מדידה כמותית של מתוך מסונתז חלבונים בעכברים

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

רמת החלבון של נוזל השדרה הגבוה יכול להיות תוצאה של דיפוזיה של חלבון פלזמה על פני מחסום דם-מוח שונה או סינתזה התוך. פרוטוקול בדיקה מיטבי מוצג במאמר זה, המסייע להפלות את שני המקרים ומספק מדידות כמותית של חלבונים מסונתז באופן פנימי.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Gilli, F., Welsh, N. C., Linzey, M. R., Royce, D. B., DiSano, K. D., Pachner, A. R. Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice. J. Vis. Exp. (153), e60495, doi:10.3791/60495 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

נוזל מוחי שדרתי, נוזל שנמצא במוח ואת חוט השדרה, הוא בעל חשיבות רבה למדע בסיסי וקליני. ניתוח הרכב חלבון שדרתי מספק מידע חיוני במחקר בסיסי במדעי המוח, כמו גם מחלות נוירולוגיות. אזהרה אחת היא כי חלבונים הנמדדים בתוך שדרתי עשוי לנבוע הן סינתזה הפנימי והטראנזפה מן הנסיוב, וניתוח חלבונים של שדרתי יכול רק לקבוע את הסכום של שני רכיבים אלה. על מנת להפלות בין החלבון המופק מהדם לבין החלבונים המיוצרים בדגמי בעלי חיים, כמו גם בבני אדם, מדידות חלבון שדרתי פרופיל באמצעות כלים קונבנציונליים ניתוח חלבון חייב לכלול את החישוב של המנה האלקטרוליציונלית/סרום (Qאלבומין), סמן של השלמות של הממשק בדם-מוח (bbi), ואת מדד החלבון (Qחלבון/qאלבומין), הערכה של סינתזה החלבון הפנימי. פרוטוקול זה ממחיש את ההליך כולו, מ שדרתי ואיסוף דם לחישובי quotients ואינדקסים, עבור המדידה הכמותית של סינתזה החלבון הפנימי וליקוי BBI בדגמי העכבר של הפרעות נוירולוגיות.

Introduction

נוזל מוחי שדרתי, נוזל ברור וחסר צבע סביב המוח וחוט השדרה, מחזיק בחשיבות מדעית קלינית ובסיסית גדולה. המוח השדרתי משמר את הסביבה האלקטרוטית של מערכת העצבים המרכזית (CN), מאזנת את הסטטוס בסיס חומצה מערכתית, אספקת חומרים מזינים לתאי העצבי והגליאל, פונקציות כמו מערכת הלימפה עבור ה-CN, ו הובלות הורמונים, נוירוטרנסמיטורים, ציטוקינים ונוירופפטידים אחרים ברחבי ה-CN1 לפיכך, כאשר הרכב הנוזל הנוזלי משקף את הפעילות של ה-CN, החומר הזה מציע מגוון בעל ערך, אם כי עקיף, גישה לאפיון המצב הפיזיולוגי והפתולוגי של ה-CN.

שדרתי שימוש כדי לאבחן את התנאים המשפיעים על ה-CN למעלה ממאה שנים, ובמשך רוב הזמן הזה, הוא למד בעיקר על ידי מטפלים ככלי אבחון. עם זאת, בשנים האחרונות נוירוביולוגים הכירו את הפוטנציאל של שדרתי לחקר הפתופסולוגיה של ה-CN. בפרט, מספר כלי ניתוח חלבון בתפוקה גבוהה הוצגו בתחום מדעי המוח המאפשר מחקר מפורט של הרכב החלבון של שדרתי, עם הציפייה כי ניתוח זה עשוי לעזור לספק תובנה שינויים דינמיים תרחשות בתוך ה-CN.

התפתחויות טכנולוגיות בשיטות חיסוני מולטיפלקס כגון לומיקס וסימוע טכנולוגיות2,3, לספק לחוקרים היום עם היכולת לזהות מאות חלבונים בריכוזים נמוכים מאוד. כמו-כן, אותן טכנולוגיות מאפשרות שימוש באמצעי אחסון קטנים לדוגמה, ובכך לקדם מחקרים בבעלי חיים קטנים, כולל עכברים, בהם כמויות מוגבלות של מדגם שדרתי מנעה באופן מוגבל תווים מפורטים של הנוזל עד לאחרונה.

אף על פי כן, אזהרה אחת היא כי חלבונים הנמדדים בתוך שדרתי עשוי לנבוע סינתזה הפנימי ו/או ההמרה מן הנסיוב בשל ממשק דם פגום מוח (BBI). למרבה הצער, ניתוח חלבונים של שדרתי בלבד יכול רק לקבוע את הסכום של שני רכיבים אלה. כדי להפלות בין transudate ובין הייצור חלבונים, מדידות חלבון שדרתי באמצעות כל הכלי הזמין ניתוח חלבון חייב להיות מותאם לשונות בודדות ריכוזי סרום, כמו גם שלמות המכשול. עם זאת, למרות התאמה זו משמשת בדרך כלל בפרקטיקה קלינית, למשל, המדד igg שדרתי, אשר יש רגישות גבוהה לזיהוי הפנימי סינתזה igg4,5,6, עד תאריך מחקרים מעטים מאוד מתוקן ריכוזי חלבון שדרתי לריכוז סרום ושלמות המכשול7,8.

כיום, הגישה הרייברגרמה היא הדרך הטובה ביותר לקבוע את תפקוד המכשול וסינתזה של חלבונים. זהו הערכה גרפית בדיאגרמות שדרתי/סרום מנה אשר מנתחת, באופן משולב, הן המכשול (dys) פונקציה סינתזה חלבון הפנימי, המתייחס חלבון בלעדי דם נגזר9,10. אלבומין החלבון העשיר ביותר נבחר בדרך כלל חלבון התייחסות כי הוא מיוצר רק בכבד ובגלל גודלו, כ 70 kDa, הוא ביניים בין חלבונים קטנים וגדולים11. דיאגרמת הניתוח הוגדרה לראשונה על ידי "רייבר ופלינהאואר" ב-1987 לכיתות הגדולות של האימונוגלובונים11, המבוססות על התוצאות שהתקבלו מניתוח של אלפי דגימות אדם9. הגישה אושרה לאחר מכן על ידי יישום שני חוקי הדיפוזיה של Fick בתאוריה של דיפוזיה מולקולרית/שיעור זרימה12. תיאוריה מעין זו ממחישה את הדיפוזיה של חלבון דרך המכשול יש התפלגות היפרבולי יכול להסביר את הדינמיקה של חלבונים ב-cn9,13. בסך הכל, היתרון של שימוש ברייברגרמה לצורך הוכחת סינתזה החלבון הפנימי הוא שהוא במקביל מזהה את שבר החלבון הנכנס השדרתי מן הנסיוב, כמו גם את כמות החלבון שנמצא השדרתי בגלל הייצור המקומי.

המאמר הנוכחי והפרוטוקול הקשור מתארים את ההליך כולו, מתוך מתקן שדרתי ואיסוף דם לחישובים הסופיים לתיקון שדרתי את רמות החלבון, עבור המדידה הכמותית של סינתזת החלבון הפנימי במודלים של העכבר הנוירולוגי פרעות. הליך זה מספק תוכנית בסיסית שממנה יש להעריך (1) את המקור הפתופסולוגי של חלבון שדרתי כלשהו ו-(2) את היציבות והמשמעות הפונקציונלית של שלמות המכשול. הליך זה ופרוטוקול אינם שימושיים רק להערכת דגימות של העכבר, אבל הם גם שימושיים בניתוח שדרתי בהמון מודלים בעלי חיים של מחלות נוירולוגיות וחולים אנושיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל העבודה בעלי חיים מנצל פרוטוקולים שנבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) בבית הספר של גייזל לרפואה בדרתמות.

1. איסוף נוזלים

הערה: הסרום והשדרתי הינם נדרשים. שני פרוטוקולים עבור כל אוסף נוזלים נחוצים להישרדות ונקרופסי.

  1. אוסף של נסיוב ושדרתי שימוש בהליכי הישרדות
    הערה: לאיסוף נוזלי הישרדות, הסרום צריך להקדים את האוסף שדרתי כפי שהוא הליך פולשני פחות. יש להשיג בתוך שבוע. של משיכה בסרום
    1. רטרו-המסלול דימום הליך עבור אוסף הנסיוב.
      הערה: הליך זה מיועד לדימום הישרדות של עכברים14. ההליך המתואר חל על כל גיל, מין, והזן של עכברים. מאז הכללים IACUC להכתיב כי נפח דם מקסימלי של 1% ממשקל הגוף ניתן להסיר כמו לצייר דם יחיד, מומלץ ההליך מבוצע רק על עכברים במשקל יותר 15 g.
      1. הזז את הכלובים המכילים עכברים מארון התקשורת לאזור עבודה מתאים. הכינו את מכונת הגז ההרדמה על ידי הפעלת מד זרימת החמצן ל-1 L/min.
      2. הציבו את החיה בחדר האינדוקציה וסגרו את המכסה בחוזקה. הפעל את מכשיר האידוי ל3.5% ונטר את בעל החיים עד שכיבה.
      3. הסר את בעל החיים מן החדר ולהעריך את רמת ההרדמה על ידי הדוושה רפלקס, כלומר, המשרד לצבוט footpad. להבטיח עומק הולם של הרדמה לפני ביצוע ההליך: חוסר תגובה לצביטה איתנה מעיד על הרדמה נאותה.
      4. רסן את העכבר המורדם על ידי האוחז בעור רופף מאחורי האוזניים עם האגודל והאצבע המורה של היד הלא-דומיננטית. הבליטה את העיניים באמצעות האצבע המורה כדי לצייר בחזרה את העור מעל העין ואת האגודל כדי למשוך בחזרה את העור מתחת לעיניים.
      5. מניחים את קצהו של פיפטה פסטר לתוך שקע העין מתחת לעין (איור 1, הלוח השמאלי), ומכוון את הטיפ כ-45 ° לכיוון מרכז שקע העין (איור 1, הלוח הימני). סובב את הפיפטה בין האצבעות במהלך המעבר הקדמי. הפעילו לחץ עדין ושחררו עד שהדם נכנס לפיפטה.
        הערה: כמות מקסימלית של דם שניתן לפרק בבת אחת מן המיקום הזה הוא כ 1% ממשקל הגוף, למשל, 0.2 mL מ 20 גרם העכבר.
      6. בעדינות להסיר את הנימים כדי למנוע פגיעה בעין ומניחים את הדם שנאסף בשפופרת צנטריפוגה 1.5 mL. לסגור את העפעף ולהחיל לחץ קל עם גזה כדי למנוע דימום נוסף. לאחר התראה מלאה וניידים (בדרך כלל 3-5 דקות), להחזיר את העכבר לכלוב ההחזקה שלו.
      7. אפשר לקריש דם במשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן הצנטריפוגה דם עבור 10 דקות ב 2,000 x g ב -4 ° c צנטריפוגה בקירור. באמצעות טכניקת צנרת נקייה, לאסוף סרום לתוך חדש, המסומן בקבוקון 0.5 mL. בקבוקון מיידי של סרום ב-80 ° c.
    2. אוסף שדרתי בתהליך הישרדות
      הערה: הליך זה מיועד לניתוח הישרדות, והוא מבוסס על הפרוטוקול שפורסם על ידי ליו ו דאף ב-200815. העכברים מורדם על ידי קטמין (20 מ"ג/ml), xylazine (0.5 mg/ml), ו-איזופרומאזין (0.5 mg/ml) קוקטייל מנוהל intraperitoneally.
      1. הזז את הכלובים המכילים עכברים מהמדף לאזור עבודה מיועד לניתוח. הכן מרחב ניתוח בסביבה סטרילית. ודא כי כל המכשירים והחומרים המשמשים הם מעוקר לפני הניתוח.
      2. שוקלים את העכבר ולחשב את נפח ההרדמה הדרוש (0.1 mL של קוקטייל הרדמה עבור 20 גרם עכבר). . הכנס intraperitoneally הרדמה16 אחרי כמה דקות, לבדוק את העכבר על ידי צובט את footpad כדי להבטיח הרדמה נאותה. אם נדרש יותר הרדמה, הכנסה נוספת 0.01 ל0.03 mL של קוקטייל הרדמה.
      3. השתמש או מספריים או מכונת גילוח כדי לגלח אזור קטן של הראש, על קצה caudal, המדיאלי על הגולגולת, כדי לחשוף שטח עבודה גדול מספיק לאוסף שדרתי. הצב את העכבר בתנוחה הנוטה על המכשיר הסטריאוטקאלי, והגבר את הראש באמצעות פסיהאוזן (איור 2 א).
        הערה: העכבר מונח כך שהראש יוצר זווית כמעט 135 ° עם הגוף (איור 2A). לאחר שבעל החיים מוצב, משתמשים בעטוף כירורגי כדי לשמור על שדה סטרילי באתר הכירורגי. וילונות דבק ברור הם העדיפו עבור אוסף שדרתי בעכברים, כפי שהם מאפשרים ויזואליזציה ישירה וממוקדת יותר של החיה.
      4. לנגב את האתר כירורגי עם 30% כלורהקאיטין diacetate. באמצעות אזמל סטרילי, לעשות חתך משונן של העור נחות occiput לחשוף את השרירים על גבי cisterna מגנה.
      5. על ידי ניתוח קהה עם מלקחיים, להפריד את הרקמה התת עורית ואת השרירים כדי לחשוף את cisterna מגנה (איור 2B). השתמש בטרקטורים כדי להחזיק את השרירים בנפרד (איור 2B) ולחשוף את השכבה המנcisterna של דורא מאטר על פני הגנה.
      6. שטוף בעדינות עם תמיסת מלח מוזרמת פוספט סטרילית (PBS) כדי להסיר זיהום דם אפשרי. כתם יבש מאטר דורא עם ספוגית כותנה סטרילית בעדינות לנקב את הקרום המכסה את cisterna מגנה עם המחט 30 G. במהירות ובעדינות להוסיף צינור זכוכית קטנה נימי לאסוף שדרתי (איור 2C).
        הערה: לחץ תוך-גולגולתי מאפשר לזרם באופן ספונטני לזרום בצורה ספונטנית לקפילר (איור 2C). בהתאם לגיל ולגודל של העכבר, כ 5 למעלה-12 μL של שדרתי מתקבל מכל עכבר.
      7. הסירו בזהירות את צינורית הקפילר מהקרום. לחבר את הצינור ל 3 מ ל מזרק דרך אבובים פוליאתילן (טבלה של חומרים) ולהזריק את המבחנה שנאספו לתוך מתויג 0.5 mL צינור (איור 2d). . שמור על הבקבוקונים בקרח
      8. סגירת חתך באמצעות תפר polydioxanone (PDS) עם מחט חד פעמי באמצעות תפרים קבורים17. לנקות את האזור של דם יבש או רקמות.
      9. הכנס עכברים, תת-עורי או intraperitoneally16, עם 0.05-0.1 מ"ג/ק"ג של בופרינורפין הידרוכלוריד כטיפול כאבים. כמו כן, להזריק תת-עורי 1 מ ל של תמיסת מלח סטרילי כדי למנוע התייבשות.
      10. מניחים את העכבר חזרה בכלוב נקי וחמים להחלמה. ברגע שהעכבר נייד ומסוגל להגיע למזון ולמים, הנח את הכלוב בחזרה על המדף.
      11. צנטריפוגה שדרתי עבור 10 דקות ב 1,000 x g ב 4 מעלות צלזיוס צנטריפוגה בקירור. בדוק את מידת זיהום הדם על ידי בדיקה חזותית לזיהוי של קסנטוכרומיה ונוכחות של גלולה אדומה בתחתית הצינור. . התעלם מדגימות מזוהמות דם
        הערה: הנוסחה המשמשת לתיקון כמויות חלבון מתוך שדרתי בדגימות דם מזוהמות מבוססת על פרמטרי המשוואה הכוללים תוכן חלבון ב שדרתי וסרום, המטוקריט (HCT), ותאי דם אדומים (RBC) לספור ב שדרתי דם18. עם זאת, אסטרטגיית תיקון כזו לא יכולה להיות מוחלת בקלות על דגימות שדרתי של העכבר בגלל הנפח הקטן, ולכן להגביל את אסטרטגיית התיקון לבדיקה חזותית.
      12. באמצעות טכניקת צנרת נקייה, לאסוף את שפופרת הזרע לתוך צינור חדש 0.2 mL, משאיר מאחורי הגלולה עם תאים. דלל את שדרתי 1:3 עם PBS כדי להפחית את אובדן נפח עקב תרסיס. להקפיא מיד את המבחנה של שדרתי ב-80 ° c.
  2. אוסף של סרום ומלא שדרתי באמצעות הליכי אי-הישרדות
    הערה: עבור אוסף נוזלים שאינם להישרדות, אוסף שדרתי מקודם אוסף הנסיוב כמו העכבר צריך להיות דופק.
    1. איסוף שדרתי
      הערה: הליך זה מיועד לניתוח אי-הישרדות, ובערך 10-20 μL של שדרתי מתקבל מכל עכבר. שדה כירורגי סטרילי מומלץ, אך אינו נדרש ניתוח שאינו הישרדות.
      1. הזז את הכלובים המכילים עכברים מארון התקשורת למרחב עבודה נוח. בצע את השלבים 1.1.2.2-1.1.2.7 ו 1.1.2.11-1.1.2.12 עבור אוסף שדרתי. המשך למדור 1.2.2. עבור אוסף הנסיוב
    2. איסוף דם באמצעות ניקוב תאיים (גישה פתוחה)
      הערה: כמויות הדם הצפויות הוא כ 3% ממשקל הגוף, למשל, 0.6 mL מ 20 גרם עכבר.
      1. האוסף העוקב אחר השדרתי מבטיחים שהעכבר עדיין מורדם מספיק על ידי צביפת הרגליים. אם כל תגובה היא נצפתה, לתת מנה שנייה של הרדמה. . אם התגובה לא נצפתה, המשך
      2. מניחים את החיה על הגב לנקות את העור על הבטן עם 70% אלכוהול. עם מספריים כירורגיים, פתחו את חלל. החזה וחשפו את הלב הכנס מחט של 25 גרם (המצורפת ל 3 מזרק mL) לתוך החדר השמאלי ולהחיל בעדינות לחץ שלילי על המזרק מזרק. משיכת המחט לאחר דם נאסף.
      3. לבצע שיטה משנית של המתת חסד כגון עריפת ראש או פריקה צוואר הרחם כדי להבטיח כי החיה הוא נפטר.
      4. לדחוף את הבוכנה של המזרק למטה ולהזריק את הדם שנאסף לתוך בקבוקון 1.5 mL. אפשר דם כדי קריש 30-60 דקות ב RT ולאחר מכן צנטריפוגה אותו עבור 10 דקות ב 2,000 x g ב-4 מעלות של צנטריפוגה בקירור.
      5. באמצעות טכניקת הפיפטה נקי, לאסוף סרום לתוך בקבוקון חדש, המסומן 0.5 mL. בקבוקון הקפאה מיידי של סרום במקפיא של 80 ° c.

2. אנליזת חלבון

  1. השתמש בשיטה מועדפת, לדוגמה, טכנולוגיית לומיקס, עבור כימות חלבון היעד (ים) ואלבומין בדגימות שדרתי.
    הערה: הנה, דוגמה ניתנת עם טכנולוגיה מגנטית של לומיקס, אך כמעט כל טכניקה המודד כמויות חלבונים, כולל חיסוני הקשורות לאנזימים (אליפי), ניתן להחיל על הפרוטוקול הנוכחי. באופן אידיאלי, דגימות שדרתי וסרום מופעל לשני אלבומין והיעד חלבונים על אותה פלטפורמה. תנאי שילובים חייב להיות ממוטב עבור צעדים מכריעים בפרוטוקול כגון, אנטיגן מצמד הריכוז, סרום ו שדרתי לדוגמה דילול, עקומות סטנדרטיות התאמה הטובה ביותר עבור כל אנליטה, והרכב המאגר כדי להפחית את הפעילות החוזרת לא ספציפית. אם משתמשים בערכה מסחרית למדידת חלבונים, לדוגמה, ערכת הקלדה החיסוני האיזובולין (רשימת חומרים) המשמש לקבלת נתונים המוצגים באיור 3, הוראות היצרנים יש לעקוב.
    1. עם הפשרה ולפני ניתוח, צנטריפוגה שדרתי ודגימות סרום (2,000 x g עבור 10 דקות) ולהשתמש supernatant כדי למנוע סתימת לוחיות הסינון ו/או לחקור. בצע את תהליך הטיפול שסופק עם הערכה עבור מדלל דגימה המתאימות. אחרת, לקבוע את הדילול המתאים עבור כל האנליטה ונוזל. . לדלל דגימות בערוץ הPBS בהתאם
      הערה: אם אין הנחיות מסוימות או הוראות, מדלל עבור כל אנליטה ונוזל צריך להיות מוקם לפני הבדיקה המחקר, על ידי קביעת טווחי דילול המתאים הדרושים כדי להשיג הערכות ריכוז הנופלים בתוך ה טווח אמין של עקומה סטנדרטית. הכרת המאפיינים של המדגם הביולוגי להיות מנותח, למשל, ריכוזים פיזיולוגיים ופתולוגיים בנוזל, מאפשר לנסות מדלל שונים עם דגימות של תוכן נמוך, בינוני, וגבוה. אם הטווח הצפוי של ריכוזים בדגימות ידוע פריורי, הדילול ניתן לבחור לאחר חישוב כמה פעמים המדגם צריך להיות מדולל כדי להיות בתוך טווח העיקול הרגיל הנבחר.
      התראה: על-ידי חישוב גורמי הדילול, זכור כי שדרתי כבר מדולל 1:3.
    2. הכן עקומה סטנדרטית עבור כל חלבון של עניין, למשל, אלבומין ו IgG כפי שנעשה שימוש כדי ליצור נתונים באיור 3, על ידי התייחסות מדלל סדרתי חלבונים סטנדרטיים. במהלך הכנת עקומות סטנדרטיות, לערבב ביסודיות כל ריכוז גבוה לפני ביצוע הדילול הבא.
      הערה: ללא קשר לשיטה שנבחרה לכמת, הכרחי לכלול עיקול סטנדרטי בכל פעם שההערכה מבוצעת להערכת החלבון (עם) ריכוז בדגימות. הבחירה הטובה ביותר עבור תקן התייחסות היא ריכוז מזוקק, ידוע של חלבון הריבית. ההחלטה על הדילול הספציפי, כמו גם על מספר נקודות הנתונים והמשכפלת המשמשות להגדרת העקומה הסטנדרטית, תלויה בדרגת היניאריות בעקומה הסטנדרטית.
    3. בחר את התאים המתאימים לנוגדנים מגנטיים מצמידים (טבלת חומרים). עבור מבחנות בודדות של חרוזים, sonicate כל בקבוקון עבור 30 s ומערבולת עבור 1 דקות. להכין "תערובת חרוזים עבודה" על ידי דילול מניות חרוז לריכוז הסופי של 50 חרוזים של כל סט/μL בתוך שיטת העבודה/שטיפת מאגר (PBS, 1% הסרום בימין). הוסף 50 μL של החרוזים מעורבים לכל באר בתחתית שטוח 96-באר (לוח חומרים).
      התראה: חרוזי הפלורסנט רגישים לאור. לכן, הם צריכים להיות מוגנים מפני חשיפה ממושכת לאור במהלך ההליך.
    4. דיאגרמת מיקום של רקעים, תקנים ודגימות בגליון עבודה של מפה טובה.
    5. הוסף 50 μL של מאגר התקן/לשטוף את כל הרקע היטב, ו 50 μL של כל תקן לבארות עבור העקומה הרגילה. טען 50 mL של כל מדגם מדולל לתוך הבארות המתאימות אחרון. לעטוף את הצלחת עם רדיד מנייר ו-דגירה עם עצבנות (~ 800 rpm) על שייקר צלחת עבור 30 דקות ב RT.
    6. מניחים את הצלחת על מגנט כף יד (טבלה של חומרים) ולהניח את הצלחת על המגנט של ~ 60 s כדי לאפשר הגדרה מלאה של חרוזים מגנטיים. הסירו את התוכן היטב בעזרת היין העדין של הצלחת ולוחית ההקשה על רפידות ספיגה כדי להסיר נוזל שיורית.
    7. לשטוף את הצלחת על ידי הסרת אותו מן המגנט, על ידי הוספת 200 μL של שיטת החישוב/לשטוף מאגר, על ידי טלטול עבור ~ 30 s, ולבסוף על ידי הצמדת אותו מחדש למגנט. חזור על כביסה 3x.
    8. לדלל את נוגדן זיהוי biotinylated, כלומר, ביוטין התווית נוגדן העלה נגד מינים מארחים חלבון, כדי 4 μg/mL בתוך מאגר בדיקות/לשטוף. הוסף 50 μL של נוגדן לזיהוי מדולל לכל טוב. לכסות את הצלחת ו דגירה עבור 30 דקות ב-RT על שייקר צלחת ב ~ 800 rpm. הנח את הצלחת על המגנט וחזור על הצעדים 2.1.6 ו 2.1.7.
    9. לדלל את הפיקוארירין (PE)-streptavidin מצומנת (SAPE) עד 4 μg/mL בתוך מאגר הערכה/שטיפת. הוסף 50 μL של SAPE מדולל לכל טוב. לכסות את הצלחת ו דגירה עבור 30 דקות ב-RT על שייקר צלחת ב ~ 800 rpm. הנח את הצלחת על המגנט וחזור על הצעדים 2.1.6 ו 2.1.7.
    10. הסר את הצלחת מהמגנט והשהה מחדש את החרוזים ב-100 μL של מאגר השוטף. לקרוא בארות עם מכשיר לייזר כפול תזרים מבוסס איתור המאפשר זיהוי של הגודל של עוצמת הזריחה PE (FI).
      הערה: האות, למשל, FI, שנוצר פרופורציונלי על כמות אנטיגן היעד המצורפת למשטח של החרוזים.
    11. לייצא נתונים גולמיים וליצור עקומות סטנדרטיות על-ידי אות זיהוי גרפים מסוג FI לעומת ריכוזי חלבון סטנדרטיים. השתמש בעקומות הסטנדרטיות כדי לחשב את ריכוז האנליט (ות) בדגימות.
      הערה: אלבומין מבוטא ב-g/dL, ואילו חלבונים של עניין מבוטאים לידי ביטוי ב-mg/dL.

3. חישובי המדד הפנימי

  1. ארגן ערכי ריכוז חלבונים בגיליון אלקטרוני ונתח את התוצאות על-ידי החלת הנוסחאות הבאות.
  2. חישובשאלה:
    Equation 1
    כאשראלבומין השדרתי והסרוםאלבומין הם ריכוזים של אלבומין מתאים בסרום ובדגימות שדרתי, בהתאמה.
  3. חישובחלבוןQ:
    Equation 2
    בוחלבון שדרתיוחלבון סרום הם ריכוזים של חלבון מטרה (s) בתאים ודגימות שדרתי, בהתאמה.
  4. חשב את אינדקס החלבון:
    Equation 3

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זה ניסוי מייצג שנועד להשוות את הסינתזה הפנימי של IgG בשני מודלים מכרסמים רלוונטיים קלינית של טרשת נפוצה (MS): המושרה PLP139-151הנגרמת אוטואימוניות Encephalomyelitis (R-השני) ואת כרונית מתקדמת, מורלין encephalomyelitis הנגרמת וירוס המושרה המחלה deמחלות (TMEV-IDD). R-הם מודל שימושי להבנת הישנות-MS, ואילו מודל TMEV-IDD תכונות MS מתקדמת כרונית19.

לצורך המחקר הנוכחי, בוצע ניתוח כמותי של סינתזה IgG הפנימי ב-R-האלה (n = 12) ו-TMEV-IDD (n = 28). שתי הקבוצות נותחו בשיא המחלה. קבוצה נוספת של 10 עכברים הייתה מטופלת ושימשה כקבוצות שליטה מותאמות לגיל (cR-האלה n = 4, cTMEV-IDD d = 6).

גישה מגנטית מבוססת חרוז עם הערכה הזמין מסחרית (טבלה של חומרים) שימש למדוד igg סה כ הסרום התאים שדרתי דגימות. ערך ה-IgG הכולל נגזר מסכום הערכים IgG1, IgG2a, IgG2b ו-IgG3 של מחלקת המחלקות. אלבומין נמדד בעזרת ערכת העכבר המסחרית (טבלת חומרים), מכיוון שמערכת שיטת לומיקס לאלבומין לא הייתה זמינה באותה תקופה. כל המדידות נערכו בקפידה בעקבות הוראות היצרנים. מנה אלבומין(qigg/qאלבומין) השתמשו לאחר מכן כדי להבדיל בין דם לבין מערכת הניווט האנטי-ממשלתית.

כפי שמוצג באיור 3A, רמות בפועל של igg סך הכל מוגברת באופן משמעותי את שדרתי של מודלים שניהם מכרסמים של MS כאשר לעומת הגיל המתאים שולטת המזויף (p ≤ 0.026). עם זאת, עכברים R-האלה להראות משופרת באופן משמעותי ערכיאלבומין (p ≤ 0.019), המציין חדירות מוגברת של המכשול בעכברים האלה (איור 3b). לעומת זאת, אין הבדליםבאלבומין הקיים בין tmev-IDD ועכברים מזויפים (p = 0.49), ובכך מאמתים את הממצא הקודם של מכשול שלם ב-tmev-IDD עכברים7,8. כדי להפלות עוד יותר בין transudate לבין הפנים המיוצרים IgG ב-R-האלה ו TMEV-IDD, מדד IgG נמדד, מראה ערכים גבוהים באופן משמעותי ב TMEV-IDD עכברים (p ≤ 0.0006), ולכן הייצור הפנימי של igg במודל זה (איור 3c).

מכשול שלם בעכברים TMEV-IDD יחד עם מדד IgG גבוה מציע כי במודל זה, הנוגדן מופק בתוך ה-CN. לעומת זאת, ב-R-האלה, התמוטטות משמעותית מכשול ואינדקס IgG נמוך לספק ראיות כי המחקר החיצוני IgG מופק בעיקר על ידי היקפי ולא בתאי B, גם רומז כי במודל זה חריפה של MS, שדרתי IgG בעיקר נגזר סרום.

Figure 1
איור 1: הדימום מסלולית רטרו של עכברים. שמאל: המיקום הנכון של המחט ביחס לסינוס מסלולית רטרו, העין ואת החלק האחורי של המסלול. מימין: מיקום הפיפטה מתחיל ב canthus האמצעי של העין ונוצץ אל ההיבט הגבי של המסלול. הקפילר מוכנס בזווית של 45 °. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אוסף שדרתי בעכברים. (א) פסי האוזן תומכים בראשו של העכבר, והעכבר מונח כך שהראש יוצר זווית 135 מעלות עם הגוף. החץ מצביע על cisterna מגנה חשופים. (ב) באמצעות חיתוך קהה עם מלקחיים, השרירים מופרדים כדי לחשוף את cisterna מגנה (מופנה על ידי החץ). מיקרוטרקטורים משמשים להחזיק את השרירים בנפרד. (ג) צינור זכוכית קטן נימי משמש לאיסוף שפופרת שדרתי מן cisterna מגנה. . עקב הלחץ התוך-גולגולתי החץ מצביע על השדרתי שנאסף בקפילר. (ד) השדרתי מועבר לתוך צינור 0.5 ml באמצעות מזרק שונה ל 3 מ ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מכשול הדם במוח תפקוד וסינתזה של Igg ב-R-IDD ו-tmev-. כתםכתמיהמייצג (א) רמות השדרתי של הכולל igg (Mg/dL) נמדד על ידי טכנולוגיית הומיקס, (ב) אלבומין quotients (qאלבומין), ו-(ג) igg מדדים (qIG/qאלבומין) בעכברים חד-מריים ומIDD, כמו גם עכברים שליטה בהתאם לגיל (cR-בן ו-ctmev-IDD). קווים אופקיים מייצגים את הערך החציוני עבור קבוצה זו. p < 0.0001; p < 0.001; * *p < 0.01; *p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטות כמותיים להערכת ריכוזי חלבון שדרתי מוגברת הם כלים שימושיים באפיון המצב הפיזיולוגי והפתולוגי של ה-CN. עם זאת, מעבר לקוונפיקציה אמין של רמות חלבון שדרתי, הזיהוי של חלבונים מתוך שדרתי מחייב ביטוי של תוצאות המפלה בין שברים דם ומערכת התחתית של שדרתי. עם זאת, עד כה, כימות החלבון הנפוץ בשימוש לא מאפשרים אפליה בין שני רכיבי החלבון, אפילו בעזרת כלי תפוקה גבוהה. כך, תיקונים ספציפיים מדידות חלבונים הוצעו על מנת להבדיל בין חלבונים מסונתז בתוך תא ה-CN וחלבונים הנגזרים מדם. תיקונים כאלה מפצים על שינויים בודדים בריכוזי הסרום ובשלמות המכשול. באופן כללי, תיקונים אלה מבוססים על חישובים של המנה השדרתי/סרום (Qחלבון), אשר מפחית את השונות עקב הבדלים בריכוז הפרט של חלבון הנסיוב. וריאציה שלחלבון q הקשור הבדלים בודדים בתפקוד המכשול ניתן להוריד עוד יותר על ידי התייחסותחלבון q למנה שדרתי/סרום אלבומין (Qאלבומין). השילוב של שני התיקונים מוכר בדרך כלל כאינדקס חלבונים ומחושבכיחס החלבוןשל Q:1,6.

אלבומין, מסונתז ומופרש על ידי הכבד, הוא חלבון פלזמה הגדול הזורם במחזור הדם. בגלל אלבומין מופק באופן בלעדי מחוץ ל-CN והרמות שלה בתוך שדרתי הם נמוכים (~ 0.15 g/dL), מוגברת רמות אלבומין מוגבר מצביעים על נזק BBI או זיהום הדם בשל הדימום הפנימי או מערכת שדרתי טראומטי. בכל אחד מהתנאים הללו, אלבומין הטרנס מסרום לתוך שנות השדרתי בפרופורציה לריכוז הנסיוב שלה. לפיכך, בהעדר זיהום דם, הקיוהאלמין יכול לשמש כאינדיקטור לתפקוד המכשול20. לעומת זאת, ה-"קיואלבומין " נשאר קבוע בטווח הנורמלי של בני אדם ובעלי חיים בעליbbiשלמה ללא שינוי. הנחה בסיסית לשימוש במנה4,6 בחישוב סינתזה חלבון בתוך הבית הוא כי כמות מוגברת של חלבון שדרתי בנוכחות מכשול דולף הוא פרופורציונלי לעלייה בריכוז אלבומין שדרתי. הנחה זו היתה מאושרת במחקר מ 19774, שבו מחברים בפיקוח על מטופלים ב-MS מעבר דם-שדרתי המעבר של igg ו-אלבומין השיגה האדם בריא סרה.

בדומה לאלבומין, כל חלבון בדם יכול לחצות את ה-BBI. כאשר המכשול שלם,חלבון Q הוא קבוע יחסית. בניגוד אלבומין, עם זאת, חלבונים רבים יכולים גם להיות מסונתז בתוך ה-CN. כתוצאה מכך,חלבון Q שהשתנה יכול לנבוע ממכשול פגום ו/או הגדלת ייצור החלבון הפנימי. עם זאת, כאשר ריכוז חלבון שדרתי גבוה מוגבר הוא בשל רק BBI פרוצים, ערכים עבורהחלבון q ו-qאלבומין מוגברת, בהשוואה לערכים של אותם quotients בעלי חיים עם מכשול שלם. לעומת זאת, כאשר המכשול הוא שלם, מוגברת ריכוזי חלבון שדרתי מוגבר ככל הנראה בשל סינתזה הפנימי מוגבר, ורקהחלבון Q הוא גדל בסופו של דבר.

השימוש באינדקס החלבון עשוי להיות מוגבל באופן חלקי על-ידי חמישה גורמים: 1) השונות הגדולה של ריכוז אלבומין שדרתי בבעלי חיים בריאים, 2) הרדיוס ההידרודינמי השונה של חלבונים, 3) הביטוי האנדוסוגני של חלבונים, 4) טכניקות דגימה שונות, ו-5 הבדלים מורפולוגיים של BBI. השונות הגדולה של ריכוז אלבומין של שדרתי בבעלי חיים בריאים גורמת לשונות ניכרת בערכים של מדד החלבון הסופי. בבני אדם, למשל,האלבומין תלוי בגיל מאז שהוא גדל עם גיל22. דו ח קודם הזכיר גם הבדל מבוסס-מין ב-Qאלבומין באוכלוסיה בריאה23. באופן דומה, בעכברים בריכוזים של אלבומין תלוי בגיל ומזן העכבר24, למשל,האלבומין החדש עבור צעיר, זכר, C57Bl/6 עכברים עשויים להיות שונים מןאלבומין הישן עבור עכברים ישנים, הנשי, DBA/1j. לכן, אין אפשרות ליצור מרווחי ייחוס סטנדרטיים עבור שלמות המכשול ובין המינים, והסכום המתאים צריך להיות מחושב בהתבסס על התנאים הניסיוניים הספציפיים.

גורם נוסף הגורם להשתנות באינדקסים הרגילים בין החלבונים הוא הגודל המולקולרי שלהם. מעבר של סרום חלבונים דרך BBI תלוי בגודל המולקולרי שלהם, ואת הקורלציה בין שיעור הסיווג ומשקל מולקולרי (MW) משמש רבות כדי להעריך את החדירות של BBI. מבני חלבונים כלליים נעים בגודלם מעשרות עד אלפי חומצות אמינו. חלבונים מסוימים הם בעלי גודל מולקולרי קטן יחסית, כגון נוגדנים, עם משקל מולקולרי הנע בין 8 ל 20 kDa. כזה מגוואט נמוך מעדיף חציית BBI, בסופו של דבר וכתוצאה מכך מפתחות חלבון נורמלי גבוה יותר. באופן שונה, חלבונים אחרים, כמו IgM, הם גדולים מאוד (900-950 kDa), ולכן מציג אינדקסים נמוכים מאוד בתנאים נורמליים6. עם זאת, זה לא תמיד המקרה, מאז, למרות MW דומה, כמה חלבונים לחלחל את המכשול הרבה יותר טוב מאשר חלבונים אחרים, אולי בגלל צורה אחרת. לפיכך, מקדם הדיפוזיה של חלבון, ומכאן ההידרודינמיקה הידרודינמית מחושבת ממנו, תלוי בגודל ובצורה של מולקולות25. ההבדל המהותי בין הגיאומטרי לבין הנפח ההידרודינמי של חלבון הופך לברור ביותר עם חלבונים גדולים מעל 150 kDa. שיעורי הסיווג ירידה של, למשל, ceruloplasmin (132 kDa), IgG (150 kDa), ו IgA (150 kDa) לשקף את טרוגניות הידרודינמי של שלושת החלבונים האלה, אשר יש MW דומה25. ייתכן גם כי יש הייצור הפנימי של חלבונים בנסיבות רגילות. כמה נוגדנים, למשל, CXCL10, מיוצרים בדרך כלל בתוך הספר, בעוד אחרים, למשל, CXCL13, הם לא26,27. משמעות הדבר היא כי הפרשנות של אינדקסים חלבון תחת התנאים הניסיוניים ביותר בדרך כלל דורש ניתוח של גיל-, מין, ו להתאמץ התאמה שולטת מטופל.

רמות החלבון בנוזלים יכולות להיות גם מושפעות מטכניקות דגימה שונות. אמנם זה לא יכול להיות בעיה עבור אוסף שדרתי כמתואר כאן-אין הבדלים בדגימה של שדרתי בין הליכים מתוארים שאינם הישרדות-, שיטות איסוף דם שונים ייתכן השפעה על כמות חלבון הסרום הכולל. כמה שיטות של איסוף דם יבול דם עורקי, אחרים להניב דם ורידים, בעוד אחרים להניב תערובת של שני14. המדגם שהתקבל הישרדות רטרו מסלולית דימום הוא תערובת של דם ורידים ונוזל רקמות, בעוד איסוף דם הטרמינל מנקב הלב יכול להניב דם ורידים או עורקים או תערובת של שני14. בבעלי חיים בריאים, החלבון הכולל והתוכן אלבומין של סרום הדם העורקי עשוי להיות מעט גבוה יותר מאשר באותם שברים של סרום דם הורידים28. זה צריך להילקח בחשבון כאשר הישרדות ודגימות אי-הישרדות מושווה.

בסופו של דבר, תכונה חשובה לשקול הוא המבנה הטרוגנית מורפולוגית של BBI, אשר מורכב לפחות שני מחסומים נפרדים, מחסום הדם-מוח (BBB) הממוקם באנדותל של המוח מיקרוכלים ומחסום דם-שדרתי (BBI שדרתי) הממוקם ב האפיתל של pleoid שימושים29. שני המחסומים מגבילים ומווסת את מעבר המולקולות והתאים בין תאי הפריפריה והשדרה, למרות שהם עושים זאת על-ידי מנגנונים שונים. בעוד BBB הוא מכשול פיזי אמיתי, המאופיין במגע מורכב בין התאים, ה-BCSF השדרתי הוא יותר מכשול פיזיולוגי, אשר בעיקר תלוי בזרימת שדרתי. הנחות בייצור שדרתי, שחרור, ושיעור זרימה עקב מצבים נוירולוגיים ו/או טראומה פוגעים בתפקוד באמצעות שדרתי, ובכך להגדיל את ה-sאלבומין9,30,31,32. לפיכך, Qאלבומין משמש כסמן טוב יותר לחדירות השדרתי, ולא ל-bbb או לרוב חדירות ה-bcsf.

לסיכום, החישוב של מדד החלבון הוא שיטה פשוטה יחסית, ומאופיינת היטב לאפליה בין transudate לבין מגוון החלבונים המיוצרים. היתרון של החלת נוסחה זו כדי לתקן את המדידה הכללית של חלבונים בדגימות שדרתי שגיאה היא כי היא מייצרת משתנה אובייקטיבי לכמת את הסינתזה הפנימי של חלבונים ולמדוד את BBI, במיוחד BBI דרתי, (dys) פונקציה. בהתחשב בחוסן של גישה זו, התיקון של כמויות החלבון השדרתי באמצעות מדד החלבוןוהפרוטאין מספק בסיס שנגדו ניתן להעריך (1) את המקור הפתופיקולוגי של חלבון שדרתי כלשהו ו-(2) את היציבות והמשמעות הפונקציונלית של שלמות המכשול. כאן הוא הציג פרוטוקול מפורט, מ שדרתי ואיסוף דם לחישובים הסופיים לתקן את הסכום הכולל חלבון שדרתי, אשר חל על מודלים של העכבר על מחלות נוירולוגיות. עם זאת, אותו הפרוטוקול ניתן להתאים בקלות למחקר של שדרתי וסינתזה של חלבונים בכל חיה, כולל בני אדם. Qאלבומין ו-igg מדד הם כבר בשימוש נפוץ בפרקטיקה קלינית לאבחון של מחלות נוירולוגיות דלקתיות6. אותם פרמטרים אותם יש גם שימשו בהצלחה כדי להעריך מגוון רחב של ציטוקינים ו נוגדנים בחולים עם מחלות מדמיאלואידית דלקתית26,33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים מודים לצוות המרכז לרפואה השוואתית ומחקר (CCMR) ב דארטמאות עבור הטיפול המומחים שלהם העכברים המשמשים למחקרים אלה. קופת המחקר של בורנשטיין מימנה את המחקר הזה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL insulin syringe BD 329650
1 mL syringe BD 329622
25 gauge needle BD 305122
3 mL syringe BD 309582
30 gauge insulin needle BD 305106
Absorbent pads Any suitable brand
Acepromazine Patterson Vet Supply Inc
BioPlex Handheld Magnetic Washer BioRad 171020100 Magnet
BioPlex MAGPIX Multiplex Reader BioRad 171015001
BioPlex Pro Flat Bottom Plates BioRad 171025001
Biotinilated detection antibody Any suitable source The antibody has to be directed against the species of the protein of interest.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A4503
Buprenorphine hydrochloride PAR Pharmaceutical NDC 42023-179-05
Capillary Tubes Sutter Instrument B100-75-10 OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller.
Centrifuge tube, 0.2 mL VWR 20170-012
Centrifuge tube, 0.5 mL VWR 87003-290
Centrifuge tube, 1.5 mL VWR 87003-294
Chlorhexidine diacetate Nolvasan E004272
Disposable pipettes tips Any suitable brand
Ear bars KOPF Instruments 1921 or 1922
Ethanol Kopter V1001
Freezer VWR VWR32086A
Gauze Medline NON25212
Heating pad Sunbeam XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch
Induction Chamber VETEQUIP
Isoflurane Patterson Vet Supply Inc NDC 14043-704-06
Ketamine (KetaVed) Patterson Vet Supply Inc
MagPlex Microspheres (antibody-coupled) BioRad Antibody-coupled magnetic bead
Microplate Shaker Southwest Scientific SBT1500
Microretractors Carfill Quality ACD-010 Blunt - 1 mm
Microsoft Office (Excel) Microsoft
MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel EMD Millipore MGAMMAG-300K Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids.
Mouse Albumin capture ELISA kit Novus Biological NBP2-60484 Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids.
Multichannel pipette Eppendorf 3125000060
Non-Sterile swabs MediChoice WOD1002 Need to be autoclaved for sterility
Oxygen AIRGAS OX USPEA
Pasteur Pippettes Fisher 13-678-20A 5 & 3/4"
PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen Patterson Vet 8695G P-3 Reverse Cutting, 18"
PE-Streptavidin BD Biosciences 554061
Pipetters Eppendorf Research seriers
Polyethylene tubing
Refrigerated Centrifuge Beckman Coulter ALLEGRA X-12R
Scale Uline H2716
Scalpel Feather EF7281
Shaver Harvard Apparatus 52-5204
Standard proteins Any suitable source The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest.
Stereotaxic instrument KOPF Instruments Model 900LS Standard Accessories
Sterile 1 x PBS Corning Cellgro 21-040-CV
Sterile saline Baxter 0338-0048-02 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP
Surgical Forceps Curved, 7 (2) Fine Science Tools 11271-30 Dumont
Surgical Scissors Fine Science Tools 14094-11 Stainless 25x
Vaporizer + Flow meter Moduflex Anhestesia Instruments
Vortex Fisher 02-215-414
Warming pad Kent Scientific Corporation RT-JR-20
Water Sonicator Cole Parmer EW-08895-01
Xylazine Patterson Vet Supply Inc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whedon, J. M., Glassey, D. Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance. Alternative Therapies in Health and Medicine. 15, (3), 54-60 (2009).
  2. Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease. Methods. 56, (4), 484-493 (2012).
  3. Barro, C., et al. Fluid biomarker and electrophysiological outcome measures for progressive MS trials. Multiple Sclerosis. 23, (12), 1600-1613 (2017).
  4. Tourtellotte, W. W., et al. Multiple sclerosis: measurement and validation of central nervous system IgG synthesis rate. Neurology. 30, (3), 240-244 (1980).
  5. Bonnan, M. Intrathecal IgG synthesis: a resistant and valuable target for future multiple sclerosis treatments. Multiple Sclerosis International. 2015, 296184 (2015).
  6. Reiber, H. Cerebrospinal fluid--physiology, analysis and interpretation of protein patterns for diagnosis of neurological diseases. Multiple Sclerosis. 4, (3), 99-107 (1998).
  7. DiSano, K. D., Linzey, M. R., Royce, D. B., Pachner, A. R., Gilli, F. Differential neuro-immune patterns in two clinically relevant murine models of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 16, (1), 109 (2019).
  8. Pachner, A. R., Li, L., Lagunoff, D. Plasma cells in the central nervous system in the Theiler's virus model of multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 232, (1-2), 35-40 (2011).
  9. Reiber, H. Flow rate of cerebrospinal fluid (CSF)--a concept common to normal blood-CSF barrier function and to dysfunction in neurological diseases. Journal of Neurological Sciences. 122, (2), 189-203 (1994).
  10. Reiber, H., Zeman, D., Kusnierova, P., Mundwiler, E., Bernasconi, L. Diagnostic relevance of free light chains in cerebrospinal fluid - The hyperbolic reference range for reliable data interpretation in quotient diagrams. Clinica Chimica Acta. 497, 153-162 (2019).
  11. Reiber, H., Felgenhauer, K. Protein transfer at the blood cerebrospinal fluid barrier and the quantitation of the humoral immune response within the central nervous system. Clinica Chimica Acta. 163, (3), 319-328 (1987).
  12. Dorta-Contreras, A. J. Reibergrams: essential element in cerebrospinal fluid immunological analysis. Revista de Neurologia. 28, (10), 996-998 (1999).
  13. Metzger, F., Mischek, D., Stoffers, F. The Connected Steady State Model and the Interdependence of the CSF Proteome and CSF Flow Characteristics. Frontiers Neuroscience. 11, 241 (2017).
  14. Wolforth, J. Methods of blood collection in the mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  15. Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. Journal of Visualized Experiments. (21), e960 (2008).
  16. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  17. Johnston, S. A., Tobias, K. M. Veterinary Surgery: Small Animal Expert Consult - E-Book. Elsevier Health Sciences. (2017).
  18. Nigrovic, L. E., Shah, S. S., Neuman, M. I. Correction of cerebrospinal fluid protein for the presence of red blood cells in children with a traumatic lumbar puncture. Journal of Pediatrics. 159, (1), 158-159 (2011).
  19. McCarthy, D. P., Richards, M. H., Miller, S. D. Mouse models of multiple sclerosis: experimental autoimmune encephalomyelitis and Theiler's virus-induced demyelinating disease. Methods in Molecular Biology. 900, 381-401 (2012).
  20. Link, H., Tibbling, G. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. II. Relation of the concentration of the proteins in serum and cerebrospinal fluid. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37, (5), 391-396 (1977).
  21. Tibbling, G., Link, H., Ohman, S. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. I. Establishment of reference values. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37, (5), 385-390 (1977).
  22. Deisenhammer, F., et al. Guidelines on routine cerebrospinal fluid analysis. Report from an EFNS task force. European Journal of Neurology. 13, (9), 913-922 (2006).
  23. Johanson, C. E., Stopa, E. G., McMillan, P. N. The blood-cerebrospinal fluid barrier: structure and functional significance. Methods in Molecular Biology. 686, 101-131 (2011).
  24. Zaias, J., Mineau, M., Cray, C., Yoon, D., Altman, N. H. Reference values for serum proteins of common laboratory rodent strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, (4), 387-390 (2009).
  25. Felgenhauer, K., Renner, E. Hydrodynamic radii versus molecular weights in clearance studies of urine and cerebrospinal fluid. Annals of Clinical Biochemistry. 14, (2), 100-104 (1977).
  26. Pachner, A. R., DiSano, K., Royce, D. B., Gilli, F. Clinical utility of a molecular signature in inflammatory demyelinating disease. Neurology, Neuroimmunology & Neuroinflammation. 6, (1), 520 (2019).
  27. Pachner, A. R., Li, L., Gilli, F. Chemokine biomarkers in central nervous system tissue and cerebrospinal fluid in the Theiler's virus model mirror those in multiple sclerosis. Cytokine. 76, (2), 577-580 (2015).
  28. Gerbi, C. Protein concentration in the arterial and venous renal blood serum of the rabbit. Archives of Biochemistry and Biophysics. 31, (1), 49-61 (1951).
  29. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37, (1), 13-25 (2010).
  30. Reiber, H. Proteins in cerebrospinal fluid and blood: barriers, CSF flow rate and source-related dynamics. Restorative Neurology and Neuroscience. 21, (3-4), 79-96 (2003).
  31. Reiber, H. Knowledge-base for interpretation of cerebrospinal fluid data patterns. Essentials in neurology and psychiatry. Arquivos de Neuropsiquiatria. 74, (6), 501-512 (2016).
  32. Kuehne, L. K., Reiber, H., Bechter, K., Hagberg, L., Fuchs, D. Cerebrospinal fluid neopterin is brain-derived and not associated with blood-CSF barrier dysfunction in non-inflammatory affective and schizophrenic spectrum disorders. Journal of Psychiatric Research. 47, (10), 1417-1422 (2013).
  33. Bromader, S., et al. Changes in serum and cerebrospinal fluif cytokines in response to non-neurological surgery: an observational study. Journal of Neuroinflammation. 9, 242 (2012).
  34. Starhof, C., et al. Cerebrospinal fluid pro-inflammatory cytokines differentiate parkinsonian syndromes. Journal of Neuroinflammation. 15, (1), 305 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics