Integrazione di approcci bioinformatici e convalide sperimentali per comprendere il ruolo della segnalazione di nota nel cancro ovarico

Cancer Research

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Summary

La bioinformatica è un modo utile per elaborare set di dati su larga scala. Attraverso l'implementazione di approcci bioinformatici, i ricercatori possono ottenere rapidamente, in modo affidabile ed efficiente applicazioni approfondite e scoperte scientifiche. Questo articolo dimostra l'utilizzo della bioinformatica nella ricerca sul cancro ovarico. Convalida anche con successo i risultati della bioinformatica attraverso la sperimentazione.

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Defreitas, S., Rowe, M., Paculis, L., Jia, D. Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer. J. Vis. Exp. (155), e60502, doi:10.3791/60502 (2020).

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Abstract

La segnalazione di notch è un percorso normativo altamente conservato coinvolto in molti processi cellulari. La disregolazione di questo percorso di segnalazione spesso porta a interferenze con un corretto sviluppo e può anche provocare l'avvio o la progressione dei tumori in alcuni casi. Poiché questo percorso serve funzioni complesse e versatili, può essere studiato ampiamente attraverso molti approcci diversi. Di questi, la bioinformatica fornisce un metodo di studio innegabilmente efficiente in termini di costi, accessibile e facile da usare. La bioinformatica è un modo utile per estrarre piccole quantità di informazioni da set di dati su larga scala. Attraverso l'implementazione di vari approcci bioinformatici, i ricercatori possono interpretare in modo rapido, affidabile ed efficiente questi grandi set di dati, producendo applicazioni approfondite e scoperte scientifiche. Qui viene presentato un protocollo per l'integrazione di approcci bioinformatici per studiare il ruolo della segnalazione notch nel cancro ovarico. Inoltre, i risultati della bioinformatica sono convalidati attraverso la sperimentazione.

Introduction

Il percorso di segnalazione di Notch è un percorso altamente conservato che è importante per molti processi di sviluppo all'interno di organismi biologici. La segnalazione di notch ha dimostrato di svolgere un ruolo significativo nella proliferazione cellulare e nell'autorinnovamento, e i difetti nel percorso di segnalazione di Notch possono portare a molti tipi di cancro1,2,3,4,5,6. In alcune circostanze, la via di segnalazione Notch è stata collegata sia alla crescita dei tessuti e cancro, così come la morte cellulare e la soppressione del tumore7. I ricettori multipli di Notch (NOTCH 1-4) e la mente di co-u2012activator (MAML 1-3), tutti con funzioni diverse, aggiungono un ulteriore livello di complessità. Mentre il percorso di segnalazione notch è sofisticato in termini di funzioni, il suo percorso di base è semplice su base molecolare8. I recettori Notch agiscono come proteine transmembrane composte da regioni extracellulari e intracellulari9. Un legame di ligando con la regione extracellulare dei recettori Notch facilita la scissione proteolitica, che consente al dominio intracellulare di Notch (NICD) di essere rilasciato nel nucleo. Il NICD si lega quindi a co-u2012activator Mastermind per attivare l'espressione genica a valle10.

Negli ultimi anni, nota segnalazione ha dimostrato di svolgere una varietà di ruoli nell'avvio e progressione di diversi tipi di cancro in diverse specie6,11. Per esempio, la segnalazione di Notch è stata collegata alla tumorigenesi che coinvolge il gene umano NOTCH1 12. Di recente, i geni della proteina 17 (DLL3) simile a un Delta-like, di Mastermind-u2012comee di un dominio disintegre e metalloproteinasi,u2012contenente di proteine 17 (ADAM17) sono stati dimostrati fortemente associati al cancro ovarico, in particolare alla scarsa sopravvivenza complessiva dei pazienti13.

Con l'aumentare continua della quantità di dati sperimentali e associati al paziente, aumenta anche la domanda di analisi dei dati disponibili. I dati disponibili sono sparsi tra le pubblicazioni e possono fornire risultati incoerenti o addirittura contraddittori. Con lo sviluppo di nuove tecnologie negli ultimi decenni, come il sequenziamento di nuova generazione, la quantità di dati disponibili è cresciuta in modo esponenziale. Anche se questo rappresenta rapidi progressi nella scienza e opportunità per la continua ricerca biologica, valutare il significato dei dati pubblicamente disponibili per risolvere le questioni di ricerca è una grande sfida14. Crediamo che la bioinformatica sia un modo utile per estrarre informazioni più piccole da set di dati su larga scala. Attraverso l'implementazione di vari approcci bioinformatici, i ricercatori possono interpretare in modo rapido, affidabile ed efficiente questi grandi set di dati, producendo scoperte approfondite. Queste scoperte possono variare dall'identificazione di potenziali nuovi bersagli di terapia farmacologica o biomarcatori della malattia, a trattamenti personalizzati per i pazienti15,16.

La bioinformatica stessa è in rapida evoluzione e gli approcci sono in continua evoluzione man mano che i progressi tecnologici spazzano la scienza medica e biologica. Attualmente, gli approcci bioinformatici comuni includono l'utilizzo di database e programmi software accessibili al pubblico per analizzare sequenze di DNA o proteine, identificare geni di particolare rilevanza o importanza e determinare la rilevanza dei geni e dei prodotti genici attraverso la genomica funzionale16. Anche se il campo della bioinformatica non è certamente limitato a questi approcci, questi sono significativi nell'aiutare i medici e i ricercatori a gestire i dati biologici a beneficio dei pazienti nel loro complesso.

Questo studio ha lo scopo di evidenziare diverse importanti banche dati e il loro uso per la ricerca sul percorso di segnalazione di Notch. NOTCH2, NOTCH3, e il loro co-u2012activator MAML1 sono stati utilizzati come esempi per lo studio del database. Questi geni sono stati utilizzati perché l'importanza della via di segnalazione di Notch nel cancro ovarico è stata convalidata. Le analisi sistematiche dei dati recuperati hanno confermato l'importanza della segnalazione di Notch nel cancro ovarico. Inoltre, poiché la segnalazione di Notch è ben conservata tra le specie, è stato confermato che la sovraespressione di Drosophila melanogaster NICD e Mastermind insieme può indurre tumori nelle ovaie della Drosophila, sostenendo i risultati del database e il ruolo significativo e conservato della segnalazione di Notch nel cancro ovarico.

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Protocol

1. Previsione dei risultati clinici dai profili genomici (PRECOG)

NOTA: il portale PRECOG (precog.stanford.edu) accede ai dati disponibili pubblicamente da 165 set di dati sull'espressione del cancro, inclusi i livelli di espressione genica e gli esiti clinici dei pazienti17. Fornisce in modo specifico l'analisi di Meta-u2012, che incorpora grandi set di dati per fornire i punteggi di diversi geni in 39 tipi di cancro per indicare la sopravvivenza complessiva del paziente. I tassi di sopravvivenza scarsi e buoni sono indicati rispettivamente da valori positivi e negativi del punteggio di z2012.

  1. Crea un account con un'email affiliata accademica per accedere a questo database. Immettere l'indirizzo di posta elettronica e la password associati all'account.
  2. Fare clic sul pulsante Visualizza dettagli situato sotto l'intestazione di analisi Meta-z.
  3. Immettere il gene di interesse nella barra di ricerca.
  4. Utilizzare la barra di scorrimento situata nella parte inferiore dello schermo per ottenere il punteggio di sopravvivenza per il tipo di cancro specifico di interesse.

2. CSIOVDB (DBOV)

NOTA: CSIOVDB (csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html) è un database di microarray sviluppato dal Cancer Science Institute di Singapore per studiare il cancro ovarico18. Questo database contiene dati di carcinomi provenienti da diversi siti tumorali e dati normali del tessuto ovarico. Inoltre, CSIOVDB fornisce grafici di sopravvivenza di Kaplan-u2012Meier per valutare la sopravvivenza del paziente con livelli di espressione genica differenziali. CSIOVDB può essere applicato per studiare l'associazione tra i livelli di espressione genica e gli stadi/gradi del cancro ovarico.

  1. Immettere il gene di interesse, quindi fare clic sul pulsante Cerca.
  2. Fare clic sulla scheda Stato malattia.
    NOTA: Questa scheda fornisce statistiche riassuntive sull'espressione genica del gene bersaglio di interesse per gli stati di malattia da cancro ovarico.
  3. Fare clic sulla scheda Istologia.
    NOTA: Questa scheda fornisce statistiche riassuntive sull'espressione genica del gene bersaglio di interesse per le principali istologie del cancro ovarico.
  4. Fare clic sulla scheda Parametri Clinico-patologici.
    NOTA: questa scheda fornisce un confronto dei livelli di espressione genica tra diversi stadi, gradi e risposte cliniche tra diversi stadi, gradi e risposte cliniche con i test Mann-Whitney.
  5. Fare clic sulla scheda Sopravvivenza.
    NOTA: questa scheda fornisce i grafici Kaplan-Meier associati alla sopravvivenza complessiva e alla sopravvivenza libera da malattie. Per questo database, la sopravvivenza libera da malattie è considerata sopravvivenza libera da progressione e recidiva18. In questa scheda si trovano anche analisi multivariate per la sopravvivenza complessiva e la sopravvivenza libera da malattie. Le analisi multivariate confrontano le caratteristiche che riguardano le prognosi del cancro ovarico (stadio, grado, debulking chirurgico, istologia, età) e il gene di interesse.
  6. Fare clic sulla scheda Sottotipo.
    NOTA: Questa scheda fornisce statistiche riassuntive e test Mann-Whitney per il livello di espressione del gene di interesse per i sottotipi molecolari del cancro ovarico. Questa scheda fornisce anche trame Kaplan-Meier associate alla sopravvivenza complessiva e alla sopravvivenza libera da malattie del gene di interesse per i sottotipi molecolari del cancro ovarico.

3. Espressione genica sul tessuto normale e tumorale (GENT)

NOTA: Il portale GENT (medicale-u2012genome.kribb.re.kr/GENT) è sviluppato e mantenuto dal Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB)19. Raccoglie 16.400 (U133A; 241 set di dati) e 24.300 (U133plus2; 306 set di dati) campioni disponibili al pubblico. Dopo la standardizzazione, GENT offre dati sull'espressione genica su diversi tessuti, che sono ulteriormente divisi in tessuti tumorali e normali.

  1. Fare clic sulla scheda Cerca nella parte superiore dello schermo.
  2. Nella sezione con l'etichetta 1. Parola chiave, selezionare il simbolo Gene per i Termini dal menu a discesa, immettere il simbolo genico del gene di interesse nell'area vuota della sezione Parola chiave e selezionare Tessuto per l'opzione Tipo.
  3. Fare clic sul pulsante Cerca nella parte inferiore del 1. Sezione Parole chiave. Mostra i grafici di sintesi dell'espressione genica nei tessuti normali e tumorali di diversi tipi di cancro basati sulle piattaforme U133A e U122Plus2.
    NOTA: è facoltativo selezionare l'opzione Filtro dati nella parte superiore del grafico di riepilogo per individuare un database specifico da studiare.
  4. Fare clic sul collegamento accanto a Download dei dati dei risultati per accedere alle informazioni dettagliate sui valori dell'espressione genica, sui tipi di tessuto e sulle origini dati.

4. Broad Institute Cancer Cell Line Enciclopedia (CCLE)

NOTA: CCLE (portals.broadinstitute.org/ccle) è stato creato dal Broad Institute e fornisce profili genomici e mutazioni di 947 linee cellulari del cancro umano20.

  1. Immettere i geni desiderati nella barra di ricerca, quindi fare clic sul pulsante Cerca.
  2. Nella sezione Seleziona set di dati, fare clic sull'opzione espressione mRNA (RNAseq) dal menu a discesa.
    NOTA: Altre opzioni includono espressione mRNA (Affy), Achille shRNA knockdowne Numero di copia.
  3. Fare clic sul pulsante Attiva/disattiva tutte le tracce. Selezionare il tipo di tessuto di interesse dalla casella grigia a destra. Scorrere verso il basso fino alla parte inferiore dello schermo e fare clic sul pulsante Scarica espressione mRNA.
  4. Aprire il documento di testo scaricato. Copiare e incollare tutto il testo nel foglio 1. Copiare tutto il testo nel foglio 1.
  5. Fare clic sul foglio nella scheda Foglio 2 del foglio di calcolo nella parte inferiore del foglio di calcolo. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla colonna A, selezionare Incolla speciale, quindi selezionare l'opzione Trasponi nel foglio 2.
  6. Una volta che il testo viene trasposto in due colonne sul foglio 2,fare clic sulla freccia a discesa per l'intestazione dell'opzione Ordina e filtra e quindi selezionare l'opzione Filtro. Nell'area dell'intestazione l'etichetta Gene verrà visualizzata una freccia denominata Gene. Fare clic sulla freccia e digitare il tipo di tessuto di interesse.
    NOTA: Questo passaggio filtrerà tutti i dati e visualizzerà solo i livelli di espressione genica per il tipo di tessuto di interesse.

5. cBioPortale

NOTA: cBioPortal (www.cioportal.org) è stato sviluppato presso il Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK), e accede, analizza e visualizza dati genomici tumorali su larga scala21,22. In particolare, questo portale consente ai ricercatori di cercare alterazioni genetiche e reti di segnalazione.

  1. Utilizzando la query nella pagina di destinazione, fare clic sugli organi/tessuti di interesse nella sezione Seleziona studi. Seleziona il particolare studio di interesse, quindi premi il pulsante Query By Gene.
  2. Nella sezione Seleziona profili genomici, selezionare una delle tre opzioni: Mutazioni, Alterazioni del numero di copia putativo da GISTICo espressione mRNA. Selezionare inoltre i dati corrispondenti dal menu a discesa per Seleziona paziente/insieme di casi.
  3. Immettere i simboli di gene di destinazione nella casella di query di Immetti gene. Fare clic sul pulsante Invia query.
  4. Fare clic sulla scheda Rete nella parte superiore della pagina per recuperare la rete genica desiderata.
    NOTA: la rete di segnalazione è contradtura a colori. I geni immessi sono indicati da nodi di semi con un bordo spesso. Ogni gene è rappresentato da un cerchio rosso e l'intensità del colore del cerchio rosso riflette la sua frequenza di mutazione. I geni sono collegati da linee di colore diverso. Le linee marroni significano "Nello stesso componente", che indica il coinvolgimento nella stessa componente biologica. Linee blu significano "Reagisce con", indicando le reazioni geniche. Linee verdi significano "Cambiamento di Stato", suggerendo che un gene potrebbe causare un cambiamento di stato di un altro gene.
  5. Fare clic sulla scheda File nella parte superiore dell'immagine per scegliere Salva come immagine (PNG) per il download dell'immagine di rete.

6. Dissezione della Drosophila con i genotipi desiderati e colorazione DAPI

NOTA: Raccogliere la Drosophila femmina con i genotipi desiderati, quindi sezionare le ovaie di mosca per sottoporsi alle procedure di colorazione DAPI per l'imaging.

  1. Preparare le scorte di mosche tj-Gal4, Gal80ts/CyO; UAS-NICD-GFP/TM6B, w; UAS-mam.A; e w[1118] per creare mosche con sovraespressione NICD(tj-Gal4, Gal80ts/ ; UAS-NICD-GFP/z) e NICD e mam-overexpression (tj-Gal4, Gal80ts/UAS-mam.A; UAS-NICD-GFP/z) .
  2. Applicare la tecnica di targeting per l'espressione genica temporale e regionale (TARGET) per controllare l'espressione genica spatiotemporale23. Sollevare le mosche a 18 gradi centigradi fino all'età adulta, quindi spostare a 29 gradi centigradi per 48 h con lievito prima della dissezione.
    NOTA: tj-Gal4 può guidare l'espressione UAS solo a temperature più elevate, quando l'inibizione di Gal80ts è alleviata. L'aggiunta di lievito prima della dissezione allarga le ovaie per la raccolta.
  3. Mettere 3 mL di 1x fosfato-bufferana (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4) in un piatto di raccolta degli embrioni. Utilizzare un pad DI CO2 per anesizzare le mosche.
  4. Scegli una mosca femminile, quindi afferra con cura il torace inferiore della mosca usando un paio di pinze dissetanti e immergila nella soluzione 1x PBS in un piatto di raccolta embrionale. Utilizzare una seconda coppia di pinze per pizzicare l'addome inferiore e tirare delicatamente per rilasciare gli organi interni.
  5. Identificare e staccare la coppia di ovaie dal corpo della mosca. Rompere la fala muscolare situata all'estremità posteriore delle ovaie e separare le ovariole.
    NOTA: Per ottenere risultati di colorazione di qualità superiore è necessario separare le ovarioe e rompersi la rottura muscolare.
  6. Collocare le ovaie in un tubo di centrifuga di 1,5 mL che contiene 500 -L di 1x PBS. Il tubo deve rimanere sul ghiaccio fino a quando non vengono raccolte tutte le ovaie.
  7. Rimuovere il 1x PBS e posizionare 0,5 mL di soluzione fix (4% formaldeide) nel tubo. Posizionare il tubo sul nutatore per 10 min.
  8. Rimuovere la soluzione di fissaggio dal tubo e smaltirla in un contenitore di rifiuti adatto. Utilizzare 1 mL di 1x PBT (1x PBS integrato con 0,4% Triton™ X-100) per lavare le ovaie 3x per 15 min.
  9. Scartare il lavaggio PBT finale e aggiungere 1 mL di PBTG (0,2% di albumin a siero bovino, siero di capra normale del 5% in 1x PBT) per evitare l'associazione non specifica.
    NOTA: Questo passaggio potrebbe essere saltato per la colorazione DAPI, ma è essenziale per la colorazione degli anticorpi. In Jia et al.24si possono trovare macchie dettagliate di immunohistochimica.
  10. Mettete 150 l di DAPI (10 g/mL) nel tubo per una noda di 10/15 minuti. Eliminare il DAPI e lavare le ovaie 1x per 10 min utilizzando 1 mL di 1x PBT. Rimuovere il PBT e lavare 2x per 10 min utilizzando 1x PBS.
  11. Rimuovere l'eccesso di PBS fino a quando circa 300 gradi di PBS rimane nel tubo con le ovaie. Convogliare le ovaie su e giù più volte utilizzando una pipetta da 200 l,l, al fine di liberare le camere d'uovo.
  12. Ruotare delicatamente il tubo e rimuovere con attenzione il più 1x soluzione PBS possibile senza rimuovere le ovaie. Inserire nel tubo 120 l di soluzione di montaggio (1 g di gallato n-propyl, 5 ml di 10X PBS, 40 ml di glicerolo e 5 ml di dH2O).
    NOTA: la soluzione di montaggio è appiccicosa, quindi è difficile trasferire esattamente 120 - L di soluzione di montaggio in un tubo. Per alleviare questo problema, è possibile utilizzare una punta di pipetta da 1.000 lun per aggiungere tre gocce di soluzione di montaggio nel tubo.
  13. Rimuovere circa 0,33 mm da una punta di pipetta da 200 e utilizzare la punta pipetta appena tagliata per posizionare la soluzione di montaggio su un vetrino di vetro al microscopio.
  14. Posizionare delicatamente il vetro dello strizzacco sulla soluzione di montaggio e sigillare i bordi dello slittamento di copertura con smalto trasparente.
    NOTA: È necessario sigillare i bordi del vetro di copertura per evitare che le camere d'uovo scorano all'interno della soluzione di montaggio quando si scattano immagini confocali.
  15. Acquisire immagini con un microscopio confocale utilizzando le seguenti impostazioni: obiettivo - ingrandimento 10x; apertura numerica: 0,8; Lunghezza d'onda di emissione DAPI : 410-513 nm.

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Representative Results

Utilizzando la procedura descritta nel passaggio 1 utilizzando il portale PRECOG, sono stati ottenuti i punteggi di NOTCH2, NOTCH3e MAML1 nel cancro ovarico (rispettivamente 1.3, 2.32, 1.62). I valori negativi di .u2012score indicano la scarsa sopravvivenza complessiva dei pazienti con alti livelli di espressione dei tre geni. Utilizzando la formattazione condizionale del software per fogli di calcolo, i valori di score 2012 vengono visualizzati in un grafico a barre colorate nella Figura 1.

Il database CSIOVDB è stato utilizzato per confermare i risultati. Utilizzando le istruzioni nel passaggio 2, NOTCH2, NOTCH3e MAML1 sono stati immessi in sequenza nell'area di ricerca del database CSIOVDB ed è stato recuperato i dati di sopravvivenza del paziente che si trovano nella scheda Sopravvivenza. Oltre ai dati di sopravvivenza complessiva, CSIOVDB fornisce la sopravvivenza senza malattia. CSIOVDB separa ulteriormente i pazienti per presentare i dati di sopravvivenza basati sul Q1 contro Q4 (quartile inferiore contro quartile superiore) dei livelli di espressione genica. Coerentemente con i risultati precedenti, l'alta espressione di NOTCH2, NOTCH3e MAML1 è correlata alla scarsa sopravvivenza complessiva e alla sopravvivenza libera da malattie(Figura 2A,B). Nel frattempo, la scheda Clinico-parametri patologici di CSIOVDB fornisce anche un confronto dei livelli di espressione genica tra diversi stadi, gradi e risposte cliniche tra diversi stadi, gradi e risposte cliniche con i test Mann-Whitney. I risultati mostrano che i livelli di espressione più elevati di NOTCH2, NOTCH3e MAML1 sono associati a stadi avanzati di cancro ovarico (Figura 2C).

Poiché NOTCH2, NOTCH3e MAML1 sono fondamentali per la sopravvivenza complessiva del paziente, i livelli di espressione genica nei tumori ovarici e nelle linee cellulari tumorali sono stati studiati ulteriormente. I dati di espressione di NOTCH2, NOTCH3e MAML1 nei tessuti ovarici normali e tumorali sono stati scaricati dalla piattaforma U133A utilizzando le istruzioni di passaggio 3 per GENT. Gli scienziati possono elaborare i dati scaricati secondo il proprio scopo di ricerca specifico. Qui, abbiamo utilizzato i dati per produrre i grafici scatola e baffi utilizzando GraphPad Prism (versione 8). Ulteriori test di permutazione hanno suggerito che NOTCH2, NOTCH3e MAML1 sono altamente espressi nei tessuti tumorali (Figura 3A). Successivamente, i dati di espressione di NOTCH2, NOTCH3e MAML1 nelle linee cellulari del cancro ovarico sono stati scaricati secondo il passaggio del protocollo 4, utilizzando il CCLE. I livelli di espressione genica nelle linee cellulari del cancro sono indicati dai grafici a scatola e baffi (Figura 3B). Anche se i livelli di espressione di NOTCH2, NOTCH3e MAML1 sono ad alto contenuto di linee cellulari tumorali, le conclusioni non possono essere tratte a causa della mancanza di normali controlli delle linee cellulari nel database CCLE. Tuttavia, gli scienziati possono identificare l'origine delle linee cellulari del cancro e confrontare i livelli di espressione in base a diversi gradi, stadi e altri parametri clinicopatologici.

Una volta confermato il significato di NOTCH2, NOTCH3e MAML1 nel cancro ovarico, il cBioPortal è stato utilizzato per studiare la loro rete di segnale associata. Utilizzando il protocollo step 5, Ovary/Fallopian Tube è stato selezionato per Select Studies, quindi è stato scelto il set di dati Ovarian Serous Cystadenocarcinoma (TCGA, Nature 2011) per l'analisi. Per la sezione denominata Select Genomic Profiles, è stata selezionata l'espressione mRNA e infine è stata selezionata la sua espressione mRNA del profilo punteggi (tutti i geni). Per la sezione Select Patient/Case Set, dal menu a discesa è stata scelta l'opzione Samples with mRNA data (Agilent microarray) (489). Alla fine, i geni NOTCH2, NOTCH3e MAML1 sono stati selezionati per inviare la domanda. Sulla base dei tre geni fondamentali, è stata creata una rete di segnalazione per fornire i 50 geni vicini più frequentemente alterati, che si trovano anche nella stessa via con i tassi dimutazionepiù alti ( Figura 4 ).

Poiché la segnalazione di Notch è ben conservata tra le specie, è stata studiata nel cancro ovarico della Drosophila. La segnalazione di notch è stata precedentemente segnalata per regolare la proliferazione cellulare follicle25, differenziazione26,27, e regolazione del ciclo cellulare28,29. La sovraespressione di NICD da sola non ha indotto i tumori nella Drosophila (Figura 5A), poiché l'epitelio delle camere d'uovo della Drosophila è rimasto intatto con un unico strato. Tuttavia, la sovraespressione di NICD e Mam insieme tumori indotti in Drosophila (Figura 5B), che è dimostrata da più strati epiteliali e cellule accumulate.

Figure 1
Figura 1: L'espressione di NOTCH2, NOTCH3e MAML1 nel cancro ovarico è associata a una scarsa sopravvivenza complessiva. I punteggi di sopravvivenza di NOTCH2, NOTCH3e MAML1 nei pazienti affetti da cancro ovarico sono presentati. La scarsa sopravvivenza è indicata da valori negativi di .u2012score. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Alti livelli di NOTCH2, NOTCH3e MAML1 nel cancro ovarico sono associati a una scarsa sopravvivenza complessiva, scarsa sopravvivenza libera da malattie e stadi tumorali avanzati. Il database di microarray CSIOVDB fornisce a Kaplan-Meier la sopravvivenza complessiva e i grafici di sopravvivenza liberi da malattie di NOTCH2, NOTCH3e MAML1 nei pazienti affetti da cancro ovarico e livelli di espressione genica in diversi stadi tumorali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: NOTCH2, NOTCH3e MAML1 sono altamente espressi nei tumori ovarici e nelle linee cellulari del cancro. I valori P sono indicati per confrontare l'espressione genica nelle ovaie normali e nei tumori ovarici corrispondenti. (Abbreviazioni: Ovary-N - tessuti ovarici normali; Ovary-C - tessuti del cancro ovarico). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: geni NOTCH2/NOTCH3/ MAML1 e la rete di segnalazione associata con i 50 geni vicini più frequentemente alterati. La rete di segnalazione è contradtura a colori. I geni immessi sono indicati da nodi di semi con un bordo spesso. Ogni gene è rappresentato da un cerchio rosso e l'intensità del colore del cerchio rosso riflette la sua frequenza di mutazione. I geni sono collegati da linee di colore diverso. Le linee marroni significano "Nello stesso componente", che indica il coinvolgimento nella stessa componente biologica. Linee blu significano "Reagisce con", indicando le reazioni geniche. Linee verdi significano "Cambiamento di Stato", suggerendo che un gene potrebbe causare un cambiamento di stato di un altro gene. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: NICD e mam in Drosophila inducono anche tumori ovarici. R. La sovraespressione di NICD da sola non induce la formazione del tumore nella Drosophila. B. La sovraespressione di NICD e mam insieme indurre tumori in Drosophila. Barra di scala - 50 m Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Poiché ci sono innumerevoli approcci e metodi per l'utilizzo della bioinformatica, ci sono numerosi database disponibili online per il grande pubblico. Un'abbondanza di informazioni può essere estratta da ciascuno di questi database, ma alcuni sono più adatti per scopi particolari, come valutare la sopravvivenza del paziente sulla base di determinati input. Le analisi sistematiche dei dati recuperati da diverse banche dati individuali possono produrre risultati scientifici importanti.

L'analisi attuale si concentra sul ruolo della segnalazione di Notch nel cancro ovarico attraverso l'utilizzo di approcci bioinformatici. Per esempio, l'analisi Meta-z sul database del portale PRECOG è stata utilizzata per ottenere i punteggi z che indicano i risultati di sopravvivenza del paziente negli studi clinici sul cancro. CSIOVDB è un altro database di meta-analisi che è stato utilizzato per studiare i risultati di sopravvivenza dei pazienti affetti da cancro ovarico. I dati di CSIOVDB hanno convalidato con successo i risultati del portale PRECOG che NOTCH2, NOTCH3e MAML1 sono fondamentali per la sopravvivenza complessiva del paziente. Successivamente, le applicazioni dei database GENT e CCLE hanno ulteriormente dimostrato che NOTCH2, NOTCH3e MAML1 sono altamente espressi nei tumori ovarici e nelle linee cellulari tumorali. La combinazione di questi database ha rivelato sistematicamente i ruoli significativi di NOTCH2, NOTCH3e MAML1 nel cancro ovarico. Questo uso di metodi bioinformatici ha fornito un modo efficiente per fare ricerca sul cancro in modo economico e mostra come può produrre importanti risultati per future applicazioni sperimentali e cliniche.

La bioinformatica offre al pubblico la capacità di accedere ai risultati di migliaia di esperimenti contemporaneamente. Le informazioni ricavate dalle banche dati pubbliche forniscono un modo economico ed efficiente per stabilire una progettazione sperimentale prima di eseguire esperimenti. Inoltre, è importante notare che i dati disponibili al pubblico possono essere sparsi tra le pubblicazioni e possono fornire risultati incoerenti o addirittura contraddittori, il che richiede l'esecuzione di meta-analisi attraverso approcci bioinformatici. Gli scienziati possono progettare ed eseguire esperimenti sulla base dei dati trovati attraverso grandi database di bioinformatica per convalidare specifiche ipotesi scientifiche. I risultati dell'esperimento Della Drosophila hanno confermato i risultati delle banche dati bioinformatiche e hanno ulteriormente sostenuto l'idea che i componenti del percorso di Notch debbano continuare a essere studiati come potenziali bersagli farmacologici terapeutici. La riuscita convalida dei risultati della bioinformatica attraverso la sperimentazione suggerisce anche l'importanza degli approcci bioinformatici per le scoperte scientifiche.

Ci possono essere alcune limitazioni della bioinformatica. In primo luogo, alcuni siti web/strumenti potrebbero non aggiornare i loro risultati a causa di sforzi di tempo o costi associati alla manutenzione. In secondo luogo, alcuni siti Web/strumenti si aggiornano costantemente, ma l'aggiornamento con input aggiuntivo potrebbe modificare i risultati ottenuti in precedenza. In terzo luogo, gli sviluppatori di alcuni siti web / strumenti riservano i diritti d'autore e limitano l'uso dei loro contenuti. Quarto, le analisi o gli algoritmi di determinati siti web/strumenti potrebbero non essere sempre accurati.

Per superare queste limitazioni, vengono suggeriti alcuni passaggi o modifiche e la risoluzione dei problemi per migliori applicazioni future. In primo luogo, alcuni siti web / strumenti consentono ai ricercatori di caricare manualmente i nuovi dati per l'analisi. In caso contrario, i ricercatori possono scaricare e analizzare i dati più recenti per conto proprio. In secondo luogo, i ricercatori devono eseguire ripetutamente le loro analisi e tenere traccia delle date. Se i risultati cambiano in modo significativo, i ricercatori potrebbero dover utilizzare l'input aggiuntivo di dati per capire i motivi. In terzo luogo, i ricercatori possono trovare un sito web/strumento alternativo per eseguire le loro analisi per evitare potenziali problemi di copyright. In quarto luogo, i ricercatori possono ottenere ulteriori siti web / strumenti per convalidare i loro risultati importanti. Se ci sono problemi con le analisi o gli algoritmi, i ricercatori possono scaricare e rianalizzare i dati per correggere gli errori o utilizzare altri siti web / strumenti con le impostazioni appropriate.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da Start-Up Funding, College of Science and Mathematics Research Grant, Summer Research Session Award e Research Seed Funding Award della Georgia Southern University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 1:1000 Dilution
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Powder, pH 7.4 ThermoFisher FLBP6651 Dissolved with ddH2O to make 1X PBS
Goat serum Gibco 16210064 Serum
Embryo dish Electron Microscopy Sciences 70543-45 Dissection Dish
Nutating mixers Fisherbrand 88861041 Nutator
tj-Gal4, Gal80ts/ CyO; UAS-NICD-GFP/ TM6B Dr. Wu-Min Deng at Florida State University N/A Fly stock
w*; UAS-mam.A Bloomington Drosophila Stock Center #27743 Fly stock
w[1118] Bloomington Drosophila Stock Center #5905 Fly stock
The PRECOG portal Stanford University precog.stanford.edu Publicly accessible database of cancer expression datasets
CSIOVDB Cancer Science Institute of Singapore csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html Microarray database used to study ovarian cancer
The Gene Expression across Normal and Tumor tissue (GENT) Portal Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) medical–genome.kribb.re.kr/GENT Publicly accessible database of gene expression data across diverse tissues, divided into tumor and normal tissues.
Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) Broad Institute and The Novartis Institutes for BioMedical Research portals.broadinstitute.org/ccle Provides genomic profiles and mutations of human cancer cell lines
cBioPortal Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) cioportal.org Portal that allows researchers to search for genetic alterations and signaling networks
Zeiss 710 Inverted confocal microscope Carl Zeiss ID #M 210491 Examination and image collection of fluorescently labeled specimens

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