキールとフィッツパトリック5からの許可を得て適応されています。著作権2018アメリカ化学会。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:メディア(陰性対照)で培養したレポーターマクロファージのNF−n-nB/AP-1活性(吸光度で表される)、30分および24時間吸着タンパク質層、および20時間TCPS上のPam3CSK4(陽性対照)。データは3つの別々の実験から結合され、平均±SDとして示される。各実験は、条件ごとにn=3つの別々のウェルを使用し、各ウェルは酵素アッセイのために複製してめっきされた(すなわち、n=9非独立細胞培養井戸およびn=18非独立酵素アッセイウェル)。一方向ANOVAおよびTukeyポストホックテストを用いて分析した。p < 0.001.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:FBS中の溶解物の希釈に応答して20時間後にレポーターマクロファージNF-аB/AP-1活性(吸光度で表される)(総タンパク質=280μg/well)をポリマー表面に30分間吸着した。(A) TCPS.(B) PMMA.(C) PDMS.(D) fPTFE.データは、1つの実験の結果を示し、平均±SDとして示される少なくとも2つの別々の実験からの結果を代表する。各実験は、条件ごとにn=3つの別々の井戸を使用し、各ウェルは酵素アッセイのために複製してめっきされた。一方向ANOVAおよびTukeyポストホックテストを用いて分析した。* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.この図は、マッキールとフィッツパトリック5からの許可を得て適応されています。著作権2018アメリカ化学会。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Supplemental Figure 1
補足図1:8チャンバーおよび48ウェルプレートフォーマットにおけるNF-аB/AP-1レポーターマクロファージ細胞培養アッセイに使用されるレイアウトの例。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

私たちの研究室の主な焦点は、固体生体軟組織インプラントに対する宿主応答であり、特に移植手順中に生じた細胞損傷が宿主応答にどのような影響を与えるかである。ここで提示する研究は、レポーターマクロファージ細胞株とインビトロ生成DAMP含有細胞リサートを用いた予備実験について説明し、細胞損傷中に放出される分子の影響(すなわち、インプラント手術から)が生体材料に対するマクロファージ応答に及ぼす影響を調べる。線維芽細胞リサートは、生体材料の配置によるMMPの細胞損傷および放出をモデル化するために使用された。線維芽細胞は、軟部組織における線維芽細胞の蔓延、ならびにフィブロネクチン18を含む様々な細胞外マトリックス(ECM)タンパク質を分泌する能力のために、リジン酸塩を作成するために選択された。凍結融解サイクリングは、インプラント環境に存在するものと同様に、細胞内およびECM由来のDampの両方を生成するリシスの方法として選択された。プロテアーゼ阻害剤は、このリサートを作るために使用されなかった.凍結融解サイクリングのような制御されていない細胞分解は、Dammpを分解する可能性のあるプロテアーゼの放出をもたらす可能性がありますが、これらの酵素は、移植手順中に細胞が損傷を受けた場合に生体材料インプラント環境にも存在する可能性があります。溶解物の複合分子混合物中のDMPの存在は、ウェスタンブロットによって確認された(1B;HMGB1 および HSP60) および SEAP レポーターアッセイ (図 1C;吸着溶解物に応答するNF-n-B/AP-1活性)。また、全タンパク質濃度に基づいてFBSでリサートを希釈し、細胞培養表面に吸着してインプラント環境の複雑さを反映させるアッセイを行いました(図5)。レポーターマクロファージNF-аB/AP-1活性は、FBSで希釈された溶解物からの吸着層で有意に増加したままであり、有意な活性化を達成するための最も低い希釈は、0.1%(TCPS)から10%(PDMSおよびfPTFE)の範囲で表面依存であった。

ポリマーPMMA、PDMS、およびPTFEは、彼らが分解性がなく、生体材料19、20、21、22、23、24、25に対するタンパク質吸着およびマクロファージ応答を評価するために文献で広く使用されているため、この作品のために選ばれました。TCPSは、インビトロマクロファージおよびTLRシグナリング作業21、26、27、28に使用される共通の基板であるため比較にも使用された。当社の研究で用いられる材料は、非分解性固体生体材料の代表的な例です。しかし、材料を細胞培養プレートまたは顕微鏡スライドにコーティングし、適切に除染することができる場合は、このモデルで他の多くの材料を使用することができます。NF-κB/AP-1レポーターマクロファージ細胞株は、SEAPのNF-κB/AP-1誘導発現を介したNF-κB/AP-1活性の迅速かつ間接的な測定を可能にするため、このインビトロモデルに対して選択された。NF-κB/AP-1レポーターマクロファージは、NF-b/AP-1誘導性SEAP遺伝子を有する細胞のみが存在することを保証するために、選択的抗生物質として培養媒体中のフレオマイシンD1を使用する必要がある。アルカリホスファターゼアッセイでは、血清中に存在するアルカリホスファターゼによって生成される潜在的な偽陽性結果を避けるために、細胞培養媒体中にHI-FBSを使用することが重要です。これまでの研究では、FBS吸着面は検出可能な偽陽性の結果を生成しないことを示唆しています。アルカリホスファターゼアッセイのレポーターマクロファージ(20時間)、アッセイインキュベーションタイムポイント(2.5時間)、吸光度読み取り波長(635nm)の培養時間ポイントを、すべての条件に対して堅牢で再現性の高い測定を保証するために最適化されました。

タンパク質吸着文献における一般的な使用(1C)30、31、32、33、34に起因する30分の初期タンパク質吸着タイムポイントが、この作品に選ばれました。しかし、我々はまた、より長い吸着時間(すなわち、60分および24時間、図4)を、マクロファージが生体内で相互作用する吸着タンパク質層をよりよく表すために、移植1の後に4−24時間が起こりそうなことを検討した。タンパク質の吸着および交換の大部分は、表面26、35、36への曝露の最初の60分で起こると仮定されているので、60分の吸着時間がより関連性の高いタイムポイントであり得る。また、吸着タンパク質層内のダプ質の存在を市販のマウスプラズマに対する負のコントロールとしてFBSを使用することから移行しました。血清の代わりに血漿を使用する根拠は、血漿タンパク質がタンパク質吸着およびマクロファージ応答1において重要な役割を果たすることが知られており、血漿が創傷環境におけるタンパク質のより良い表現を提供することである。タンパク質吸着実験で使用される血漿は、一般的に1−10%希釈26、36、37として調製され、10%の血漿の使用を動機づけました。ヒト血漿は、マウス血漿に比べて大量に、より臨床的に関連するので、一般的に26、36が使用される。しかし、このモデルでは市販のマウスプラズマを使用して、タンパク質溶液の種をレポーター細胞の種と一致させ続けることを選択しました。

レポーターマクロファージ細胞株の使用は、研究内でいくつかの制限を導入しました.まず、マウス白血病マクロファージ細胞株を用いると、表現型および行動が一次マクロファージ培養物とは異なる場合があるため、固有の制限がある。この制限は、一次マクロファージを用いた将来の作業で取り組むが、親マクロファージ細胞株は、細胞表面受容体およびTR2、3および438の微生物リガンドに対する応答の観点からマウス骨髄由来マクロファージを密接に模倣することが示された。さらに、NF−κB/AP−1レポーターマクロファージは、腹腹原一発マウスマクロファージ39と比較した場合、HMGB1およびLPS刺激に応答して同様の結果をもたらした。なお、NF−κB/AP-1レポーターマクロファージは、その親株と、TLR540を発現しないことに留意すべきである。研究者は、HMGB1がヒトTLR541で安定にトランスフェクトされたHEK-293細胞におけるTLR5シグナル伝達経路を介してNF-κB転写因子を活性化することができたことを実証した。したがって、リサーテ被覆面における全体的なNF-κB活性に対するHMGB1-TLR5シグナル伝達の寄与は、このモデルでは無視された。さらに、レポーターマクロファージおよびその親株はASCアダプタタンパク質を発現せず、その結果、ほとんどのタイプの炎症性タンパーソームを形成せず、不活性IL-1βまたは不活性IL-18を成熟形態42に処理することができない。したがって、我々が使用したモデルは、ASC依存性炎症活性およびリサート吸着面に対するマクロファージ応答におけるその後のオートクリンIL-1βおよびIL-18シグナル伝達の寄与を考慮していない。したがって、このアッセイはTLR依存性NF-κB活性化の予備検討として意図されており、一次マクロファージを用いたその後の研究は、目的の物質表面におけるマクロファージ活性化および表現型のより完全かつ代表的な理解を提供することを推奨する。

アルカリホスファターゼアッセイは、レポーターマクロファージのNF-аB/AP-1活性を間接的に測定する。しかしながら、NF−аB/AP-1を含むTR以外の多くのシグナル伝達経路がある(例えば、インターロイキン-1受容体[IL-1R]43および腫瘍壊死因子受容体[TNFR]44)。したがって、阻害アッセイを用いて溶解吸着面に対するNF-b/AP-1応答の増加におけるTLR2およびTLR4シグナル伝達の寄与を評価する必要があった(図3)。これら2つの表面TRRを選択する根拠は、TLR2およびTLR445を介してシグナル化することが示された少なくとも23個のDRP(よく特徴付けられたHMGB1を含む)であり、両方の受容体が細胞表面上で発現され、生体材料表面6と直接相互作用することができる。TLR2およびTLR4阻害アッセイは、TLR2またはTLR4シグナル伝達が遮断された場合、溶解物を吸着するレポーターマクロファージのNF−аB/AP-1応答が減少し、両方の経路が関与していることを示した。しかし、TLR2シグナル伝達が中和されたときのNF-аB/AP-1活性の著しい減少は、TLR2が溶解物を吸着するレポーターマクロファージの応答において主要な役割を果たす可能性があることを示唆した。我々は、TLRシグナル伝達経路中和抗体および阻害剤を用いて、何らかのオフターゲット阻害がある可能性があることを認識する。中和抗体は、この研究の時点で市販のTLR2阻害剤分子がなかったため、TLR2経路を阻害するために使用された。

ここで提示する方法は、DMPの複雑な供給源として溶解物を使用し、ポリマーバイオマテリアルに吸着したDMPおよび他のタンパク質に対するマクロファージ応答のためのインビトロモデルとしてNF-κB/AP-1レポーターマクロファージを使用する(図1)。当社のプロトコルは、さまざまな材料(分解性材料、多孔質足場またはヒドロゲルを含む)および吸着タンパク質層に対するレポーターマクロファージのNF-κB/AP-1応答および上流TLRシグナル伝達を迅速に分析するために使用できることを期待しています(図3)。しかし、多孔質材料とヒドロゲルの使用は、吸着分子と包まれた分子を区別することが困難な場合があるため、システム内で複雑さを引き起こす可能性があります。我々はまた、このプロトコルが適切な阻害剤を用いてNF−−−−−−AP−1上流の他のシグナル伝達経路(例えば、C型レクチン受容体46およびヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン(NOD)様受容体47)の寄与を調べるために容易に適応することができることを期待する。さらに、レポーターマクロファージのNF-κB/AP-1応答は、異なる材料間で比較することができ、応答がベースライン細胞活性に正規化され(すなわち、事前吸着タンパク質を有しない各表面の媒体中の細胞)およびすべての材料が検出不能なエンドトキシンレベルを有する。

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Disclosures

著者たちは何も開示する必要はない。

Acknowledgments

著者らは、カナダ保健研究プロジェクト(PTJ 162251)、クイーンズ大学上院諮問委員会、カナダイノベーション財団ジョン・エヴァンのリーダーシップ基金(プロジェクト34137)および研究革新オンタリオ研究基金(プロジェクト34137)からのインフラ支援からの運営資金を感謝して認めています。L.A.M.は、クイーンズ大学R.サミュエル・マクラフリン・フェローシップ、カナダカナダ大学院奨学金修士賞、オンタリオ州大学院奨学金の自然科学・工学研究評議会の支援を受けました。著者たちは、NF-κB/AP-1レポーターマクロファージ細胞株とマイケル・ブレナーハセット博士とサンドラ・ロウレンセン博士のゲルイメージングシステムとプレートプレートの使用に対する寛大な贈り物に対するマイロン・シェフツク博士に感謝したいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
anti-mouse/human CD282 (TLR2) Biolegend 121802
CLI-095 (TLR4 inhibitor) Invivogen TLRL-CLI95
C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin InnovativeResearch IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml Mouse plasma
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Sigma Aldrich D6429-500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Fisher Scientific 14190250 No calcium, no magnesium
Fetal bovine serum (FBS), research grade Wisent 98150
LPS-EK Invivogen TLRL-EKLPS Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12
NIH/3T3 fibroblasts ATCC CRL-1658
Pam3CSK4 Invivogen tlrl-pms Synthetic triacylated lipopeptide - TLR1/2 ligand
Penicillin/streptomycin Sigma Aldrich P4333-100ML
Plasmocin Invivogen ANT-MPP Mycoplasma elimination reagent
RAW-Blue cells Invivogen raw-sp NF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line
Trypan blue solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061
TrypLE express enzyme (1X) Fisher Scientific 12604021 animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme
Zeocin Invivogen ANT-ZN-1
Kits and assays
ELISA precoated plates, mouse IL-6 Biolegend B213022
ELISA precoated plates, mouse TNF-α Biolegend B220233
Endotoxin (Escherichia coli) - Control standard endotoxin (CSE) Associates of Cape Cope Inc. E0005-5 Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay
LAL water, 100 mL Associates of Cape Cope Inc. WP1001 Used with chromogenic endotoxin assay
Micro BCA protein assay Fisher Scientific PI23235
Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit Associates of Cape Cope Inc. C1500-5 Chromogenic endotoxin assay reagent
QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium Invivogen rep-qb2 Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity
Polymeric coating reagents
Chloroform, anhydrous Sigma Aldrich 288306-1L
Ethyl alcohol anhydrous Commercial Alcohols P006EAAN Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L
Straight tapered fine tip forceps Fisher Scientific 16-100-113
Fluorinert FC-40 solvent Sigma Aldrich F9755-100ML Fluorinated solvent for fPTFE
Cell culture grade water (endotoxin-free) Fisher Scientific SH30529LS
Poly(methyl methacrylate) (PMMA) Sigma Aldrich 182230-25G
Sylgard 184 elastomer kit Fisher Scientific 50822180
Teflon-AF (fPTFE) Sigma Aldrich 469610-1G Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene]
Consumables
Adhesive plate seals Fisher Scientific AB-0580
Axygen microtubes, 1.5 mL Fisher Scientific 14-222-155
Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps Fisher Scientific 03-337-4
Clear PS 48-well plate Fisher Scientific 08-772-52
Clear TCPS 96-well plate Fisher Scientific 08-772-2C
Clear TCPS 48-well plate Fisher Scientific 08-772-1C
Cover glasses, circles Fisher Scientific 12-545-81
Falcon tissue culture treated flasks, T25 Fisher Scientific 10-126-10
sticky-Slide 8 Well Ibidi 80828
Superfrost microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
Tissue culture treated flasks, T150 Fisher Scientific 08-772-48

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