2,300 Views
•
12:15 min
•
February 08, 2022
DOI:
Detta protokoll ger mikrostrukturell insikt i strukturella patologiska sjukdomar på hela organskalan med hjälp av mikrodatortomografi. I detta protokoll implementeras en specialiserad vävnadsberedningsmetod för att optimera högupplöst avbildning av hela hjärtprover från translationella stora däggdjursmodeller hos människor med selektiv kontrastförbättring av strukturella sjukdomar. Hjärtmikrostrukturen såsom fördelningen av fibros och organisationen av det spännande myokardiet ligger till grund för ett brett spektrum av hjärtsjukdomar och sätter scenen för den livshotande arytmin.
Som demonstrerar proceduren kommer Nestor Pallares-Lupon, postdoktor och doktorand för mitt laboratorium. Börja med att förbereda en kardioplegisk lösning innehållande natriumheparin och förvara lösningen vid fyra grader Celsius. Förbered sedan PBS / EDTA genom att först tillsätta EDTA till en liter destillerat vatten för en 10 millimolär slutkoncentration.
Öka sedan och behåll lösningens pH vid 12 med användning av natriumhydroxid för att lösa upp EDTA. När EDTA är helt upplöst sänker du pH-värdet till 7,4 med saltsyra. Tillsätt sedan en foliepåse PBS för att erhålla en 0,01 mollösning med pH 7,4.
Förvara den beredda lösningen vid rumstemperatur. Slutligen bereda en 1% etanol PMA-kontrastmedelslösning genom att tillsätta 10 gram PMA till en liter absolut etanol. Förvara den beredda lösningen vid rumstemperatur.
Förbered en en liter behållare som stöds 80 centimeter över en dissektionsskål och koppla ett termoplastiskt rör till en avloppsport i behållaren. Fäst en trevägskran på dräneringsslangen och koppla ytterligare termoplastslangar till varje fri port på trevägskranen. Fäst tvåvägskranar i slangens fria ändar.
Fyll sedan behållaren med den kardioplegiska lösningen kompletterad med heparin. Öppna kranarna så att den kardioplegiska lösningen kan tömma alla luftbubblor. Stäng sedan tvåvägskranarna.
Efter att ha extraherat hjärtat från ett avlivat djur, placera det i kall kardioplegisk lösning lagrad på is tills den är klar för dissektion. Förbered sedan kanylen för vänster och höger koronar osteo genom att klippa fem centimeter PTFE-slang och värma ena änden genom att placera spetsen bredvid en öppen låga. När en millimeter av spetsen börjar smälta och blir genomskinlig, tryck spetsen mot en hård värmebeständig yta för att forma en ås vid kanylspetsen för att förhindra att kanylen glider ut ur kärlen och sätt sedan in en centimeter av den icke-uppvärmda änden av varje kanyl i de två ändarna av avloppsbehållarens dräneringsrör.
Ta sedan bort aortakanylen och lokalisera vänster och höger osteo i kransartärerna under den kalla kardioplegiska lösningen. Använd spetsig sax och separera försiktigt aortaroten från den omgivande vävnaden ovanför och under koronar osteo för att möjliggöra gängning av en nollmätare silkesutur under kranskärlet. Öppna sedan tvåvägskranarna och sätt in kanylspetsarna i kranskärls osteo.
Med kanylspetsarna som sträcker sig en till två centimeter in i osteo och bortom suturplaceringen, knyt av kanylen. Skölj sedan hjärtat medan du försiktigt masserar ventriklarna i 15 minuter tills hjärtat rensas av blod. Efter sköljning, stäng tvåvägskranarna, koppla bort dem från trevägskranen och överför hjärtat till en en liters kemisk resistent plastbehållare som innehåller 500 ml PBS / EDTA-lösning.
Återcirkulera PBS/EDTA-lösningen i termoplastslangen under en dragkåpa med en peristaltisk pump med två kanaler. Fyll pumpröret tills slangen saknar luftbubblor. Läs sedan varje kranskärlskanin genom återcirkulation vid rumstemperatur i två timmar vid 80 ml per minut.
Efter att ha säkerställt att dragskåpet är i drift, stoppa pumpen, töm lösningen från behållaren och byt ut den med 10% formalin för fixering i en timme vid 80 ml per minut. Läs hjärtat med hjälp av en serie ökande etanolkoncentrationer, som börjar med 20% etanol i minst tre timmar. Byt sedan ut 20% etanolen mot 30% etanol och perfuse i två timmar.
Fortsätt perfusionen genom att öka etanolkoncentrationen vid varje iteration med minsta perfusion på en timme vid varje koncentration. För att förstärka hjärtvävnaden före lufttorkning, återcirkulera en lika blandning av etanol och HMDS i 10 minuter följt av 100% HMDS i ytterligare två timmar. Stoppa perfusionspumpen, koppla sedan bort kanylen från slangen och stäng av hjärtat från en aorta sutur inuti dragskåpet.
Skjut försiktigt en blixtlåspåse över hjärtat och stäng påsförseglingen över suturen för att minska hjärtats exponering för den cirkulerande luften. Låt hjärtat torka genom avdunstning i en vecka. För diffusionsbelastningskontrastmedel, ta bort påsen.
Tvätta hjärtat i 100% etanol i 15 minuter med omrörning innan du nedsänker det i 100% etanol kompletterat med 1% PMA i 48 timmar under vakuum, täck sedan hjärtat med en blixtlåspåse som visats tidigare och låt det torka. Montera det lufttorkade hjärtat på en lämplig provhållare. För att förhindra rörelse under röntgenmikro-CT-mätningarna, använd en klämma förankrad i provhållaren och säkra hjärtat via den torkade och styva aortan.
Montera provhållaren i mikro-CT-skannern. Öppna sedan programvaran och starta röntgenmikro-CT-systemet. Ställ sedan in röntgenfiltret aluminium till en millimeter.
Röntgenkällans spänning till 60 kilovolt och ström till 120 mikroampere. Ställ dessutom in bilddimensionerna till 2 016 x 1 344 pixlar och pixelstorleken till 20 mikrometer. Scouta röntgenöverföringsbilder längs stödets längd för att bestämma det totala bildfältet i hjärtats längsgående åtkomst.
För skanning, använd ett rotationssteg på 0,18 grader, en ram i genomsnitt på fem och en provrotation på 180 grader genom att avmarkera alternativet för en 360 graders förvärv. Välj förskjutningsskanningsläget för att avbilda hela bredden på exempelstödet. Efter skanning, använd programvaran för tomografisk rekonstruktion av en isotrop tredimensionell bildvolym.
I slutspaningsprogramvaran använder du förvärvsrelaterad artefaktkorrigering, inklusive strålhärdningseffekter på 10% och ringartefaktreduktion på åtta. Använd sedan Data Viewer-programvaran och visualisera den rekonstruerade datastacken. Orientera provet digitalt inom bildgränserna för att justera provernas långa och korta axel med treprincipen en axel i bildvolymen.
Slutligen beskär du bildvolymen i alla tre axlarna för att ta bort bildens yttre bakgrundslager och maximalt minska den totala bildstorleken. Röntgenöverföringsavbildning av lufttorkade grishjärtan visar stora anatomiska landmärken inklusive ventrikulära håligheter och muskelväggen. Tomografiska rekonstruktioner av tredimensionella bildvolymer visade tydlig separation mellan vävnad och bakgrund vid epikardiella och endokardiella gränser.
Masons trikromfärgning visade kollagenpositiv färgning vid epitel- och endotelskikten paravaskulärt i subepikardiell vävnad. Ljusfältbelysning visade mörkare färg i kollagena strukturer efter PMA-färgning, vilket stöder den förmånliga ackumuleringen av PMA. PMA-färgade fluorescerande bilder av ventrikulära vävnadssektioner hade PMA-inducerad förlust av fluorescens vid platser av kollagen.
Där ett hjärtprov färgades med ett kontrastmedel via perfusion före lufttorkning, avslöjade bildrekonstruktion mycket fläckig färgning i myokardfacket. Dessutom visade vävnad med låg kontrast dålig separation från bakgrundsintensiteten. Mikro-CT-avbildning av en fårdel som lider av kronisk hjärtinfarkt avslöjade en central tät fibrotisk lesion omgiven av en lös och heterogen gränszon.
De största signalintensiteterna för rekonstruerade bildvolymer vid vävnadsgränserna och ärrregionerna visas här. Kontrastmedel färgade dåligt det friska myokardiet, men mikrostrukturell kontrast behölls. Vid gränszonen var ärrvävnad varvat med överlevande myokardium.
Tät fibros verkade transmural men ändå texturerad vilket indikerar variationer i kompositionen. Transmural vänster ventrikulär region av PMA-färgad vävnadsberedning visade selektiv färgning för kollagen och ingen färgning i regioner med överlevande myokardium. Längre perfusionstider med etanol rekommenderas för att säkerställa fullständigt utbyte av hjärtats vatteninnehåll med etanol.
Interaktioner mellan HMDS och vattnet producerar värme, vilket kan skada provet. En stark fördel med denna procedur är förmågan att validera mikro-CT-avbildning med hjälp av histologi. Lufttorkade prover kan bäddas in direkt i paraffin för sektionering av färgning och mikroskopavbildning.
Här presenterar vi ett protokoll för att få högupplösta mikrodatortomografibilder av friska och patologiska stora däggdjurshelhjärtan med kollagenselektiv kontrastförbättring.
Read Article
Cite this Article
Pallares-Lupon, N., Bayer, J. D., Guillot, B., Caluori, G., Ramlugun, G. S., Kulkarni, K., Loyer, V., Bloquet, S., El Hamrani, D., Naulin, J., Constantin, M., Dos Santos, P., Bernus, O., Jaïs, P., Pasdois, P., Walton, R. D. Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease. J. Vis. Exp. (180), e62909, doi:10.3791/62909 (2022).
Copy