Plateforme Lab-on-a-CD pour générer des sphéroïdes multicellulaires tridimensionnels

Bioengineering

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Summary

Nous présentons un dispositif microfluidique centrifuge à moteur qui peut cultiver des sphéroïdes cellulaires. À l'aide de cet appareil, les sphéroïdes de types de cellules simples ou multiples pourraient être facilement cocultivés dans des conditions de haute gravité.

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Kim, D., Lee, G. H., Park, J., Lee, J. C., Park, J. Y. Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids. J. Vis. Exp. (153), e60399, doi:10.3791/60399 (2019).

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Abstract

Une culture tridimensionnelle de cellules sphéroïdes peut obtenir des résultats plus utiles dans les expériences cellulaires parce qu'elle peut mieux simuler les microenvironnements cellulaires du corps vivant que la culture cellulaire bidimensionnelle. Dans cette étude, nous avons fabriqué une plate-forme de culture de laboratoire sur un CD (disque compact) à moteur électrique, appelée système de culture sphéroïde microfluidique centrifuge (CMS), pour créer des sphéroïdes cellulaires tridimensionnels (3D) mettant en œuvre une force centrifuge élevée. Cet appareil peut varier les vitesses de rotation pour générer des conditions de gravité de 1 x g à 521 x g. Le système CMS est de 6 cm de diamètre, a cent 400 micropuits m, et est fait en moulage avec du polydiméthylsiloxane dans un moule en polycarbonate préfabriqué par une machine de contrôle numérique de l'ordinateur. Un mur de barrière à l'entrée du canal du système CMS utilise la force centrifuge pour répartir les cellules uniformément à l'intérieur de la puce. À l'extrémité du chenal, il y a une région de glissement qui permet aux cellules d'entrer dans les micropuits. Comme démonstration, les sphéroïdes ont été générés par la monoculture et la coculture des cellules souches adipeuses humaines et des fibroblastes pulmonaires humains dans des conditions de haute gravité utilisant le système. Le système CMS a utilisé un schéma d'opération simple pour produire des sphéroïdes de coculture de diverses structures de concentrique, Janus, et sandwich. Le système CMS sera utile dans les études de biologie cellulaire et d'ingénierie tissulaire qui nécessitent des sphéroïdes et la culture organoïde de types de cellules simples ou multiples.

Introduction

Il est plus facile de simuler des microenvironnements biologiques in vivo avec une culture tridimensionnelle (3D) de cellules sphéroïdes qu'avec la culture cellulaire bidimensionnelle (2D) (p. ex., la culture conventionnelle des cellules de plat Petri) pour produire une culture expérimentale plus réaliste sur le plan physiologique résultats1. Actuellement disponibles méthodes de formation sphéroïde comprennent la technique de chute de suspension2, technique de superpose use liquide3, technique de cellulose carboxymethyl4, technique microfluidique à base de force magnétique5, et l'utilisation de bioréacteurs6. Bien que chaque méthode ait ses propres avantages, une amélioration supplémentaire de la reproductibilité, de la productivité et de la production de sphéroïdes de coculture est nécessaire. Par exemple, alors que la technique microfluidique à base de force magnétique5 est relativement peu coûteuse, les effets des champs magnétiques forts sur les cellules vivantes doivent être soigneusement examinés. Les avantages de la culture sphéroïde, en particulier dans l'étude de la différenciation et de la prolifération des cellules souches mésenchymales, ont été rapportés dans plusieurs études7,8,9.

Le système microfluidique centrifuge, également connu sous le nom de laboratoire-sur-un-CD (disque compact), est utile pour contrôler facilement le fluide à l'intérieur et exploiter la rotation du substrat et a donc été utilisé dans des applications biomédicales telles que les immunossays10, essais colorimétriques pour détecter les marqueurs biochimiques11, amplification de l'acide nucléique (PCR), systèmes automatisés d'analyse sanguine12, et tout-en-un dispositifs microfluidiques centrifuges13. La force motrice contrôlant le fluide est la force centripète créée par la rotation. En outre, plusieurs fonctions de mixage, de valorisation et de fractionnement d'échantillons peuvent être effectuées simplement dans cette plate-forme CD unique. Cependant, par rapport aux méthodes d'analyse biochimique mentionnées ci-dessus, il y a eu moins d'essais appliquant des plates-formes de CD aux cellules de culture, en particulier les sphéroïdes14.

Dans cette étude, nous montrons la performance du système sphéroïde microfluidique centrifuge (CMS) par monoculture ou coculture de cellules souches d'adipose humaine (hASC) et de fibroblastes pulmonaires humains (MRC-5). Cet article décrit en détail la méthodologie de recherche de notre groupe15. Ainsi, la plate-forme de laboratoire de culture sphéroïde sur un CD peut être facilement reproduite. Un système de génération CMS comprenant une puce de culture CMS, un support de puce, un moteur DC, une monture de moteur, et une plate-forme tournante, est présenté. La monture moteur est imprimée en 3D avec du styrène butadéin acrylonitrile (ABS). Le support de puce et la plate-forme rotative sont CNC (contrôle numérique de l'ordinateur) usiné avec le PC (polycarbonate). La vitesse de rotation du moteur est contrôlée de 200 à 4 500 tr/min en codant un algorithme PID (proportionnel-dérivé-dérivé) basé sur la modulation de la largeur des impulsions. Ses dimensions sont 100 mm x 100 mm x 150 mm et il pèse 860 g, ce qui le rend facile à manipuler. En utilisant le système CMS, les sphéroïdes peuvent être générés dans diverses conditions de gravité de 1 x g à 521 x g, de sorte que l'étude de la promotion de la différenciation cellulaire sous haute gravité peut être étendue à partir de cellules 2D16,17 à 3D Sphéroïde. La coculture de divers types de cellules est également une technologie clé pour imiter efficacement l'environnement in vivo18. Le système CMS peut facilement générer des sphéroïdes monoculturels, ainsi que des sphéroïdes de coculture de différents types de structures (p. ex. concentrique, Janus et sandwich). Le système CMS peut être utilisé non seulement dans de simples études sphéroïdes, mais aussi dans des études d'organoïdes 3D, pour tenir compte des structures des organes humains.

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Protocol

1. Fabrication de puces de culture à base de microfluoïdes centrifuges (CMS)

  1. Faire des moules PC pour les couches supérieures et inférieures de la puce de culture CMS par l'usinage CNC. Les dimensions détaillées de la puce sont indiquées à la figure 1.
  2. Mélanger la base PDMS et l'agent de durcissement PDMS à un rapport de 10:1 (w/w) pendant 5 min et placer dans un dessiccateur pendant 1 h pour enlever les bulles d'air.
  3. Après avoir versé le mélange De PDMS dans les moules de la puce de culture CMS, retirer les bulles d'air pendant 1 h de plus et guérir dans une chambre chauffante à 80 oC pendant 2 h.
  4. Placez-les dans le nettoyeur de plasma aspiré avec les surfaces à recollé s'il fait face et exposez-les au plasma assisté par air à une puissance de 18 W pour 30 s.
  5. Attachez les deux couches de la puce de culture CMS et placez-la dans la chambre chauffre à 80 oC pendant 30 min pour augmenter la force d'adhérence.
  6. Stériliser la puce de culture CMS dans un stérilisateur autoclave à 121 oC et 15 psi.

2. Préparation cellulaire

  1. Décongeler le 1 ml de flacon contenant 5 à 105et 106 cellules de LAC ou DEM5 dans un bain d'eau à 36,5 oC pendant 2 min.
  2. Ajouter 1 ml de Médium Aigle Modifié (DMEM) de Dulbecco dans un flacon et mélanger délicatement avec une pipette de 1 000 l.
  3. Mettre 15 ml de la DMEM préréchauffée à 36,5 oC dans un plat Petri de 150 mm de diamètre à l'aide d'une pipette et ajouter les cellules du flacon.
  4. Après 1 jour, aspirez le DMEM et remplacez-le par 15 ml de DMEM frais. Par la suite, changez les médias tous les 2 ou 3 jours.
  5. Pour détacher les cellules du plat Petri, ajouter 4 ml de trypsine aux plats Petri et les placer dans un incubateur à 36,5 oC et 5 % de CO2 pendant 4 min.

3. Formation sphéroïde de monoculture

  1. Mettre 2,5 mL de 4 % (w/v) solution pluronique F-127 dans le trou d'entrée de la puce de culture CMS (Figure 2A) tout en faisant pivoter la puce à 500 à 1 000 tr/min, puis faire pivoter la puce à 4 000 tr/min pendant 3 min à l'aide du système CMS (Figure 2B).
    REMARQUE : Le revêtement pluronique empêche l'attachement cellulaire au port d'entrée pendant que la puce tourne. Assurez-vous que l'air n'est pas emprisonné dans les micropuits.
  2. Incuber la puce de culture CMS remplie de solution pluronique pendant la nuit à 36,5 oC dans 5 % de CO2.
  3. Retirez la solution pluronique, lavez la solution pluronique restante avec DMEM, et séchez la puce pendant 12 h sur un banc propre.
  4. Ajouter 2,5 ml de DMEM à la puce de culture CMS et faire pivoter la puce à 4 000 tr/min pendant 3 min pour prémouiller l'intérieur de la puce.
  5. Arrêtez la rotation et retirez 100 l de DMEM pour faire de la place pour l'injection de la suspension cellulaire.
  6. Ajouter 100 l de suspensions cellulaires qui contiennent soit 5 '105 hASCs ou 8 '105 MRC-5s par pipetting Distribuer uniformément les cellules en pipetting 3-5x pour la resuspension.
  7. Faire pivoter la puce à 3 000 tr/min pendant 3 min pour piéger les cellules de chaque micropuits par une force centrifuge.
    REMARQUE : Une vitesse de rotation excessive peut provoquer une évasion cellulaire par des trous d'éjection de solution.
  8. Culture des cellules pendant 3 jours dans l'incubateur à 36,5 oC, 95 % d'humidité, et 5 % de CO2,tournant à 1 000 à 2 000 tr/min. Changer de culture média tous les jours.

4. Formation sphéroïde de coculture

  1. Formation de sphéroïdes concentriques
    1. Ajouter les premières cellules, 2,5 à 105 hASC, et faire pivoter la puce à 3 000 tr/min. Après 3 min, ajouter les deuxièmes cellules, 4 à 105 MRC-5, et faire pivoter la puce à 3 000 tr/min pendant 3 min. Injecter un total de 100 l de suspensions cellulaires par tuyauterie. Lorsque les cellules sont injectées, déplacez la vitesse de rotation à 500-1000 tr/min.
    2. Culture les cellules de l'incubateur à 36,5 oC, à 95 % d'humidité et 5 % de CO2 en tournant à 1 000 à 2 000 tr/min. Les sphéroïdes concentriques sont créés dans les 24 h. Pour la culture à long terme, changer le milieu de la culture tous les jours.
  2. Formation sphéroïde de Janus
    1. Ajouter 100 l de suspensions cellulaires contenant les premières cellules, 2,5 à 105 hASC, par pipetting tandis que la puce tourne à 500 à 1 000 tr/min. Ensuite, faites pivoter la puce à 3 000 tr/min pendant 3 min.
    2. Incuber la puce à 36,5 oC, à 95 % d'humidité et 5 % de CO2 en tournant à 1 000 à 2 000 tr/min pendant 3 h.
    3. Ajouter 100 l de suspensions cellulaires contenant le deuxième ensemble de cellules, 4 à 105 MRC-5, par pipetting tandis que la puce tourne à 500 à 1 000 tr/min. Ensuite, faites pivoter la puce à 3 000 tr/min pendant 3 min.
    4. Culture les cellules de l'incubateur à 36,5 oC, 95 % d'humidité, et 5 % de CO2 en tournant à 1 000 à 2 000 tr/min. Les sphéroïdes Janus sont créés dans les 24 heures. Pour la culture à long terme, changer le milieu de la culture tous les jours.
  3. Formation sphéroïde de sandwich
    1. Ajouter 100 l de suspensions cellulaires contenant les premières cellules, 1,5 à 105 hASC, par pipetting tandis que la puce tourne à 500 à 1 000 tr/min. Ensuite, faites pivoter la puce à 3 000 tr/min pendant 3 min.
    2. Incuber la puce à 36,5 oC, à 95 % d'humidité et 5 % de CO2 en tournant à 1 000 à 2 000 tr/min pendant 3 h.
    3. Ajouter 100 l de suspensions cellulaires contenant les deuxièmes cellules, 3 à 105 MRC-5, par pipetting tandis que la puce tourne à 500 à 1 000 tr/min. Ensuite, faites pivoter la puce à 3 000 tr/min pendant 3 min.
    4. Incuber la puce à 36,5 oC, à 95 % d'humidité et 5 % de CO2 en tournant à 1 000 à 2 000 tr/min pendant 3 h.
    5. Ajouter 100 l de suspensions cellulaires contenant les troisièmes cellules, 1,5 à 105 hASC, par pipetting tandis que la puce tourne à 500 à 1 000 tr/min. Ensuite, faites pivoter la puce à 3 000 tr/min pendant 3 min.
    6. Culture les cellules de l'incubateur à 36,5 oC, à 95 % d'humidité et 5 % de CO2 en tournant à 1 000 à 2 000 tr/min. Les sphéroïdes sandwich sont créés dans les 12 h. Pour la culture à long terme, changer le milieu de la culture tous les jours.

5. Coloration cellulaire

  1. Réchauffer le colorant de fluorescence cellulaire à température ambiante (20 oC).
  2. Ajouter 20 l de diméthylsulfoxide anhylsulfoxide (DMSO) par flacon pour faire une solution de 1 mM.
  3. Diluer la fluorescence à une concentration de travail finale de 1 M à l'aide de DMEM.
  4. Ajouter la fluorescence à la suspension cellulaire et resuspendre doucement à l'aide d'une pipette.
  5. Incuber 20 min à 36,5 oC, humidité de 95 % et 5 % de CO2.

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Representative Results

La puce de culture CMS de 6 cm de diamètre (figure 2) a été réalisée avec succès selon le protocole ci-dessus. Tout d'abord, la puce a été faite séparément à partir d'une couche supérieure et une couche inférieure, puis colléensemble par liaison plasmatique. Les sphéroïdes qui en résultent peuvent être facilement recueillis en détachant la puce. Le canal de la puce de culture CMS comprend un port d'entrée et des régions centrales, de glissement et de micropuits (figure 3). Les solutions cellulaires, moyennes et pluroniques sont injectées par un trou d'aurein d'un diamètre de 5 mm. Les cellules injectées sont réparties uniformément par resuspension 3-5x dans la région du port d'entrée. Les cellules sont soumises à une force centrifuge dans la région centrale et se propagent vers l'extérieur. Parce que la région centrale est plus élevée que le micropuits, elle peut contenir plus de milieu, permettant aux sphéroïdes de survivre plus longtemps. La hauteur du micropuits est de 0,4 mm et la hauteur de la région centrale est de 1,5 mm. Des trous de succion sont présents au centre de la région centrale pour enlever facilement les solutions internes. La région de glissement est une zone en pente reliant la région centrale et la région de micropuits. Les cellules se déplacent le long d'une pente de 45 degrés et s'installent dans la région du micropuits, où les cellules s'installent, se développent et s'emmêlent pour former des sphéroïdes. Les micropuits situés à 14 mm du centre de la puce sont semi-cylindriques avec une hauteur de 400 m et un diamètre de 400 m. Au total, 100 sphéroïdes peuvent être générés simultanément dans 100 micropuits.

À l'aide de la puce CMS préparée, les sphéroïdes peuvent être générés dans l'ordre indiqué dans le protocole (Figure 4). Les sphéroïdes de monoculture et de coculture ont été produits avec des cellules hASC et MRC-5. Pour générer un sphéroïde monoculturel de chaque type de cellule, 5 '105 hASCs ou 8 '105 MRC-5' ont été injectés. Le nombre de cellules injectées était indépendant de la taille de la cellule. Des images en accéléré des deux types de cellules ont été prises à 2 000 tr/min jusqu'au jour 3 de la culture cellulaire (figure 5). Des sphéroïdes de coculture des HASC et des MRC-5 ont également été produits avec des structures concentriques, Janus, et sandwich. Pour fabriquer des sphéroïdes concentriques, les premières cellules (2,5 et 105 hASC) ont été injectées et les deuxièmes cellules (4 à 105 MRC-5) ont été injectées 3 min plus tard (figure 6A). Lorsque les premières cellules ont été injectées, elles sont devenues en forme de U en raison de la gravité élevée, et quand les deuxièmes cellules ont été injectées, elles se sont déplacées au milieu de la forme En U. Au fil du temps, les premières cellules en forme de U encerclaient les deuxièmes cellules et complétaient les sphéroïdes concentriques. Pour fabriquer des sphéroïdes Janus, les premières cellules (2,5 et 105 hASC) ont été injectées, et les deuxièmes cellules (4 à 105 MRC-5) ont été injectées 3 h plus tard(figure 6B). Lorsque l'intervalle d'injection entre les deux cellules était long, la forme des premières cellules est passée d'une forme en U à une forme elliptique par agrégation cellulaire. Une fois que les deuxièmes cellules ont été ajoutées à la forme elliptique des premières cellules, les sphéroïdes de Janus ont été produits. Dans le cas des sphéroïdes sandwich, les premières cellules (1,5 à 105 hASC) ont été injectées, les deuxièmes cellules (3 à 105 MRC-5) ont été injectées 3 h plus tard, et les troisièmes cellules (1,5 à 105 hASC) ont été injectées après 3 h (Figure 6C) ). Semblable au sphéroïde De Janus, chaque cellule agrégée en forme elliptique, et les trois couches empilées pour générer des sphéroïdes sandwich. Enfin, pour démontrer la capacité culturelle à long terme du CMS, les HASC ont été cultivés, exposés à une gravité élevée pendant 7 jours, suivis d'un analyse vivante/morte effectuée pour montrer que la plupart des cellules ont survécu (figure 7). En outre, des photos de tous les micropuits de la CMS ont été prises après 3 jours de culture MRC-5s pour montrer une excellente uniformité et la sphénicité des sphéroïdes (Figure 8).

Figure 1
Figure 1 : Dimensions des couches supérieure et inférieure d'une puce de culture CMS. Le moule PC a été fabriqué à l'aide d'une machine CNC et répliqué avec PDMS pour faire une puce de culture CMS basée sur le dessin créé par un 3D CAD (conception assistée par ordinateur) programme. Les quatre cercles sur les bords des couches supérieure et inférieure sont pour aligner les deux couches. Les dimensions sont en millimètres. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Photographies du système CMS. (A) Photographies de la puce de culture CMS terminée. Le diamètre de la puce est de 6 cm et le diamètre du micropuits est de 400 m. Les nombres au-dessus des micropuits représentent les nombres individuels des micropuits de 1 à 100. Ces nombres ont été gravés dans le moule. Barre d'échelle de 400 m. (B) Photographie de l'ensemble du système CMS. Le système CMS comprend la puce de culture CMS, le support de puce, le moteur DC et la plate-forme rotative. Les dispositifs CMS peuvent générer des conditions de gravité allant jusqu'à 521 x g par la force de rotation. Le support de puce empêche la séparation de la puce de culture CMS en raison de la gravité élevée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Composants de canal du CMS. (A) Images schématiques et (B) photographies d'une section transversale de la puce de culture CMS. La puce de culture CMS se compose d'un port d'entrée et des régions centrales, de glissement et de micropuits. Étant donné que les cellules injectées ne passent pas par la barrière à une vitesse de rotation inférieure à 1 000 tr/min, la barrière aide à la suspension de la cellule et même à la distribution au micropuits. Barre d'échelle de 2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Processus de chargement des cellules dans la puce de culture CMS. (A) Pour empêcher les cellules de coller au fond de la puce, enduire de 2,5 ml de la solution pluronique F-127 à 4 000 tr/min. Attendez un jour que le revêtement soit appliqué. (B) Retirez la solution pluronique et remplissez le canal avec 2,5 ml du milieu DMEM. (C) Retirez 100 l de la DMEM et ajoutez 100 l de suspension cellulaire. À ce moment, resuspendre 3-5x de sorte que les cellules sont réparties uniformément. (D) Déplacez les cellules vers le micropuits en faisant pivoter la puce, puis culture les cellules pendant 3 jours à 1000 à 2.000 tr/min. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Photographie en accéléré des sphéroïdes de monoculture des cellules hASC et MRC-5. Les cellules ont été cultivées pendant 24 h à 2 000 tr/min. Le sphéroïde a été généré dans un rayon de 24 h. Barre à l'échelle de 400 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Images de fluorescence des sphéroïdes de coculture. (A) Formes sphéroïdes concentriques dans lesquelles les cellules hASC (vertes) entourent les cellules MRC-5 (rouge). (B) Forme sphéroïde de Janus dans laquelle deux cellules sont symétriques. (C) Forme sphéroïde sandwich dans laquelle les couches hASC sont empilées entre deux couches MRC-5. Barre d'échelle de 400 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : Live/Dead assay of hASC on Day 7. La couleur fluorescente verte représente les cellules vivantes et la couleur fluorescente rouge représente les cellules mortes. Barre d'échelle de 400 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8
Figure 8 : Sphéroïdes MRC-5 le jour 3. Un nombre relativement constant de cellules pénètrent dans chaque micropuits et forment des sphéroïdes ayant une sphénicité relativement constante dans le système CMS. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 9
Figure 9 : Récolte des sphéroïdes. Les sphéroïdes cultivés peuvent être récoltés en divisant les deux couches de la puce de culture CMS. Les deux couches à plasma peuvent être facilement séparées à la main. Ensuite, les sphéroïdes sont recueillis dans les micropuits de la couche inférieure simplement par pipetting. Barre d'échelle de 400 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Le CMS est un système fermé dans lequel toutes les cellules injectées pénètrent dans le micropuits sans déchets, ce qui le rend plus efficace et économique que les méthodes conventionnelles de production de sphéroïdes à base de micropuits. Dans le système CMS, les supports sont remplacés tous les 12 à 24 h par un trou d'aspiration conçu pour enlever les supports de la puce (Figure 3A). Pendant le processus d'aspiration des médias, presque aucun média s'échappe de l'intérieur du micropuits en raison de la tension de surface entre les médias et la paroi du micropuits. Un utilisateur peut facilement enlever le support piégé en appuyant près de la région micropuits de la puce avec un doigt, parce que la puce faite de PDMS est élastique et flexible. Les cellules du micropuits restent stables sans s'échapper, même avec de multiples changements médiatiques. Pour obtenir la même qualité de sphéroïde dans les 100 micropuits, la rotation de l'appareil ne doit pas être excentrique, et la puce doit être axisymmétrique. Sinon, un nombre variable de cellules peut entrer dans chaque puits et la taille et la forme du sphéroïde pourraient différer. Dans le système de micropuits conventionnel, parce que l'air est souvent emprisonné dans le micropuits, il est nécessaire d'enlever les bulles d'air. Cependant, le système CMS ne nécessite pas le processus d'élimination des bulles parce que la force centrifuge élevée générée par la rotation provoque les médias à pousser les bulles et les presser hors des micropuits.

Le système CMS a également ses limites par rapport aux méthodes conventionnelles. Le système CMS nécessite un espace de culture plus grand (p. ex., grand espace incubateur) puisqu'il comprend un moteur, une plate-forme rotative et un contrôleur, et sa taille totale est d'environ 100 mm x 100 mm x 150 mm(figure 2B). En outre, il provoque une vibration légère mais persistante. Nous nous attendons à ce que la miniaturisation du système (j'espère similaire à la taille de 6 plaques de puits) résoudra ces problèmes.

Il convient de noter que les sphéroïdes cultivés peuvent être recueillis en séparant les deux couches de plasma du système CMS (figure 9). La liaison des deux couches est assez forte pour empêcher le support de fuir pendant le fonctionnement du système. Cependant, en raison de la petite zone de liaison, il est séparable à la main. Les sphéroïdes peuvent simplement être recueillis à partir de la couche inférieure par pipetting.

Le système CMS a une meilleure reproductibilité et productivité que les méthodes conventionnelles de génération de sphéroïdes. Les méthodes conventionnelles, telles que les méthodes normales de micropuits ou de gouttelettes suspendues, sont laborieuses. Cependant, dans le système CMS, il est beaucoup plus facile d'augmenter le nombre de sphéroïdes en augmentant simplement la taille des puces. Avec ce dispositif, il est également possible de générer des organoïdes qui nécessitent une culture de types multicellulaires, ce qui n'est pas facile à faire dans les méthodes de culture conventionnelles. En plus des cellules de cette étude (hASC et MRC-5), le CMS pourrait être utilisé pour la production de sphéroïdes à l'aide de divers autres types de cellules qui peuvent former des sphéroïdes.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Cette recherche a été appuyée par le Programme de recherche en sciences fondamentales (2016R1D1A1B03934418) et le Programme de développement des technologies bio et médicales (2018M3A9H1023141) de la NRF, et financé par le gouvernement coréen, MSIT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printer Cubicon 3DP-210F
Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) ATCC PCS-500-011
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 Contained 1% of completed medium and buffer
CellTracker Green CMFDA Thermo Fisher Scientific C2925 10 mM
CellTracker Red CMTPX Thermo Fisher Scientific C34552 10 mM
Computer numerical control (CNC) rotary engraver Roland DGA EGX-350
DC motor Nurielectricity Inc. MB-4385E
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) ATCC 30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) ATCC 30-2200
Fetal bovine serum ATCC 30-2020 Contained 10% of completed medium
human lung fibroblasts (MRC-5) ATCC CCL-171
Inventor 2019 Autodesk 3D computer-aided design program
Petri dish Φ 150 mm JetBiofill CAD010150 Surface Treated
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Pluronic F-127 Sigma Aldrich 11/6/9003 Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Polycarbonate (PC) Acrylmall AC15PC 200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dowcorning Sylgard 184
Trypsin Gibco 12604021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230, (1), 16-26 (2015).
  2. Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136, (3), 473-478 (2011).
  3. Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Cancer Research. 41, (7), 2980-2984 (1981).
  4. Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297, (2), 415-423 (2004).
  5. Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
  6. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3, (9-10), 1172-1184 (2008).
  7. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
  8. Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
  9. Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14, (1), 105 (2014).
  10. Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87, (2), 922-928 (2015).
  11. Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
  12. Park, Y. -S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).
  13. Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86, (22), 11349-11356 (2014).
  14. Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10, (14), 1758-1773 (2010).
  15. Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9, (4), (2017).
  16. Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
  17. Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
  18. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32, (8), 760-772 (2014).

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