Chlorure de vinyle et régime riche en matières grasses comme modèle d'interaction avec l'environnement et l'obésité

Medicine
 

Summary

Le but de ce protocole était de développer un modèle murin d'exposition toxique de bas niveau qui ne cause pas des dommages manifestes de foie mais exacerbe plutôt les dommages préexistants de foie. Ce paradigme récapitule mieux l'exposition humaine et les changements subtils qui se produisent lors de l'exposition à des concentrations toxiques qui sont considérées comme sûres.

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Lang, A. L., Goldsmith, W. T., Schnegelberger, R. D., Arteel, G. E., Beier, J. I. Vinyl Chloride and High-Fat Diet as a Model of Environment and Obesity Interaction. J. Vis. Exp. (155), e60351, doi:10.3791/60351 (2020).

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Abstract

Le chlorure de vinyle (VC), un contaminant environnemental abondant, cause la stéatohépatite à des niveaux élevés, mais est considéré comme sûr à des niveaux inférieurs. Bien que plusieurs études aient étudié le rôle du VC en tant qu'hépatotoxicant direct, le concept que VC modifie la sensibilité du foie à d'autres facteurs, tels que la maladie de foie gras non alcoolique (NAFLD) provoquée par le régime à haute teneur en graisses (HFD) est nouveau. Ce protocole décrit un paradigme d'exposition pour évaluer les effets de l'exposition chronique à faible niveau au VC. Les souris sont acclimatées à un régime faible en gras ou riche en matières grasses une semaine avant le début de l'exposition par inhalation et restent sur ces régimes tout au long de l'expérience. Les souris sont exposées au VC (niveau sous-OSHA : 1 ppm) ou à l'air de la pièce dans les chambres d'inhalation pendant 6 heures/jour, 5 jours/semaine, jusqu'à 12 semaines. Les animaux sont surveillés chaque semaine pour la prise de poids corporelle et la consommation alimentaire. Ce modèle d'exposition au VC ne cause aucune lésion manifeste au foie avec l'inhalation de VC seule. Cependant, la combinaison de VC et de HFD améliore de manière significative la maladie de foie. Un avantage technique de ce modèle de co-exposition est l'exposition du corps entier, sans retenue. En outre, les conditions ressemblent plus étroitement à une situation humaine très commune d'une exposition combinée au VC avec la maladie hépatique non alcoolique fondamentale et soutiennent donc l'hypothèse originale que VC est un facteur de risque environnemental pour le développement des dommages de foie comme complication de l'obésité (c.-à-d., NAFLD). Ce travail remet en question le paradigme selon lequel les limites actuelles d'exposition du CR (professionnel et environnemental) sont sûres. L'utilisation de ce modèle peut jeter un nouvel éclairage et des préoccupations sur les risques d'exposition au CR. Ce modèle de lésions hépatiques induites par des substances toxiques peut être utilisé pour d'autres composés organiques volatils et pour étudier d'autres interactions qui peuvent avoir un impact sur le foie et d'autres systèmes d'organes.

Introduction

De nombreux substances toxiques sont présentes dans l'air que nous respirons à des niveaux très bas. Le chlorure de vinyle (VC) est un gaz monomérique utilisé par l'industrie pour créer des produits en plastique en polyvinyle chlorure (PVC)1. Il s'agit d'un hépatotoxicologique environnemental prédominant, cancérogène connu, et est classé #4 sur la liste des substances dangereuses ATSDR2. Pour mieux comprendre les effets toxiques sur la santé humaine et les interactions avec les comorbidités existantes, il est crucial d'établir des modèles d'exposition qui imitent l'exposition humaine. L'intérêt principal de ce groupe est d'étudier les effets hépatiques de l'exposition chronique de VC à de faibles concentrations. VC exerce ses principaux effets sur le foie, où il a été montré (à des concentrations élevées) pour causer la stéatose, et la stéatohépatite toxicant-associée (TASH) avec nécrose, fibrose, cirrhose3,4, ainsi que le carcinome hépatocellulaire (HCC) et l'hémangiosarsarcome hépatique par ailleurs extrêmement rare5. TASH a probablement existé dans la population pendant des décennies, mais est resté non caractérisé et sous-estimé par les enquêteurs4,6. À la suite de recherches démontrant les préoccupations directes en matière de toxicité de l'exposition au CR, l'Administration de la sécurité et de la santé au travail (OSHA) a abaissé le seuil d'exposition acceptable à 1 ppm au cours d'une journée de travailde 8h 7 . Bien que le seuil d'exposition ait été abaissé, l'effet de cette concentration de CR sur la santé humaine n'est pas clair7. En outre, l'effet de l'exposition au CR sur les comorbidités existantes, comme les maladies du foie, est largement inconnu8. Ce manque de connaissances est particulièrement important aujourd'hui en raison de la prévalence mondiale croissante de la stéatose hépatique non alcoolique (NALFD)4,7,9,10,11,12. Fait important, vc de vc a récemment été montré pour être un facteur de risque indépendant pour l'affection hépatique d'autres causes13. L'objectif de ce protocole était donc de développer un modèle d'inhalation pertinent pour l'exposition au substance toxique volatile de l'environnement, le VC dans le contexte des lésions hépatiques sous-jacentes, afin d'imiter l'exposition humaine et d'identifier les mécanismes potentiels et nouveaux des lésions hépatiques induites par le VC ou améliorées par le VC.

La principale voie d'exposition pour de nombreux substances toxiques et polluants environnementaux est l'inhalation. Une fois inhalé, le composé peut entrer dans la circulation systémique à travers les poumons, Voyage au foie, et devenir métaboliquement activé par des enzymes hépatiques avant d'être excrété14,15,16. Ce sont souvent ces métabolites actifs qui causent la toxicité et les dommages dans le corps. Des études antérieures menées par ce groupe et d'autres ont utilisé des métabolites de VC comme substituts pour l'exposition au gaz VC17,18. D'autres groupes ont utilisé des modèles d'inhalation de CR; cependant, des niveaux d'exposition extrêmement élevés (à partir de 50 ppm) ont été mis en œuvre pour induire une toxicité aigue, des lésions hépatiques graves et le développement tumoral19. Bien que ces études aient fourni des informations et des mécanismes cruciaux de cancérogénicité induite par le VC, elles ne récapitulent pas les effets subtils et les interactions complexes avec d'autres facteurs contributifs et sont donc moins pertinentes pour l'exposition humaine.

Le modèle d'inhalation de VC et de régime riche en graisses (HFD) décrit ici (voir la figure 1 pour la chronologie), est le premier modèle d'exposition chronique à faible dose de VC (c.-à-d., concentration de sous-OSHA), dans lequel les souris sont exposées au toxique dans des conditions qui imitent l'exposition humaine beaucoup plus étroitement. En effet, les données de ce modèle ont récapitulé les résultats observés chez l'homme exposés au VC, tels que l'impact sur les voies métaboliques20, le stress oxydatif et le dysfonctionnement mitochondrial4. D'autres modèles murins d'inhalation, tels que les modèles de tête seulement et de nez seulement21,exigent que l'animal soit retenu, causant le stress à l'animal. Ici, cette méthode d'exposition du corps entier ne nécessite pas d'injection ou de stress inutile pour les animaux. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau et sont placés dans la plus grande chambre d'inhalation pour un nombre déterminé d'heures par jour et jours par semaine. De plus, le concept selon lequel le VC modifie la sensibilité à un autre hépatotoxique est une conclusion nouvelle, démontrée pour la première fois par ce groupe12 et a des répercussions sur l'exposition au VC à des concentrations bien inférieures à celles nécessaires à l'hépatotoxicité directe.

Cette méthode d'exposition par inhalation peut être utilisée pour imiter l'exposition à une variété de substances toxiques gazeuses, y compris d'autres composés organiques volatils, présents dans notre environnement. En effet, les composés organiques volatils constituent un grand groupe de substances toxiques pour l'environnement et sont plus répandus dans les régions industrialisées, ce qui fait que certaines populations sont plus à risque d'exposition chronique22. Ce protocole peut être modifié en fonction de différentes questions expérimentales. La durée et la concentration des composés administrés peuvent être modifiées. Bien qu'initialement développé pour la détermination des lésions hépatiques, d'autres systèmes d'organes peuvent et ont été étudiés avec ce modèle23. Les chercheurs qui visent à étudier les expositions chroniques avec des animaux, mais qui souhaitent minimiser le stress chez les animaux, devraient envisager d'utiliser ce modèle.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux et le CR ont été approuvées par le ministère de la Santé environnementale, la Safety Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care et les procédures ont été approuvées par le Comité local des soins et de l'utilisation des animaux en établissement.

1. Mise en place expérimentale et acclimatation aux régimes purifiés et expérimentaux

  1. Déterminer le nombre total de souris C56Bl/6J (minimum de 6 à 8 souris par groupe).
    REMARQUE : Les animaux de chaque groupe de régime seront subdivisés en groupes d'exposition. Assurez-vous de tenir compte du nombre total d'animaux nécessaires lors de la planification de l'étude.
  2. Identifiez et pesez les animaux. Enregistrez ces données.
  3. Passer du chow régulier au régime purifié à faible teneur en gras (LFD) ou à haute teneur en matières grasses (HFD) une semaine avant le début des expériences d'inhalation pour acclimater les souris aux nouveaux régimes (voir la figure 1 pour la chronologie).
  4. Fournir de la nourriture et de l'eau ad libitum. Surveiller la consommation alimentaire en pesant et en enregistrant les aliments à donner par cage, et en pesant et en enregistrant le reste de la nourriture à chaque jour d'alimentation. Si vous hébergez 4 souris par cage, fournissez 50 g de nourriture deux fois par semaine. Si vous hébergez 5 souris par cage, fournissez 60 g de nourriture deux fois par semaine.
    REMARQUE : Pendant l'alimentation des régimes purifiés, la quantité de nourriture doit être vérifiée chaque jour pour s'assurer que les souris ont suffisamment de granulés. S'il n'y a pas suffisamment de granulés, les souris ont tendance à « amasser » de la nourriture et à augmenter l'apport. En outre, en particulier le HFD a tendance à s'effondrer beaucoup plus que le LFD, provoquant un effet similaire.
  5. Surveillez les animaux tout au long de l'expérience pour s'assurer que la santé animale est maintenue.
    REMARQUE : Le gain de poids hebdomadaire et la consommation alimentaire, ainsi que la surveillance métabolique peuvent être faites pour fournir un indice de la santé animale globale.

2. Système d'exposition par inhalation de chlorure de vinyle

REMARQUE : Il existe de multiples systèmes d'exposition à l'inhalation disponibles sur le marché, allant de l'exposition « nez seulement » à l'exposition « corps entier » et manuelle aux systèmes automatisés. Les données précédemment publiées par ce groupe ont été dérivées d'un système manuel du corps entier12,23,24. Un diagramme décrivant le système automatisé d'exposition à l'inhalation est affiché à la figure 2.

  1. Veiller à ce que l'air diluant dans les chambres expérimentales et de contrôle soit de l'air particulaire à haut rendement (HEPA) et du carbone activé filtré, séché et sous pression réglé avant d'entrer dans leurs dispositifs de mesure du débit respectifs (contrôleur de débit de masse [MFC) ] chambre expérimentale, chambre de contrôle du rotamètre).
    REMARQUE : Dans la chambre de contrôle, le rotamètre régule le flux d'air vers les souris. L'air pénètre dans le haut de la chambre, passe par les souris, puis est épuisé sous les souris et passé à travers un filtre HEPA avant d'entrer dans le capot chimique. La température et l'humidité relative (RH) sont mesurées à l'intérieur de la chambre. Dans la chambre expérimentale, l'air diluant est mélangé à l'air d'un réservoir de VC. Les deux flux sont réglementés par des MFC. Le rapport des deux mélanges détermine la concentration de VC dans la chambre expérimentale. Le VC entre dans le haut de la chambre d'exposition par un disperseur avec sept jets qui pointent dans des directions différentes. Le VC passe par les souris et est ensuite épuisé par 12 ports distincts qui sont placés sous le support de la cage. Cette conception de chambre a été montrée pour fournir des concentrations toxiques homogènes précédemment25.
  2. Assurez-vous que la pression, la température et la RH sont surveillées à partir des chambres expérimentales et de contrôle.
  3. Confirmez que l'échappement de chambre passe à travers un filtre HEPA, une sonde CO2 et un filtre à carbone activé avant d'entrer dans la zone d'échappement du capot chimique et que le niveau de CO2 est surveillé pour s'assurer que les souris reçoivent une ventilation acceptable.
  4. Utilisez le logiciel personnalisé pour modifier, surveiller et enregistrer les variables environnementales pendant les expositions par inhalation.
    REMARQUE : Si un système manuel est utilisé, les variables décrites dans les étapes 2.1-2.4 doivent être surveillées et calibrées, si nécessaire régulièrement tout au long de la période d'exposition.

3. Mise en place de pré-exposition

  1. Éteignez tous les flux d'air dans les chambres expérimentales et de contrôle pour la sécurité des techniciens.
  2. Pour chaque chambre, ouvrez la porte de la chambre et placez le matériel de literie absorbant (côté absorbant vers le haut) sur le dessus de la casserole d'excréta. Mouillez le matériau absorbant pour fournir un niveau d'humidité confortable (40 à 60 % de RH) tout au long de la période d'exposition.
  3. Définir le niveau d'exposition souhaité de VC dans la chambre. Pour les concentrations de limites inférieures à l'OSHA, utiliser 0,85 ppm de VC. Utilisez soit le contrôle de rétroaction géré par le logiciel et basé sur le détecteur de la livraison de VC à la chambre ou utilisez des ajustements manuels au système.
    REMARQUE : Cette dernière approche exige la connaissance du volume de chambre, du taux de rafraîchissement de chambre, du débit d'air et du taux de livraison du gaz de VC de l'approvisionnement en stock ; ces calculs doivent ensuite être validés et calibrés par des mesures des concentrations de VC dans la chambre à l'état stable12,24. La technique la plus courante pour mesurer le VC dans la chambre est par l'analyse chromatographique de gaz de l'air d'échantillon12,24. Les avantages de l'approche axée sur le logiciel en ce qui concerne la précision et la précision de la livraison de VC sont clairs. Cependant, il a été démontré que l'approche manuelle est également précise et cohérente12,24.
    CAUTION: VC est un toxique connu et cancérogène à des niveaux élevés. Exercez un équipement de protection individuelle approprié et manipulez le gaz tout en allumant et en s'éteignant des chambres.

4. Cage d'exposition et préparation des animaux

  1. Retirez les souris de leurs chambres d'habitation et placez-les dans les cages individuelles du support de cage de chambre d'inhalation (un support de cage pour les souris témoins, un pour les souris exposées). Randomiser le placement de chaque souris dans le support de la cage tous les jours pour s'assurer que chaque souris est exposée de façon homogène dans la chambre d'exposition. Marquez le numéro et la position de placement de la cage de chaque animal dans le cahier de laboratoire.
  2. Placez chaque cage dans sa chambre respective et fermez les portes de la chambre.

5. Effectuer une exposition

  1. Assurez-vous que la soupape du réservoir d'essence VC est en position ouverte. Assurez-vous que le débit diluant de la chambre expérimentale est réglé à 25 L/min.
  2. Démarrer le flux de diluant dans la chambre expérimentale. Assurez-vous que le rotamètre de la chambre de commande est réglé à 25 L/min.
  3. Assurez-vous que tous les capteurs (flux, température, humidité, pression de la chambre, niveau CO2) fonctionnent correctement et affichent les résultats attendus dans les chambres expérimentales et de contrôle.
    REMARQUE : Le flux de VC est calculé et réglé en fonction du débit diluant et de la concentration de VC désirée.
  4. Assurez-vous que tout au long de l'exposition, dans la chambre expérimentale, le temps d'exposition, le débit diluant, le débit de VC, la température, l'humidité, la pression de chambre, le niveau de CO2 et la concentration théorique de VC sont affichés, graphiques et enregistrés. Confirmez que la température et l'humidité de la chambre de commande sont également affichées, graphiques et enregistrées.
    REMARQUE : Si un système manuel est utilisé, le flux de VC doit être vérifié et ajusté, au besoin, tout au long de la période d'exposition.
  5. Si des problèmes surviennent pendant l'exposition, placez le flux de VC à zéro et augmentez le débit diluant à sa valeur maximale pour purger rapidement la chambre.
  6. Une fois la durée d'exposition (c.-à-d. 6 h/jour) atteinte, le logiciel désactive automatiquement le flux VC. La minuterie de sécurité de 15 minutes commence alors pour le temps après la durée pour la chambre expérimentale pour effacer le VC. Une fois qu'il est sûr d'enlever les animaux, cliquez sur le bouton OK dans la boîte de dialogue. Le système cessera d'enregistrer les mesures du fichier et l'exposition est terminée.
    REMARQUE : Si un système manuel est utilisé, l'utilisateur doit désactiver manuellement le flux de VC à la fin de la durée d'exposition et le temps de l'autorisation de VC à la fin de l'exposition doit être calculé.

6. Post-exposition

  1. Tournez le robinet d'arrêt de la soupape pour le réservoir d'essence VC jusqu'à la position fermée et éteignez tous les flux d'air dans la chambre d'exposition. Tournez le rotamètre jusqu'à ce qu'aucun flux d'air ne circule dans la chambre de commande.
  2. Retirez les portes de chaque chambre pour fournir une ventilation aux souris. Retirer les supports de la cage des chambres. Sous une hotte, retirez les souris de leurs cages d'exposition et placez-les dans leurs cages d'habitation. Transportez toutes les souris dans leur salle d'habitation pour un logement de nuit dans des cages régulières.
  3. Éliminer les déchets de la casserole d'excréments dans un contenant de biorisque approuvé par le ministère de la Santé et de la Sécurité environnementales (DEHS), car ces déchets peuvent être considérés comme un danger chimique par les services institutionnels de santé environnementale. Nettoyez les portes de la chambre, le pan d'excréments, le support de cage d'exposition et la chambre d'exposition pour les systèmes expérimentaux et de contrôle.

7. Validation de la concentration de VC dans les chambres pendant l'exposition

  1. Effectuer une mesure de la concentration de VC dans la chambre expérimentale à mi-chemin de chaque exposition (3 h).
  2. Casser les pointes de verre sur un tube de détecteur VC et un tube de préretraite. Fixez l'extrémité de sortie du tube de détecteur de VC à la pompe de tube de détecteur. Fixez l'extrémité d'écoulement du tube de détecteur de VC à l'extrémité d'écoulement du tube de pretreat avec un court morceau de tube. Fixez un court morceau de tube à l'extrémité d'écoulement du tube de préretraite.
  3. Retirez un bouchon de l'un des ports d'échantillonnage qui se trouve près de la zone respiratoire des souris. Fixez le tube de l'extrémité de l'écoulement du tube de préretraite au port d'échantillonnage.
  4. De la pleine en position, étendre la poignée sur le piston de la pompe à tube détecteur à la position complète. Cela permettra d'extraire 100 ml de gaz échantillonné de la chambre dans le tube détecteur VC sur une période de 90 s. Après avoir attendu les 90 s, repoussez la poignée.
  5. Répétez l'étape 7.4 trois fois de plus de sorte qu'un total de 400 ml est tiré dans le tube de détecteur de VC.
  6. Retirez le tube du port d'échantillonnage de la chambre et réinsérez le bouchon dans le port. Inspecter le changement de couleur du tube de détecteur de VC pour vérifier la concentration de VC dans la chambre.
  7. Enregistrez la lecture du tube de détecteur de VC dans le cahier de laboratoire et comparez à la valeur théorique. Disposer du tube détecteur DE VC et du tube de préretraite dans un récipient approprié.

8. Fin de l'expérience d'exposition par inhalation

REMARQUE : Après le délai d'exposition souhaité, par exemple, 6, 8 et/ou 12 semaines après le début de l'exposition par inhalation, les expériences sont terminées et les animaux seront euthanasiés (voir la figure 1 pour la chronologie).

  1. Rapide les souris 4 h avant le moment de l'euthanasie.
    REMARQUE : Cette procédure permet la détermination des niveaux de glucose sanguin et d'insuline de jeûne pour l'analyse métabolique.
  2. Utilisez une approche d'euthanasie conforme aux directives de l'American Veterinary Medical Association (AVMA), comme l'anesthésie suivie de l'exsanguination.
  3. Administrer la kétamine/xylazine (100/15 mg/kg) par injection intrapéritonéale à chaque souris pour induire l'anesthésie.
    REMARQUE : Évitez le pentobarbital de sodium comme anesthésique pré-euthanasie, car l'exposition au chlorure de vinyle peut nuire à son efficacité.
  4. Recueillir le sang de la veine inférieure cava dans la solution de citrate de sodium (finale, 0,38%), pour prévenir la coagulation du sang et pour la préservation de l'échantillon.
  5. Retirer le foie et/ou tout autre organe désiré. Disséquer le foie et congeler les parties dans de l'azote liquide, incorporer dans le milieu des échantillons congelés, et fixer dans 10% de formaline tamponnée pour l'histologie.
  6. Séparez le plasma du sang par centrifugation et transférez le plasma citatisé dans un tube approprié et entreposez-le à -80 oC jusqu'à ce qu'il soit nécessaire d'être analysé.
  7. Pour évaluer les indices histologiques des lésions hépatiques, effectuez la coloration de l'hématoxylin et de l'éosine (H et E) avec des sections de foie intégrées à la formaline à paraffine fixe de 5 M et obtenez des images à l'aube d'un microscope à champ lumineux.
  8. Pour obtenir des niveaux de transaminase plasmatique, effectuez à la fois des analyses cinétiques d'aminotransferase d'alanine (ALT) et d'aminotransferase d'aspartate (AST) sur le plasma citatisé à l'aide de kits disponibles dans le commerce.
    REMARQUE : Pour le contrôle de la qualité, les transaminases plasmatiques pour les souris C57Bl/6J devraient être dans la plage normale (35-45 UI/L) pour le groupe LFD-VC, tandis que les valeurs devraient être élevées (150 UI/L) pour le groupe HFD-VC(figure 3C).

Representative Results

Au cours de l'expérience, le poids corporel des animaux et la consommation alimentaire ont été surveillés chaque semaine afin d'assurer la santé animale et d'évaluer le métabolisme in vivo. La figure 3A représente le poids corporel et la consommation alimentaire pour une expérience de 12 semaines. Le poids corporel a été mesuré une fois par semaine et la consommation alimentaire a été mesurée deux fois par semaine pour tous les groupes. Toutes les souris ont pris du poids tout au long de l'étude. Tandis que, comme prévu les souris dans les groupes de HFD ont gagné plus de poids que les souris dans les groupes de LFD, les souris exposées au VC n'ont pas gagné plus de poids que les souris dans le groupe témoin respectif. La consommation alimentaire n'était pas différente entre tous les groupes12,24.

La figure 3B représente des photomicrographes représentatifs de sections hépatiques tachées de H et E pour l'analyse de la morphologie générale. Dans le groupe de LFD, VC n'a causé aucun changement pathologique manifeste. L'alimentation de HFD a augmenté de manière significative la stéatose (accumulation de graisse) et l'exposition de VC a augmenté cet effet. En outre, l'exposition de VC dans le groupe de HFD a eu comme conséquence quelques foyers inflammatoires12,24.

Les niveaux de transaminase plasmatique (ALT et AST) ont été mesurés comme indicateurs des dommages au foie et un niveau élevé de transaminase est un indicateur des dommages au foie. Dans le groupe LFD, le CR n'a pas augmenté les niveaux de transaminase. HFD seul légèrement augmenté les niveaux de transaminase et surtout VC considérablement augmenté cet effet (Figure 3C)12,24.

Les ratios poids du foie au poids corporel ont été calculés pour chaque groupe. HFD a augmenté de manière significative les rapports foie-poids corporel. Toutefois, le CR n'a pas augmenté de façon significative cet effet (figure 3D)12.

Figure 1
Figure 1 : Aperçu de la procédure du modèle d'inhalation. Les souris sont nourries les régimes respectifs à faible teneur en gras (13 % en gras saturés) ou à haute teneur en gras (42 % en gras saturés) ad libitum pendant 1 semaine pour les acclimater au régime purifié. Après une semaine, les souris sont introduites dans le régime d'inhalation. Pour cela, les souris sont placées dans des chambres d'inhalation de tout le corps à la fine pointe de la technologie pour être exposées à une concentration de VC de niveau sous-OSHA de 1 ppm (0,85 ppm et 0,1 ppm) ou d'air de pièce (contrôle) pendant 6 heures/jour, 5 jours/semaine, pendant 12 semaines. Pendant la procédure d'inhalation, les souris ont un accès gratuit à la nourriture et à l'eau. À 12 semaines, les souris sont euthanasiées le matin. Ce modèle peut être étendu à de plus longues périodes d'exposition chronique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Conception de chambre d'inhalation. Un diagramme d'un système automatisé d'exposition par inhalation qui fournit des concentrations toxiques homogènes est montré. Un logiciel personnalisé permet à l'utilisateur de modifier, de surveiller et d'enregistrer les variables environnementales lors des expositions par inhalation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Le chlorure de vinyle seul ne cause pas de lésions hépatiques manifestes, mais améliore les maladies hépatiques induites par l'alimentation. (A) Le poids corporel et la consommation alimentaire ont été surveillés chaque semaine. (B) Des photomicrographes représentatifs de la morphologie générale du foie par coloration h et E sont montrés (magnification 200x). (C) Le plasma citatisé a été recueilli à la fin de la période d'exposition et analysé pour l'activité enzymatique de transaminase comme indice des dommages de foie. (D) Le poids du foie a été déterminé à différents moments expérimentaux et comparé au poids corporel entier. Les résultats sont présentés comme la moyenne - SEM.a, p lt; 0,05 par rapport à la commande LFD respective; b, p 'lt; 0.05 comparé à l'absence de VC. Taille des échantillons par groupe n '8'10. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Ce modèle de NAFLD amélioré par LE VC est une nouvelle méthode pour évaluer l'effet de l'exposition au VC limite la sous-OSHA dans un paradigme d'inhalation de tout le corps. Ce modèle permet aux chercheurs d'étudier les effets sous-hépatotoxiques et sensibilisants par de faibles niveaux de VC seul. En effet, ce modèle de co-exposition permet d'améliorer les lésions hépatiques, l'élévation du plasma ALT et AST et l'inflammation modérée, tout en n'affectant pas en grande partie d'autres systèmes d'organes, tels que le cœur, à cette concentration23. Ce modèle chronique nécessite des chambres d'inhalation de tout le corps, mais minimise les concentrations de stress et d'exposition. Bien que le protocole présenté ici soit une approche axée sur le logiciel, notre expérience a montré que l'approche manuelle est également une méthode précise et cohérente d'exposition12,24. En outre, il est facilement applicable à plusieurs domaines de recherche, y compris d'autres dommages aux organes23 causés par l'exposition volatile composé organique22. Notamment, ce modèle peut ressembler plus étroitement à la pathogénie des co-expositions humaines aux produits chimiques environnementaux et à la maladie sous-jacente5.

Afin d'obtenir des résultats similaires, certaines étapes critiques de l'optimisation du protocole doivent être réalisées. Par exemple, les chercheurs doivent établir que la concentration de VC ou d'autres substances toxiques dans les chambres se situe dans la plage d'exposition souhaitée (c.-à-d. faible niveau, sous-OSHA ou niveaux aigus). L'optimisation de cette étape de la chambre d'inhalation est essentielle pour un modèle réussi de l'exposition humaine d'intérêt. Deuxièmement, l'ajustement de l'heure d'exposition par jour et de la durée de l'expérience peut également être modifié. Selon les intérêts de ce groupe, un cadre d'exposition professionnelle a été atteint, et un paramètre supplémentaire de l'alimentation a également été étudié. Cependant, les expositions environnementales et aigues peuvent également être modélisées avec ce protocole.

Ce travail remet en question le paradigme selon lequel les limites actuelles d'exposition du CR (professionnel et environnemental) sont sûres. En effet, bien que la limite d'exposition actuelle à l'OSHA pour le VC soit de 1 ppm, ce modèle a prouvé que les concentrations de VC inférieures à cette limite sont suffisantes pour améliorer les lésions hépatiques causées par la DHH chez les souris. Ce protocole permet aux chercheurs d'étudier et de caractériser un nouveau paradigme d'exposition aux substances toxiques et de modéliser le TASH.

Il s'agit du premier modèle d'exposition chronique au VC à faible dose. Les travaux antérieurs utilisaient des concentrations de bolus très élevées, des expositions aigues ou des métabolites actifs comme substituts pour l'exposition au VC. Toutes ces approches diminuent la pertinence des résultats pour l'exposition humaine. Par conséquent, ce nouveau modèle d'interaction TASH-NAFLD fournit la plate-forme nécessaire pour que les chercheurs examinent les interactions complexes de l'exposition de CR de bas niveau.

Ce modèle de lésions hépatiques induites par des substances toxiques peut être utilisé pour d'autres composés organiques volatils et aussi pour étudier d'autres interactions qui peuvent avoir un impact sur le foie et d'autres systèmes d'organes8,22,23. En outre, ce modèle a été, et peut être utilisé davantage, pour étudier les thérapies d'intervention et des études mécanistes approfondies du mode d'action pour ce toxique prévalent24. Comme le VC est un cancérogène connu26,27,28, ce paradigme d'exposition peut également être modifié pour l'étude du cancer induit par le VC. D'autres comorbidités comme l'affection hépatique alcoolique peuvent également être améliorées par la co-exposition de VC. En outre, il serait intéressant d'étudier différents types de graisses, telles que les graisses polyinsaturées18,29,30, ou différents types de glucides31 et leur co-exposition avec VC dans ce modèle. En effet, tous ces facteurs sont connus pour avoir des effets différentiels sur le développement des dommages de foie et peuvent jouer un rôle dans la maladie hépatique VC-induite.

En conclusion, il s'agit d'un nouveau modèle d'inhalation de lésions hépatiques induites par les substances toxiques pour l'environnement et établit un paradigme d'exposition pour l'exposition chronique au VC de faible niveau. La concentration de VC utilisée dans ce modèle est sous-hépatotoxique en soi, alors qu'elle améliore les lésions hépatiques causées par un autre facteur (HFD) chez la souris. Ce modèle permettra aux chercheurs d'étudier les mécanismes et les interventions pour la toxicité chronique du VC et peut être utile pour les études translationnelles portant sur les sujets humains exposés et le plus à risque d'exposition.

Disclosures

WT Goldsmith a un intérêt financier dans IEStechno, qui est le modèle pour le système décrit. Les autres auteurs n'ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par des prix des National Institutes of Health (K01 DK096042 et R03 DK107912) à Juliane Beier. La recherche a également été soutenue par un Prix de développement institutionnel (IDeA) de l'Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health sous le numéro de subvention P20GM113226 et l'Institut national sur l'abus d'alcool et l'alcoolisme de la National Institutes of Health sous le numéro de prix P50AA024337. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ALT/AST reagents Thermo Fisher TR70121, TR71121
C57Bl/6J mice The Jackson Laboratory 000664 Animal studies must conform to all relevant ethics and animal welfare regulations and must be reviewed and approved by the
appropriate governmental and institutional animal care and use committees. Since this is a chronic study, we recommend using male or female mice 4-6 weeks of age.
CO2 Monitor IEStechno Ex-Sens
Eosin Sigma E6003
Hematoxylin Sigma HHS16
Inhalation exposure chamber system IEStechno GasExpo The inhalation exposure chamber system includes custom software, interface and controller hubs
Saturated fat (13%) control diet Teklad Diets TD.120336
Saturated fat (42%) diet Teklad Diets TD.07511
Sodium citrate Sigma 71497
Vinyl Chloride MATHESON TRI-GAS Series 3590-CGA* Handle gas with caution

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References

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