3 डी सेल-लादेन अग्नाशय ऊतक निर्माण मुद्रण के लिए अग्नाशय ऊतक-व्युत्पन्न एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स बायोइंक

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Bioengineering

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Summary

डिसेलुलर एक्ससेल्युलर मैट्रिक्स (डीईसीएम) एक इंजीनियर निर्माण में लक्ष्य ऊतकों के अंतर्निहित कार्यों को फिर से तैयार करने के लिए उपयुक्त सूक्ष्म पर्यावरणीय संकेत प्रदान कर सकता है। यह लेख अग्नाशय के ऊतकों के विकोशियीकरण, अग्नाशय के ऊतकों-व्युत्पन्न डीसीएम बायोइंक के मूल्यांकन और 3डी अग्नाशय के ऊतकों की पीढ़ी के लिए प्रोटोकॉल को स्पष्ट करता है जो बायोप्रिंटिंग तकनीक का उपयोग करके निर्माण करता है।

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Kim, J., Kim, M., Hwang, D. G., Shim, I. K., Kim, S. C., Jang, J. Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs. J. Vis. Exp. (154), e60434, doi:10.3791/60434 (2019).

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Abstract

अग्नाशय आइलेट्स का प्रत्यारोपण उन रोगियों के लिए एक आशाजनक उपचार है जो हाइपोग्लाइसीमिया और माध्यमिक जटिलताओं के साथ टाइप 1 मधुमेह से पीड़ित हैं। हालांकि, आइलेट प्रत्यारोपण अभी भी इस तरह के गरीब आइलेट engraftment और शत्रुतापूर्ण वातावरण के कारण प्रत्यारोपित islets की कम व्यवहार्यता के रूप में कई सीमाएं हैं । इसके अलावा, मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से विभेदित इंसुलिन उत्पादक कोशिकाओं को पर्याप्त हार्मोन है कि रक्त ग्लूकोज के स्तर को विनियमित कर सकते है स्राव करने की क्षमता है; इसलिए, उचित माइक्रोएनवायरमेंटल संकेतों के साथ कोशिकाओं को सख्त करके परिपक्वता में सुधार की दृढ़ता से आवश्यकता है। इस लेख में, हम एक अग्नाशय के ऊतक-व्युत्पन्न विसेसेलुलर मैट्रिक्स (pdECM) बायोइंक तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल को स्पष्ट करते हैं ताकि एक लाभकारी माइक्रोएनवातावरण प्रदान किया जा सके जो अग्नाशय के आइलेट्स की ग्लूकोज संवेदनशीलता को बढ़ा सकता है, जिसके बाद वर्णन किया जाता है 3 डी अग्नाशय के ऊतकों को उत्पन्न करने की प्रक्रिया माइक्रोएक्सट्रस-आधारित बायोप्रिंटिंग तकनीक का उपयोग करके निर्माण करती है।

Introduction

हाल ही में, अग्नाशय आइलेट प्रत्यारोपण प्रकार 1 मधुमेह के साथ रोगियों के लिए एक आशाजनक उपचार माना गया है । प्रक्रिया की सापेक्ष सुरक्षा और न्यूनतम आक्रामकता इस उपचार के बड़े फायदे हैं1. हालांकि, इसमें आइलेट्स को अलग करने की कम सफलता दर और इम्यूनोसप्रेसिव दवाओं के दुष्प्रभाव जैसी कई सीमाएं हैं। इसके अलावा, शत्रुतापूर्ण वातावरण2के कारण प्रत्यारोपण के बाद एन्ग्राफेड आइलेट्स की संख्या तेजी से कम हो जाती है। इन कठिनाइयों को दूर करने के लिए अग्नाशय आइलेट प्रत्यारोपण के लिए विभिन्न जैव संगत सामग्री जैसे अल्जीनेट, कोलेजन, पाली (लैक्टिक-सह-ग्लाइकोलिक एसिड) (पीएलजीए) या पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) लागू किए गए हैं।

3डी सेल प्रिंटिंग तकनीक अपनी महान क्षमता और उच्च प्रदर्शन के कारण ऊतक इंजीनियरिंग में उभर रही है। कहने की जरूरत नहीं है, बायोइंक्स को उपयुक्त माइक्रोएनवायरमेंट प्रदान करने और मुद्रित ऊतक निर्माण ों में सेलुलर प्रक्रियाओं में सुधार को सक्षम करने के लिए महत्वपूर्ण घटकों के रूप में जाना जाता है। कतरनी-पतला हाइड्रोगेल जैसे फिब्रिन, एल्गिनेट और कोलेजन का व्यापक रूप से बायोइंक के रूप में उपयोग किया जाता है। हालांकि, ये सामग्री देशी ऊतक3में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) की तुलना में संरचनात्मक, रासायनिक, जैविक और यांत्रिक जटिलता की कमी दिखाती है। आइलेट्स और ईसीएम के बीच बातचीत जैसे माइक्रोएनवायरमेंटल संकेत आइलेट्स के कार्य को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण संकेत हैं। Decellularized ECM (dECM) कोलेजन, ग्लाइकोसामिनोग्लिकन (GAGs), और ग्लाइकोप्रोटीन सहित विभिन्न ईसीएम घटकों की ऊतक विशिष्ट संरचना विश्राम कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, प्राथमिक आइलेट्स जो अपने परिधीय ईसीएमएस (उदाहरण के लिए, टाइप I, III, IV, V, और VI कोलेजन, लेमिनिन और फाइब्रोनेक्टिन) को बनाए रखते हैं, कम एपोप्टोसिस और बेहतर इंसुलिन संवेदनशीलता प्रदर्शित करते हैं, इस प्रकार यह दर्शाता है कि ऊतक-विशिष्ट सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन मूल ऊतक4के समान कार्य करने की उनकी क्षमता को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

इस पेपर में, हम अग्नाशय के ऊतकों को तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल को स्पष्ट करते हैं-विसेलुलर एक्ससेल्युलर मैट्रिक्स (pdECM) बायोइंक अग्नाशय के आइलेट्स की गतिविधि और कार्यों को बढ़ाने के लिए लाभकारी माइक्रोएनवायरमेंटल संकेत प्रदान करने के लिए, इसके बाद माइक्रोएक्सट्रसियन-आधारित बायोप्रिंटिंग तकनीक(चित्र 1)का उपयोग करके 3डी अग्नाशय ऊतक निर्माण पैदा करने की प्रक्रियाओं के बाद।

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Protocol

पोर्सिन अग्नाशय के ऊतकों को एक स्थानीय कसाईघर से एकत्र किया गया था। पशु प्रयोगों को आसन मेडिकल सेंटर, सियोल, कोरिया की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. ऊतक विकोशियीकरण

  1. विकोशियीकरण के लिए समाधान तैयार करें।
    नोट: सभी समाधान तैयारियों में उपयोग किए जाने वाले 1x फॉस्फेट-बफरेड लवण (पीबीएस) को 10x पीबीएस में आसुत पानी जोड़कर पतला किया जाता है।
    1. 1% ट्राइटन-एक्स 100 समाधान के लिए, 100% ट्राइटन-एक्स 100 समाधान के 900 मीटर में 100 मीटर का 100 मीटर घोल 1x पीबीएस के 900 मीटर में 150 आरपीएम पर सरगर्मी के साथ एक चुंबकीय हलचल बार का उपयोग कर 1 एच के लिए 1% ट्राइटन-एक्स 100 समाधान के 40 0 mL के साथ 1% ट्राइटन-एक्स 100 समाधान और 360 मीटर 1x के 100 मीटर उपयोग से ठीक पहले पीबीएस तैयार किया गया।
      नोट: 10% ट्राइटन-एक्स 100 समाधान की जरूरत होने तक कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. 0.1% पेरेसेटिक एसिड समाधान के लिए, उपयोग से ठीक पहले 368.7 मिलील आसुत पानी के साथ 70% इथेनॉल के 22.8 मिलील में 4.7% पेरेसेटिक एसिड का 8.5 मिलील पतला करें।
  2. अग्न्याशय के परिधीय ऊतकों को हटा दें और विकोशियीकरण से पहले ऊतक ों को काट लें।
    1. नल के पानी को चलाने के साथ पुन: विभाजित पोर्सिन अग्न्याशय धोएं और निष्फल कैंची का उपयोग करपरिध ऊतकों को हटा दें।
    2. अग्न्याशय को संदंश के साथ प्लास्टिक बैग में स्थानांतरित करें और अगले चरण के लिए अग्न्याशय को प्रभावी ढंग से काटने में मदद करने के लिए 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
    3. जमे हुए अग्न्याशय को एक ग्राटर का उपयोग करके 1 मिमी मोटी टुकड़ों में काट लें।
    4. कटा हुआ ऊतक के 50 ग्राम को 500 मीटर प्लास्टिक कंटेनर में स्थानांतरित करें।
      नोट: ऊतकों को संदूषण से बचाने और समाधान वाष्पीकरण को रोकने के लिए यहां ढक्कन के साथ एक प्लास्टिक कंटेनर की सिफारिश की जाती है।
  3. अभिकर्मकों के साथ उपचार।
    नोट: पूरी विसेशियीकरण प्रक्रिया 150 आरपीएम पर एक डिजिटल कक्षीय शेखर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए। सभी विसेलुलराइजेशन चरणों में, अग्न्याशय के स्लाइस को एक साथ चिपके रहने से रोकने के लिए संदंश का उपयोग करने वाली शारीरिक टुकड़ी की आवश्यकता होती है। कंटेनर को आसुत पानी से धोना आवश्यक है ताकि अवशिष्ट रिएजेंट्स को कंटेनर में पूरी तरह से हटाया जा सके।
    1. किसी भी अभिकर्मक उपचार से पहले, एक शेखर का उपयोग करके 300 मिलीग्राम आसुत पानी के साथ 50 ग्राम कटा हुआ अग्न्याशय धोएं।
    2. 150 आरपीएम पर लगातार ऊतक हिलाओ जब तक बादल पानी गायब हो जाता है (लगभग 12 घंटे के बाद) । हर 2 घंटे आसुत पानी को बदलें।
      नोट: आसुत पानी को बदलने हर घंटे बादल पानी को और अधिक जल्दी से हटाने के लिए दक्षता के लिए सिफारिश की है ।
    3. पानी को त्यागें और 84 घंटे के लिए 1x पीबीएस समाधान में 1% ट्राइटन-एक्स 100 के 400 मीटर के साथ ऊतकों के 50 ग्राम का इलाज करें।
      नोट: इस बिंदु पर, ऊतक की मात्रा कम हो जाएगी क्योंकि सेलुलर घटकों को हटाया जा रहा है।
    4. अग्न्याशय से शेष वसा को हटाने के लिए 2 घंटे के लिए आइसोप्रोपेनॉल (आईपीए) के 400 मिलील के साथ इलाज करें।
      नोट: इस प्रक्रिया में वसा को हटाने के कारण ऊतक के लिए कठिन हो जाना सामान्य है।
    5. 2 घंटे के बाद, आईपीए को हटा दें और 24 घंटे के लिए 1x पीबीएस के 400 मीटर के साथ ऊतक धोलें। 1x पीबीएस को हर 12 घंटे में ताज़ा करें।
    6. विसेलुलर ऊतक को निष्फल करने के लिए, पिछले समाधान को त्यागें और 2 घंटे के लिए 4% इथेनॉल में 0.1% पेरेसेटिक एसिड के 400 मिलील के साथ इलाज करें।
    7. अवशिष्ट डिटर्जेंट को हटाने के लिए, ऊतक को 6 घंटे के लिए 1x पीबीएस के 400 मीटर के साथ धोएं। समाधान को हर 2 घंटे ताज़ा करें।
    8. संदंश के साथ एक 50 mL शंकुई ट्यूब में विकोशिराइज्ड ऊतकों को इकट्ठा करें।
    9. 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना फ्रीज करें। ढक्कन के बजाय एक लिंट-मुक्त पोंछ के साथ शंकु ट्यूब को कवर करें और कुशल लाइओफिलाइजेशन के लिए रबर बैंड के साथ ठीक करें।
    10. Lyophilize ऊतक 4 डी के लिए -50 डिग्री सेल्सियस पर।
      नोट: चरण 1.3 के लिए, 1 ग्राम गैर-विकोशियकृत ऊतक को भी एक ही शर्तों के तहत फ्रीज-सूखे किया जाना चाहिए।

2. विकोशियकृत ऊतकों का आकलन

नोट: देशी ऊतक की तुलना में डीडीएनए, ग्लाइकोसामिनोग्लाइकान (जीजी) और विसेलुलर ऊतक में कोलेजन की अवशिष्ट मात्रा का मूल्यांकन करने के लिए, प्रत्येक गैर-विसेलुलर ऊतक (देशी ऊतक) में से कम से कम 1 ग्राम और विसेलुलर ऊतक की आवश्यकता होती है। मूल्यांकन का बैच। ऊतक के सूखे वजन के आधार पर डीएसडीएनए, गाग्स और कोलेजन की मात्रा की गणना की जा सकती है।

  1. जैव रासायनिक परख के लिए समाधान तैयार करें।
    1. नमूना पाचन के लिए पाकिन समाधान तैयार करें।
      नोट: बफर की राशि को नमूनों की संख्या के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।
      1. 10 मीटर सोडियम फॉस्फेट (मोनोबेसिक), 18.6 मिलीग्राम 0.5 मीटर Na2-EDTA, और 8.8 मिलीग्राम 5 m cysteine-एचसीएल के 10 मीटर में ऑटोक्लेव पानी भंग।
      2. 10 एम NaOH समाधान जोड़कर 6.5 समाधान के पीएच समायोजित करें।
      3. उपरोक्त समाधान और भंवर में 10 मिलीग्राम/एमएल पापापाइन स्टॉक समाधान के 125 माइक्रोन जोड़ें, जिससे प्रत्येक तत्व समान रूप से मिश्रण कर सके।
    2. डिमेथिल-मिथाइलीन ब्लू (डीएमएमबी) परख के लिए समाधान तैयार करें।
      1. डीएमएमबी डाइ बनाने के लिए, 8 मिलीग्राम 1,9-डाइमेथिल-मिथालीन ब्लू जिंक क्लोराइड डबल नमक, 1.52 ग्राम ग्लाइसिन, और 1.185 ग्राम एनसीएल को 500 मिलीग्राम ऑटोक्लाव्ड पानी में भंग करें। बेंच-टॉप पीएच मीटर का उपयोग करके पीएच के परिवर्तन को मापते हुए 0.5 एम एचसीएल समाधान जोड़कर पीएच को 3 में समायोजित करें। फिर, इसे 500 एमएल बोतल-टॉप वैक्यूम फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
      2. 10 मिलीग्राम/mL chondroitin सल्फेट के 15 μL मानक के लिए एक समाधान बनाओ ।
    3. हाइड्रोक्सीप्रोलिन परख के लिए समाधान तैयार करें।
      1. क्लोरामाइन वर्किंग सॉल्यूशन के लिए 2.4 ग्राम सोडियम एसीटेट, 1 ग्राम साइट्रिक एसिड और 0.68 ग्राम सोडियम हाइड्रोक्साइड को आसुत पानी के 24 मिलीग्राम में घोलें और हिमनदों के एसिड के 240 माइक्रोन, टॉलुईन के 10 माइक्रोन और आईपीए के 6 मिलीएल जोड़ें।
        नोट: भंवर मिक्सर का उपयोग करके समाधान में सभी पाउडर भंग करें। क्लोरामाइन वर्किंग सॉल्यूशन को तीन महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है।
      2. क्लोरामाइन टी समाधान के लिए, क्लोरामाइन वर्किंग सॉल्यूशन के 20 मीटर में क्लोरामाइन टी के 0.35 ग्राम को भंग करें और आईपीए के 2.5 मीटर जोड़ें। भंवर सभी घटकों को मिलाने के लिए।
        नोट: उपयोग से पहले तुरंत तैयार करें।
      3. पी-डीएबी समाधान के लिए, पी-डीएबी के 3.75 ग्राम को पेक्लोरिक एसिड के 6.5 मीटर और आईपीए के 15 मीटर में रखें; इसे एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें।
        नोट: उपयोग से पहले तुरंत तैयार करें।
  2. नमूने को बेहतर पचाने के लिए 1.5 मिलीग्राम माइक्रोसेंटिफ्यूज ट्यूब और भंवर ट्यूब में 10 मिलीग्राम लाइओफिलेज ऊतक में पाकिन समाधान का 1 मिलीग्राम जोड़ें।
  3. 1.5 मिलीआर माइक्रोसेंट्रिकफ्यूज ट्यूब को रबर रैक में रखें और नमूनों को 500 मिलील बीकर में पचा लें जिसमें 16 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर 300 मिलीएल पानी होता है।
  4. 20 मिन के लिए 9,500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, सुपरनेटेंट इकट्ठा करें, और इसे एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. अवशिष्ट डीएनए और विकोशियीकृत ऊतक में प्रमुख प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करें।
    1. स्पेक्ट्रोमीटर में पचाने वाले नमूने का लोड 1 माइक्रोन और निर्माता के निर्देशों के अनुसार डीएसडीएनए की मात्रा को मापें।
      नोट: प्रयोगकर्ता को अपने बालों को वापस बांधना चाहिए और नमूने को दूषित करने से बचने के लिए एक मुखौटा पहनना चाहिए।
  6. डीएमएमबी परख करें जो विसेलुलर ऊतक में रहने वाले गागों की मात्रा की मात्रा निर्धारित करने के लिए करें।
    1. मानक बनाने के लिए कॉन्ड्रोइटिन सल्फेट ए सल्फेट ए सॉल्यूशन और 499 माइक्रोन का मिक्स करें। कॉन्ड्रोइटिन सल्फेट को पतला करें 0, 4, 8, 12, 16 और 20 μg/mL की सांद्रता पर आसुत पानी के साथ एक समाधान ।
    2. मानक की प्रत्येक एकाग्रता के 50 माइक्रोन के लोड ट्रिपलिकेट्स और एक 96-अच्छी तरह से प्लेट में पचाने वाले नमूने।
    3. एक बहु चैनल पिपेट का उपयोग कर प्रत्येक अच्छी तरह से DMMB रंगे के 200 μL जोड़ें।
    4. तुरंत एक माइक्रोप्लेट रीडर पर 525 एनएम पर अवशोषण पढ़ें।
  7. कोलेजन की मात्रा निर्धारित करने के लिए हाइड्रोक्सीप्रोलाइन परख करें।
    1. हाइड्रोक्सीप्रोलाइन परख का संचालन करने के लिए, 16 घंटे के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर एचसीएल के बराबर मात्रा के साथ पचाने वाले नमूने का इनक्यूबेट 250 माइक्रोन।
    2. नमूनों को ठंडा करने के लिए कमरे के तापमान पर अवशेषों को 3 घंटे तक सुखाएं और फिर 1x पीबीएस के 1 mL में नमूनों को फिर से भंग करें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 2,400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    4. मानक के रूप में 100 μg/mL हाइड्रोक्सीप्रोलाइन समाधान तैयार करें।
    5. मानक समाधान के लिए 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 μg/mL की एकाग्रता पर आसुत जल के साथ हाइड्रोक्सीप्रोलाइन समाधान को पतला करें।
    6. नमूनों के 50 माइक्रोन और मानक समाधान के लोड ट्रिपलिकेट्स को 96-अच्छी प्लेट में लोड करें।
    7. क्लोरामाइन टी समाधान के 50 μL जोड़ें तो कमरे के तापमान पर 20 min के लिए इनक्यूबेट।
    8. पी-डीएबी समाधान के 50 माइक्रोन जोड़ें और 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 सीन के लिए इनक्यूबेट।
      नोट: एक अंधेरे कमरे में Aliquot । इसके अलावा, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ थाली लपेटें।
    9. कमरे के तापमान पर 30 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट।
    10. ठंडा होने के बाद, एक माइक्रोप्लेट रीडर पर 540 एनएम पर अवशोषण को मापें।

3. बायोइंक तैयारी

नोट: पीडीईसीएम पाउडर को कम से कम एक वर्ष के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रूप से संग्रहित किया जा सकता है। पीएच समायोजन से पहले, पचाने वाले पीडीईसीएम समाधान को एक महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। उपयोग करने से पहले, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए पीडीईसीएम समाधान का नमूना गल जाए। पीएच-समायोजित पीडीईसीएम समाधान को एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। पचाने वाला पीडीईसीएम समाधान कम से कम कुछ दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है लेकिन 1 सप्ताह से अधिक नहीं होना चाहिए।

  1. पेप्सिन के साथ फ्रीज-सूखे पीडीईसीएम को पचाएं।
    1. बायोइंक के प्रभावी पाचन के लिए, एक मोर्टार और मूसल का उपयोग करके तरल नाइट्रोजन के साथ लिओफिलेइज्ड पीडीईसीएम को स्पंदित करें।
    2. 50 मिलीग्राम शंकुई ट्यूब में 200 मिलीग्राम पीडीईसीएम पाउडर एकत्र करें और 20 मिलीग्राम पेप्सिन और 0.5 एम एसिटिक एसिड (अंतिम एकाग्रता 2 w/v%) का 8.4 मिलीग्राम जोड़ें।
    3. चुंबकीय हलचल बार को 50 एमएएल शंकुन ट्यूब में रखें और 96 घंटे के लिए 300 आरपीएम पर हलचल करें।
  2. पचा ने वाले पीडीईसीएम समाधान के पीएच को समायोजित करें।
    नोट: पीएच समायोजन से पहले जेलेशन से बचने के लिए, यह प्रक्रिया बर्फ पर आयोजित की जानी चाहिए।
    1. भागों के इष्टतम पाचन प्राप्त करने के लिए बर्फ पर एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग कर के एक 40 μm सेल छलनी का उपयोग कर pdECM समाधान में अपाच्य कणों को फ़िल्टर करें।
    2. नाओएच का उपयोग करने से पहले 10x पीबीएस और भंवर का 1 एल जोड़ें।
    3. पीएच संकेतक स्ट्रिप्स के साथ पीएच की जांच 10 एम NaOH के साथ 7 को पीएच समायोजित करें ।
      नोट: भंवर हर बार NaOH जोड़ा जाता है ताकि बायोइंक अच्छी तरह से अंय अभिकर्मकों के साथ मिलाया जाता है ।

4. रियालॉजिकल विश्लेषण

  1. प्रायोगिक सेटअप
    1. रेलोलॉजिकल गुणों का आकलन करने के लिए पीडीईसीएम बायोइंक का 1.5% (डब्ल्यू/वी) तैयार करें।
    2. एक रीओमीटर के दर-नियंत्रित मोड में 20 मिमी शंकु प्लेट ज्यामिति (2° कोण के साथ 20 मिमी का शंकु व्यास) स्थापित करें।
    3. पीडीईसीएम बायोइंक के चिपचिपाहट, जेलेशन काइनेटिक्स और गतिशील मॉड्यूलस को मापने के लिए स्थापित सॉफ्टवेयर (ट्रिओस) में प्रायोगिक दृश्य बनाएं।
      1. चिपचिपाहट: थाली पर pdECM बायोइंक रखें। 15 डिग्री सेल्सियस के निरंतर तापमान पर 1 से 1,000एस -1 तक बढ़ती कतरनी दर के तहत पीडीईसीएम बायोइंक के जटिल चिपचिपाहट (Pa's) को मापें।
      2. जेलेशन काइनेटिक्स: प्लेट पर पीडीईसीएम बायोइंक रखें। 5 डिग्री सेल्सियस/मिन (टाइम-स्वीप मोड) की वृद्धिशील वृद्धि दर के साथ पीडीईसीएम बायोइंक के भंडारण और हानि मॉड्यूलस को 4-37 डिग्री सेल्सियस पर मापकर जटिल मॉड्यूलस (जी *) की गणना करें।
      3. डायनेमिक मॉड्यूलस: माप से पहले 60 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट पर पीडीईसीएम बायोइंक रखें। 2% तनाव पर 0.1-100 रेड/एस की सीमा में पीडीईसीएम बायोइंक के आवृत्ति-निर्भर भंडारण मॉड्यूलस (जी') और हानि मॉड्यूलस (जी') को मापें।

5. आइलेट का उपयोग करके अग्नाशय के ऊतकों की 3 डी सेल प्रिंटिंग

  1. इक्का-दुक्का आइलेट्स की तैयारी
    1. पिछले काम5में वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार प्राथमिक आइलेट्स को चूहे से अलग करें ।
    2. अलग आइलेट से मलबे और मृत कोशिकाओं को अलग करने के लिए, एक 70 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन पारित करें। 70 माइक्रोन से छोटे व्यास वाले आइलेट्स को मृत या असामान्य माना जाता है।
    3. आरपीएमआई-1640 मीडियम में इक्का-दुक्का आइलेट्स को सस्पेंड करें और उन्हें पेट्री डिश पर रखें। बायोसेफ्टी कैबिनेट में माइक्रोस्कोप (4x ऑब्जेक्टिव लेंस) के तहत पी200 वॉल्यूम पिपेट का उपयोग करके व्यास में 300 माइक्रोन से बड़े आइलेट्स निकालें।
  2. आइलेट pdECM बायोइंक में encapsulation
    1. पीएच समायोजित पीडीईसीएम बायोइंक और अलग आइलेट तैयार करें।
      नोट: पीएच समायोजन से पहले जेलेशन से बचने के लिए, इस प्रक्रिया को बर्फ पर किया जाना चाहिए।
    2. धीरे-धीरे पीडीईसीएम बायोइंक और मीडिया को आइलेट्स (अनुपात 3:1) के साथ निलंबित मिलाएं जब तक कि समान रूप से मिश्रित होने तक सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग किया जा सके।
      नोट: पीडीईसीएम बायोइंक की अंतिम एकाग्रता 1.5% है और पीडीईसीएम बायोइंक में सेल घनत्व 3,000 आईईक्यू/एमएल है।
  3. अग्नाशय के ऊतकों की 3डी सेल प्रिंटिंग निर्माण
    1. एक निष्फल सिरिंज और 22 जी नोजल तैयार करें।
      नोट: इस गेज को 100-250 माइक्रोन के व्यास के साथ आइलेट्स प्रिंटकरने के लिए चुना गया था।
    2. सिरिंज में आइलेट से लदी पीडीईसीएम बायोइंक लोड करें।
    3. बायोइंक को अनुकूलित मुद्रण स्थिति (फ़ीड दर: 150 मिमी/मीन; वायवीय दबाव: 15 केपीए) के साथ जाली के आकार में 18 डिग्री सेल्सियस पर प्रिंट करें।
    4. बायोइंक को क्रॉसलिंक करने के लिए, मुद्रित निर्माण को 30 मिन के लिए इनक्यूबेटर में रखें।
    5. मुद्रित निर्माण को आइलेट कल्चर मीडिया में विसर्जित करें जो आरपीएमआई-1640 मध्यम है जो 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 100 यू/एमएल पेनिसिलिन और 100 यू/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक है।

6. पैटर्न संरचना के साथ अग्नाशय के निर्माण की 3 डी सेल प्रिंटिंग

  1. बायोइंक के दो प्रकार की तैयारी
    1. कई बायोइंक का उपयोग करके मुद्रण बहुमुखी प्रतिभा को मान्य करने के लिए, पीडीईसीएम बायोइंक के दो सेट तैयार करें और उन्हें क्रमशः 1:20 के अनुपात में प्रत्येक पीडीईसीएम बायोइंक में 0.4% ट्राइपैन ब्लू और गुलाब बंगाल समाधान जोड़कर दाग दें।
      नोट: पीएच समायोजन से पहले जेलेशन से बचने के लिए, यह प्रक्रिया बर्फ पर आयोजित की जानी चाहिए।
    2. धीरे-धीरे पीडीईसीएम बायोइंक और मीडिया को आइलेट्स (अनुपात 3:1) के साथ निलंबित मिलाएं जब तक कि समान रूप से मिश्रित होने तक सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग किया जा सके।
      नोट: पीडीईसीएम बायोइंक की अंतिम एकाग्रता 1.5% है और पीडीईसीएम बायोइंक में सेल घनत्व 3,000 आईईक्यू/एमएल है।
  2. बहुभौतिकआधारित अग्नाशय के ऊतकों की 3डी सेल प्रिंटिंग का निर्माण
    1. निष्फल सीरिंज और एक 25 जी नोजल तैयार करें।
    2. प्रत्येक बायोइंक (नीले और लाल) को क्रमशः दो अलग-अलग सीरिंज में लोड करें।
    3. अनुकूलित मुद्रण स्थिति के साथ बायोइंक प्रिंट (फ़ीड दर: 150 मिमी/मीन; वायवीय दबाव: 15 केपीए) नीले और लाल रंग की बारी वाली रेखाओं के साथ जाली के आकार में 18 डिग्री सेल्सियस पर।
    4. बायोइंक को क्रॉसलिंक करने के लिए, मुद्रित निर्माण को 30 मिन के लिए इनक्यूबेटर में रखें।
    5. मुद्रित निर्माण को आइलेट कल्चर मीडिया में विसर्जित करें जो आरपीएमआई-1640 मध्यम है जो 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 100 यू/एमएल पेनिसिलिन और 100 यू/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक है।

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Representative Results

अग्नाशय के ऊतकों का विसेशियीकरण
हमने 3 डी बायोप्रिंटेड ऊतक निर्माण(चित्रा 2ए)में आइलेट्स की कार्यक्षमता बढ़ाने के लिए अग्नाशय के ऊतक-विशिष्ट माइक्रोवातावरण प्रदान करने के लिए पीडीईसीएम बायोइंक तैयार करने की प्रक्रिया विकसित की है। विसेलुलराइजेशन प्रक्रिया के बाद, डीएसडीएनए के 97.3% को हटा दिया गया था और कोलेजन और गाग जैसे प्रतिनिधि ईसीएम घटक क्रमशः देशी अग्नाशय के ऊतकों की तुलना में 1278.1% और 96.9% पर रहे(चित्रा 2बी)।

बायोइंक तैयारी
मुद्रण प्रक्रिया में पीडीईसीएम लागू करने के लिए, पीडीसीएम पाउडर को पेप्सिन के साथ कमजोर एसिड में घुलनशील किया गया था और 10 एम नाओएच समाधान का उपयोग करके निष्क्रिय कर दिया गया था। पचाने वाला पीडीईसीएम समाधान तब सेल कल्चर मीडियम या 1x पीबीएस के साथ मिक्सिंग के जरिए पतला हो सकता है । इस अध्ययन में, हमने आगे के अध्ययन के लिए 1.5% की अंतिम एकाग्रता पर पीडीईसीएम बायोइंक तैयार किया। पीडीईसीएम बायोइंक ने एक समाधान चरण बनाए रखा जब इसे कमरे के तापमान के नीचे रखा गया था और तुरंत 30 न्यूनतम के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के बाद जेल चरण में परिवर्तित कर दिया गया था। आइलेट्स पर पीडीईसीएम बायोइंक के प्रभाव की जांच करने के लिए, पीडीईसीएम, अल्गिनेट और कोलेजन बायोइंक में 1.5% की एकाग्रता पर अलग-थलग आइलेट्स को समझाया गया था। ग्लूकोज से उत्तेजित इंसुलिन स्राव परीक्षण के परिणाम से पता चला कि पीडीईसीएम बायोइंक में आइलेट्स ने प्रयोगात्मक समूहों के बीच उच्चतम सूचकांक (लगभग 3.174) का प्रतिनिधित्व किया, जो आइलेट एनकैप्सुलेशन5के लिए व्यापक रूप से लागू हाइड्रोगेल पर उच्च कार्यक्षमता का संकेत देता है।

रियालॉजिकल विश्लेषण
प्रिंट करने योग्य बायोमटेरियल पर विचार करते समय चिपचिपाहट महत्वपूर्ण विशेषताओं में से एक है। हमने पीडीईसीएम बायोइंक की चिपचिपाहट को 15 डिग्री सेल्सियस से लेकर 15 डिग्री सेल्सियस तक की आवृत्ति पर मापा , जो विभिन्न डीईसीएम बायोइंक6,7,8मुद्रण के लिए था । pdECM bioink कतरनी पतला व्यवहार दिखाया और मूल्य 1/s की कतरनी दर पर लगभग 10 Pa's था, pdECM bioink का संकेत एक नोजल के माध्यम से बाहर निकलने के लिए उचित rheological विशेषताओं था(चित्रा 3ए)। 4 से 37 डिग्री सेल्सियस तक के तापमान पर जेलेशन काइनेटिक्स ने शारीरिक रूप से प्रासंगिक तापमान पर पीडीईसीएम बायोइंक के जेलेशन व्यवहार का संकेत दिया। जब तापमान 15 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच गया तो जटिल मॉड्यूलस बढ़ने लगा और तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने पर यह तेजी से बढ़ गया, जो पीडीईसीएम बायोइंक(चित्रा 3बी)के सोल-जेल संक्रमण का संकेत है। प्रिंटिंग प्रक्रिया के बाद इसकी स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक तापमान पर गतिशील जी और जी की जांच की गई, जिसके परिणामस्वरूप आवृत्ति स्वीप स्थिति(चित्रा 3सी)के तहत एक स्थिर मॉड्यूलस हो गया।

3डी सेल प्रिंटिंग
माइक्रोएक्सट्रशन-आधारित प्रिंटिंग प्रक्रिया का उपयोग करके 3डी सेल-लादेन अग्नाशय के ऊतकों के निर्माण को निर्मित किया गया था। कम से कम 3,000 आइलेट समकक्ष (आईईक्यू) वाले निर्माण का निर्माण करने के लिए, जो 150 माइक्रोन9के व्यास के साथ पूरी तरह से गोलाकार आइलेट के ऊतक ों की मात्रा से मेल खाता है, हमने 10 मिमी x 10 मिमी x 3 मिमी(चित्र 4ए)के आयाम के साथ निर्माण डिजाइन किया। अग्नाशय आइलेट्स मुद्रण के लिए प्रक्रिया मापदंडों और शर्तों को आइलेट्स को समझाने के लिए चुना गया था, जो व्यास में 100-250 माइक्रोन(चित्रा 4बी)से लेकर आकार ों में बड़े सेलुलर क्लस्टर हैं। एक बहु-प्रमुख मुद्रण प्रणाली का उपयोग करना, विभिन्न प्रकार के 3 डी निर्माण- जैसे नीले और लाल रंग की वैकल्पिक लाइनें रखने वाली जाली के आकार को विकसित पीडीईसीएम(चित्र4सी)का उपयोग करके गढ़े गए थे, जो ऊतक जैसी व्यवस्था में दो या अधिक प्रकार की जीवित कोशिकाओं में सामंजस्य स्थापित करने के लिए 3डी बायोप्रिंटिंग के उद्देश्य से पीडीईसीएम की बहुमुखी प्रतिभा का संकेत देता है।

Figure 1
चित्रा 1: विसेलुलर अग्नाशय के ऊतकों के विकास की योजनाबद्ध, पीडीईसीएम बायोइंक का मूल्यांकन और 3 डी अग्नाशय के ऊतकों का निर्माण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: डीईसीएम के विसहीकरण प्रक्रिया और जैव रासायनिक लक्षण वर्णन की प्रतिनिधि छवियां। (A)पोर्सिन अग्नाशय के ऊतकों के विसेलुलराइजेशन का अवलोकन। (ख)देशी ऊतक और पीडीईसीएम के जैव रासायनिक परखों के परिणाम । त्रुटि बार मानक विचलन दिखाते हैं। कॉपीराइट (2019) रॉयल सोसायटी ऑफ केमिस्ट्री5. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: पीडीईसीएम बायोइंक का रियालॉजिकल विश्लेषण। (A)पीडीईसीएम और कोलेजन बायोंक्स की चिपचिपाहट जिसने कतरनी पतले व्यवहार का प्रदर्शन किया। (ख)तापमान परिवर्तन के दौरान पीडीईसीएम और कोलेजन बायोइंक्स के जेलेशन काइनेटिक्स । (ग)क्रॉसलिंक्ड पीडीईसीएम और कोलेजन बायोइंक्स का जटिल मॉड्यूलस। रॉयल सोसायटी ऑफ केमिस्ट्री5का कॉपीराइट (2019) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: 3 डी अग्नाशय के ऊतकों के निर्माण के लिए सेल-लादेन पीडीईसीएम बायोइंक की 3डी सेल प्रिंटिंग। (A)3डी अग्नाशय के ऊतकों के आयाम ों का निर्माण करता है। (ख)अग्नाशय आइलेट-लादेन और(सी)बहुसामग्री आधारित 3 डी अग्नाशय के ऊतकों का निर्माण करता है । रॉयल सोसायटी ऑफ केमिस्ट्री5का कॉपीराइट (2019) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में पीडीईसीएम बायोइंकके के विकास और 3डी अग्नाशय के ऊतकों के निर्माण को 3 डी सेल प्रिंटिंग तकनीकों का उपयोग करके वर्णित किया गया है। 3 डी इंजीनियर ऊतक निर्माण में लक्ष्य ऊतक के माइक्रोएनवायरमेंट को फिर से तैयार करने के लिए, बायोइंक का चुनाव महत्वपूर्ण है। पिछले अध्ययन में, हमने इस बात को मान्य किया कि स्टेम सेल भेदभाव और प्रसार10को बढ़ावा देने के लिए ऊतक-विशिष्ट डीईसीएम बायोइंक्स फायदेमंद हैं। सिंथेटिक पॉलिमर की तुलना में, डीसीईसीएम ऊतक-विशिष्ट संरचना और वास्तुकला11के कारण सेल-अनुकूल वातावरण के रूप में काम कर सकता है। इसलिए, डीसीएम में प्रमुख घटकों की उच्च अवधारण के लिए विकोशियीकरण प्रक्रिया पर गंभीरता से विचार किया जाना चाहिए।

अग्नाशय के ऊतकों के विकेशिष्ट के लिए विभिन्न डिटर्जेंट का चयन अवशिष्ट ईसीएम घटक12में भिन्न होता है . विसेलुलराइजेशन की प्रक्रिया में, हमने देखा कि सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) का उपयोग ईसीएम प्रोटीन13के नुकसान को प्रभावित कर सकता है। इस प्रकार, हमने एसडीएस समाधान के उपचार के लिए कदम को नष्ट करके अपने पिछले प्रोटोकॉल को संशोधित किया, जो एक आयनिक सर्फेक्टेंट है जिसका उपयोग कई सफाई और विसेलुलराइजेशन प्रक्रियाओं में किया जाता है, जिसमें ट्रिऑन-एक्स 100, या 3-[(3-चोलामिडोप्रोपिल) डाइमेथिल-लैमोनियो]-1-प्रोपेनसल्नेट (चैप्स) जैसे अन्य लोगों की तुलना में अपेक्षाकृत कठोर विशेषताओं की विशेषता होती है। इस प्रोटोकॉल में, हमने एसडी एस एसएस समाधान के बजाय 84 घंटे के लिए 1% ट्राइटन-एक्स 100 समाधान का उपयोग किया, जो गाग्स और कोलाजस प्रोटीन को संरक्षित करते समय सेलुलर घटकों को प्रभावी ढंग से हटाने में सक्षम था। इसके अलावा, हमने कहा कि आईपीए के साथ इलाज करके अवशिष्ट लिपिड को हटाना भी पीडीईसीएम बायोइंक के क्रॉसलिंकिंग को प्रेरित करने के लिए एक बहुत महत्वपूर्ण प्रक्रिया है और इसे पहले प्रकाशित अनुच्छेद4के समान संदर्भ में समझा जा सकता है। विसेसेलुलर ऊतक की नसबंदी के लिए परेसेटिक एसिड समाधान के साथ उपचार भी लागू किया गया था। इसके अलावा, डिसेलुलर ऊतक में शेष डिटर्जेंट और रसायनों को हटाना भड़काऊ मेजबान प्रतिक्रिया को रोकने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। हालांकि, हमने इस प्रोटोकॉल में उस मुद्दे पर चर्चा नहीं की । जिन प्रोटोकॉलों में विकोशियीकरण के अंत में एक स्वच्छता प्रक्रिया शामिल है, वे विकोशिकीकृत सामग्री की जैव अनुकूलता में सुधार करेंगे। इसके अलावा, मूल्यांकन मानदंडों के लिए मानकों को सुनिश्चित करने के लिए कि डिटर्जेंट और रसायनों को पूरी तरह से हटा रहे है पर विचार किया जाना चाहिए ।

पेप्सिन के साथ पीडीसीएम बायोइंक का पाचन कोलेजस प्रोटीन में टेलोपेटाइड क्षेत्र के क्लीवेज द्वारा अम्लीय समाधान में पीडीसीएम पाउडर के समरूप मिश्रण को प्राप्त करने के लिए किया गया था। पीएच समायोजन प्रक्रिया में, जेलेशन के संरक्षण के लिए बर्फ पर पीडीईसीएम बायोइंक रखना महत्वपूर्ण है। इसके बाद, हम शारीरिक रूप से क्रॉसलिंकेबल पीडीईसीएम प्री-जेल बायोइंक का उत्पादन कर सकते हैं जो 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग करके जेल राज्य में प्रवेश कर सकते हैं, जो डीसीएम-आधारित बायोइंक्स के मुख्य फायदों में से एक है। पीडीईसीएम बायोइंक की उचित एकाग्रता का चयन भी महत्वपूर्ण10है । एक आदर्श बायोइंक को कोशिकाओं को बाहरी क्षति से बचाना चाहिए जो मुद्रण प्रक्रिया के दौरान होता है जैसे वायवीय दबाव और तापमान परिवर्तन। यह ज्ञात है कि लागू कतरनी बल कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है और मुद्रित निर्माण10में कोशिका व्यवहार्यता को कम कर सकता है । इसके अलावा, बायोइंक की सांद्रता को बढ़ाने से सेल डेथ5को प्रेरित कर सकता है। इसके विपरीत, बायोइंक की कम सांद्रता कम चिपचिपाहट को प्रेरित करती है जिसका अर्थ है मुद्रण के दौरान खराब प्रिंटेबिलिटी और आकार-निष्ठा। बायोइंक की चिपचिपाहट की जांच करना और इसकी एकाग्रता को अनुकूलित करना आवश्यक है।

वर्तमान में, शोधकर्ता सक्रिय रूप से 3 डी ऊतक मुद्रण के लिए विभिन्न प्रकार के ऊतक-व्युत्पन्न बायोइंकके के विकास का अध्ययन कर रहे हैं14,15,16का निर्माण करता है। इन अध्ययनों के परिणामों से संकेत मिलता है कि बायोइंक कोशिकाओं के लिए ऊतक-विशिष्ट माइक्रोवातावरण प्रदान कर सकता है। ये अनूठी स्थितियां स्टेम सेल के भेदभाव या परिपक्वता और कोशिकाओं के प्रसार को बढ़ावा दे सकती हैं। इसके अलावा, मल्टी-हेड लैस 3डी सेल-प्रिंटिंग सिस्टम का उपयोग करने से एक साथ उच्च परिशुद्धता के साथ कई प्रकार के बायोइंक प्रिंट करना संभव हो जाता है। इस तकनीक का उपयोग करके, एक विशिष्ट पैटर्न वाली संरचना का उत्पादन किया जा सकता है, इस प्रकार डिजाइन बहुमुखी प्रतिभा दिखा ता है। इसके अलावा, देशी सेल व्यवस्था17की नकल करने के लिए प्रत्येक बायोइंक में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं को समझाना संभव है। इन नमूनों संरचनाओं का उपयोग सेल-टू-सेल इंटरैक्शन में सुधार करके संवहनी करण या सह-संस्कृति प्रभाव को शामिल करने में किया जा सकता है, जो विशिष्ट कोशिकाओं18,19के दीर्घकालिक अस्तित्व में प्रमुख कारक हो सकते हैं।

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Disclosures

कोई नहीं.

Acknowledgments

इस शोध को कोरियाई सरकार (एमएसआईटी) (2017M3A9C6032067) और "आईसीटी कॉनसिलिज क्रिएटिव प्रोग्राम" (आईआईटीपी-2019-2011-1-00783) द्वारा वित्त पोषित राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) के जैव और चिकित्सा प्रौद्योगिकी विकास कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था। आईआईटीपी (सूचना एवं संचार प्रौद्योगिकी योजना एवं मूल्यांकन संस्थान) द्वारा पर्यवेक्षण किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological Safety Cabinets CRYSTE PURICUBE 1200
Deep Freezer Thermo Scientific Forma 957
Digital orbital shaker DAIHAN Scientific DH.WSO04010
Dry oven DAIHAN Scientific WON-155
Freeze dryer LABCONCO 7670540
Fridge SANSUNG CRFD-1141
Grater ABM 1415605793
Inverted Microscopes Leica DMi1
Microcentrifuge CRYSTE PURISPIN 17R
Microplate reader Thermo Fisher Scientific Multiskan GO
Mini centrifuge DAIHAN Scientific CF-5
Multi-Hotplate Stirrers DAIHAN Scientific SMHS-6
Nanodrop Thermo Fisher Scientific ND-LITE-PR
pH benchtop meter Thermo Fisher Scientific STARA2110
Rheometer TA Instrument Discovery HR-2
Vortex Mixer DAIHAN Scientific VM-10
Cirurgical Instruments
Operating Scissors Hirose HC.13-122
Forcep Korea Ace Scientific HC.203-30
Materials
1.7 mL microcentrifuge tube Axygen MCT-175-C
10 ml glass vial Scilab SL.VI1243
40 µm cell strainer Falcon 352340
5 L beaker Dong Sung Science SDS 2400
50 mL cornical tube Falcon 352070
500 mL beaker Korea Ace Scientific KA.23-08
500 mL bottle-top vacuum filter Corning 431118
500 mL plastic container LOCK&LOCK INL301
96well plate Falcon 353072
Aluminum foil DAEKYO
Kimwipe Kimtech
Magnetic bar Korea Ace Scientific BA.37110-0003
Mortar and pestle DAIHAN Scientific SC.MG100
Multi-channel pipettor Eppendorf 4982000314
Petri Dish SPL 10100
pH indicator strips Sigma-Aldrich 1095350001
Sieve filter mesh DAIHAN Scientific
Decellularization
10x pbs Hyclone SH30258.01
4.7% Peracetic acid Omegafarm
70% ethanol SAMCHUN CHEMICALS E0220 SAM
Distilled water
IPA SAMCHUN CHEMICALS samchun I0348
Triton-X 100 Biosesang T1020
Biochemical assay
1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt Sigma-Aldrich 341088
10 N NaOH Biosesang S2018
Chloramine T Sigma-Aldrich 857319
Chondroitin sulfate A Sigma-Aldrich C4384
Citric acid Supelco 46933
Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C1276
Glacial acetic acid Merok 100063
Glycine Sigma-Aldrich 410225
HCl Sigma-Aldrich H1758
Na2-EDTA Sigma-Aldrich E5134
NaCl SAMCHUN CHEMICALS S2097
Papain Sigma-Aldrich p4762
P-DAB Sigma-Aldrich D2004
Perchloric acid Sigma-Aldrich 311421
Sodium acetate Sigma-Aldrich S5636
Sodium hydroxide Supelco SX0607N
Sodium phosphate(monobasic) Sigma-Aldrich RDD007
Toluene Sigma-Aldrich 244511
Bioink
Charicterized FBS Hyclone SH30084.03
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Pepsin Sigma-Aldrich P7215
Rose bengal Sigma-Aldrich 198250
RPMI-1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154

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References

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