Optokardiografi och elektrofysiologi studier av ex vivo Langendorff-parfymera hjärtan

Medicine
 

Summary

Syftet med denna studie var att etablera en metod för att undersöka hjärtats dynamik med hjälp av en translationell djurmodell. Den beskrivna experimentella metoden innehåller Dual-emission optokardiografi i samband med en Elektrofysiologisk studie för att bedöma elektrisk aktivitet i en isolerad, intakt svin hjärt modell.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Swift, L. M., Jaimes III, R., McCullough, D., Burke, M., Reilly, M., Maeda, T., Zhang, H., Ishibashi, N., Rogers, J. M., Posnack, N. G. Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts. J. Vis. Exp. (153), e60472, doi:10.3791/60472 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Små djurmodeller används oftast inom kardiovaskulär forskning på grund av tillgången på genetiskt modifierade arter och lägre kostnader jämfört med större djur. Men större däggdjur lämpar sig bättre för translationella forskningsfrågor med anknytning till normal hjärtfysiologi, patofysiologi och preklinisk testning av terapeutiska medel. För att övervinna de tekniska hinder som är förknippade med att anställa en större djurmodell i Hjärtforskning, beskriver vi en metod för att mäta fysiologiska parametrar i ett isolerat, Langendorff-perfused Nasse hjärta. Denna metod kombinerar två kraftfulla experimentella verktyg för att utvärdera tillståndet i hjärtat: elektrofysiologi (EP) studie och samtidig optisk kartläggning av transmembranspänning och intracellulära kalcium med parameter känsliga färgämnen (RH237, Rhod2-AM). De beskrivna metoderna lämpar sig väl för translationella studier som undersöker hjärtats retledningssystem, förändringar i potentiell morfologi, kalcium hantering, excitation-kontraktion och incidensen av hjärt växlar eller Arytmier.

Introduction

Hjärt-kärlsjukdom är en ledande orsak till sjukdom och död i hela världen. Som sådan är ett primärt forskningsfokus att optimera metoder som kan användas för att studera normal hjärtfysiologi och bakomliggande mekanismer som kan bidra till sjuklighet och dödlighet hos människor. Grundläggande kardiovaskulär forskning har traditionellt förlitat sig på små djurmodeller, inklusive gnagare och kaniner1,2,3, på grund av tillgången på genetiskt modifierade arter4,5, lägre kostnad, mindre experimentellt fotavtryck och högre dataflöde. Användningen av en gris modell har dock potential att ge mer kliniskt relevanta data6. Tidigare studier har dokumenterat likheter i kardiell elektrofysiologi (EP) mellan människor och svin, inklusive liknande Jon strömmar7, actionpotential form8, och svar på farmakologiska tester9. Dessutom har svin hjärtat kontraktila och avslappning kinetik som är mer jämförbara med människor än antingen gnagare eller kaniner10. Jämfört med en Hundarnas modell, den porcin koronar anatomi närmare liknar ett mänskligt hjärta11,12 och är en modell för val för studier fokuserade på hjärt utveckling, pediatrisk kardiologi och/eller medfödda hjärtfel 13. även om det finns skillnader mellan svin och mänskligt hjärta8, dessa likheter gör svin hjärta en värdefull modell för kardiovaskulär forskning14.

Retrograd perfusion av hjärtat har blivit ett standardprotokoll för att studera hjärt Dynamics ex vivo15 sedan första inrättades av Oskar langendorff16. Följaktligen kan Langendorff-perfusion användas för att stödja ett isolerat, intakt hjärta i avsaknad av autonoma influenser. Denna modell är ett användbart verktyg för att direkt Jämföra kardiell elektrofysiologi och kontraktilitet mellan friska och icke-friska hjärtan. Eftersom hjärtats dynamik är både temporally och rumsligt komplex kan en liten förändring i en region dramatiskt påverka hela hjärtats förmåga att arbeta som syncytium17. Därför är hög spatiotemporal avbildning av parameter känsliga färgämnen ett användbart verktyg för att övervaka hjärtfunktionen över ytan av hjärtat18,19. Samtidig dubbel avbildning av spänning och kalcium känsliga lysrör möjliggör bedömning av elektrisk aktivitet, kalcium hantering och excitation-kontraktion på vävnadsnivå20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Langendorff-perfusion och/eller optiska kartläggnings tekniker har tidigare använts för att dokumentera nedgången i hjärt prestanda på grund av åldrande eller genetiska mutationer, och för att bedöma säkerheten för farmakologiska agens eller miljöexponeringar29 ,30,31,32,33.

I den kliniska inställningen, en invasiv kardiell elektrofysiologi studie används ofta för att undersöka hjärtrytmrubbningar, identifiera patologier, och lokalisera möjliga behandlingsalternativ. Likaså beskriver vi ett EP-protokoll som kan användas för att bedöma sinus Node funktion, mäta atrioventrikulär överledning, och identifiera refraktäritet av myokardvävnad. Den beskrivna EP-studien kan utföras i samband med optisk kartläggning, eller optokardiografi34, för att till fullo karakterisera hjärtats fysiologi i isolerade hjärtan. I det beskrivna protokollet utfördes en hög spatiotemporal upplösning fluorescens Imaging med en kombination av spänning (RH237) och kalcium (Rhod-2AM) färgämnen i en dual emission setup. Dessutom, kardiell elektrofysiologi parametrar övervakades under både sinus rytm och som svar på programmerad elektrisk stimulering.

Protocol

Alla experiment utfördes i enlighet med National Institutes of Health Guide för vård och användning av försöksdjur (åttonde upplagan). Alla metoder och protokoll som används i dessa studier har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning protokoll kommittén på Children ' s National Hospital enligt riktlinjer för vård och användning av försöksdjur som publicerats av NIH. Alla djur som används i denna studie fick Human Care i enlighet med handledningen för vård och användning av försöksdjur.

1. förberedelser

  1. Förbered 6 L av modifierad Krebs-Henseleit lösning16 (mM: 118,0 nacl, 3,3 kcl, 1,2 MgSO4, 24,0 NAHCO3, 1,2 KH2Po4, 10,0 glukos, 2,0 Natriumpyruvat, 2% albumin, 2,0 CaCl2). Lägg CaCl2 på dagen för experimentet, eftersom över tid, i närvaro av fosfater, kalciumklorid kommer terminalt fällning ur lösningen som kalciumfosfat.
  2. Justera pH till 7,4 efter steril filtrering (porstorlek: 0,22 μm). Kontrollera lösningens osmolalitet för att säkerställa en räckvidd på 275 − 310 mOsm/kg. Cool 1 L på is för användning omedelbart efter att hjärtat är excised. Värm 3 L i ett vattenbad till cirka 37 ° c före bubblande med carbogen (95% O2,5% Co2).
    Anmärkning: Uppvärmningen minimerar bubblor och potentiell embolism, eftersom kall vätska har en ökad kapacitet av gas för att lösa upp; Därför, som den modifierade Krebs-Henseleit Media passerar genom perfusion systemet och värmer, gasen kommer att släppas som bubblor.
  3. Bered 2 L kardioplegia (modifierad del Nido kardioplegia lösning, tabell 1). Frys tillräckligt med cardioplegia i en Ice Cube bricka för att fylla en 500 mL bägare.
  4. Sätt på de cirkulerande vatten Baden inställd på 42 ° c. Slå på pumparna för att cirkulera parfymen i en sluten hydronisk värmeslinga (för en fullständig förteckning över material, se tabell över material och figur 1).
    Anmärkning: En uppvärmd cirkulerande vattenbad används för att värma vatten-jacketed rör och värmeväxlare.
  5. Rengör rör kretsar och kammare genom att köra 2 L av en 1% lösning av universalmedel i vatten genom systemet. Skölj alla rör kretsar och kamrarna i Langendorff-systemet med > 4 L renat vatten. Kör pumpar tills allt vatten har avlägsnats från systemet.
  6. Tillsätt ett syntetiskt membranfilter i linje med per fusions pumparna (polypropenfilter, porstorlek > 5 μm). Gas en microfiber oxygenator (hemofilter) med 95% O2 och 5% Co2 vid 80 kPa.
    Anmärkning: När du använder albumin, det finns ofta skumning i samband med syresättning och/eller pumpning aktivitet genom slangen kretsen. En anti-skum förening (antifoam Y30 emulsion) kan läggas droppvis regelbundet (~ varje 30 min) för att släcka den när den inträffar.
  7. Kontrollera en tvåpunktskalibrering (0 och 60 mmHg) för tryckgivaren placerad ovanför aorta eller i bubbelfällan; Kalibrera efter behov.
  8. Omedelbart innan hjärtat excision, häll media i Langendorff loop perfusion system. Se till att parfymen passerar genom mikrofiberoxygenatorer (hemofilters) gasade med syrat parfymisat, som sedan strömmar genom värmeväxlare för att upprätthålla en Media-perfusattemperatur på 37 ° c vid aorta.
  9. Ställ cirkulerande vattenbadet till några grader högre än 37 ° c, såsom 42 ° c, för att ta hänsyn till värmeförluster under utbyte och i hela systemet. Övervaka den cirkulerande perfusattemperaturen med termoelement.

2. Heart excision och Langendorff-perfusion

  1. Sedate grisen med en intramuskulär (I.M.) injektion av ketamin (20 mg/kg) och xylazin (2 mg/kg) och intubera med endotrakealtub. För induktion, administrera en intravenös (I.V.) bolusinjektion av fentanyl (50 μg/kg) och rokuronium (1 mg/kg). Upprätthåll anestesi med inhalerad isofluran (0,5 − 3%), fentanyl (10 − 25 μg/kg) och pankuronium (1 mg/kg).
    Anmärkning: För denna studie av proof-of-principle användes juvenila Yorkshire-grisar (14 − 42 dagar gamla, n = 18) som varierade mellan 2,5 − 10,5 kg kroppsvikt och 18 − 137 g hjärtvikt (figur 2). Om en ytterligare injektion för induktion är nödvändig, kan ketamin (10 mg/kg) injiceras I.M.
  2. När djuret är helt sövda och icke-lyhörd, utföra en sternotomi att exponera stigande aorta och höger förmak.
    1. Med hjälp av en skalpell, göra en mittlinjen snitt från toppen av bröstbenet vid bröst inloppet, ner till xiphoid processen. Med en diatermi (eller sax), dissekera den underliggande fett och muskler tills bröstbenet är synlig.
    2. Från xiphoid processen, skär bröstbenet mittlinjen upp genom manubrium med antingen kirurgiska bensax eller en Bensåg. Sätt tillbaka upprullningsdon i snittet för att exponera hjärtat.
  3. Ge en bolusdos av heparin (300 U/kg) till höger Atria, med hjälp av en 18 G nål och spruta, för att minimera blot blodproppar vid organ excision. Placera absorberande kuddar i bröstet hålighet och is runt hjärtat.
  4. Med sax, försiktigt skära igenom hjärtsäcken, isolera aorta av trubbig dissektion från omgivande bindväv, och klämma aorta strax under den första arteriella grenen på aortabågen. Med en 50 mL spruta med en 18 G nål, injicera iskall cardioplegia (20 mL/kg) genom toppen av aorta ascendens.
  5. Skär genom de fartyg som leder till hjärtat och ta bort hjärtat med stigande aorta intakt och störta exciderade hjärtat i iskalla cardioplegia.
  6. Greppa väggarna i aorta med ett par Peanger och glida den på en räfflad kanyl bifogas slangar som leder till 1 L iskall kardioplegia Media upphängd ovanför hjärtat (~ 95 cm för att ge ~ 70 mm Hg). Låt vätskan att komma in och fylla aorta tills den flödar över för att förhindra att någon bubbla från att komma in i vaskulaturen.
    Anmärkning: Användning av en mekanisk uncoupler (2, 3-butanedione monoxim [BDM] eller blebbistatin) kommer att minska den koronar perfusion hastighet som syrebehovet av vävnaden minskar.
  7. Säkra aorta till kanyl med navel band och ytterligare förankra det genom att binda upp Peanger att bära vikten av hjärtat, som nu hänger från kanyl (figur 1c). Låt kylan media att retrograd parfymera hjärtat vid ett konstant tryck på 70 mmHg via gravitation. Håll hjärtat nedsänkt i kallt kardioplegia tills det är färdigt att överföras till det värmda (37 ° c) Langendorff-per fusions systemet (< 10 min).
    Anmärkning: Aorta på mindre hjärtan (< 50 g, upp till 2 veckor gammal gris) kommer att bära vikten av hjärtat men större hjärtan riskerar att glida av kanyl. Under den initiala kanyleringen och när du flyttar till det värmda systemet, förhindra luft från att komma in i aorta, vilket kan orsaka koronar emboli. Använd stora Bore slangar (> 3/8 "invändig diameter) som gör att bubblor att stiga snabbare än den lösning som kommer in i aorta.
  8. Överför hjärtat till Langendorff-systemet (37 ° c) utan att tillföra luft in i kanylen. Tillåt normal sinus rytm att spola vaskulaturen av kvarvarande blod och cardioplegia.
    Anmärkning: I den beskrivna studien observerades en genomsnittlig initial flödeshastighet på 184 ± 17 mL/min i isolerade juvenila Nasse-hjärtan. Flödeshastigheten sjönk till 70 ± 7,5 mL/min (medelvärde ± SEM) efter att ha parfymerat med värmda medier som innehåller en mekanisk uncoupler (20 mM BDM). Sänk inte ihop hjärt vävnaden, eftersom det kan inkräkta på hjärt-avbildning. Vävnads temperaturen upprätthålls av koronarflödet i gris hjärtat på grund av dess större volym och mindre yta, jämfört med gnagare. Under fullt flöde, den epicardium och endokardium temperaturerna varierade från 35 ° c till 37 ° c, respektive.
    Försiktighet: Använd lämplig personlig skyddsutrustning, inklusive ögon förslitning när du arbetar med mekaniska uncouplers. Hjärtat kan mata ut media snabbt och oväntat.
  9. Defibrillera hjärtat i händelse av chockbar arytmier (ventrikulär takykardi, ventrikelflimmer) genom att placera externa paddlar i spetsen och basen av hjärtat och leverera en enda chock på 5 j, ökar i 5 j steg (eller som kan väljas av defibrillator) tills 50 J, elkonvertering eller un-shockable rytm. Upprepa stötar på 50 J vid behov.
    Anmärkning: I den presenterade studien krävde 89% av preparaten defibrillering. Efter jämvikt (~ 10 min) observerades en snittpuls på 70 ± 4,5 BPM (medelvärde ± SEM) för juvenila Nasse-hjärtan (figur 2).
  10. Spola hjärtat med minst 1 L modifierat Krebs-Henseleit-medium, utan recirkulerande, för att avlägsna kvarvarande blod och cardioplegia. När medierna löper klart genom hjärtat, Stäng cirkulations slingan för att återcirkulera parfymen.

3. undersökning av elektrofysiologi

  1. För att spela in en standard bly II elektrokardiogram (EKG) under hela studien, bifoga en 29 G nål elektrod till ventrikulära epicardium nära spetsen, med en annan elektrod i höger förmak. Anslut de positiva och negativa ingångarna på en differential bio förstärkare till Apex och höger förmak, respektive.
  2. Bifoga en bipolär stimulans elektrod på höger Atria, och en andra bipolär stimulans elektrod till den laterala vänstra ventrikeln för pacing ändamål.
  3. Pace hjärtat med hjälp av en elektrofysiologi stimulator, med den initiala strömmen inställd på dubbelt den diastoliska tröskeln (1 − 2 mA) och en 1 MS Pulse bredd35,36.
    Anmärkning: Om stimuleringen inte framkallar ett svar, kan pulsbredden ökas upp till 2 MS. mer ström (~ 10X) behövs med stora koaxialelektroder (bipolär stimulering).
  4. Identifiera tröskeln för pacing genom att använda en serie stimulans impulser (1 − 2 mA, 1 MS pulsbredd) vid definierade tempo cykellängder (PCL) för att säkerställa konsekvent stimulans reaktion.
    Anmärkning: När den inneboende hastigheten är etablerad, kan den initiala impuls tåget börja på en något kortare PCL.
  5. Utför extrastimulus pacing med antingen en S1 − S1 eller S1 − S2 pacing Train, i det senare ett tåg av 6 − 8 impulser (S1) följdes av en enda impuls (S2). Minska den S2 PCL stegvis med 10 ms (dvs., 200 MS, 190 MS, 180 MS, etc.) tills den inte kan fånga. Steg upp till den näst sista PCL (dvs., 190 MS) och minska i 1 MS intervall för att hitta den mest exakta PCL innan förlusten av fångst (dvs., 184 MS).
    Anmärkning:
    samma stimuleringsparametrar används för både S1 och S2 (1 − 2 Ma, 1 MS pulsbredd). Se figur 3 för representativa exempel, eller tidigare publicerade värden på svin Heart elektrofysiologi mätningar37.
    1. För att fastställa ventrikulär effektiv refraktär period (VERP), använda stimulans elektroden på den laterala vänstra ventrikeln att identifiera den kortaste S1 − S2 intervall där S2 (för tidig Beat) initierar ventrikulär depolarisering.
      Anmärkning: Refraktärperioden är det kortaste möjliga kopplings intervallet S1 − S2.
    2. För att definiera Wenckebachs cykel längd (WBCL), Använd stimulans elektroden på höger förmak för att hitta det kortaste S1 − S1-intervallet vid vilket 1:1 atrioventrikulär överledning sprider sig via den normala lednings vägen.
      Anmärkning: Underlåtenhet att göra det representerar 2nd grad hjärtblock.
    3. För att definiera sinusnodens återhämtningstid (SNRT), Använd stimulans elektroden på höger förmak för att applicera ett pacing-tåg (S1 − S1) och mät tidsfördröjningen mellan den sista impulsen i pacing-tåget och återhämtningen av spontan sinoatriell nodmedierad aktivitet.
    4. För att etablera atrioventrikulär nod effektiv refraktärperiod (AVNERP), Använd stimulus elektrod på höger förmak för att hitta det kortaste S1 − S2-kopplingsintervallet där den förtida förmaksstimulering följs av en bunt potential som framkallar en QRS komplex, vilket innebär ventrikulär depolarisering.

4. optisk kartläggning av Transmembranspänning och intracellulär kalcium

Anmärkning: En mekanisk uncoupler bör användas för att minimera rörelse artefakter under optisk kartläggning och för att undvika hypoxi3,38,39,40. (-/-) Blebbistatin (5 μM cirkulerande koncentration) kan tillsättas långsamt som en bolusdos på 0,5 mM i 5 mL perfusat (100x slutlig koncentration)41. Alternativt kan BDM initialt ingå i parfymen med en cirkulerande koncentration på 20 mM.

  1. Förbered spännings färgen genom att lösa 5 mg RH237 i 4 mL vattenfri DMSO. Späd färgämnet alikvot med upp till 5 mL media och Vortex. Tillsätt långsamt RH237 (62,1 μg per 500 mL perfusat) proximalt till aorta kanyl.
    Anmärkning: Myokardvävnaden kan på nytt färgas med RH237, om det behövs, under hela experimentet.
  2. Förbered kalcium färgen genom att lösa 1 mg Rhod2-AM i 1 mL vattenfri DMSO. Blanda färgämnet med 50 μL av Pluronic syra, placera i en 37 ° c sonikering bad i upp till 10 min, och sedan späd med upp till 5 mL media. Tillsätt långsamt kalcium färgämnet (50 μg per 500 mL perfusat) proximalt till aorta kanyl.
    Anmärkning: För att säkerställa en enhetlig färg färgning, bör färgämnen tillsättas långsamt (> 30 s). Rhod-2AM tar upp till 10 min för att nå Peak fluorescens, medan RH237 fläckar hjärtat inom en 1 − 2 min. med den beskrivna Dye lastning, signal-brus-förhållande (SNR) intervall av ~ 42 − 86 och ~ 35 − 69 för spänning och kalcium, respektive, kan förväntas. SNR-värden kan beräknas som SNR = (topp-till-toppantal)/(standard avvikelse under diastoliskt intervall)42.
  3. Placera bild maskinvaran (kamera, bild delare, lins) så som visas i figur 1, för att fokusera på ett lämpligt synfält.
    Anmärkning: Splitter är konfigurerad med en Dichroic spegel (660 + nm) som passerar RH237 och reflekterar Rhod2 emission Spectra. Högtransmissions-utsläppsfilter används för RH237 (710 nm Long pass) och Rhod2 (585 ± 40 Nm) utsänt ljus (lång pass ET710, se tabell över material). En wide-elev 50 mm/F 0,95 l-objektiv är fäst på framsidan av bild delaren. Denna konfiguration resulterar i tillräcklig utsläpps ljus separation, som tidigare validerade43,44.
  4. Anslut kameran till en arbetsstation och hämta bilder med vald programvara, med en exponeringstid på 0,5 − 2 MS. Utför bildjustering med hjälp av programvara som kan dela upp önskade regioner, overlay, och visa en grå skala subtraktion eller pseudo-Color Förutom att markera feljustering (se tabell över material för programvarualternativ).
  5. Stäng av rumsbelysningen för att minimera fluorescensinterferensen från omgivande belysning. Testa LED-lamporna (525 nm, 1,4 mW/mm2) före starten av bilden för att säkerställa en jämn och maximal epikardiell belysning, vilket bestäms av sensorn och djupet.
    Anmärkning: Varje ljus leds genom ett magnetiseringen filter (535 ± 25 nm). LED-lampor kan aktiveras manuellt innan inspelningen för att maximera signalen linearitet. Utsänd fluorescens från epicardium leds genom bild delaren och emissions filtren. Delade bilder projiceras på en snabb sensor. Synfältet är ca 12 cm x 10 cm, eller 5,9 cm x 4,7 cm för varje delad bild, beroende på objektivets val och avstånd från hjärtat.
  6. För optiska kartläggnings studier, bild av hjärtmuskeln under sinusrytm, ventrikelflimmer (figur 4) eller dynamisk pacing (S1 − S1, 1 − 2 Ma, 1 MS Pulse Width) via en stimuleringselektor placerad på vänster kammare (figur 5). Börja med en tempo cykel längd på 350 MS, och minska med 10 − 50 ms för att generera restitutionskurvor (figur 5e)35,36.

5. rensning

  1. Ta bort hjärtat från systemet och dränera alla perfusate. Skölj system slangen och kamrarna med renat vatten.
  2. För rutinmässigt underhåll, skölj systemet regelbundet med rengöringslösning eller utspädd Väteperoxidlösning efter behov.

6. data behandling

  1. Bekräfta optisk signalkvalitet genom hela studien genom att öppna en videofil, välja en region av intresse, och plottning Mean fluorescens över tid med hjälp av en lämplig programpaket eller anpassad algoritm.
  2. Analysera bild data som tidigare beskrivits23,33,43,45,46, för att kvantifiera åtgärdspotential och kalcium övergående temporala parametrar, inklusive aktiveringstid, spänning-kalcium koppling tid (skillnaden mellan VM och ca Aktiveringstider), och repolarisering varaktighet mätningar.
    1. Använd tröskelvärde för att isolera fluorescerande epikardiella pixlar och ignorera bullriga bakgrundsdata.
      Anmärkning: Thresholding kommer att förenkla och påskynda analysen över stora videor.
    2. Rumsligt filtrera optiska signaler över en epikardiell yta med kärna storlekar från 3 mm x 3 mm till 5 mm x 5 mm, som framgår av figur 4 och figur 5.
      Anmärkning: Den senare kommer att förbättra SNR utan snedvridning åtgärder potentiella funktioner, kalcium övergående morfologi, eller övergripande kontur av vågfronter19,47. Detta kan vara onödigt om du använder en sensor med stora pixlar eller om Binning under förvärvet.
    3. Temporally filter signaler med ett digitalt lågpassfilter (t. ex., 5: e-Beställ Butterworth) med en cutoff frekvens mellan 100 och 75 Hz för att eliminera obetydlig signal innehåll45.
      Anmärkning: Se figur 5c för ett exempel på representativa bearbetade spår.
    4. Applicera drift borttagning och subtraktion, via NTH-Beställ polynom montering, för att minimera effekterna av photoblekning, rörelse, eller andra betydande källor till variation.
    5. Efter bearbetning och normalisering av optiska data över en hel video, beräkna actionpotential och kalcium övergående parametrar av intresse. Bestäm aktiveringstid, definierad som tiden för maximal derivata under depolarisering, och Peak fluorescens för att beräkna repolarisering procent gånger och perioder (action potentiell varaktighet [APD] och [ca2 +] jag varaktighet [CAD], se Figur 5).
    6. Efter temporala parametrar beräknas, generera isochronal kartor att skildra aspekter av en enda åtgärd potential eller kalcium övergående över hela avbildas epikardiell yta med hjälp av anpassade algoritmer23,33, 43,45,46.
      Anmärkning: Se figur 5D för ett exempel.

Representative Results

Figur 1a visar ett diagram över det isolerade hjärt per fusions systemet, som omfattar rör krets, pump, filter, oxygenator, reservoarer och värmeelement. Placeringen av EKG (lead II-konfiguration) och pacing-elektroder visas i figur 1b, och bild installationen avbildas i figur 1c. En schematisk av de optiska komponenterna och ljus banorna visas i figur 1d.

Experimentella studier utfördes på intakt, hela hjärtan isolerade från juvenila Yorkshire svin (14 − 42 dagar, n = 18) som varierade i storlek från 2,5 − 10,5 kg kroppsvikt och 18 − 137 g hjärta vikt (figur 2A). Efter att ha överfört det isolerade hjärtat till ett Langendorff-system (37 ° c), stabiliserades hjärtfrekvensen till 70 ± 4,5 BPM (medelvärde ± SEM) inom ~ 10 min av defibrillering och förblev konstant under hela studiens varaktighet (figur 2b). En genomsnittlig flödeshastighet på 184 ± 17 mL/min (medelvärde ± SEM) mättes, vilket avtog till 70 ± 7,5 mL/min efter att ha parfymerat med värmda medier som innehåller en mekanisk uncoupler (figur 2C).

Bly II-EKG registrerades under hela studiens varaktighet under sinusrytm (figur 3a) eller som svar på externt tempo (figur 3B-E) för att kvantifiera elektrofysiologiska parametrar. För EP-utvärdering tillämpades Dynamic pacing (S1 − S1) på höger förmak för att lokalisera WBCL och SNRT (återhämtningstid efter S1 − S1 inleds, figur 3c), VARVID wbcl var betecknade som den kortaste PCL som initierade förmakt till ventrikulär överledning. En S1 − S2 pacing protokoll genomfördes med hjälp av en bipolär stimulans elektrod på vänster kammare för att identifiera den kortaste kopplingsintervall som initierade ventrikulär depolarisering, därmed precisera VERP (figur 3D). Alternativt, ett S1 − S2 förmaksflimmer-protokoll appliceras på Pinpoint AVNERP (S1 − S2), som visas i figur 3E. Representativa exempel på Pig Heart elektrofysiologi parametrar anpassa nära med dem som tidigare publicerats37.

Optiska kartläggning experiment utfördes under sinusrytm, spontan ventrikelflimmer (figur 4), eller under dynamisk pacing (S1 − S1) av vänster kammare (LV) för att generera elektriska och kalcium återbördande kurvor som avbildas i Figur 5. Representativa bilder av en Dye-Loaded Nasse hjärta visas i figur 4 med motsvarande optiska åtgärder potentialer (VM) och kalcium (ca) transienter som samlats in från två regioner av intresse på epikardiell yta (höger kammare [RV] = blå, LV = röd) . Obearbetade signaler visas under sinus rytm och under ventrikelflimmer. Som tidigare nämnts, dynamisk epikardiell pacing (S1 − S1) användes också under optisk kartläggning experiment för att normalisera någon liten skillnad i den inneboende hjärtfrekvensen (figur 5A-E). RAW-signaler visas (RV = blå, LV = röd), som användes för att skildra aktionspotentialen – kalcium övergående kopplingstid (figur 5c), aktiverings-och varaktighetstid (figur 5D), elektrisk och kalcium återlämnande (figur 5e). För tjocka hjärt preparat, spatial filtrering med kernel storlek ~ 3 mm x 3 mm är lämplig för epikardiell åtgärd potential eller kalcium transitorisk analys19,47. Därför är bilder med hög rumslig upplösning (i den beskrivna inställningen 1240 x 1024 totalt, eller 620 x 512 per kanal, 6,5 μm pixelstorlek) ofta rumsligt papperskorgen under eller efter förvärvet (figur 5c). Bildbehandling kan utföras för att generera aktiverings-och repolariseringskartor med anpassade algoritmer23,33,43,45 (figur 3D), med aktiveringstiden för varje pixel på hjärtat definierades som den maximala derivat av åtgärden potentiella eller kalcium övergående upstroke.

Figure 1
Bild 1: experimentell inställning. A) diagram över det isolerade hjärt per fusions systemet. pilar betecknar flödesriktningen. (B) ett kanylerat hjärta visas med elektrodplacering. RA = höger Atria, RV = höger kammare, LV = vänster kammare, EKG = elektrokardiogram för bly II. C) bild plattformen i nära anslutning till hjärt vävnaden. D) utsläpp av varje kompletterande sond (spänning, kalcium) separeras med våglängd med hjälp av en bild delnings anordning med lämpliga emissions filter och Dichroic spegel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: hjärtvikt, hastighet och flödesmätningar. A) hjärtvikt till kroppsvikt för varje gris som används i studien (n = 18). (B) hjärtfrekvens mätt ~ 10 min efter defibrillering och igen vid studiens (ca 1 h). (C) koronar flödet sjunker precipitously efter perfusion med en mekanisk uncoupler (+ BDM) på grund av minskad syre efterfrågan. Skalstreck representerar medelvärdet ± SEM. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: representativa exempel på bly II elektrokardiogram inspelningar som samlats in under sinusrytm eller som svar på extern pacing. (A) normal sinus rytm. (B) exempel på epikardiell pacing vid cykellängden på 400 MS (S1 − S1), som användes för bild experiment. (C) topp: förmaksflimmer för att identifiera WBCL; lyckad fångst observeras vid S1 = 250 MS vari förmaks till ventrikulär överledning observeras. Observera att förmaksflimmer kan användas för att bestämma SNRT (tid till sinus noden urladdning, efter att ha inlett extern pacing). Bottom: eftersom S1 cykellängden minskas till 205 MS, överledning till ventrikeln misslyckas. (D) topp: epikardiell pacing (S1 − S2) för att identifiera verp; lyckad fångst observeras vid S1 = 450 ms, S2 = 300 MS. bottom: som S2 cykellängden minskas till 250 MS, ventrikulär vävnad inte fånga. E) förmaksflimmer (S1 − S2) för att identifiera AVNERP. Överst: lyckad fångst observeras vid S1 = 450 ms, S2 = 200 MS. bottom: som S2 cykellängden minskas till 199 MS, överledning till ventrikeln misslyckas. Blå pilar betecknar pacing spikar, röda pilar betecknar Capture ("C") eller ingen fångst ("NC"). S1 − S1 = dynamiskt tempo, S1 − S2 = extrastimulus pacing. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: optisk data under sinusrytm och ventrikelflimmer. Vänster: representativa bilder av en Dye-Loaded gris hjärta (VM = spänning, RH237; Ca = kalcium, Rhod2), främre vy. Rumsligt filtrerad transmembranspänning och intracellulär kalcium fluorescerande signaler från en gris hjärta under sinus rytm (Center). Och kalcium signaler under ventrikelflimmer (höger). Signal regions storlekar (15 x 15 pixlar = 2,4 x 2,4 mm2, 30 x 30 = 4,8 x 4,8 mm2 kernel size) representeras som röda och Blå rutor. Enheter = ΔF/F. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: optiska data från Langendorff-parfymera gris hjärtan. Obearbetade, rumsligt filtrerade (a) transmembranspänning och (B) intracellulära kalcium fluorescens signaler från höger och vänster kammare under elektrisk pacing på spetsen. Ofiltrerade, rumsligt genomsnitt signaler skildrar optiska åtgärder potentialer och kalcium transienter från regioner av intresse (signalenheter är ΔF/F). (C) en överlagring av normaliserade transienter illustrerar actionpotential-kalcium övergående kopplingstid (Low-pass filtreras vid 75 Hz). D) bearbetning av signaler över epikardiell yta för att generera isochronala kartor över temporala parametrar, inklusive aktiveringstid (tact) och 80% repolariseringstid. E) elektriska och kalciumtransienta restitutionskurvor som genereras vid multipla frekvenser (till vänster) med statistisk analys (höger) för att illustrera längre repolariseringstid vid långsammare tempo. Skalstreck = medelvärde ± SEM. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kemiska Formel Molekylvikt g/L
Natriumklorid Nacl 58,44 5,26
Natriumglukonat C6H11Nao7 218,14 5,02
Natriumacetattrihydrat C2H3Nao2• 3H2O 136,08 3,68
Kaliumklorid KCl 74,55 0,63
Magnesiumklorid (vattenfri) MgCl2 95,21 0,1405
8,4% natriumbikarbonat NaHCO3 84,01 13
Mannitol C6H14O6 182,17 16,3
Magnesiumsulfat MgSO4 120,37 4
Ph 7,4
Osmolaritet (mOsmol/L) 294

Tabell 1: modifierad del Nido ' s cardioplegia recept.

Discussion

Även om kardiovaskulära forskningsmodeller sträcker sig från cellulära till in vivo preparat, det finns en inneboende avvägningar mellan klinisk relevans och experimentell nytta. På detta spektrum är det isolerade Langendorff-parfymiserade hjärtat en nyttig kompromiss för att studera kardiologisk fysiologi48. Hela hjärt modellen representerar en högre nivå av funktionell och strukturell integration än encellig eller vävnads monolayers, men undviker också den störande komplexiteten i samband med in vivo-modeller. En stor fördel vid dubbla optiska kartläggnings experiment är att den epikardiella ytan av det isolerade hjärtat kan observeras, och fluorescensavbildning av transmembranpotential och kalcium hantering kan användas för att övervaka kardiologisk fysiologi34.

Gnagare modeller används oftast för isolerade hjärt preparat i motsats till större djur, delvis på grund av den tillhörande kostnaden för upp-dimensionering alla element som berörs (t. ex. lösningsvolym, perfusion krets, kvantitet av färgämnen och mekaniska uncouplers) tillsammans med större instabilitet och benägenhet för arytmier hos större djur10,36,49. En fördel med att använda gris hjärtan är att de liknar det mänskliga hjärtat i struktur, storlek och hastighet av kontraktion, därför mer exakt modellering hemodynamiska parametrar som koronar blodflöde och hjärt minut effekt. Likaså, människor och grisar har liknande kalcium hantering, elektrokardiogram intervall37, och åtgärd potentiell morfologi inklusive de underliggande kanalerna att den representerar12,50,51, 52. Detta protokoll beskriver i detalj stegen för att skapa en reproducerbar stor djurmodell för att utförligt karakterisera hjärtfunktionen. Samtidig avbildning av transmembranspänning (RH237) och intracellulärt kalcium (Rhod2), som används tillsammans med etablerade elektrofysiologiska protokoll, ger möjlighet att precisera mekanismer som är ansvariga för förändrade hjärt Funktion. Den beskrivna metoden kan användas för prekliniska säkerhetstest, toxikologisk screening och utredning av genetiska eller andra sjukdoms patologier. Dessutom kan den beskrivna metoden modifieras och anpassas för användning med andra hjärt modeller (t. ex. hund, människa) beroende på den specifika forskningsinriktningen53,54,55.

Det finns några viktiga ändringar att tänka på när du övergår från en mindre gnagare modell till en större gris modell för isolerade, hela hjärtat preparat. Under beredning och installation, rekommenderar vi att tillsätta albumin till parfymen för att bibehålla onkotiskt tryck och minska ödem (plus skumgummi, om det behövs)56,57,58,59. Dessutom kan vätska innehållande albumin också stöd i metaboliska studier som också kräver fettsyra-tillskott till media60,61. Till skillnad från gnagare hjärtan, den större gris hjärta behöver inte vara nedsänkt i varma medier på grund av dess mindre yta till volym förhållande och den ökade volymen av värmda medier som flyter genom kranskärlen som bättre upprätthåller temperaturen. Som nämnts tidigare, placerade vi temperaturprober inne i höger kammare och på epikardiell yta av både höger och vänster kammare, Observera endast smärre temperaturvariationer på 1 − 2 ° c på alla tre platser under hela studien. Viktigare, sådana snabbare flöden kan också öka sannolikheten för bubblor och en potentiell embolism. För att kringgå detta problem rekommenderar vi att du använder en bubbelfälla med stora borrslangar som leder rakt ner till aorta kanyl. Likaså fann vi det mest användbart för att ha två personer som arbetar tillsammans för att kanylera aorta på en större (och tyngre) hjärta; en person att hålla aorta öppna med robust Peanger och en annan för att säkra aorta till kanula med navel band. I den beskrivna metoden fann vi att perfusion med cardioplegia och defibrillering var avgörande för hjärt återhämtning, vilket strider mot gnagare hjärt preparat. Enligt vår erfarenhet, endast ett fåtal censurerade hjärtan återupptogs normal sinus-driven aktivitet utan elkonvertering.

För att förbättra optiska Imaging ändpunkter, en hängande hjärta beredning begränsade effekten av bländning som kan uppstå med ett nedsänkt hjärta. Dessutom, den hängande hjärtat undviker också någon kompression eller kompromiss av kranskärlen på den bakre delen av hjärtat som kan uppstå när du lägger hjärtat ner horisontellt för vertikal avbildning. Vi fann också att lastning fluorescerande färgämnen efter bubblan fällan (nära aorta kanyl) kraftigt förbättrad vävnad färgning och optiska signaler. Slutligen, för att förbättra kardiell Elektrofysiologisk effektmått, användning av en större koaxial stimulering elektrod underlättade framgångsrika förmaksflimmer. Även om vi beskriver användningen av elektrokardiogram för att identifiera fånga och förlust av fångst för olika EP parametrar, intrakardiell katetrar eller bipolär inspelnings elektroder kan också användas.

Vår studie var inriktad på att utveckla en metodik för dubbel optisk kartläggning och kardiell Elektrofysiologisk bedömning i en isolerad, intakt hjärt modell av svin. På grund av likheter med det juvenila mänskliga hjärtat är svin hjärtat en populär modell för studier inriktade på pediatrisk kardiologi eller medfödda hjärtfel. Viktigt, den beskrivna metoden kan anpassas för att användas med större medelstora vuxna hjärtan och/eller olika arter av intresse. Faktum är att andra laboratorier kan finna att användningen av hundarnas eller människors hjärtan (antingen givare eller sjuka) är mer tillämpliga för deras specifika forskningsfokus53,54,55. En annan potentiell begränsning till denna studie är användningen av en mekanisk uncoupler att minska rörelse artefakt under avbildning. Blebbistatin har blivit uncoupler av val i hjärt-avbildning applikationer på grund av dess minimala effekter på EKG-parametrar, aktivering och refraktär perioder41,62,63. BDM är ett billigare val, vilket kan vara särskilt viktigt i stora djurstudier som kräver större volymer av parfymen och mekanisk uncoupler, men det är känt att ha en större inverkan på kalium och kalcium strömmar som kan förändra actionpotential morfologi64,65,66,67. Om BDM används, Observera att APD förkortning ökar hjärtan sårbarhet för chock-inducerad arytmier68. Omvänt är den huvudsakliga begränsningen till att använda blebbistatin dess fotosensitivitet och fototoxicitet, även om alternativa formuleringar som har minskat dessa effekter69,70,71. Slutligen använder den beskrivna metoden ett enda kamerasystem för dubbel optisk kartläggning experiment, men det är viktigt att notera att forskningsstudier fokuserade på ventrikelflimmer och/eller spårning av elektriska vågor över epikardiell yta skulle behöva ändra denna metod för att inkludera tredimensionell panoramabild, som beskrivs av andra15,19,72,73,74,75 .

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna erkänner tacksamt Dr Matthew Kay för hjälpsam experimentell vägledning, och Manelle Ramadan och Muhaymin Chowdhury för tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (R01HL139472 to NGP, R01 HL139712 to NI), barnens forskningsinstitut, Children ' s National Heart Institute och Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical innovation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(-)-Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560-5MG Mechanical Uncoupler
2,3-Butanedione monoxime (BDM) Sigma-Aldrich B0753-100G Mechanical Uncoupler
Albumin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9418
Analog signal interface emka Technologies itf16USB
Antifoam Sigma-Aldrich A5758-250ML
Antifoam Y-30 Emulsion Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A5758
Aortic cannula, 5/16” Cole-Parmer 45509-60
Bubble trap Sigma-Aldrich CLS430641U-100EA
CaCl2 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ C77-500
Camera, sCMOS Andor Technology Zyla 4.2 PLUS
Coaxial stimulation electrode (atria) Harvard Apparatus 73-0219
Defibrillator Zoll M Series
Dichroic mirror Chroma Technology T660lpxrxt-UF2
Differential amplifier Warner Instruments DP-304A
Emission filter, calcium Chroma Technology ET585/40m
Emission filter, voltage Chroma Technology ET710lp
EP stimulator (Bloom) Fisher Medical DTU-215B
Excitation filter Chroma Technology CT510/60bp
Excitation lights Thorlabs SOLIS-525C
Filter McMaster-Carr 8147K52
Filter cartridge, polypropylene Pentair PD-5-934
Filter housing McMaster-Carr 9979T21
Flow transducer Transonic ME6PXN
Glucose Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 158968
Heating coil Radnoti 158821
Hemofilter Hemocor HPH 400
Hemostatic Forceps World Precision Instruments 501326
Image Splitter Cairn Research OptoSplit II
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P3911
KH2PO4 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ 423-316
Large-bore tubing, I.D. 3/8” Fisher Scientific 14-169-7H
Lens 50 mm, 0.95 f-stop Navitar DO-5095
Metamorph Molecular Devices Image Alignment
MgSO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M-7506
Mucasol detergent Sigma-Aldrich Z637181-2L
Na Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P2256
NaCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S-3014
NaHCO3 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ S-233
Needle Electrodes 29 G, 2 mm AD Instruments Inc. MLA1204
Noise eliminator Quest Scientific Humbug
Perfusion pump PolyStan A/S 1481
Pressure transducer World Precision Instruments BLPR2
Reservoir, 2 L Cole-Parmer UX-34541-07
RH237 AAT Bioquest Inc. 21480
Rhod2-AM AAT Bioquest Inc. 21062
Stimulation electrode (ventricle) Harvard Apparatus 73-0160
Surgical Suture McKesson Medical-Surgical 890186
Transducer amplifier World Precision Instruments TBM4M
Tubing flow console Transonic TS410
Umbilical tape Jorvet J0025UA
Water bath/circulator VWR 89400-970
Surgical Tools
Bandage shears Harvard Apparatus 72-8448 Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0 mm blade length, 17.0 cm
Electrocautery Dalwha Corp. Ltd. BA2ALD001 Model: 200 Basic
Hemostat Roboz RS-7476 St Vincent Tube Occluding Forceps
Hemostatic forceps Harvard Apparatus 72-8960 Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm
Hemostats Harvard Apparatus 72-8985 Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2 mm tip 14 cm
Mayo scissors WPI 501749 14.5 cm, Straight
Metzenbaum scissors WPI 501747 11.5 cm, Straight
Mosquito forceps Harvard Apparatus 72-8980 Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2 mm tip width 12 cm
Needle holder Harvard Apparatus 72-8828 Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length
Pediatric cross clamp Roboz RS-7660 Cooley-Derra Clamp 6.25" 5 mm Calibrations
Right angle forceps WPI 501240 Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14 cm, Right Angle
Scalpel Ted Pella 549-4 Scalpel Handle No. 4, 13.7 cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades
Scissors Harvard Apparatus 72-8380 Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42 mm blade,12 cm
Straight Serrated forceps WPI 500363 Dressing Forceps 15.5 cm
Towel clamp WPI 501700 Backhaus Towel Clamp, 13 cm, Curved, Locking handle, SS
Weitlaner retractor WPI 501314 Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2 cm, 2x 3 Sharp Prongs
Disposables
3-0 prolene suture Various vendors Various vendors
Vessel loop Aspen surgical 011001PBX Sterion® Vessel Loop, 0.8 mm x 406 mm
Cardioplegia (Plegisol) Pfizer 00409-7969-05 Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20 mL/kg
Heparin Various vendors Various vendors 300 U/kg
Syringe and Needle Various vendors Various vendors 60 mL & 18 G respectively
Umbilical tape Ethicon U12T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, L., De Jesus, N. M., Ripplinger, C. M. Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart. Journal of Visualized Experiments. (103), e53166 (2015).
  2. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2012).
  3. Asfour, H., Wengrowski, A. M., Jaimes, R., Swift, L. M., Kay, M. W. NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts. Journal of Visualized Experiments. (65), e4115 (2012).
  4. Capecchi, M. R. The new mouse genetics: altering the genome by gene targeting. Trends in genetic. 5, (3), 70-76 (1989).
  5. Hall, B., Limaye, A., Kulkarni, A. B. Overview: generation of gene knockout mice. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 19, Unit 19 1-17 (2009).
  6. Schechter, M. A., et al. An Isolated Working Heart System for Large Animal Models. Journal of Visualized Experiments. (88), e51671 (2014).
  7. Arlock, P., et al. Ion currents of cardiomyocytes in different regions of the Göttingen minipig heart. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 86, 12-18 (2017).
  8. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of anatomy. 193, Pt 1 105-119 (1998).
  9. Markert, M., et al. Validation of the normal, freely moving Göttingen minipig for pharmacological safety testing. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 60, (1), 79-87 (2009).
  10. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141, (3), 235-249 (2014).
  11. Bertho, E., Gagnon, G. A comparative study in three dimension of the blood supply of the normal interventricular septum in human, canine, bovine, porcine, ovine and equine heart. Diseases of the Chest. 46, 251-262 (1964).
  12. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53, (5), 432-438 (2014).
  13. Camacho, P., Fan, H., Liu, Z., He, J. Q. Large Mammalian Animal Models of Heart Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3, (4), 30 (2016).
  14. Jordan, C. P., et al. Minimally Invasive Resynchronization Pacemaker: A Pediatric Animal Model. The Annals of Thoracic Surgery. 96, (6), 2210-2213 (2013).
  15. Rogers, J. M., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Kay, M. W. Panoramic optical mapping reveals continuous epicardial reentry during ventricular fibrillation in the isolated swine heart. Biophysical Journal. 92, (3), 1090-1095 (2007).
  16. Langendorff, O. Untersuchungen am uberlebenden Saugethierherzen [Investigations on the surviving mammalian heart]. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 61, 291-332 (1895).
  17. Pumir, A., Arutunyan, A., Krinsky, V., Sarvazyan, N. Genesis of ectopic waves: role of coupling, automaticity, and heterogeneity. Biophysical Journal. 89, (4), 2332-2349 (2005).
  18. Kay, M. W., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Rogers, J. M. Lifetimes of epicardial rotors in panoramic optical maps of fibrillating swine ventricles. American journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 291, (4), 1935-1941 (2006).
  19. Lee, P., et al. Low-Cost Optical Mapping Systems for Panoramic Imaging of Complex Arrhythmias and Drug-Action in Translational Heart Models. Scientific Reports. 7, 43217 (2017).
  20. Venkataraman, R., Holcomb, M. R., Harder, R., Knollmann, B. C., Baudenbacher, F. Ratiometric imaging of calcium during ischemia-reperfusion injury in isolated mouse hearts using Fura-2. BioMedical Engineering OnLine. 11, (1), 39 (2012).
  21. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical Imaging of the Heart. Circulation Research. 95, (1), 21-33 (2004).
  22. Zimmermann, W. H., et al. Three-dimensional engineered heart tissue from neonatal rat cardiac myocytes. Biotechnology and Bioengineering. 68, (1), 106-114 (2000).
  23. Jaimes, R., et al. A Technical Review of Optical Mapping of Intracellular Calcium within Myocardial Tissue. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310, (11), 1388-1401 (2016).
  24. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110, (4), 609-623 (2012).
  25. Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. S. Imaging Calcium Sparks in Cardiac Myocytes. Methods in Molecular Biology. 689, Clifton, N.J. 205 (2011).
  26. Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents. Frontiers in Physiology. 5, 344 (2014).
  27. Thomas, K., Goudy, J., Henley, T., Bressan, M. Optical Electrophysiology in the Developing Heart. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5, (2), 28 (2018).
  28. Nikolski, V., Efimov, I. Fluorescent imaging of a dual-pathway atrioventricular-nodal conduction system. Circulation Research. 88, (3), 23-30 (2001).
  29. Posnack, N. G., et al. Bisphenol A Exposure and Cardiac Electrical Conduction in Excised Rat Hearts. Environmental Health Perspectives. 122, (4), 384-390 (2014).
  30. Garrott, K., et al. KATP channel inhibition blunts electromechanical decline during hypoxia in left ventricular working rabbit hearts. The Journal of Physiology. 595, (12), 3799-3813 (2017).
  31. Wang, Z., et al. Exposure to Secondhand Smoke and Arrhythmogenic Cardiac Alternans in a Mouse Model. Environmental Health Perspectives. 126, (12), 127001 (2018).
  32. Francis Stuart, S. D., et al. Age-related changes in cardiac electrophysiology and calcium handling in response to sympathetic nerve stimulation. The Journal of Physiology. 596, (17), 3977-3991 (2018).
  33. Jaimes, R., et al. Plasticizer Interaction With the Heart: Chemicals Used in Plastic Medical Devices Can Interfere With Cardiac Electrophysiology. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 12, (7), (2019).
  34. Boukens, B. J., Efimov, I. R. A century of optocardiography. IEEE reviews in Biomedical Engineering. 7, 115-125 (2014).
  35. Li, N., Wehrens, X. H. Programmed Electrical Stimulation in Mice. Journal of Visualized Experiments. (39), e1730 (2010).
  36. Dor-Haim, H., Berenfeld, O., Horowitz, M., Lotan, C., Swissa, M. Reduced Ventricular Arrhythmogeneity and Increased Electrical Complexity in Normal Exercised Rats. PLoS ONE. 8, (6), 66658 (2013).
  37. Noszczyk-Nowak, A., et al. Normal Values for Heart Electrophysiology Parameters of Healthy Swine Determined on Electrophysiology Study. Advances in Clinical and Experimental. 25, (6), 1249-1254 (2016).
  38. Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R., Kay, M. W. NADH changes during hypoxia, ischemia, and increased work differ between isolated heart preparations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306, (4), 529-537 (2014).
  39. Schramm, M., Klieber, H. G., Daut, J. The energy expenditure of actomyosin-ATPase, Ca(2+)-ATPase and Na+,K(+)-ATPase in guinea-pig cardiac ventricular muscle. The Journal of Physiology. 481, 647-662 (1994).
  40. Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 314, (4), 704-715 (2018).
  41. Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4, (5), 619-626 (2007).
  42. Evertson, D. W., et al. High-Resolution High-Speed Panoramic Cardiac Imaging System. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55, (3), 1241-1243 (2008).
  43. Jaimes, R., et al. Path Splitter: A New Approach for Truly Simultaneous Dual Optical Mapping of the Heart with a Single Camera. bioRxiv. 651380 (2019).
  44. Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
  45. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303, (7), 753-765 (2012).
  46. O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9, (1), 1389 (2019).
  47. Mironov, S. F., Vetter, F. J., Pertsov, A. M. Fluorescence imaging of cardiac propagation: spectral properties and filtering of optical action potentials. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291, (1), 327-335 (2006).
  48. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55, (2), 113-126 (2007).
  49. Nishida, K., Michael, G., Dobrev, D., Nattel, S. Animal models for atrial fibrillation: clinical insights and scientific opportunities. Europace. 12, (2), 160-172 (2010).
  50. Verdouw, P. D., Van Den Doel, M. A., De Zeeuw, S., Duncker, D. J. Animal models in the study of myocardial ischaemia and ischaemic syndromes. Cardiovascular Research. 39, (1), 121-135 (1998).
  51. Camacho, P., Fan, H., Liu, Z., He, J. Q. Large Mammalian Animal Models of Heart Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3, (4), 30 (2016).
  52. Swindle, M. M., Makin, A., Herron, A. J., Clubb, F. J., Frazier, K. S. Swine as Models in Biomedical Research and Toxicology Testing. Veterinary Pathology. 49, (2), 344-356 (2012).
  53. Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical Volume of Human Myocardium Necessary to Maintain Ventricular Fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11, (11), 006692 (2018).
  54. Hill, A. J., et al. In Vitro Studies of Human Hearts. The Annals of Thoracic Surgery. 79, (1), 168-177 (2005).
  55. Fedorov, V. V., et al. Structural and functional evidence for discrete exit pathways that connect the canine sinoatrial node and atria. Circulation Research. 104, (7), 915-923 (2009).
  56. Jacob, M., et al. Albumin Augmentation Improves Condition of Guinea Pig Hearts After 4 hr of Cold Ischemia. Transplantation. 87, (7), 956-965 (2009).
  57. Segel, L. D., Ensunsa, J. L. Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 254, (6), 1105-1112 (1988).
  58. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41, (6), 613-627 (2000).
  59. Werner, J. C., Whitman, V., Fripp, R. R., Schuler, H. G., Morgan, H. E. Carbohydrate metabolism in isolated, working newborn pig heart. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 241, (5), 364-371 (1981).
  60. Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303, (2), 156-167 (2012).
  61. Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 13, (1), 168-172 (1989).
  62. Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302, (1), 262-269 (2012).
  63. Swift, L. M., et al. Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, (5), 503-512 (2012).
  64. Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart. Experimental Physiology. 89, (2), 163-172 (2004).
  65. Liu, Y., et al. Effects of diacetyl monoxime on the electrical properties of sheep and guinea pig ventricular muscle. Cardiovascular Research. 27, (11), 1991-1997 (1993).
  66. Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25, (45), 419-424 (2010).
  67. Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74, (6), 305-313 (1994).
  68. Cheng, Y., Li, L., Nikolski, V., Wallick, D. W., Efimov, I. R. Shock-induced arrhythmogenesis is enhanced by 2,3-butanedione monoxime compared with cytochalasin D. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, (1), 310-318 (2004).
  69. Kolega, J. Phototoxicity and photoinactivation of blebbistatin in UV and visible light. Biochemical and Biophysical Research Communications. 320, (3), 1020-1025 (2004).
  70. Sakamoto, T., Limouze, J., Combs, C. A., Straight, A. F., Sellers, J. R. Blebbistatin, a myosin II inhibitor, is photoinactivated by blue light. Biochemistry. 44, (2), 584-588 (2005).
  71. Várkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6, (1), 26141 (2016).
  72. Bray, M. A., Lin, S. F., Wikswo, J. P. Three-dimensional surface reconstruction and fluorescent visualization of cardiac activation. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 47, (10), 1382-1391 (2000).
  73. Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart. Journal of Biomedical Optics. 12, (4), 44019 (2007).
  74. Gloschat, C., et al. RHYTHM: An Open Source Imaging Toolkit for Cardiac Panoramic Optical Mapping. Scientific Reports. 8, (1), 2921 (2018).
  75. Kay, M. W., Amison, P. M., Rogers, J. M. Three-dimensional surface reconstruction and panoramic optical mapping of large hearts. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 51, (7), 1219-1229 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics