Developmental Biology
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मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से वायुमार्ग उपकला सेल एयर-तरल इंटरफ़ेस संस्कृतियों की पीढ़ी
Chapters
Summary June 14th, 2022
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मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल भेदभाव प्रोटोकॉल में हालिया प्रगति अंग-विशिष्ट सेल प्रकारों के चरणबद्ध व्युत्पत्ति की अनुमति देती है। यहां, हम आईपीएससी-व्युत्पन्न वायुमार्ग बेसल कोशिकाओं के रखरखाव और विस्तार और वायु-तरल इंटरफ़ेस संस्कृतियों में एक श्लेष्म उपकला में उनके भेदभाव के लिए विस्तृत कदम प्रदान करते हैं।
Transcript
यह प्रोटोकॉल सहायक है क्योंकि यह उन चरणों का पालन करना आसान प्रदान करता है जो कार्यात्मक वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए अनुमति देते हैं, जिनका उपयोग वायुमार्ग जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ एक साथ प्राथमिक वायुमार्ग कोशिकाओं को प्राप्त करने और संवर्धन करने की कठिनाइयों से बचने के दौरान कई कार्यात्मक वायुमार्ग उपकला सेल संस्कृतियों को उत्पन्न करने की क्षमता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन टेलर मैट, हमारी प्रयोगशाला से एक स्नातक छात्र होगा।
बर्फ पर 3 डी मैट्रिक्स की पर्याप्त मात्रा को पिघलाकर शुरू करें। उपयोग के लिए तैयार होने तक इसे बर्फ पर रखें। आईबीसी के पहले क्रायोप्रिजर्व्ड सिंगल सेल निलंबन की एक शीशी को 37 डिग्री सेल्सियस पानी या मनका स्नान में इनक्यूबेट करके पिघलाएं जब तक कि कोई दृश्यमान जमे हुए मीडिया न हो।
एक पांच मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, सेल निलंबन को 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। सेल निलंबन में डीएमईएम / एफ 12 ड्रॉपवाइज के छह से 10 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे मिश्रण और अपकेंद्रित्र पांच मिनट के लिए 300 आरसीएफ पर कोशिकाओं गोली.
सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें और पी 1000 माइक्रोपिपेट के साथ बेसल सेल मीडियम के एक मिलीलीटर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। एक 10 माइक्रोलीटर विभाज्य तैयार करें और एक सेल गिनती करें। पांच मिनट के लिए 300 आरसीएफ पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें।
सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें और पी 1000 माइक्रोपिपेट के साथ 3 डी मैट्रिक्स पर पहले पिघलाए गए माइक्रोलीटर में 4, 000 कोशिकाओं प्रति माइक्रोलीटर के घनत्व पर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। पी 200 माइक्रोपिपेट के साथ, 12-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति-उपचारित प्लेट के प्रत्येक कुएं के आधार पर लगभग 25 से 50 माइक्रोलीटर के अनुरूप मैट्रिक्स समाधान की एक बूंद जोड़ें। लगभग 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट सेते हैं।
फिर पांच मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके छोटी बूंद को पूरी तरह से डुबोने के लिए प्रत्येक कुएं में पर्याप्त बेसल सेल माध्यम जोड़ें। प्लेट को एक आर्द्र इनक्यूबेटर में लौटाएं। ताजा बेसल सेल माध्यम का उपयोग कर हर दो दिनों में कोशिकाओं को खिलाएं।
एक पांच मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ अच्छी तरह से के पक्ष में ताजा माध्यम जोड़ें, ध्यान रखना कोशिकाओं की छोटी बूंद परेशान नहीं है। बर्फ पर 3 डी मैट्रिक्स की पर्याप्त मात्रा पिघलना। उपयोग के लिए तैयार होने तक इसे बर्फ पर रखें।
संस्कृति प्लेटों को इनक्यूबेट करने के लगभग पांच से सात दिनों के बाद, प्रत्येक कुएं से माध्यम की आकांक्षा करें, फिर पी 1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, मैट्रिक्स की बूंद से अलग होने के लिए सीधे स्फेरॉइड पर एक मिलीलीटर डिस्पेस द्वितीय जोड़ें। प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 10 से 15 मिनट के लिए रखें। पी 1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, 3 डी मैट्रिक्स के बड़े गुच्छों को तोड़ते हुए, दो बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके डिस्पेस मिलाएं।
अतिरिक्त 30 से 40 मिनट के लिए प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर लौटाएं, जिससे मैट्रिक्स पूरी तरह से भंग हो जाए। जब 3 डी मैट्रिक्स की छोटी बूंद अब प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे दिखाई नहीं देती है, तो पांच मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट टिप का उपयोग करके 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्वतंत्र रूप से फ्लोटिंग स्फेरॉइड जोड़ें। एफ 12 प्रति शंक्वाकार ट्यूब 10 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा के लिए जोड़ें और स्फेरॉइड को गोली देने के लिए तीन मिनट के लिए 200 आरसीएफ पर अपकेंद्रित्र जोड़ें।
सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें और प्रत्येक प्रारंभिक बूंद के लिए 0.05% ट्रिप्सिन का एक मिलीलीटर जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, इसे हर दो से तीन मिनट में ट्राइट्यूरेट करें। हर कुछ मिनट में प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ समाधान का मूल्यांकन करें।
जब 90% से अधिक स्फेरॉइड को एकल कोशिकाओं में अलग कर दिया जाता है, तो ट्रिप्सिन में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम जोड़ें। पांच मिनट के लिए 300 आरसीएफ पर 40 माइक्रोमीटर सेल छलनी और अपकेंद्रित्र के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर करें। एक सेल गिनती करें और पिघला हुआ 3 डी मैट्रिक्स के प्रति माइक्रोलीटर 400 कोशिकाओं के घनत्व पर कोशिकाओं को समान रूप से फिर से निलंबित करें।
हवा के बुलबुले पेश करने से बचें। डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग के लिए आवश्यकतानुसार कई बूंदों को पुन: निलंबित करें। प्रत्येक कुएं के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
सबसे हालिया मार्ग के 10 से 14 दिनों के बाद, स्फेरॉइड को एक एकल सेल निलंबन में अलग करें जैसा कि पहले प्रदर्शित किया गया था और एक सेल गिनती करें। सॉर्ट बफर में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। यह मुख्य जनसंख्या होगी।
एक अलग ट्यूब में 25 से 50 माइक्रोलीटर के एक छोटे विभाज्य को स्थानांतरित करें। यह नाबालिग आबादी होगी। मुख्य सेल आबादी में संयुग्मित एंटी-एनजीएफआर एंटीबॉडी जोड़ें।
मामूली सेल आबादी के लिए आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी जोड़ें। कोशिकाओं को प्रकाश से बचाएं और उन्हें 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखें ताकि पेलेटिंग को रोकने के लिए कोशिकाओं को रुक-रुक कर ट्राइट्यूरेट किया जा सके। 30 मिनट के बाद, कोशिकाओं की प्रत्येक ट्यूब के लिए सॉर्ट बफर जोड़ें।
पांच मिनट के लिए 300 आरसीएफ पर अपकेंद्रित्र कोशिकाएं। सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा, सॉर्ट बफर में गोली कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और जीवित या मृत सेल दाग जोड़ें। एक उपयुक्त एनजीएफआर सकारात्मक गेटिंग रणनीति का उपयोग करके, आवश्यक डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त एनजीएफआर सकारात्मक कोशिकाओं को सॉर्ट करें।
निर्माता के निर्देश के अनुसार एपिकल चैंबर में 200 माइक्रोलीटर मैट्रिक्स जोड़कर 6.5 मिलीमीटर झरझरा झिल्ली आवेषण तैयार करें। जरूरत से पहले इसे कम से कम दो घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। सम्मिलित करने के एपिकल कक्ष से कोटिंग मैट्रिक्स की आकांक्षा करें।
बेसल सेल मीडियम के 500 माइक्रोलीटर को बेसोलेटरल चैंबर में जोड़ें। 100 से 200 माइक्रोलीटर बेसल सेल मीडियम में कम से कम 30, 000 सॉर्ट किए गए एनजीएफआर सकारात्मक कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और पी 200 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके एपिकल चैंबर में स्थानांतरित करें। शेष कुओं के लिए दोहराएं।
प्लेट को आर्द्र 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। दो से तीन दिनों में, एपिकल और बेसोलेटरल कक्षों की आकांक्षा करें और ताजा बेसल सेल मीडियम के साथ फ़ीड करें। प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ दैनिक एपिकल चैंबर की निगरानी करें।
जब कोशिकाएं 80% से अधिक संगम तक पहुंचती हैं, तो बेसल सेल मीडियम को एपिकल और बेसोलेटरल दोनों कक्षों में एएलआई भेदभाव माध्यम के साथ बदलें। मीडिया कंटेनरों को पन्नी में लपेटकर और जब संभव हो तो ओवरहेड लाइट बंद करके एएलआई भेदभाव माध्यम को प्रकाश से बचाएं। अगले दिन, एपिकल चैंबर से माध्यम की आकांक्षा करें, इस प्रकार एपिकल सतह को हवा में उजागर करें।
हर दो से तीन दिनों में बेसोलेटरल चैंबर में एएलआई भेदभाव मीडिया को बदलें। हर एक से दो दिनों में संस्कृति की उपस्थिति की निगरानी करें। सेल परत को परेशान किए बिना एपिकल चैंबर से किसी भी संचित तरल को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें।
मलबे या बलगम को हटाने के लिए एपिकल चैंबर में कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और फिर ध्यान से पीबीएस की आकांक्षा करते हैं। उपकला अखंडता के लिए टीईईआर का आकलन करें।
हवा के संपर्क के सात से 10 दिनों के बाद, प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मल्टीसिलिया की उपस्थिति के लिए निरीक्षण करें। नियोजित प्रयोग और रीडआउट के आधार पर, हवा के संपर्क के 14 से 28 दिनों के बाद कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा सकता है। सबसे हालिया 3 डी संस्कृति मार्ग के 10 से 14 दिनों के बाद, स्फेरॉइड को एकल सेल निलंबन में अलग करें जैसा कि पहले प्रदर्शित किया गया था।
एक सेल गिनती करें, क्रायोवियल में क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम में सेल निलंबन को फिर से निलंबित करें। तापमान में लगातार गिरावट सुनिश्चित करने के लिए एक कंटेनर में क्रायोवियल रखें। और 24 से 48 घंटे के लिए शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस तक स्थानांतरित करें और इसके बाद दीर्घकालिक भंडारण के लिए शून्य से 150 डिग्री सेल्सियस तक स्थानांतरित करें।
इस गेटिंग तकनीक के साथ, 28% जीवित एकल कोशिकाएं एनजीएफआर सकारात्मक थीं। दो दिनों के बाद, व्यक्तिगत कोशिकाओं को शुरू में आसानी से पहचाना जा सकता था और एक लम्बी धुरी के आकार की उपस्थिति थी। दो और दिनों के बाद, कोशिकाओं ने एक संगम और शिथिल पैक मोनोलेयर का गठन किया।
बाद के दिनों से हफ्तों तक, कोशिकाओं ने एक कसकर पैक, अत्यधिक सेलुलर उपकला परत का गठन किया। और सात से 10 दिनों के बाद, सिलिया और बलगम उत्पादन की धड़कन का स्पष्ट उद्भव हुआ। नमूनों के टीईईआर को मापा गया था और परिणाम प्राथमिक वायुमार्ग उपकला सेल नियंत्रण नमूनों के माप के समान थे।
कैनोनिकल वायुमार्ग उपकला सेल मार्करों के लिए पैराफॉर्म एल्डिहाइड और इम्यूनोलेबलिंग के साथ बाद में निर्धारण एमयूसी 5 एसी और एसिटिलेटेड अल्फा-ट्यूबुलिन के लिए किया गया था। इस प्रोटोकॉल के बाद, शोधकर्ता विभिन्न रीडआउट का आकलन करने के लिए बड़ी संख्या में रोगी-व्युत्पन्न वायुमार्ग उपकला सेल संस्कृतियों को उत्पन्न कर सकते हैं, जिसमें रोग और स्वास्थ्य दोनों में बेसल, स्रावी और बहुसंयोजक कोशिकाओं के कार्यों का परीक्षण करना शामिल है।
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