Optokardiografi og Elektrofysiologi studier af ex vivo Langendorff-perfbrugte hjerter

Medicine
 

Summary

Formålet med denne undersøgelse var at etablere en metode til undersøgelse af hjertets dynamik ved hjælp af en translationel dyremodel. Den beskrevne eksperimentelle tilgang inkorporerer Dual-emission optocardiography i forbindelse med en elektrofysiologisk undersøgelse for at vurdere elektrisk aktivitet i en isoleret, intakt svine hjerte model.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Swift, L. M., Jaimes III, R., McCullough, D., Burke, M., Reilly, M., Maeda, T., Zhang, H., Ishibashi, N., Rogers, J. M., Posnack, N. G. Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts. J. Vis. Exp. (153), e60472, doi:10.3791/60472 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Små dyremodeller anvendes oftest i hjerte-kar-forskning på grund af tilgængeligheden af genetisk modificerede arter og lavere omkostninger i forhold til større dyr. Endnu, større pattedyr er bedre egnet til translationelle forskningsspørgsmål i forbindelse med normal hjertets fysiologi, Patofysiologi, og præklinisk testning af terapeutiske midler. For at overvinde de tekniske barrierer, der er forbundet med at ansætte en større dyremodel inden for Kardiologisk forskning, beskriver vi en tilgang til måling af fysiologiske parametre i et isoleret, Langendorff-perfektbrugt Grisling hjerte. Denne fremgangsmåde kombinerer to kraftfulde eksperimentelle værktøjer til at evaluere tilstanden af hjertet: Elektrofysiologi (EP) undersøgelse og samtidig optisk kortlægning af transmembran spænding og intracellulære calcium ved hjælp af parameter følsomme farvestoffer (RH237, Rhod2-am). De beskrevne metoder egner sig godt til translationelle undersøgelser, der undersøger det kardiale ledningssystem, ændringer i aktionspotentialet morfologi, calcium håndtering, excitation-sammentrækning kobling og forekomsten af hjerte vekslere eller Arytmier.

Introduction

Hjerte-kar-sygdom er en førende årsag til sygdom og død på verdensplan. Som sådan er en primær forskning fokus på at optimere metoder, der kan bruges til at studere normal hjertets fysiologi og underliggende mekanismer, der kan bidrage til sygelighed og dødelighed hos mennesker. Grundlæggende kardiovaskulær forskning har traditionelt været baseret på små dyremodeller, herunder gnavere og kaniner1,2,3, pågrund af tilgængeligheden af genetisk modificerede arter4,5, lavere omkostninger, mindre eksperimenterende fodspor og højere gennemløb. Brugen af en svine model har imidlertid potentiale til at give mere klinisk relevante data6. Faktisk, tidligere undersøgelser har dokumenteret ligheder i hjertets Elektrofysiologi (EP) mellem mennesker og grise, herunder lignende ion strømme7, action potentiel figur8, og respons på farmakologiske test9. Desuden, svine hjertet har kontraktile og afslapning kinetik, der er mere sammenlignelige med mennesker end enten gnavere eller kaniner10. Sammenlignet med en hunde model, den Porcin koronar anatomi mere ligner en menneskelig hjerte11,12 og er den model af valg for undersøgelser fokuseret på hjerte udvikling, pædiatrisk kardiologi og/eller medfødte hjertefejl 13. selv om der er forskelle mellem gris og menneskelige hjerte8, disse ligheder gør svin hjerte en værdifuld model for hjerte-kar-forskning14.

Retrograd perfusion af hjertet er blevet en standardprotokol for at studere hjertets dynamik ex vivo15 siden først etableret af Oskar Langendorff16. Derfor kan Langendorff-perfusion anvendes til at støtte et isoleret, intakt hjerte uden autonome påvirkninger. Denne model er et nyttigt værktøj til direkte at sammenligne hjertets Elektrofysiologi og kontraktilitet mellem sunde og ikke-sunde hjerter. Da hjertets dynamik både er timeligt og rumligt komplekst, kan en mindre ændring i én region dramatisk påvirke hele hjertets evne til at arbejde som syncytium17. Derfor er høj spatiotemporale billeddannelse af parameter følsomme farvestoffer et nyttigt værktøj til overvågning af hjertets funktion på tværs af hjertets overflade18,19. Faktisk giver simultan dobbelt billeddannelse af spænding og calcium-følsomme fluorescerende sonder mulighed for vurdering af elektrisk aktivitet, calcium håndtering og excitation-sammentrækning kobling på vævsniveau20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Langendorff-perfusion og/eller optisk kortlægnings teknik har tidligere været anvendt til at dokumentere nedgangen i hjertets ydeevne på grund af aldring eller genetiske mutationer og til at vurdere sikkerheden af farmakologiske agenser eller miljø eksponeringer29 ,30,31,32,33.

I de kliniske omgivelser, en invasiv kardiel Elektrofysiologi undersøgelse bruges ofte til at undersøge hjerterytmeforstyrrelser, identificere patologier, og lokalisere mulige behandlingsmuligheder. På samme måde beskriver vi en EP-protokol, der kan bruges til at vurdere sinus node funktion, måle atrioventrikulær ledning, og identificere refraktoriness af myokardievæv. Den beskrevne EP-undersøgelse kan udføres i forbindelse med optisk kortlægning, eller optokardiografi34, til fuldt ud at karakterisere hjertets fysiologi i isolerede hjerter. I den beskrevne protokol blev der udført en høj spatiotemporale opløsning fluorescens Imaging med en kombination af spænding (RH237) og calcium (rhod-2AM) farvestoffer i en dual emission opsætning. Derudover blev kardielle Elektrofysiologi parametre overvåget under både sinusrytme og som respons på programmeret elektrisk stimulation.

Protocol

Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health guide til pleje og brug af forsøgsdyr (ottende udgave). Alle metoder og protokoller, der anvendes i disse undersøgelser er blevet godkendt af den institutionelle Animal Care og brug protokol Udvalget på children's national Hospital efterretnings linjerne for pleje og anvendelse af forsøgsdyr offentliggjort af NIH. Alle dyr, der anvendes i denne undersøgelse, har modtaget human behandling i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af forsøgsdyr.

1. forberedelse

  1. Forbered 6 L modificeret Krebs-Henseleit løsning16 (mM: 118,0 nacl, 3,3 kcl, 1,2 mgso4, 24,0 NAHCO3, 1,2 KH2po4, 10,0 glucose, 2,0 natrium pyruvat, 2% albumin, 2,0 CaCl2). Tilsæt CaCl2 på dagen for forsøget, da calciumchlorid over tid, i nærværelse af fosfater, vil terminalt udfældet ud af opløsningen som calciumphosphat.
  2. PH-værdien justeres til 7,4 efter steril filtrering (porestørrelse: 0,22 μm). Kontrollér opløsningen osmolalitet for at sikre et interval på 275 − 310 mOsm/kg. Cool 1 L på is til brug umiddelbart efter at hjertet er fjernet. Varm 3 L i et vandbad til ca. 37 °C før boblende med carbogen (95% O2,5% Co2).
    Bemærk: Opvarmning minimerer bobler og potentiel emboli, da kold væske har en øget kapacitet af gas til at opløse; Derfor vil gassen blive frigivet som bobler, da de modificerede Krebs-Henseleit-medier passerer gennem perfusions systemet og varmer.
  3. Forbered 2 L kardioplegi (modificeret del Nido cardioplegi opløsning, tabel 1). Fryse nok cardioplegi i en isterning bakke til at fylde en 500 mL bægerglas.
  4. Tænd de cirkulerende vand bade sat til 42 °C. Tænd pumperne for at cirkulere perfusatet i et lukket hydronisk opvarmnings kredsløb (for en komplet liste over materialer, se tabel over materialer og figur 1).
    Bemærk: Et opvarmet cirkulerende vandbad bruges til at varme de vand-jacketed rør og varmevekslere.
  5. Rengør slange kredsløb og kamre ved at køre 2 L af en 1% opløsning af universalrengøringsmiddel i vand gennem systemet. Skyl alle slange kredsløb og-kamre i Langendorff-systemet med > 4 liter renset vand. Kør pumper, indtil alt vand er blevet fjernet fra systemet.
  6. Tilsæt et syntetisk membranfilter i overensstemmelse med perfusions pumperne (polypropylen filter, porestørrelse > 5 μm). Gas en microfiber oxygenatoren (hemofilter) med 95% O2 og 5% Co2 ved 80 kPa.
    Bemærk: Ved brug af albumin er der ofte skumning forbundet med iltning og/eller pumpe aktiviteten gennem slange kredsløbet. En anti-skum sammensatte (antifoam Y30 emulsion) kan tilsættes dråbevis periodisk (~ hver 30 min) at slukke det som det sker.
  7. Kontroller en to-punkts kalibrering (0 og 60 mmHg) for trykføleren placeret over aorta eller i boble fælden; Kalibrer efter behov.
  8. Umiddelbart før hjertet excision, hæld medierne i Langendorff loop perfusion system. Sørg for, at perfusat passerer gennem mikrofiberoxygenatorer (hemofilters) gasset med oxygeneret perfusat, som derefter strømmer gennem varmevekslere for at opretholde en mediperfusattemperatur på 37 °C ved aorta.
  9. Sæt det cirkulerende vandbad til et par grader højere end 37 °C, såsom 42 °C, for at højde for varmetab under ombytning og i hele systemet. Overvåg den cirkulerende perfusattemperatur med termo par.

2. hjerte excision og Langendorff-perfusion

  1. Sedate gris med en intramuskulær (I.M.) injektion af ketamin (20 mg/kg) og xylazin (2 mg/kg) og intubate med en endotracheal tubus tube. Til induktion indgives en intravenøs (I.V.) bolt indsprøjtning af fentanyl (50 μg/kg) og rocuronium (1 mg/kg). Anæstesi med inhaleret isofluran (0,5 − 3%), fentanyl (10 − 25 μg/kg) og af (1 mg/kg).
    Bemærk: Til dette proof-of-princip-studie blev Juvenile Yorkshire-grise (14 − 42 dage gamle, n = 18) anvendt, der varierede fra 2,5 − 10,5 kg legemsvægt og 18 − 137 g hjertevægt (figur 2). Hvis en yderligere injektion til induktion er nødvendig, kan ketamin (10 mg/kg) injiceres I.M.
  2. Når dyret er helt bedøvet og ikke-lydhør, udføre en sternotomi at udsætte stigende aorta og højre atrium.
    1. Ved hjælp af en skalpel skal du lave et mellemlinje snit fra toppen af brystbenet ved thorax indløbet, ned til xiphoid-processen. Med en Cautery (eller saks), dissekere den underliggende fedt og muskler, indtil brystbenet er synlig.
    2. Fra xiphoid-processen skæres brystbenet mellem linjen op gennem manubrium med enten kirurgisk knogle saks eller en knogle sav. Indsæt retraktorer i snittet for at udsætte hjertet.
  3. Giv en dosis af heparin (300 e/kg) til højre Atria ved hjælp af en 18 G nål og sprøjte for at minimere blottede blodpropper ved organ excision. Placer absorberende puder i brysthulen og isen omkring hjertet.
  4. Med en saks, skær forsigtigt gennem perikardiet, Isoler aorta ved stump dissektion fra det omgivende bindevæv, og klem aorta lige under den første arterielle gren på aorta Arch. Ved hjælp af en 50 mL sprøjte med en 18 G nål indsprøjtes iskold kardioplegi (20 mL/kg) gennem toppen af den stigende aorta.
  5. Skær gennem de fartøjer, som fører til hjertet, og fjern hjertet med opstigende aorta intakt og kast det fjernede hjerte i iskold kardioplegi.
  6. Grib væggene i aorta med et par produkter og slip det på en ribbet kanyle fastgjort til slanger, der fører til 1 L iskold cardioplegi medier suspenderet over hjertet (~ 95 cm til at give ~ 70 mm Hg). Lad væsken trænge ind og fylde aorta, indtil den løber ud for at forhindre enhver boble i at trænge ind i Vaskulaturen.
    Bemærk: Brug af en mekanisk af (2,3-butandion monoxim [BDM] eller blebbistatin) vil nedsætte koronar perfusions hastigheden, da iltbehovet i vævet falder.
  7. Fastgør aorta til kanylen ved hjælp af navle tape og yderligere anker det ved at binde op produkter at bære vægten af hjertet, som nu hænger fra kanylen (figur 1c). Lad de kolde medier til at tilbage perfuse hjertet ved et konstant tryk på 70 mmHg via tyngdekraften. Hold hjertet nedsænket i kold kardioplegi, indtil det er klar til at blive overført til det varmede (37 °C) Langendorff-perfusion system (< 10 min).
    Bemærk: Aorta på mindre hjerter (< 50 g, op til 2 uger gamle gris) vil bære vægten af hjertet, men større hjerter er i fare for at glide ud af kanylen. Under den indledende kanyle og når du flytter til det varmede system, forhindre luft i at trænge ind i aorta, som kan forårsage koronar emboli. Brug store bore slanger (> 3/8 "indre diameter), som tillader bobler at stige hurtigere end opløsningen ind i aorta.
  8. Hjertet overføres til Langendorff-systemet (37 °C) uden at indføre luft i kanylen. Lad den normale sinusrytme skylle Vaskulaturen af resterende blod og kardioplegi.
    Bemærk: I det beskrevne studie blev der observeret en gennemsnitlig Initial strømningshastighed på 184 ± 17 ml/min i isolerede Juvenile Grisling hjerter. Strømningshastigheden faldt til 70 ± 7,5 mL/min (gennemsnit ± SEM) efter perfusing med varmede medier indeholdende en mekanisk afkobling (20 mM BDM). Må ikke nedsænkes hjertevævet, da det kan påvirke hjertets billeddannelse. Vævs temperaturen vedligeholdes ved koronar flow i svine hjertet på grund af dens større volumen og mindre overfladeareal, sammenlignet med gnavere. Under fuld strømning varierede temperaturen i epicardium og endokardiet fra henholdsvis 35 °c til 37 °c.
    Forsigtig: Bær passende personlige værnemidler, herunder øjen slitage, når du arbejder med mekaniske uncouplers. Hjertet kan skubbe medierne hurtigt og uventet.
  9. Defibrillate hjertet i tilfælde af choker bare arytmier (ventrikulær takykardi, ventrikelflimren) ved at placere eksterne padler i spidsen og bunden af hjertet og levere et enkelt chok ved 5 j, stigende i 5 j intervaller (eller som valgbar af defibrillator) indtil 50 J, kardioversion eller ikke-stød bare rytme. Gentag chok ved 50 J om nødvendigt.
    Bemærk: I den præsenterede undersøgelse, 89% af præparater krævede defibrillering. Efter ækvibration (~ 10 min) blev en gennemsnitlig puls på 70 ± 4,5 BPM (gennemsnit ± SEM) observeret for unge Grisling hjerter (figur 2).
  10. Skyl hjertet med mindst 1 L modificerede Krebs-Henseleit medier, uden recirkulere, at fjerne eventuelle resterende blod og cardioplegi. Når medierne løber klart gennem hjertet, skal du lukke den cirkulerende løkke for at recirkulere perfusat.

3. Elektrofysiologi undersøgelse

  1. For at optage et standard bly II elektrokardiogram (EKG) i løbet af studiet, Fastgør en 29 G nål elektrode til ventrikulær epicardium nær spidsen, med en anden elektrode i det højre atrium. Tilslut de positive og negative indgange for en differentiel bioforstærker til henholdsvis Apex og højre atrium.
  2. Fastgør en bipolar stimulus elektrode til højre Atria, og en anden bipolar stimulus elektrode til den laterale venstre ventrikel til pacing formål.
  3. Pace hjertet ved hjælp af en Elektrofysiologi stimulator, med den oprindelige strøm indstillet til to gange den diastoliske tærskel (1 − 2 MA) og en 1 MS pulsbredde35,36.
    Bemærk: Hvis stimuleringen ikke fremkalder et respons, kan puls bredden øges op til 2 MS. mere strøm (~ 10x) er nødvendig med store koaksiale elektroder (bipolar stimulation).
  4. Identificer pacing tærsklen ved at anvende en række stimulus impulser (1 − 2 mA, 1 MS pulsbredde) på definerede pacing cyklus længder (PCL) for at sikre konsekvent stimulus respons.
    Bemærk: Når den iboende hastighed er fastslået, kan det indledende impuls tog begynde ved en lidt kortere PCL.
  5. Udfør ekstrastimulus pacing ved hjælp af enten et S1-S1-eller S1-S2-pacing-tog, i sidstnævnte blev et tog på 6 − 8 impulser (S1) efterfulgt af en enkelt impuls (S2). Reducer S2 PCL trinvise med 10 MS (dvs., 200 MS, 190 MS, 180 MS, etc.), indtil den undlader at fange. Træd op til den næstsidste PCL (dvs. 190 MS) og fald i 1 MS intervaller for at finde den mest præcise PCL før tabet af Capture (dvs., 184 MS).
    Bemærk:
    de samme stimulerings parametre anvendes til både S1 og S2 (1 − 2 Ma, 1 MS pulsbredde). Se figur 3 for repræsentative eksempler eller tidligere offentliggjorte værdier for målinger af svine hjertets Elektrofysiologi37.
    1. For at etablere ventrikel effektiv refraktær periode (VERP), bruge stimulus elektroden på den laterale venstre ventrikel til at identificere den korteste S1 − S2 interval, hvor S2 (for tidlig Beat) initierer ventrikulær depolarisering.
      Bemærk: Den ildfaste periode er det korteste opnåelige S1 − S2-koblings interval.
    2. For at definere Wenckebachs cyklus længde (WBCL) skal du bruge stimulus elektroden på højre atrium for at finde det korteste S1-S1-interval, hvor 1:1 atrioventrikulær ledning spredes via den normale lednings vej.
      Bemærk: Undladelse af at gøre det repræsenterer 2nd grad hjerteblok.
    3. For at definere sinus node restitueringstiden (SNRT) skal du bruge stimulus elektroden på det højre atrium til at anvende et pacing-tog (S1 − S1) og måle tidsforsinkelsen mellem den sidste impuls i pacing-toget og genfinding af spontan Sinoatrialt node medieret aktivitet.
    4. For at etablere atrioventrikulært knude effektiv refraktær periode (AVNERP), skal du bruge stimulus elektroden på højre atrium for at finde det korteste S1-S2-koblings interval, hvor den præmature atriale stimulation efterfølges af et bundt potentiale, der fremkalder en QRS kompleks, hvilket betyder ventrikulær depolarisering.

4. optisk kortlægning af transmembrane spænding og intracellulær calcium

Bemærk: En mekanisk afkobling bør anvendes til at minimere bevægelses artefakter under optisk kortlægning og for at undgå hypoxi3,38,39,40. (-/-) Blebbistatin (5 μM cirkulerende koncentration) kan tilsættes langsomt som en bolt dosis på 0,5 mM i 5 mL perfusat (100x af den endelige koncentration)41. Alternativt kan BDM i første omgang inkluderes i perfusatmediet i en cirkulerende koncentration på 20 mM.

  1. Forbered spændings farven ved at opløse 5 mg RH237 i 4 mL vandfri DMSO. Farvestoffet alikvot fortyndes med op til 5 mL medier og vortex. Tilsæt langsomt RH237 (62,1 μg pr. 500 mL perfusat) proksimalt til aorta kanylen.
    Bemærk: Den myokardial væv kan re-plettet med RH237, hvis det er nødvendigt, i hele varigheden af forsøget.
  2. Tilbered calcium farvestoffet ved at opløse 1 mg Rhod2-AM i 1 mL vandfri DMSO. Bland farvestoffet med 50 μl pluralistisk syre, Placer i et 37 ° c sonicere bad i op til 10 min, og derefter fortyndes med op til 5 ml medier. Tilsæt langsomt calcium farvestoffet (50 μg pr. 500 mL perfusat) proksimalt til aorta kanylen.
    Bemærk: For at sikre ensartet farvning af farvestoffer skal farvestofferne tilsættes langsomt (> 30 s). Rhod-2AM tager op til 10 min for at nå peak fluorescens, mens RH237 pletter hjertet inden for en 1 − 2 min. ved hjælp af den beskrevne farve belastning, kan signal til støjforhold (SNR) intervaller på ~ 42 − 86 og ~ 35 − 69 for henholdsvis spænding og calcium forventes. SNR-værdier kan beregnes som SNR = (peak-to-peak tæller)/(standard afvigelse under diastolisk interval)42.
  3. Placer billedbehandlings hardwaren (kamera, billed opdeler, objektiv) som vist i figur 1for at fokusere på et passende synsfelt.
    Bemærk: Splitter er konfigureret med et koldtlysreflektorlamper spejl (660 + nm), der passerer RH237 og afspejler Rhod2 emissions spektre. Høj-transmissions emission filtre anvendes til RH237 (710 nm lang pass) og Rhod2 (585 ± 40 nm) udsendte lys (lang pass ET710, se tabel over materialer). En bred-pupil 50 mm/F 0,95 l linse er fastgjort til forsiden af billed splitter. Denne konfiguration resulterer i tilstrækkelig emission lys adskillelse, som tidligere valideret43,44.
  4. kameraet til en arbejdsstation, og Hent billeder ved hjælp af valgt software med en eksponeringstid på 0,5 − 2 MS. Udfør Billedjustering ved hjælp af software, der kan opdele de ønskede områder, overlejring og vise en grå-skala subtraktion eller pseudo-farve tilføjelse til at fremhæve forkert justering (Se tabel over materialer til software option).
  5. Sluk for rumlyset for at minimere fluorescens interferens fra omgivende belysning. Test LED-lysene (525 nm, 1,4 mW/mm2) før påbegyndelsen af billeddannelse for at sikre ensartet og maksimal epicardial-belysning, som bestemmes af sensorens brønd dybde.
    Bemærk: Hvert lys ledes gennem et excitation filter (535 ± 25 nm). LED-lys kan udløses manuelt før optagelserne for at maksimere signal lineariteten. Udledt fluorescens fra epicardium passerer gennem billed splitter og emissions filtre. Opdelte billeder projiceres over på en højhastigheds sensor. Synsfeltet er ca. 12 cm x 10 cm, eller 5,9 cm x 4,7 cm for hvert split billede, afhængigt af linse valg og afstand fra hjertet.
  6. For optisk kortlægnings undersøgelser, billede af myokardiet under sinusrytme, ventrikelflimren (figur 4) eller dynamisk pacing (S1 − S1, 1 − 2 Ma, 1 MS pulsbredde) via en stimulerings elektrode placeret på venstre ventrikel (figur 5). Begynd med en pacing cyklus længde på 350 MS, og faldende med 10 − 50 MS til at generere restitution kurver (figur 5e)35,36.

5. oprydning

  1. Fjern hjertet fra systemet og dræne alle perfusat. Skyl system slangen og kamrene med renset vand.
  2. Til rutinemæssig vedligeholdelse skylles systemet periodisk med en vaskeopløsning eller en fortyndet hydrogenperoxid opløsning efter behov.

6. data behandling

  1. Bekræft kvaliteten af det optiske signal gennem hele studiet ved at åbne en videofil, vælge en interesseregion og afbilde gennemsnitlig fluorescens over tid ved hjælp af en passende softwarepakke eller brugerdefineret algoritme.
  2. Analysere billeddata som tidligere beskrevet23,33,43,45,46, at kvantificere aktionspotentiale og calcium forbigående tidsmæssige parametre, herunder aktiveringstidspunkt, spændings-calcium koblingstid (forskel mellem VM og ca aktiverings tider), og repolarisering varighed målinger.
    1. Anvend tærskel for at isolere fluorescerende epicardial-pixels og kassere støjende baggrundsdata.
      Bemærk: Thresholding vil forenkle og fremskynde analysen på tværs af store videoer.
    2. Spatialt filter optiske signaler over en epicardial overflade med kerne størrelser spænder fra 3 mm x 3 mm til 5 mm x 5 mm, som det ses i figur 4 og figur 5.
      Bemærk: Sidstnævnte vil forbedre SNR uden fordrejende handling potentielle funktioner, calcium forbigående morfologi, eller samlede kontur af bølge fronter19,47. Dette kan være unødvendigt, hvis du bruger en sensor med store pixels, eller hvis Binning under købet.
    3. Timeligt filter signaler med et digitalt Lowpass-Filter (f. eks. 5th-Order Butterworth) med en cutoff-frekvens mellem 100 og 75 Hz for at eliminere ubetydeligt signal indhold45.
      Bemærk: Se figur 5c for et eksempel på repræsentative forarbejdede spor.
    4. Påfør afdrift fjernelse og subtraktion, via nth-Order polynomium fitting, for at minimere virkningerne af foto blegning, bevægelse, eller andre væsentlige kilder til variation.
    5. Efter behandling og normalisering af optiske data på tværs af en hel video, Beregn aktionspotentiale og calcium forbigående parametre af interesse. Bestem aktiveringstiden, defineret som tidspunktet for maksimal derivat under depolarisering, og Peak fluorescens for at beregne repolarisering procent gange og perioder (action potentiel varighed [APD] og [ca2 +] i varighed [CaD], se Figur 5).
    6. Når der er beregnet tidsmæssige parametre, skal du generere isokronale kort for at skildre aspekter af et enkelt aktionspotentiale eller calcium forbigående på tværs af hele den afbildet epicardial-overflade ved hjælp af brugerdefinerede algoritmer23,33, 43,45,46.
      Bemærk: Se figur 5D for et eksempel.

Representative Results

Figur 1a viser et diagram over det isolerede hjerte perfusions system, som omfatter slange kredsløbet, pumpen, filteret, oxygenatoren, reservoirer og varmeelementer. Placeringen af EKG (lead II-konfiguration) og pacing-elektroder vises i figur 1b, og billedbehandlings opsætningen er afbildet i figur 1c. En skematisk af de optiske komponenter og lysstier er vist i figur 1d.

Eksperimentelle undersøgelser blev udført på intakt, hele hjerter isoleret fra unge Yorkshire grise (14 − 42 dage, n = 18), der varierede i størrelse fra 2.5 − 10,5 kg legemsvægt og 18 − 137 g hjertevægt (figur 2a). Efter overførsel af det isolerede hjerte til et Langendorff-system (37 °C) stabiliseres hjertefrekvensen til 70 ± 4,5 BPM (gennemsnit ± SEM) inden for ~ 10 min af defibrillationen og forblev konstant under hele studiets varighed (figur 2b). En gennemsnitlig strømningshastighed på 184 ± 17 mL/min (gennemsnit ± SEM) blev målt, hvilket faldt til 70 ± 7,5 mL/min efter perfusing med varmede medier indeholdende en mekanisk afkobling (figur 2c).

Bly II-Ecg'erne blev registreret i hele studiets varighed under sinus rytmen (figur 3a) eller som reaktion på ekstern pacing (figur 3B-E) for at kvantificere elektrofysiologiske parametre. For ep's vurdering blev dynamisk pacing (S1 − S1) anvendt på det højre atrium til at lokalisere wbcl og snrt (restitutionstiden efter S1 − S1 påbegyndes, figur 3c), hvor wbcl blev betegnet som den korteste PCL, der indledte atrieflimren til ventrikulær ledning. En S1 − S2 pacing-protokol blev implementeret ved hjælp af en bipolar stimulus-elektrode på venstre ventrikel for at identificere det korteste koblings interval, der initierede ventrikulær depolarisering, hvorved man pegede VERP (figur 3D). Alternativt anvendes en S1-S2 atrieflimren pacing-protokol til at lokalisere avnerp (S1 − S2), som vist i figur 3e. Repræsentative eksempler på svine hjertets Elektrofysiologi parametre er i tæt overensstemmelse med dem, der tidligere blev offentliggjort37.

Der blev udført optiske kortlægnings eksperimenter under sinusrytme, spontan ventrikelflimren (figur 4) eller under dynamisk pacing (S1 − S1) af venstre VENTRIKEL (LV) for at generere elektriske og calcium restitutions kurver afbildet i Figur 5. Repræsentative billeder af et farvestof-lastet Grisling hjerte er vist i figur 4 med tilsvarende optisk action potentialer (VM) og calcium (ca) transienter indsamlet fra to regioner af interesse på den epicardial overflade (højre ventrikel [RV] = blå, LV = rød) . Ubehandlede signaler vises under sinus rytmen og under ventrikelflimren. Som tidligere nævnt blev der også anvendt dynamisk epicardial pacing (S1 − S1) under eksperimenter med optisk kortlægning for at normalisere enhver lille forskel i den iboende puls (figur 5A-E). RAW-signaler vises (RV = blå, LV = rød), som blev brugt til at skildre aktionspotentialet — calcium transitorisk koblings tidspunkt (figur 5c), aktiverings-og varigheds tidspunkt (figur 5D), elektrisk og calcium restitution (figur 5e). For tykke Myokardie præparater, rumlig filtrering med kerne størrelse ~ 3 mm x 3 mm er passende for epicardial aktionspotentiale eller calcium forbigående analyse19,47. Derfor er billeder med høj rumlig opløsning (i den beskrevne opsætning 1240 x 1024 i alt eller 620 x 512 pr. kanal, 6,5 μm pixelstørrelse) ofte rumligt bineret under eller efter erhvervelse (figur 5c). Billedbehandling kan udføres for at generere aktiverings-og repolariserings kort ved hjælp af brugerdefinerede algoritmer23,33,43,45 (figur 3D), med aktiveringstiden for hver pixel på hjertet blev defineret som det maksimale derivat af aktionspotentialet eller calcium-forbigående upstroke.

Figure 1
Figur 1: eksperimentel opsætning. A) diagram over det isolerede hjerte perfusions system pilene angiver retningen af flowet. B) et kanyle hjerte vises med elektrodeplacering. RA = højre Atria, RV = højre ventrikel, LV = venstre ventrikel, EKG = bly II elektrokardiogram. C) billedbehandlings platformen i umiddelbar nærhed af hjertevævet. D) emission af hver supplerende sonde (spænding, calcium) adskilles ved bølgelængde ved hjælp af en billed delings anordning med passende emissions filtre og koldtlysreflektorlamper-spejl. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: måling af hjertevægt, hastighed og flow. (A) hjertevægt til legemsvægt forhold for hver pattegris, der anvendes i studiet (n = 18). B) hjertefrekvensen målt ~ 10 min efter defibrillering og igen ved studiets afslutning (ca. 1 time). C) koronar strømmen falder bundfaldet efter perfusion med en mekanisk af (+ BDM) på grund af nedsat iltforbrug. Skala søjler repræsenterer Mean ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentative eksempler på optagelser af bly II-elektrokardiogram, som er indsamlet under sinusrytme eller som reaktion på ekstern pacing. (A) normal sinusrytme. B) eksempel på epicardial-pacing med en cyklus længde på 400 MS (S1 − S1), som blev anvendt til billeddiagnostiske forsøg. C) Top: atrieflimning for at identificere WBCL vellykket opsamling observeres ved S1 = 250 MS, hvor atrieflimren til ventrikulær ledning observeres. Bemærk, at atrieflimren pacing kan bruges til at bestemme snrt (tid til sinus node udledning, efter påbegyndelse af ekstern pacing). Bund: da S1-cyklussens længde er faldet til 205 MS, mislykkes lednings ledningen til ventriklen. (D) Top: epicardial pacing (S1 − S2) for at identificere verp; vellykket opsamling observeres ved S1 = 450 MS, S2 = 300 MS. bottom: som S2 cyklus længde er faldet til 250 MS, ventrikel vævet undlader at fange. E) atrieflimning (S1 − S2) for at identificere AVNERP. Top: vellykket opsamling observeres ved S1 = 450 MS, S2 = 200 MS. bottom: som S2 cyklus længde er faldet til 199 MS, ledning til ventriklen mislykkes. Blå pile betegner pacing pigge, røde pile betegner Capture (' C ') eller ingen Capture (' NC '). S1 − S1 = dynamisk pacing, S1 − S2 = extrastimulus pacing. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: optiske data under sinusrytme og ventrikelflimren. Venstre: repræsentative billeder af et farvestof-lastet gris hjerte (VM = spænding, RH237; Ca = calcium, Rhod2), forreste visning. Rumligt filtreret transmembran spænding og intracellulære calcium fluorescerende signaler fra en gris hjerte under sinusrytme (Center). Spændings-og calcium signaler under ventrikelflimren (højre). Signal område størrelser (15 x 15 pixels = 2,4 x 2,4 mm2, 30 x 30 = 4,8 x 4,8 mm2 kerne størrelse) repræsenteret som røde og blå firkanter. Enheder = ΔF/F. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: optiske data fra Langendorff-perfbrugte svine hjerter. Uforarbejdet,rumligtfiltreret (A) transmembran spænding og (B) intracellulære calcium fluorescens signaler fra højre og venstre ventrikler under elektrisk pacing ved spidsen. Ufiltrerede, rumligt gennemsnitlige signaler skildrer optiske aktionspotentialer og calcium transienter fra regioner af interesse (signalenheder er ΔF/F). (C) en overlejring af normaliserede transienter illustrerer aktions potentiel-calcium transitorisk koblings tidspunkt (lavpasfilter filtreret ved 75 Hz). (D) behandling af signaler på tværs af epicardial overflade for at generere isokronale kort over tidsmæssige parametre, herunder aktiveringstidspunkt (tact) og 80% repolariserings tidspunkt. E) elektriske og calcium forbigående restitutions kurver genereret ved flere frekvenser (venstre) med statistisk analyse (højre) for at illustrere længere repolariserings tidspunkt ved langsommere pacing-cyklus længder. Skala stænger = gennemsnit ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Kemiske Formel Molekylvægt g/L
Natriumchlorid Nacl 58,44 5,26
Natriumgluconat C6H11Nao7 218,14 5,02
Natriumacetat-trihydrat C2H3Nao2• 3h2O 136,08 3,68
Kaliumchlorid KCl 74,55 0,63
Magnesium klorid (vandfri) MgCl2 95,21 0,1405
8,4% natriumbicarbonat NaHCO3 84,01 13
Mannitol C6H14O6 182,17 16,3
Magnesium sulfat MgSO4 120,37 4
Ph 7,4
Osmolaritet (mOsmol/L) 294

Tabel 1: modificeret del Nido s cardioplegi opskrift.

Discussion

Selv om kardiovaskulære forskningsmodeller spænder fra cellulære til in vivo præparater, der er en iboende trade-off mellem klinisk relevans og eksperimentel nytte. På dette spektrum er det isolerede Langendorff-perfvant hjerte fortsat et nyttigt kompromis for studiet af hjertets fysiologi48. Hele hjerte modellen repræsenterer en højere grad af funktionel og strukturel integration end enkelt celle-eller vævs monolayers, men undgår også de forstyrrende kompleksiteter, der er forbundet med in vivo-modeller. En stor fordel ved Dual optisk kortlægning eksperimenter er, at den epicardial overflade af det isolerede hjerte kan observeres, og fluorescens billeddannelse af transmembran potentiale og calcium håndtering kan bruges til at overvåge hjertets fysiologi34.

Gnaver modeller er mest almindeligt anvendt til isolerede hjerte præparater i modsætning til større dyr, skyldes til dels de tilknyttede omkostninger ved at op-dimensionere alle de involverede elementer (f. eks opløsning volumen, perfusion kredsløb, mængde af farvestoffer og mekaniske uncouplers) sammen med større ustabilitet og tilbøjelighed til arytmias i større dyr10,36,49. En fordel ved at bruge gris hjerter er, at de ligner det menneskelige hjerte i struktur, størrelse og hastighed af sammentrækning, derfor mere præcist modellering hæodynamiske parametre som koronar blodgennemstrømning og hjertets udgang. På samme måde har mennesker og grise lignende calcium håndtering, elektrokardiogram intervaller37, og action potentielle morfologi, herunder de underliggende kanaler, som det repræsenterer12,50,51, 52. Denne protokol beskriver i detaljer de trin, for at skabe en reproducerbar store animalske model til omfattende karakterisere myokardial funktion. Samtidig billeddannelse af transmembran-spænding (RH237) og intracellulær calcium (Rhod2), der anvendes sammen med etablerede elektrofysiologiske protokoller, giver mulighed for at udpege mekanismer, der er ansvarlige for ændrede kardiale Funktion. Den beskrevne metodologi kan anvendes til prækliniske sikkerhedsundersøgelser, toksikologisk screening og undersøgelse af genetiske eller andre sygdoms patologier. Desuden kan den beskrevne metodologi ændres og tilpasses til brug sammen med andre hjerte modeller (f. eks. hunde, mennesker) afhængigt af det specifikke forsknings fokus53,54,55.

Der er et par kritiske ændringer at huske på, når overgangen fra en mindre gnaver model til en større svine model for isolerede, hele hjerte præparater. Under klargøring og opsætning anbefaler vi at tilføje albumin til perfusatet for at opretholde onkotisk tryk og reducere ødem (plus antifoam, hvis det er nødvendigt)56,57,58,59. Desuden, perfusat indeholder albumin kan også støtte i metaboliske undersøgelser, der også kræver fedtsyre tilskud til medierne60,61. I modsætning til gnaver hjerter behøver det større svine hjerte ikke at blive nedsænket i varme medier på grund af dets mindre overflade til volumen forhold og den øgede mængde varmede medier, der strømmer gennem krans karrene, som bedre bevarer temperaturen. Som tidligere nævnt placerede vi temperatur sonder inde i højre ventrikel og på den epicardial overflade af både højre og venstre ventrikler, der kun observerede små temperaturudsving på 1 − 2 °C på alle tre steder i hele studiet. Vigtigere, kan sådanne hurtigere strømningshastigheder også øge sandsynligheden for bobler og en potentiel emboli. For at omgå dette problem anbefaler vi at bruge en boble fælde med store bore slanger, der fører direkte ned til aorta kanylen. Tilsvarende fandt vi det mest nyttigt at have to personer, der arbejder i tandem til at kanyle aorta på et større (og tungere) hjerte; en person til at holde aorta åben med robuste produkter og en anden til at sikre aorta til atraumatiske ved hjælp af navle bånd. I den beskrevne metode konstaterede vi, at perfusion med kardioplegi og defibrillering var afgørende for hjerte genfinding, hvilket er i modstrid med gnaver hjerte præparater. I vores erfaring, genoptog kun et par fjernede hjerter normal sinus-drevet aktivitet uden kardioversion.

For at forbedre optiske billedbehandlings slutpunkter begrænsede en hængende hjerte forberedelse effekten af blænding, der kan opstå med et nedsænket hjerte. Desuden, den hængende hjerte undgår også enhver kompression eller kompromis af krans karrene på det bageste aspekt af hjertet, der kan opstå, når æglæggende hjertet ned horisontalt for vertikal billeddannelse. Vi fandt også, at lastning fluorescerende farvestoffer efter boble fælde (tæt på aorta-kanyle) stærkt forbedret vævs farvning og optiske signaler. Endelig, at forbedre hjertets Elektrofysiologi endepunkter, brugen af en større koaksial stimulation elektrode lettet vellykket atrieflimning. Selv om vi beskriver brugen af elektrokardiogrammer til at identificere opsamling og tab af Capture til forskellige EP parametre, kan intrakardiel katetre eller bipolar optagelse elektroder også anvendes.

Vores undersøgelse var fokuseret på at udvikle en metode til dual optisk kortlægning og kardiel elektrofysiologisk vurdering i en isoleret, intakt svine hjerte model. På grund af ligheder med den unge menneskelige hjerte, svine hjertet er stadig en populær model for undersøgelser fokuseret på pædiatrisk kardiologi eller medfødte hjertefejl. Vigtigere, kan den beskrevne tilgang tilpasses til brug med større størrelse voksne hjerter og/eller forskellige arter af interesse. Faktisk kan andre laboratorier finde, at brugen af hunde eller menneskelige hjerter (enten donor eller syge) er mere gældende for deres specifikke forskning fokus53,54,55. En anden potentiel begrænsning til denne undersøgelse er brugen af en mekanisk af at reducere bevægelse artefakt under billeddannelse. Blebbistatin er blevet afkobler af valg i hjertets billedbehandlings applikationer på grund af dets minimale effekt på EKG-parametre, aktivering og refraktære perioder41,62,63. BDM er et billigere valg, som kan være særlig vigtigt i store dyreforsøg, der kræver større mængder af perfusat og mekanisk afkobling, men det vides at have en større indvirkning på kalium-og calcium strømme, der kan ændre aktionspotentialet morfologi64,65,66,67. Hvis BDM anvendes, Bemærk, at APD forkortelse øger hjertets sårbarhed over for chok-induceret rytmeforstyrrelser68. Omvendt er den primære begrænsning for brug af blebbistatin dens lysfølsomhed og fototoksicitet, selv om alternative formuleringer, der har reduceret disse virkninger69,70,71. Endelig anvender den beskrevne metode et enkelt kamerasystem til dobbelt optisk kortlægning eksperimenter, men det er vigtigt at bemærke, at forskningsundersøgelser fokuseret på ventrikelflimren og/eller sporing af elektriske bølger på tværs af epicardial overflade ville være nødvendigt at ændre denne tilgang til at omfatte tredimensionel panoramabilleder, som beskrevet af andre15,19,72,73,74,75 .

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender taknemmeligt Dr. Matthew Kay for hjælpsom eksperimentel vejledning, og Manelle Ramadan og Muhaymin Chowdhury for teknisk assistance. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R01HL139472 to NGP, R01 HL139712 to NI), children's Research Institute, children's national Heart Institute og Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical innovation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(-)-Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560-5MG Mechanical Uncoupler
2,3-Butanedione monoxime (BDM) Sigma-Aldrich B0753-100G Mechanical Uncoupler
Albumin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9418
Analog signal interface emka Technologies itf16USB
Antifoam Sigma-Aldrich A5758-250ML
Antifoam Y-30 Emulsion Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A5758
Aortic cannula, 5/16” Cole-Parmer 45509-60
Bubble trap Sigma-Aldrich CLS430641U-100EA
CaCl2 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ C77-500
Camera, sCMOS Andor Technology Zyla 4.2 PLUS
Coaxial stimulation electrode (atria) Harvard Apparatus 73-0219
Defibrillator Zoll M Series
Dichroic mirror Chroma Technology T660lpxrxt-UF2
Differential amplifier Warner Instruments DP-304A
Emission filter, calcium Chroma Technology ET585/40m
Emission filter, voltage Chroma Technology ET710lp
EP stimulator (Bloom) Fisher Medical DTU-215B
Excitation filter Chroma Technology CT510/60bp
Excitation lights Thorlabs SOLIS-525C
Filter McMaster-Carr 8147K52
Filter cartridge, polypropylene Pentair PD-5-934
Filter housing McMaster-Carr 9979T21
Flow transducer Transonic ME6PXN
Glucose Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 158968
Heating coil Radnoti 158821
Hemofilter Hemocor HPH 400
Hemostatic Forceps World Precision Instruments 501326
Image Splitter Cairn Research OptoSplit II
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P3911
KH2PO4 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ 423-316
Large-bore tubing, I.D. 3/8” Fisher Scientific 14-169-7H
Lens 50 mm, 0.95 f-stop Navitar DO-5095
Metamorph Molecular Devices Image Alignment
MgSO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M-7506
Mucasol detergent Sigma-Aldrich Z637181-2L
Na Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P2256
NaCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S-3014
NaHCO3 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ S-233
Needle Electrodes 29 G, 2 mm AD Instruments Inc. MLA1204
Noise eliminator Quest Scientific Humbug
Perfusion pump PolyStan A/S 1481
Pressure transducer World Precision Instruments BLPR2
Reservoir, 2 L Cole-Parmer UX-34541-07
RH237 AAT Bioquest Inc. 21480
Rhod2-AM AAT Bioquest Inc. 21062
Stimulation electrode (ventricle) Harvard Apparatus 73-0160
Surgical Suture McKesson Medical-Surgical 890186
Transducer amplifier World Precision Instruments TBM4M
Tubing flow console Transonic TS410
Umbilical tape Jorvet J0025UA
Water bath/circulator VWR 89400-970
Surgical Tools
Bandage shears Harvard Apparatus 72-8448 Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0 mm blade length, 17.0 cm
Electrocautery Dalwha Corp. Ltd. BA2ALD001 Model: 200 Basic
Hemostat Roboz RS-7476 St Vincent Tube Occluding Forceps
Hemostatic forceps Harvard Apparatus 72-8960 Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm
Hemostats Harvard Apparatus 72-8985 Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2 mm tip 14 cm
Mayo scissors WPI 501749 14.5 cm, Straight
Metzenbaum scissors WPI 501747 11.5 cm, Straight
Mosquito forceps Harvard Apparatus 72-8980 Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2 mm tip width 12 cm
Needle holder Harvard Apparatus 72-8828 Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length
Pediatric cross clamp Roboz RS-7660 Cooley-Derra Clamp 6.25" 5 mm Calibrations
Right angle forceps WPI 501240 Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14 cm, Right Angle
Scalpel Ted Pella 549-4 Scalpel Handle No. 4, 13.7 cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades
Scissors Harvard Apparatus 72-8380 Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42 mm blade,12 cm
Straight Serrated forceps WPI 500363 Dressing Forceps 15.5 cm
Towel clamp WPI 501700 Backhaus Towel Clamp, 13 cm, Curved, Locking handle, SS
Weitlaner retractor WPI 501314 Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2 cm, 2x 3 Sharp Prongs
Disposables
3-0 prolene suture Various vendors Various vendors
Vessel loop Aspen surgical 011001PBX Sterion® Vessel Loop, 0.8 mm x 406 mm
Cardioplegia (Plegisol) Pfizer 00409-7969-05 Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20 mL/kg
Heparin Various vendors Various vendors 300 U/kg
Syringe and Needle Various vendors Various vendors 60 mL & 18 G respectively
Umbilical tape Ethicon U12T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, L., De Jesus, N. M., Ripplinger, C. M. Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart. Journal of Visualized Experiments. (103), e53166 (2015).
  2. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2012).
  3. Asfour, H., Wengrowski, A. M., Jaimes, R., Swift, L. M., Kay, M. W. NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts. Journal of Visualized Experiments. (65), e4115 (2012).
  4. Capecchi, M. R. The new mouse genetics: altering the genome by gene targeting. Trends in genetic. 5, (3), 70-76 (1989).
  5. Hall, B., Limaye, A., Kulkarni, A. B. Overview: generation of gene knockout mice. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 19, Unit 19 1-17 (2009).
  6. Schechter, M. A., et al. An Isolated Working Heart System for Large Animal Models. Journal of Visualized Experiments. (88), e51671 (2014).
  7. Arlock, P., et al. Ion currents of cardiomyocytes in different regions of the Göttingen minipig heart. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 86, 12-18 (2017).
  8. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of anatomy. 193, Pt 1 105-119 (1998).
  9. Markert, M., et al. Validation of the normal, freely moving Göttingen minipig for pharmacological safety testing. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 60, (1), 79-87 (2009).
  10. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141, (3), 235-249 (2014).
  11. Bertho, E., Gagnon, G. A comparative study in three dimension of the blood supply of the normal interventricular septum in human, canine, bovine, porcine, ovine and equine heart. Diseases of the Chest. 46, 251-262 (1964).
  12. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53, (5), 432-438 (2014).
  13. Camacho, P., Fan, H., Liu, Z., He, J. Q. Large Mammalian Animal Models of Heart Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3, (4), 30 (2016).
  14. Jordan, C. P., et al. Minimally Invasive Resynchronization Pacemaker: A Pediatric Animal Model. The Annals of Thoracic Surgery. 96, (6), 2210-2213 (2013).
  15. Rogers, J. M., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Kay, M. W. Panoramic optical mapping reveals continuous epicardial reentry during ventricular fibrillation in the isolated swine heart. Biophysical Journal. 92, (3), 1090-1095 (2007).
  16. Langendorff, O. Untersuchungen am uberlebenden Saugethierherzen [Investigations on the surviving mammalian heart]. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 61, 291-332 (1895).
  17. Pumir, A., Arutunyan, A., Krinsky, V., Sarvazyan, N. Genesis of ectopic waves: role of coupling, automaticity, and heterogeneity. Biophysical Journal. 89, (4), 2332-2349 (2005).
  18. Kay, M. W., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Rogers, J. M. Lifetimes of epicardial rotors in panoramic optical maps of fibrillating swine ventricles. American journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 291, (4), 1935-1941 (2006).
  19. Lee, P., et al. Low-Cost Optical Mapping Systems for Panoramic Imaging of Complex Arrhythmias and Drug-Action in Translational Heart Models. Scientific Reports. 7, 43217 (2017).
  20. Venkataraman, R., Holcomb, M. R., Harder, R., Knollmann, B. C., Baudenbacher, F. Ratiometric imaging of calcium during ischemia-reperfusion injury in isolated mouse hearts using Fura-2. BioMedical Engineering OnLine. 11, (1), 39 (2012).
  21. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical Imaging of the Heart. Circulation Research. 95, (1), 21-33 (2004).
  22. Zimmermann, W. H., et al. Three-dimensional engineered heart tissue from neonatal rat cardiac myocytes. Biotechnology and Bioengineering. 68, (1), 106-114 (2000).
  23. Jaimes, R., et al. A Technical Review of Optical Mapping of Intracellular Calcium within Myocardial Tissue. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310, (11), 1388-1401 (2016).
  24. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110, (4), 609-623 (2012).
  25. Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. S. Imaging Calcium Sparks in Cardiac Myocytes. Methods in Molecular Biology. 689, Clifton, N.J. 205 (2011).
  26. Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents. Frontiers in Physiology. 5, 344 (2014).
  27. Thomas, K., Goudy, J., Henley, T., Bressan, M. Optical Electrophysiology in the Developing Heart. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5, (2), 28 (2018).
  28. Nikolski, V., Efimov, I. Fluorescent imaging of a dual-pathway atrioventricular-nodal conduction system. Circulation Research. 88, (3), 23-30 (2001).
  29. Posnack, N. G., et al. Bisphenol A Exposure and Cardiac Electrical Conduction in Excised Rat Hearts. Environmental Health Perspectives. 122, (4), 384-390 (2014).
  30. Garrott, K., et al. KATP channel inhibition blunts electromechanical decline during hypoxia in left ventricular working rabbit hearts. The Journal of Physiology. 595, (12), 3799-3813 (2017).
  31. Wang, Z., et al. Exposure to Secondhand Smoke and Arrhythmogenic Cardiac Alternans in a Mouse Model. Environmental Health Perspectives. 126, (12), 127001 (2018).
  32. Francis Stuart, S. D., et al. Age-related changes in cardiac electrophysiology and calcium handling in response to sympathetic nerve stimulation. The Journal of Physiology. 596, (17), 3977-3991 (2018).
  33. Jaimes, R., et al. Plasticizer Interaction With the Heart: Chemicals Used in Plastic Medical Devices Can Interfere With Cardiac Electrophysiology. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 12, (7), (2019).
  34. Boukens, B. J., Efimov, I. R. A century of optocardiography. IEEE reviews in Biomedical Engineering. 7, 115-125 (2014).
  35. Li, N., Wehrens, X. H. Programmed Electrical Stimulation in Mice. Journal of Visualized Experiments. (39), e1730 (2010).
  36. Dor-Haim, H., Berenfeld, O., Horowitz, M., Lotan, C., Swissa, M. Reduced Ventricular Arrhythmogeneity and Increased Electrical Complexity in Normal Exercised Rats. PLoS ONE. 8, (6), 66658 (2013).
  37. Noszczyk-Nowak, A., et al. Normal Values for Heart Electrophysiology Parameters of Healthy Swine Determined on Electrophysiology Study. Advances in Clinical and Experimental. 25, (6), 1249-1254 (2016).
  38. Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R., Kay, M. W. NADH changes during hypoxia, ischemia, and increased work differ between isolated heart preparations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306, (4), 529-537 (2014).
  39. Schramm, M., Klieber, H. G., Daut, J. The energy expenditure of actomyosin-ATPase, Ca(2+)-ATPase and Na+,K(+)-ATPase in guinea-pig cardiac ventricular muscle. The Journal of Physiology. 481, 647-662 (1994).
  40. Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 314, (4), 704-715 (2018).
  41. Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4, (5), 619-626 (2007).
  42. Evertson, D. W., et al. High-Resolution High-Speed Panoramic Cardiac Imaging System. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55, (3), 1241-1243 (2008).
  43. Jaimes, R., et al. Path Splitter: A New Approach for Truly Simultaneous Dual Optical Mapping of the Heart with a Single Camera. bioRxiv. 651380 (2019).
  44. Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
  45. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303, (7), 753-765 (2012).
  46. O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9, (1), 1389 (2019).
  47. Mironov, S. F., Vetter, F. J., Pertsov, A. M. Fluorescence imaging of cardiac propagation: spectral properties and filtering of optical action potentials. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291, (1), 327-335 (2006).
  48. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55, (2), 113-126 (2007).
  49. Nishida, K., Michael, G., Dobrev, D., Nattel, S. Animal models for atrial fibrillation: clinical insights and scientific opportunities. Europace. 12, (2), 160-172 (2010).
  50. Verdouw, P. D., Van Den Doel, M. A., De Zeeuw, S., Duncker, D. J. Animal models in the study of myocardial ischaemia and ischaemic syndromes. Cardiovascular Research. 39, (1), 121-135 (1998).
  51. Camacho, P., Fan, H., Liu, Z., He, J. Q. Large Mammalian Animal Models of Heart Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3, (4), 30 (2016).
  52. Swindle, M. M., Makin, A., Herron, A. J., Clubb, F. J., Frazier, K. S. Swine as Models in Biomedical Research and Toxicology Testing. Veterinary Pathology. 49, (2), 344-356 (2012).
  53. Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical Volume of Human Myocardium Necessary to Maintain Ventricular Fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11, (11), 006692 (2018).
  54. Hill, A. J., et al. In Vitro Studies of Human Hearts. The Annals of Thoracic Surgery. 79, (1), 168-177 (2005).
  55. Fedorov, V. V., et al. Structural and functional evidence for discrete exit pathways that connect the canine sinoatrial node and atria. Circulation Research. 104, (7), 915-923 (2009).
  56. Jacob, M., et al. Albumin Augmentation Improves Condition of Guinea Pig Hearts After 4 hr of Cold Ischemia. Transplantation. 87, (7), 956-965 (2009).
  57. Segel, L. D., Ensunsa, J. L. Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 254, (6), 1105-1112 (1988).
  58. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41, (6), 613-627 (2000).
  59. Werner, J. C., Whitman, V., Fripp, R. R., Schuler, H. G., Morgan, H. E. Carbohydrate metabolism in isolated, working newborn pig heart. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 241, (5), 364-371 (1981).
  60. Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303, (2), 156-167 (2012).
  61. Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 13, (1), 168-172 (1989).
  62. Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302, (1), 262-269 (2012).
  63. Swift, L. M., et al. Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, (5), 503-512 (2012).
  64. Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart. Experimental Physiology. 89, (2), 163-172 (2004).
  65. Liu, Y., et al. Effects of diacetyl monoxime on the electrical properties of sheep and guinea pig ventricular muscle. Cardiovascular Research. 27, (11), 1991-1997 (1993).
  66. Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25, (45), 419-424 (2010).
  67. Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74, (6), 305-313 (1994).
  68. Cheng, Y., Li, L., Nikolski, V., Wallick, D. W., Efimov, I. R. Shock-induced arrhythmogenesis is enhanced by 2,3-butanedione monoxime compared with cytochalasin D. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, (1), 310-318 (2004).
  69. Kolega, J. Phototoxicity and photoinactivation of blebbistatin in UV and visible light. Biochemical and Biophysical Research Communications. 320, (3), 1020-1025 (2004).
  70. Sakamoto, T., Limouze, J., Combs, C. A., Straight, A. F., Sellers, J. R. Blebbistatin, a myosin II inhibitor, is photoinactivated by blue light. Biochemistry. 44, (2), 584-588 (2005).
  71. Várkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6, (1), 26141 (2016).
  72. Bray, M. A., Lin, S. F., Wikswo, J. P. Three-dimensional surface reconstruction and fluorescent visualization of cardiac activation. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 47, (10), 1382-1391 (2000).
  73. Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart. Journal of Biomedical Optics. 12, (4), 44019 (2007).
  74. Gloschat, C., et al. RHYTHM: An Open Source Imaging Toolkit for Cardiac Panoramic Optical Mapping. Scientific Reports. 8, (1), 2921 (2018).
  75. Kay, M. W., Amison, P. M., Rogers, J. M. Three-dimensional surface reconstruction and panoramic optical mapping of large hearts. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 51, (7), 1219-1229 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics