मानव एमनियोटिक झिल्ली के विभिन्न शारीरिक क्षेत्रों से एपिथेलियल कोशिकाओं की विट्रो संस्कृति में

Developmental Biology

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Summary

यह प्रोटोकॉल नैदानिक और शारीरिक मॉडल में संभावित आवेदन के लिए उनकी विषमता और कार्यात्मक गुणों का निर्धारण करने के लिए मानव एमनियोटिक झिल्ली के विभिन्न शारीरिक क्षेत्रों से एपिथेलियल कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन करता है।

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Avila-González, D., García-López, G., Díaz-Martínez, N. E., Flores-Herrera, H., Molina-Hernández, A., Portillo, W., Díaz, N. F. In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane. J. Vis. Exp. (153), e60551, doi:10.3791/60551 (2019).

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Abstract

मानव एमनियोटिक एपिथेलियल कोशिकाओं (एचईसी) के अलगाव और संस्कृति के लिए साहित्य में कई प्रोटोकॉल की सूचना दी गई है। हालांकि, ये मान लेते हैं कि एमनियोटिक एपिथेलियम एक सजातीय परत है। मानव एमनियन को तीन शारीरिक क्षेत्रों में विभाजित किया जा सकता है: परिलक्षित, अपरा, और गर्भनाल। प्रत्येक क्षेत्र में विभिन्न शारीरिक भूमिकाएं होती हैं, जैसे रोग की स्थिति में। यहां, हम तीन वर्गों में मानव एमनियन ऊतक को विच्छेदन करने और इसे विट्रो में बनाए रखने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। संस्कृति में, परावर्तित एमनियन से प्राप्त कोशिकाओं ने एक क्यूबॉइडल आकृति विज्ञान प्रदर्शित किया, जबकि अपरा और नाल दोनों क्षेत्रों की कोशिकाएं स्क्वैमस थीं। फिर भी, प्राप्त सभी कोशिकाओं में एक एपिथेलियल फेनोटाइप होता है, जो ई-कैथेरिन के इम्यूनोडिटेक्शन द्वारा प्रदर्शित होता है। इस प्रकार, क्योंकि सीटू में अपरा और परिलक्षित क्षेत्र सेलुलर घटकों और आणविक कार्यों में भिन्न होते हैं, इन विट्रो अध्ययनों के लिए इन मतभेदों पर विचार करना आवश्यक हो सकता है, क्योंकि उनमें एचईसी के उपयोग के लिए शारीरिक निहितार्थ हो सकते हैं बायोमेडिकल अनुसंधान और पुनर्योजी चिकित्सा में इन कोशिकाओं का आशाजनक अनुप्रयोग।

Introduction

मानव एमनियोटिक एपिथेलियम कोशिकाएं (एचएईसी) भ्रूण विकास के शुरुआती दौर के दौरान लगभग आठ दिनों के पोस्टफर्टिलाइजेशन में उत्पन्न होती हैं। वे एपिब्लास्ट की स्क्वैमस एपिथेलियल कोशिकाओं की आबादी से उत्पन्न होते हैं जो एमनियोटिक झिल्लीकीअंतरतम परत से प्राप्त होते हैं । इस प्रकार, एचईसी को एपिब्लास्ट से प्लुरिपोटेम्पकोशिकाओं के अवशेष माना जाता है जिनमें भ्रूण2की तीन रोगाणु परतों में अंतर करने की क्षमता होती है। पिछले दशक में, विविध अनुसंधान समूहों ने इन कोशिकाओं को गर्भ की अवधि में एमनियोटिक झिल्ली से अलग करने के तरीके विकसित किए हैं ताकि विट्रो3,4में संस्कृति मॉडल में उनके प्रकल्पित बहुपक्षीयता से संबंधित गुणों की विशेषता हो सके।

तदनुसार, यह पाया गया है कि एचईसी में मानव pluripotent स्टेम सेल (HPSC) की विशेषता लक्षण हैं, जैसे सतह एंटीजन SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; प्लीरिपोटेंसी ट्रांसक्रिप्शन कारकों का मूल OCT4, SOX2, और NANOG; और प्रसार मार्कर KI67, सुझाव है कि वे स्वयं कर रहे है5नवीनीकरण,6,7. इसके अलावा, इन कोशिकाओं को तीन रोगाणु परतों (एक्टोडर्म, मेसोडर्म, और एंडोडर्म)4,5,8,साथ ही मानव रोगों के पशु मॉडल ों में वंश-विशिष्ट मार्कर के लिए सकारात्मक कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग करने को चुनौती दी गई है। अंत में, HAEC एक्सप्रेस ई-cadherin, जो प्रदर्शित करता है कि वे HPSC5,9की तरह एक विशेषण प्रकृति बनाए रखने ।

उनके भ्रूणीय मूल के अलावा, एचईसी में अन्य आंतरिक गुण हैं जो उन्हें विभिन्न नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त बनाते हैं, जैसे कि विरोधी भड़काऊ और जीवाणुरोधी अणुओं का स्राव10,11,विकास कारक और साइटोकिन रिलीज12,टेराटोमास का कोई गठन नहीं जब उन्हें एचपीएससी2के विपरीत इम्यूनोडेफिकेटिफिएंट चूहों में प्रत्यारोपित किया जाता है, और प्रतिरक्षा सहिष्णुता क्योंकि वे एचएलए-जी को व्यक्त करते हैं, जो एचएलए-जी को व्यक्त करते हैं, जो अस्वीकृति के जोखिम को कम कर देते हैं प्रत्यारोपण13.

हालांकि, पिछली रिपोर्टों ने माना है कि मानव एमनियन एक समरूप झिल्ली है, इस बात पर विचार किए बिना कि इसे शारीरिक रूप से और शारीरिक रूप से तीन क्षेत्रों में विभाजित किया जा सकता है: अपरा (एमनियन जो दशमलव बासलिसको कवर करता है), गर्भनाल (वह हिस्सा जो गर्भनाल को ढंकता है), और परिलक्षित होता है (बाकी झिल्ली अपरा से जुड़ी नहीं)14। यह दिखाया गया है कि एमनियन के अपरा और परिलक्षित क्षेत्र आकृति विज्ञान, माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों15,मिरना अभिव्यक्ति16और सिग्नलिंग पाथवे17की सक्रियता में अंतर प्रदर्शित करते हैं। इन परिणामों से पता चलता है कि मानव एमनियन विभिन्न कार्यक्षमता के साथ एक विषम आबादी द्वारा एकीकृत है जिसे सीटू या इन विट्रो मॉडल में किए गए आगे के अध्ययनों के लिए विचार किया जाना चाहिए। जबकि अन्य प्रयोगशालाओं ने पूरी झिल्ली से HAEC के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल डिजाइन किए हैं, हमारी प्रयोगशाला ने विभिन्न शारीरिक क्षेत्रों से कोशिकाओं को अलग करने, संस्कृति और विशेषता के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल को मेक्सिको सिटी में इंस्टीट्यूटो नैसिनल डी पेरिनाटोलोजिया की नैतिक समिति (रजिस्ट्री संख्या 212250-21041) द्वारा अनुमोदित किया गया था। इन अध्ययनों में की गई सभी प्रक्रियाएं इंस्टीट्यूटो नैसिनल डी पेरिनाटोलोजिया, हेलसिंकी घोषणा और स्वास्थ्य मंत्रालय के आधिकारिक मैक्सिकन मानक में निर्धारित दिशा-निर्देशों के नैतिक मानकों के अनुसार थीं।

1. तैयारी

  1. EDTA के साथ 1x पीबीएस का समाधान तैयार करें। ऐसा करने के लिए, 0.5 मीटर EDTA की अंतिम एकाग्रता के लिए 1x पीबीएस के 500 मीटर में 0.5 एम ईटीए स्टॉक के 500 माइक्रोन जोड़ें।
  2. एचईसी के लिए संस्कृति माध्यम तैयार करें। उच्च ग्लूकोज के 450 मिलील ले लो- DMEM, सोडियम पायरुवेट (100 mM) के 5 mL के साथ इसे पूरक करें, स्टेम सेल के लिए योग्य गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम का 50 मिलील, गैरजरूरी अमीनो एसिड (100x), एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक (100x), एल-ग्लूटामाइन का 5 एमएल (200 एम), मर्काप्टोथेनॉल (1,000x) का 500 माइक्रोन।
  3. ऊतक के परिवहन और प्रसंस्करण के लिए कंटेनरों को स्टरलाइज करें: ऑपरेटिंग थिएटर से प्रयोगशाला तक पूरे प्लेसेंटा को परिवहन करने के लिए ढक्कन के साथ एक स्टेनलेस स्टील कंटेनर, एक ट्रे (20 सेमी x 30 सेमी x 8 सेमी) धोने और पूरे अपरा से रक्त को हटाने से पहले एमनियोटिक झिल्ली का विच्छेदन, और एमनियोटिक झिल्ली को तीन क्षेत्रों में अलग करने के लिए एक प्लास्टिक काटने का बोर्ड।
  4. सर्जिकल उपकरणों (स्केलपेल, कैंची, संदंश, और क्लैंप), 500 मीटर बीकर, कपास गॉज और खारा समाधान को स्टरलाइज करें।

2. अपरा ऊतक प्राप्त करना

नोट: एमनियोटिक झिल्ली महिलाओं से पूर्ण अवधि के गर्भ (37−40 सप्ताह) में प्राप्त की गई थी, सिजेरियन डिलीवरी के संकेत के तहत, सक्रिय श्रम के किसी भी सबूत के बिना, और संक्रमण की कोई सूक्ष्म जैविक विशेषताएं नहीं। पूर्ण अलगाव और संस्कृति प्रक्रियाओं बाँझ परिस्थितियों में एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर किया गया ।

  1. ऑपरेटिंग रूम में, ऊतक के बाकी हिस्सों में रक्त प्रवाह को रोकने के लिए गर्भनाल को दबाएं। बाँझ कंटेनर में क्लैंप गर्भनाल के साथ पूरे अपरा ले लीजिए।
  2. प्लेसेंटा हाइड्रेट करने के लिए कंटेनर में खारा समाधान के 500 मीटर जोड़ें।
  3. कंटेनर को बंद करें और ऊतक को कमरे के तापमान पर प्रयोगशाला में परिवहन करें।
  4. बायोसिक्योरिटी कैबिनेट के अंदर प्लेसेंटा के साथ कंटेनर रखो।
    नोट: यदि विच्छेदन प्लेसेंटा एकत्र करने के 15 मिनट के भीतर नहीं किया जाता है, तो प्रसंस्करण तक बर्फ पर प्लेसेंटा के साथ कंटेनर स्टोर करें। अपरा प्राप्त करने और विच्छेदन की शुरुआत के बीच 1 घंटे से अधिक बीता हुआ समय से बचें।

3. एमनियोटिक झिल्ली के प्रति क्षेत्र यांत्रिक जुदाई

नोट: प्रक्रिया बाँझ परिस्थितियों में और कमरे के तापमान पर एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर किया जाना चाहिए ।

  1. कंटेनर से पूरे अपरा निकालें और ऊपर की ओर गर्भनाल के साथ ट्रे पर रखें।
  2. बाँझ कपास धुंध का उपयोग करके, कोरोन-एमनियन की सतह से रक्त के थक्के को साफ करें जो प्लेसेंटा को कवर करता है।
  3. झिल्ली के तीन क्षेत्रों की पहचान करें: गर्भनाल को घेरना, दरिदुआ बेसलिस को कवर करने वाला अपरा एमनियन, और परावर्तित क्षेत्र, जो बाकी एमनियन है जो प्लेसेंटा(चित्रा 1)से जुड़ा नहीं है।
  4. गर्भनाल एमनियन क्षेत्र(चित्रा 2A)विच्छेदन करें।
    1. विच्छेदन संदंश का उपयोग करके, एमनियन झिल्ली के हिस्से को पकड़ें जो प्लेसेंटा और गर्भनाल के जंक्शन को कवर करता है।
    2. एक स्केलपेल के साथ, उस क्षेत्र को विच्छेदन करें जो कॉर्ड को चोरन से अलग करने के लिए खींचते समय कॉर्ड को घेर लेता है।
    3. अलग ऊतक को खारा समाधान के 100 मिलील के साथ एक लेबल बीकर में जमा करें।
  5. अपरा एमनियन क्षेत्र(चित्रा 2B)विच्छेदन करें।
    1. बाँझ कपास धुंध के साथ, कोरोन-एमनियन की सतह से रक्त के थक्के को हटा दें जो प्लेसेंटा को कवर करता है।
    2. नाल और परावर्तित क्षेत्र के बीच सीमा पर झिल्ली को विच्छेदन संदंश के साथ पकड़ें।
    3. स्केलपेल के साथ प्लेसेंटा की परिधि के साथ काटें।
    4. अपरा amnion को चोरियन से अलग करें, सावधान रहें कि किसी भी जहाजों को अपरा से न काटें।
    5. अलग ऊतक को खारा समाधान के 300 मिलील के साथ एक और लेबल बीकर में रखें।
  6. बाकी एमनियोटिक झिल्ली को अलग करें जो कोरिऑन(चित्रा 2 सी)से प्लेसेंटा (यानी, परावर्तित भाग) से जुड़ी नहीं होती है।
    1. नमकीन समाधान के 300 मिलील के साथ एक और लेबल बीकर में परिलक्षित क्षेत्र ले लीजिए।
      नोट: ऊतक को सूखने से रोकने के लिए विच्छेदन के दौरान लगातार खारा समाधान जोड़ें।

4. झिल्ली धोना

नोट: प्रक्रिया कमरे के तापमान पर बाँझ शर्तों के तहत एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर किया जाना चाहिए ।

  1. प्रत्येक झिल्ली क्षेत्र के खारे समाधान को अलग से त्यागें।
  2. नाल क्षेत्र के लिए ताजा खारा समाधान के 100 मीटर जोड़ें।
  3. अपरा और परिलक्षित क्षेत्रों के लिए ताजा खारा समाधान के 300 मीटर क्रमशः जोड़ें।
  4. रक्त अवशेषों को हटाने के लिए संदंश की मदद से झिल्ली हिलाएं।
  5. खारा समाधान त्यागें।
  6. धोती और आंदोलन को कम से कम 3x दोहराएं जब तक कि झिल्ली पारदर्शी न हो जाए।
  7. वॉश के साथ नहीं हटाए गए रक्त के थक्के को साफ करने के लिए बोर्ड पर झिल्ली को रखें और बढ़ाएं।
    नोट: जितना संभव हो उतने एरिथ्रोसाइट्स को हटाना बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि उनकी उपस्थिति ट्राइप्सिन फ़ंक्शन और बाद की कोशिका संस्कृतियों की व्यवहार्यता को प्रभावित करती है।

5. विभिन्न क्षेत्रों से झिल्ली का एंजाइमैटिक पाचन

नोट: प्रक्रिया बाँझ शर्तों के तहत एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर किया जाना चाहिए ।

  1. परावर्तित और अपरा क्षेत्रों को दो या तीन टुकड़ों में काट लें।
  2. नाल क्षेत्र में कटौती न करें।
  3. प्रत्येक क्षेत्र के टुकड़ों को अपकेंद्रित्र ट्यूबों में रखें। परिलक्षित और अपरा क्षेत्रों में 0.5% ट्राइप्सिन/ईटीए के 20 मिलील और गर्भनाल क्षेत्र में 0.5% ट्राइप्सिन/ईटीए के 5 मिलीग्राम को क्रमशः जोड़ें।
    नोट: परिलक्षित और अपरा क्षेत्रों को छोटे टुकड़ों में काटना महत्वपूर्ण है क्योंकि उन्हें ट्राइप्सिन समाधान में पूरी तरह से डूबने की आवश्यकता है।
  4. अपकेंद्रित्र ट्यूबों को हल्के से 30 एस के लिए हिलाएं। ट्राइप्सिन को त्यागें।
  5. परिलक्षित और अपरा क्षेत्रों के लिए नए ०.५% ट्राइप्सिन/EDTA के 30 mL जोड़ें और नाल क्षेत्र के लिए नए ०.५% ट्राइप्सिन/EDTA के 15 mL।
  6. ट्यूबों को इनक्यूबेटर के अंदर एक रोटेटर में रखें।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिन के लिए रोटेशन (20 आरपीएम) के साथ इनक्यूबेट।
    नोट: यदि कोई ट्यूब रोटेटर उपलब्ध नहीं है, तो ट्यूबों को हल्के से मैन्युअल रूप से हर 10 घर हिलाएं।
  8. प्रत्येक क्षेत्र से ट्राइप्सिन/सेल समाधानों को नई अपकेंद्रित्र ट्यूबों में स्थानांतरित करें ।
  9. एंजाइम को निष्क्रिय करने के लिए एचईसी मीडिया की मात्रा 37 डिग्री सेल्सियस प्रति ट्यूब पर जोड़ें।
  10. बर्फ पर पहले पाचन स्टोर करें।
  11. दूसरी पाचन अवधि के लिए चरण 5.6−5.8 दोहराएं।
  12. प्रत्येक क्षेत्र के लिए, विच्छेदन संदंश का उपयोग करके एमनियन भाग का एक छोर रखें, और एक अन्य जोड़ी के साथ ऊतक के साथ निचोड़ ने एपिथेलियल कोशिकाओं की पंक्तियों को हटा दिया जो पिछले ऊष्मायन अवधि के दौरान पूरी तरह से छील नहीं था।
  13. दूसरे पाचन को अपकेंद्रित्र ट्यूबों के एक और सेट में एकत्र करें और एचईसी मीडिया की मात्रा को 2x के साथ निष्क्रिय करें।
  14. पचाने वाली झिल्ली को बायोहैज़र्ड कंटेनर में छोड़ दें।

6. एचईसी का अलगाव

नोट: प्रक्रिया बाँझ शर्तों के तहत एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर किया जाना चाहिए ।

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मीटर के लिए 200 x ग्राम पर सभी ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें।
  2. अधिनायक को त्यागें और प्रत्येक गोली को अलग करने के लिए प्रति ट्यूब (37 डिग्री सेल्सियस तक) पूर्वगरम एचईसी मीडिया (37 डिग्री सेल्सियस तक) के 10 मिलील जोड़ें और प्रत्येक गोली को अलग करने के लिए धीरे से पाइप करें।
  3. प्रत्येक झिल्ली क्षेत्र के लिए एक व्यक्तिगत ट्यूब में दो पाचन के सेलुलर निलंबन गठबंधन।
  4. एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स मलबे को हटाने और एकल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए 100 माइक्रोन सेल छलनी का उपयोग कर सेलुलर निलंबन फ़िल्टर करें।
  5. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में ट्राइपैन ब्लू के 90 माइक्रोन के साथ तीन एलिकोस तैयार करें।
  6. माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूबों में झिल्ली क्षेत्र प्रति प्रत्येक कोशिका निलंबन के 10 μL जोड़ें और मिश्रण।
  7. कोशिकाओं को हल्के क्षेत्र माइक्रोस्कोप के नीचे हीमोसाइटोमीटर के साथ गिनें।

7. एचईसी की संस्कृति

  1. मानव एपिडर्मल विकास कारक (ईजीएफ) के 10 एनजी/एमएल के साथ पूरक, 3 × 104 कोशिकाओं/सेमी2 के घनत्व पर अलग से तीन क्षेत्रों से HAEC बीज ।
    1. कोशिकाओं को 100 मिमी प्लेटों में बीज में बनाए रखने के लिए उन्हें विट्रो में या इम्यूनोकेमिकल विश्लेषण के लिए 24 अच्छी तरह से प्लेटों में।
  2. एक आर्द्र इनक्यूबेटर में नॉर्मोक्सिक स्थितियों (5% सीओ2)के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर व्यंजन ों को इनक्यूबेट करें।
  3. दैनिक EGF जोड़ें और हर तीसरे दिन माध्यम बदल जाते हैं।
    नोट: कोशिकाएं 4−6 दिनों के बाद अनुकूल हो जाएंगी।
  4. पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, सेल छंटाई विश्लेषण, क्रायोप्रोपिंग, आरएनए और प्रोटीन निष्कर्षण, या पारित होने को जारी रखने के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें।

8. एचईसी का मार्ग

  1. एचईसी माध्यम निकालें और पीबीएस/EDTA 0.01M समाधान के साथ 2x धोएं ।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए पीबीएस/ईडीटीए 0.01 एम समाधान के साथ इनक्यूबेट।
  3. पीबीएस/EDTA निकालें और ०.५% ट्रिप्सिन/EDTA के १.५ mL जोड़ें ।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5−8 मिन के लिए इनक्यूबेट।
  5. एचईसी मीडिया के दो खंडों के साथ एंजाइम को निष्क्रिय करें।
  6. 200 x ग्रामपर 5 मिन के लिए मिश्रित समाधान और अपकेंद्री लीजिए।
  7. कोशिकाओं की गणना करें और निम्नलिखित मार्ग ों के साथ जारी रखें या आगे के विश्लेषण के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें।

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Representative Results

एचईसी को एमनियोटिक झिल्ली के तीन शारीरिक क्षेत्रों में से प्रत्येक से अलग किया गया था और व्यक्तिगत रूप से विट्रो में सुसंस्कृत किया गया था। संस्कृति के 48 एच के बाद, एक एपिथेलियल फेनोटाइप वाली कोशिकाओं ने प्लेट की सतह का पालन किया, हालांकि मीडिया में सेल मलबे और फ्लोटिंग कोशिकाएं भी थीं, जिन्हें एक बार मध्यम बदलने के बाद हटा दिया गया था(चित्रा 3)।

प्राथमिक संस्कृति (मार्ग शून्य, पी0) के प्रसंस्करण के दौरान, कुछ जटिलताएं उत्पन्न हो सकती हैं जो प्रायोगिक डेटा विश्लेषण में हस्तक्षेप कर सकती हैं(चित्र 4):अभिकर्मकों के संदूषण के कारण या अलगाव प्रक्रिया(चित्रा 4ए)के दौरान बैक्टीरिया की उपस्थिति की पहचान करने पर संस्कृतियों को त्यागने और एक और झिल्ली को संसाधित करने की सलाह दी जाती है; झिल्ली की अपर्याप्त धुलाई के कारण अत्यधिक एरिथ्रोसाइट्स(चित्र4B); प्लेटों के लिए कोशिकाओं की कमी या कोई आसंजन(चित्र4C); या फाइब्रोब्लास्ट आकृति विज्ञान(चित्रा 4D)के साथ कोशिकाओं, सुझाव है कि मानव एमनियोटिक मेसेंचिमल कोशिकाओं (HAMC) HAEC के बजाय अलग थे ।

एचईसी आकृति विज्ञान इन कोशिकाओं की उत्पत्ति पर निर्भर करता है: परावर्तित क्षेत्र से कोशिकाओं में एक क्यूबॉइडल आकृति विज्ञान होता है और अपरा और नाल क्षेत्रों की कोशिकाओं के विपरीत एक कोबल्ड मोनोलेयर में बढ़ता है, जो चापलूसी और स्क्वैमस(चित्रा 5)होते हैं। ये डेटा समर्थन करते हैं कि एमनियन से एपिथेलियल परत झिल्ली में एक समान नहीं है। मार्ग के दौरान, सभी क्षेत्रों से कोशिकाओं का आकार बढ़ जाता है, लेकिन वे अपनी एपिथेलियल प्रकृति को बनाए रखते हैं और फाइब्रोब्लास्ट आकृति विज्ञान प्राप्त नहीं करते हैं। दरअसल, ई-कैथेरिन के खिलाफ इम्यूनोफ्लोरेसेंस से पता चला है कि प्राथमिक संस्कृतियों (पी0) और उपसंस्कृतियों (P1-P2) ने अपने एपिथेलियल फेनोटाइप(चित्रा 6)को बनाए रखा, जिससे यह सुझाव दिया गया कि एक अन्य कोशिका प्रकार का कोई संदूषण नहीं है, जैसे मेसेंचिमल स्ट्रोमल कोशिकाएं, या एपिथेलियाल-मेसेनचिमल संक्रमण। इसके अलावा, इन कोशिकाओं को ट्यूनल परख(अनुपूरक चित्रा 1)के अनुसार सेल मौत का कोई सबूत नहीं दिखा, लेकिन KI-६७ प्रसार मार्कर(चित्रा 6)के लिए सकारात्मक हैं, हालांकि हमारे पिछले परिणामों प्रत्येक मार्ग5के बीच इस मार्कर के लिए कोई महत्वपूर्ण अंतर पाया ।

प्राप्त कोशिकाओं की संख्या क्षेत्र के अनुसार भिन्न होती है: क्रमशः परिलक्षित और अपरा क्षेत्रों से 61.6 x 106 और 71.8 x 106 कोशिकाएं, और गर्भनाल क्षेत्र(तालिका 1)से प्रति नमूना 1 x 106 से कम। इस प्रोटोकॉल के साथ यह बताया गया है कि अपरा और नाल क्षेत्र उनकी अभिव्यक्ति प्रोफाइल में बहुत समान हैं, जैसा कि परिलक्षित और अपरा क्षेत्रों के विपरीत है, विशेष रूप से जीन में जो ईसीएम रिसेप्टर इंटरैक्शन, फोकल आसंजन, और आरएनए-एसईक्यू6के माध्यम से PI3K-Akt सिग्नलिंग मार्ग में भाग लेते हैं। समझौते में, पिछले अध्ययन में माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेज की अंतर अभिव्यक्ति और विकास कारक बीटा रास्तों को बदलने के साथ-साथ दोनों क्षेत्रों17के बीच भड़काऊ साइटोकिन्स की सूचना दी गई थी।

हालांकि सबूत ों से पता चला है कि एमनियन से उपआबादी उनकी आकृति विज्ञान और शारीरिक गुणों में भिन्न होती है, हमने पहले यह दर्शाया था कि प्लीरिओता कारकों के मूल की अभिव्यक्ति और उपस्थिति अपरा और परिलक्षित क्षेत्रों से प्राप्त एचईसी में नहीं बदलतीहै। इस संदर्भ में, गर्भनाल क्षेत्र से कोशिकाओं की अपेक्षाकृत सीमित संख्या के अलावा, बाद के अध्ययनों को अपरा से अलग HAEC पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए और शारीरिक निहितार्थों पर विचार करते हुए स्वतंत्र रूप से एमनियन को प्रतिबिंबित करना चाहिए, क्योंकि विभिन्न उपआबादी श्रम के दौरान लंबे समय तक गर्भावस्था या भड़काऊ प्रक्रियाओं जैसी विशिष्ट घटनाओं के समान रूप से प्रतिक्रिया नहीं देगी, हालांकि मुख्य बहुपक्षीय मार्कर(चित्र 7)के लिए कोई विशिष्ट सकारात्मक कोशिकाएं नहीं हैं।

Figure 1
चित्रा 1: शब्द में एमनियोटिक झिल्ली से शारीरिक क्षेत्र। गर्भनाल एमनियोटिक झिल्ली (पीला), अपरा एमनियोटिक झिल्ली (सफेद), और परिलक्षित एमनियोटिक झिल्ली (काला)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एमनियोटिक झिल्ली का यांत्रिक विच्छेदन। (क)नाल क्षेत्र,(बी)अपरा क्षेत्र, और(सी)परिलक्षित क्षेत्र । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एमनियोटिक झिल्ली से प्राप्त एचईसी की प्रतिनिधि प्राथमिक संस्कृति। संस्कृति 48 एच के बिना अलगाव के बाद(ए)और के साथ(बी)मीडिया के एक परिवर्तन. स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: HAEC की प्राथमिक संस्कृति के नकारात्मक परिणामों के प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ । (A)एरिथ्रोसाइट्स की अधिकता। (ख)बैक्टीरियल संदूषण। (ग)एचईसी ने 48 घंटे के अलगाव के बाद पालन नहीं किया। (D)फाइब्रोब्लास्ट आकृति विज्ञान के साथ कोशिकाओं से बना प्राथमिक संस्कृति। स्केल बार = 200 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: विट्रो में विभिन्न शारीरिक क्षेत्रों से HAEC की आकृति विज्ञान। परिलक्षित (ऊपरी पैनल), अपरा (मध्य पैनल), और गर्भनाल (निचले पैनल) क्षेत्रों से समप्रवाह एचईसी के प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ हालांकि P0−P2 सुसंस्कृत हैं। स्केल बार 200 = μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: एचईसी में ई-कैथेरिन और केआई-67 की अभिव्यक्ति। ई-कैडरिन+ और KI-67+ HAEC से परिलक्षित (बाएं पैनल) और अपरा (दाएं पैनल) एमनियन एमनियन की प्रतिनिधि एपीफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियां P0−P2 के माध्यम से सुसंस्कृत। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: विभिन्न शारीरिक क्षेत्रों से HAEC एक pluripotency मार्कर पैनल प्रदर्शित करते हैं । आरए-1-60 के साथ नैनोजी के लिए डबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस एमनियन की प्रतिनिधि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां, ई-कैथेरिन के साथ OCT4, और SSEA-4 के साथ एचईसी (P1) में परिलक्षित (ऊपरी पैनल) और अपरा (निचले पैनल) क्षेत्रों से। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

# झिल्ली परिलक्षित अपरा नाल पूरी झिल्ली
1 75 X 106 130 X 106 0.2 X 106 205.2 X 106
2 38.5 X 106 52 X 106 0.53 X 106 91.03 X 106
3 59 X 106 53 X 106 0.2 X 106 112.2 X 106
4 42 X 106 27 X 106 0.36 X 106 69.36 X 106
5 44.8 X 106 22.3 X 106 Np 76.1 X 106
6 100 X 106 140 X 106 1 X 106 241 X 106
7 72 X 106 78 X 106 Np 150 X 106
औसत 61.6 X 106 71.8 X 106 0.45 X 106 133.8 X 106

तालिका 1: एमनियोटिक झिल्ली से प्रति क्षेत्र अलग एचईसी की संख्या। (एनपी = कार्रवाई नहीं) ।

अनुपूरक आंकड़ा 1: परावर्तित क्षेत्र से एचईसी (मार्ग 2) में और सकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं (एचएल-60 कोशिकाओं में कैम्प्टोथेसिन के साथ इलाज) में ट्यूनल धुंधला। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हमने एचईसी को शब्द झिल्ली से अलग करने के लिए एक नया प्रोटोकॉल लागू किया। यह पिछली रिपोर्टों से अलग है कि प्रत्येक झिल्ली को हर एक से कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए अलगाव से पहले अपने तीन शारीरिक क्षेत्रों में विभाजित किया गया था।

प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक सभी रक्त के थक्के को हटाने के लिए झिल्ली की धुलाई है, क्योंकि वे एपिथेलियल कोशिकाओं को अलग करते समय ट्राइप्सिन की गतिविधि में हस्तक्षेप कर सकते हैं। इस कदम को ठीक से पूरा करने में विफलता अत्यधिक एरिथ्रोसाइट्स और कुछ अनुयायी एपिथेलियल कोशिकाओं के साथ एक प्राथमिक संस्कृति प्राप्त करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यदि कोशिकाओं को बोने के बाद पहले 24−48 घंटे में कोई लगाव नहीं देखा जाता है, तो हम संस्कृति को त्यागने की सलाह देते हैं। एक और महत्वपूर्ण बिंदु एंजाइमैटिक पाचन के लिए ऊष्मायन समय है। यदि ऊष्मायन अवधि बहुत लंबी है, तो सेल व्यवहार्यता कम हो सकती है और/या एपिथेलियल आकृति विज्ञान के बजाय मेसेनचिमल के साथ सेल संस्कृतियों को प्राप्त किया जा सकता है(चित्र4)। इसके अलावा, यदि झिल्ली पाचन उचित आंदोलन के साथ नहीं किया जाता है, तो प्रति झिल्ली कोशिकाओं की कम संख्या प्राप्त करने की संभावना बढ़ जाती है।

इस प्रोटोकॉल में, हम अपने एपिथेलियल फेनोटाइप को खोए बिना विट्रो में एचईसी की आबादी को बनाए रख सकते हैं, जैसा कि मार्ग के साथ अधिकांश कोशिकाओं के लिए विशिष्ट एपिथेलियल सेल मार्कर ई-कैथेरिन की उपस्थिति से प्रदर्शित किया गया है(चित्रा 6)। हालांकि, हमारे अनुभव में HAEC केवल तीन मार्ग (P1−P3) के लिए विस्तारकिया जा सकता है। उन प्रयोगों के लिए सीमित संख्या में मार्गों को ध्यान में रखा जाना चाहिए जिनमें संस्कृति या कई मार्गों की लंबी अवधि की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, यह बताया गया है कि P3 के बाद कोशिकाएं अपनी आकृति विज्ञान को बदलना शुरू कर दें और ई-कैथेरिन की अभिव्यक्ति को कम करें, इसलिए लंबे समय तक संस्कृति एपिथेलियाल-मेसेनचिमल संक्रमण (ईएमटी)18को प्रेरित कर सकती है। हाल ही में, यह प्रदर्शित किया गया था कि प्रोजेस्टेरोन ओवाइन एमनियोटिक एपिथेलियल कोशिकाओं19,20में ईएमटी को रोकता है, इसलिए तीसरे मार्ग के बाद मेसेंचिमल फेनोटाइप से बचने के लिए एचईसी संस्कृति माध्यम में प्रोजेस्टेरोन की विभिन्न सांद्रता के प्रभाव का विश्लेषण करना दिलचस्प होगा।

पिछली सभी रिपोर्टों में जहां HAEC अलग-थलग थे, एमनियन को पूरी झिल्ली शामिल करने वाली एपिथेलियल आबादी की संभावित विषमता के बावजूद एक समान ऊतक मान लिया गया है। इसके विपरीत, यह प्रोटोकॉल झिल्ली को अपने तीन शारीरिक क्षेत्रों में विभाजित करता है ताकि पिछले रूपात्मक और जीन अभिव्यक्ति रिपोर्टों पर विचार करते हुए अलग-अलग और संस्कृति एचईसी को अलग-अलग किया जा सके जो कार्यात्मक मतभेदों का सुझाव देते हैं। केवल एपिथेलियल आबादी प्राप्त करने के लिए सेल छंटाई के माध्यम से शुद्ध करना भी अनावश्यक है, जैसा कि पी 2 तक मार्ग के दौरान ई-कैथेरिन मार्कर का पता लगाकर दिखाया गया है।

यह दिखाया गया है कि प्रत्येक झिल्ली क्षेत्रों से अलग एचईसी में बहुलता कोर की एक समान अभिव्यक्ति होती है, जो स्टेमनेस के साथ कोशिकाओं का एक अव्यक्त जलाशय है। इस संदर्भ में, इन कोशिकाओं का उपयोग आणविक तंत्रों का अध्ययन करने के लिए विट्रो में किया जा सकता है, जैसे कि बहुलता से संबंधित प्रतिलेखन कारकों का गतिशील स्थानीयकरण या कैंसर से जुड़े जीन व्यक्त करने के बावजूद शांत रहने की उनकी क्षमता, चाहे उनके मूल क्षेत्र की परवाह किए बिना। हालांकि, भविष्य के अनुसंधान की रिपोर्ट आणविक मतभेदों पर विचार करना चाहिए (वैश्विक अभिव्यक्ति जीन, चयापचय गतिविधि, संकेत रास्ते) प्रत्येक क्षेत्र के बीच, जो पुनर्योजी चिकित्सा में उनके आवेदन के लिए नतीजों होगा । हमने पहले PI3K/AKT और फोकल आसंजन सिग्नलिंग पाथवे में शामिल जीन की एक अलग अभिव्यक्ति की सूचना दी, जो आरएनए-सीक्यू6द्वारा विभिन्न एमनियोटिक क्षेत्रों के बीच संकेत दे रहे हैं । PI3K/AKT आत्म नवीकरण को नियंत्रित करता है और HPSC में pluripotenc रखता है, जबकि फोकल आसंजन kinase की सक्रियता उनके भेदभाव को बढ़ावा देता है21,22। इस प्रकार, हम वंश-विशिष्ट भेदभाव प्रोटोकॉल के दौरान विभिन्न शारीरिक क्षेत्रों से अलग HAEC में दोनों रास्तों की भूमिका की विशेषता का प्रस्ताव करते हैं। इसके अलावा, कई अध्ययन सेलुलर घटकों, आणविक कार्य और जैविक प्रक्रियाओं के बारे में दोनों क्षेत्रों के बीच मतभेदों को प्रदर्शित करते हैं। उदाहरण के लिए, क्षेत्र-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति और एक्वापोरिन के प्रोटीन वितरण, जो इंट्रेमब्रंसस अवशोषण की परिवहन प्रक्रिया में शामिल हैं,23की सूचना दी गई है । एक अन्य अध्ययन में माइक्रोरेज़ द्वारा मिरनोम की तुलना की गई, जिसमें एमआईआर-145 और एमआईआर-143 की क्षेत्र-विशिष्ट अभिव्यक्ति दिखाई गई है, बाद में16टर्म में श्रम जैसी विशिष्ट शर्तों के तहत प्रोस्टाग्लैंडिन-एंडोपेरोक्सी सिनेथेस को पोस्टट्रांसक्रिप्शन करने में सक्षम किया जा रहा है। इसके अलावा, अपरा क्षेत्र उच्च माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन लेकिन कम प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का पता लगाने के रूप में परिलक्षित ऊतक15के साथ तुलना में प्रस्तुत करता है । परिलक्षित और अपरा क्षेत्रों में एमनियन विच्छेदन को एचईसी को अलग करने और उनके विशिष्ट गुणों का अलग-अलग विश्लेषण करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है, जैसे विकास कारकों और साइटोकिन्स की रिहाई, उनकी कम इम्यूनोजेनिकिटी, बाह्य मैट्रिक्स का उत्पादन, अन्य सेल प्रकारों के साथ सहसंस्कृति में उनके वातानुकूलित माध्यम का प्रभाव, और उपन्यास कार्य जैसे कि एचपीएससी लाइनों को एक फीडर परतकेरूप में बनाए रखने की उनकी क्षमता।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हमारे शोध को इंस्टीटो नैसिनल डी पेरिनाटोलोजिया डी मेक्सीको (21041 और 21081) और कोनेसाइट (A1-S-8450 और 252756) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम तकनीकी सहायता के लिए जेसिका गोंजालेज नॉरिस और लिडिया यूरिया पैरेडेस विवेस को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Culture reagents
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific/Gibco 21985023 55 mM
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific/Gibco 15240062 100X
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific/Gibco 12430054 Supplemented with high glucose and HEPES
EDTA Thermo Fisher Scientific/Ambion AM9260G 0.5 M
Embryonic stem-cell FBS, qualified Thermo Fisher Scientific/Gibco 10439024
Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher Scientific/Gibco 11140050 100X
Paraformaldehyde any brand
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific/Gibco 10010023 1X
Saline solution (sodium chloride 0.9%) any brand
Sodium Pyruvate Thermo Fisher Scientific/Gibco 11360070 100 mM
Trypsin/EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific/Gibco 25300054
Disposable material
100 µm Cell Strainer Corning/Falcon 352360
100 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3526
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3516
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube any brand with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.
Sterile cotton gauzes
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL any brand
Sterile surgical gloves any brand
Equipment
Biological safety cabinet
Centrifuge
Micropipettes
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Sterile beakers of 500 mL
Sterile plastic cutting board
Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps
Sterile stainless steel container
Sterile tray
Tube Rotator MaCSmix
Antibodies and Kits Antibody ID
Anti-E-cadherin BD Biosciences 610181 RRID:AB_3975
Anti-KI67 Santa Cruz 23900 RRID:AB_627859)
Anti-NANOG Peprotech 500-P236 RRID:AB_1268274
Anti-OCT4 Abcam ab19857 RRID:AB_44517
Anti-SOX2 Millipore AB5603 RRID:AB_2286686
Anti-SSEA-4 Cell Signaling 4755 RRID:AB_1264259
Anti-TRA-1-60 Cell Signaling 4746 RRID:AB_2119059
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11029 RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11036 RRID:AB_10563566
Tunel Assay Kit Abcam 66110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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