В vitro Культура эпителиальных клеток из различных анатомических регионов амниотической Мембраны человека

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Этот протокол описывает изоляцию эпителиальных клеток из различных анатомических областей амниотической мембраны человека для определения их неоднородности и функциональных свойств для возможного применения в клинических и физиопатологических моделях.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Avila-González, D., García-López, G., Díaz-Martínez, N. E., Flores-Herrera, H., Molina-Hernández, A., Portillo, W., Díaz, N. F. In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane. J. Vis. Exp. (153), e60551, doi:10.3791/60551 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Несколько протоколов были зарегистрированы в литературе для изоляции и культуры человека амниотических эпителиальных клеток (HAEC). Однако они предполагают, что амниотический эпителий является однородным слоем. Амнион человека можно разделить на три анатомические области: отраженную, плацентарную и пупочную. Каждый регион имеет различные физиологические роли, например, в патологических условиях. Здесь мы описываем протокол для вскрытия ткани амниона человека в трех разделах и поддерживать его в пробирке. В культуре клетки, полученные из отраженного амниона, отображали кубоидальную морфологию, в то время как клетки как из плацентарных, так и из пупочных областей были плоскоклеточными. Тем не менее, все полученные клетки имеют эпителиальный фенотип, продемонстрированный иммунообнаружением E-кадерин. Таким образом, поскольку плацентарные и отраженные области на месте отличаются в клеточных компонентах и молекулярных функциях, может потребоваться для исследования in vitro рассмотреть эти различия, поскольку они могут иметь физиологические последствия для использования HAEC в биомедицинских исследований и перспективного применения этих клеток в регенеративной медицине.

Introduction

Клетки амниотического эпителия человека (HAEC) возникают на ранних стадиях эмбрионального развития, примерно в восемь дней послеоплодизации. Они возникают из популяции плоскоклеточных эпителиальных клеток эпибласта, которые вытекают из внутреннего слоя амниотической мембраны1. Таким образом, HAEC считаются остатками плюрипотентных клеток из эпибласта, которые имеют потенциал, чтобы дифференцироваться в три слоя зародыша эмбриона2. В последнее десятилетие, различные исследовательские группы разработали методы, чтобы изолировать эти клетки от амниотической мембраны в срок беременности, чтобы охарактеризовать их предполагаемых плюрипотентных свойств, связанных с культурой в пробирке3,4.

Соответственно, было установлено, что HAEC особенность черты, характерные для человека плюрипотентных стволовых клеток (HPSC), таких как поверхностные антигены SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; ядро факторов транскрипции pluripotency OCT4, SOX2 и NANOG; и маркер распространения KI67, предполагая, что они самообновляются5,6,7. Кроме того, эти клетки были оспорены с помощью протоколов дифференциации для получения клеток, положительных для линейных конкретных маркеров трех слоев микробов (эктодерм, мезодерм, и эндодерм)4,5,8, а также в животных моделей человеческих заболеваний. Наконец, HAEC выразить E-кадерин, которые демонстрируют, что они сохраняют эпителиальный характер так же, как HPSC5,9.

Помимо их эмбрионального происхождения, HAEC имеют другие свойства, которые делают их пригодными для различных клинических применений, таких как секреция противовоспалительных и антибактериальных молекул10,11, факторы роста и цитокинов релиз12, не образование тератомы, когда они пересажены в иммунодефицитных мышей в отличие от HPSC2, и иммуно-толерной толерантности, потому что они выражают HLA-G отказ, который трансплантация13.

Однако, предыдущие доклады предполагали, что амнион человека является однородной мембраной, не учитывая, что она может быть анатомически и физиологически разделена на три области: плацентарный (амнион, который охватывает decidua базалис),пупочная (часть, которая обволакивает пуповину), и отражается (остальная часть мембраны не прилагается к плаценте)14. Было показано, что плацентарные и отраженные области амниона отображают различия в морфологии, митохондриальной активности, обнаружении реактивных видов кислорода15, выражении миРНК16, и активации сигнальных путей17. Эти результаты свидетельствуют о том, что амнион человека интегрируется в разнородную популяцию с различной функциональностью, которая должна быть рассмотрена для дальнейших исследований, проведенных в situ или in vitro моделей. В то время как другие лаборатории разработали протоколы для изоляции HAEC от всей мембраны, наша лаборатория разработала протокол для изоляции, культуры и характеристики клеток из различных анатомических регионов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол был одобрен комитетом по этике Национального института Перинатологии в Мехико (номер реестра 212250-21041). Все процедуры, проведенные в этих исследованиях, соответствовали этическим стандартам Национального института перинатологии, Хельсинкской декларации и руководящим принципам, изложенным в официальном мексиканском стандарте Министерства здравоохранения.

1. Подготовка

  1. Подготовьте решение 1x PBS с помощью EDTA. Для этого добавьте 500 л 0,5 М EDTA в 500 мл 1x PBS для конечной концентрации 0,5 мм EDTA.
  2. Подготовьте среду культуры для HAEC. Возьмите 450 мл высокоглюкозного дМЭМ, дополните его 5 мл пирувата натрия (100 мМ), 50 мл тепло-неактивной сыворотки крупного рогатого скота, 5 мл несущественных аминокислот (100x), 5 мл антибиотико-антимикотик (100х), 5 мл L-глухота (20 м0 м0 м0 м0 м0 м0 м0 м0 м0м м0м) 500 л меркаптоэтанола (1000x).
  3. Стерилизовать контейнеры для транспортировки и обработки ткани: контейнер из нержавеющей стали с крышкой для транспортировки всей плаценты из операционной в лабораторию, лоток (20 см х 30 см х 8 см) для мытья и удаления крови из всей плаценты до вскрытие амниотической мембраны и пластиковой разделочной доски для разделения амниотической мембраны на три области.
  4. Стерилизовать хирургические инструменты (скальпели, ножницы, щипцы и зажимы), 500 мл клюв, хлопчатобумажные марли и солевой раствор.

2. Получение плацентарной ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Амниотические мембраны были получены от женщин на полную беременность (37–40 недель), под указанием кесарева сечения, без каких-либо признаков активного труда и никаких микробиологических характеристик инфекции. Процедуры полной изоляции и культуры осуществлялись в рамках кабинета биобезопасности в стерильных условиях.

  1. В операционной, зажим пуповины, чтобы предотвратить приток крови к остальной части ткани. Соберите всю плаценту с пуповиной зажатой в стерильных контейнерах.
  2. Добавьте 500 мл соблюй раствора в контейнер для увлажнения плаценты.
  3. Закройте контейнер и транспортировать ткань в лабораторию при комнатной температуре.
  4. Поместите контейнер с плацентой в шкаф биобезопасности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если вскрытие не осуществляется в течение 15 минут от сбора плаценты, хранить контейнер с плацентой на льду до обработки. Избегайте более 1 ч прошедшего времени между получением плаценты и началом вскрытия.

3. Механическое разделение на область амниотической мембраны

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура должна проводиться в шкафу биобезопасности в стерильных условиях и при комнатной температуре.

  1. Удалите всю плаценту из контейнера и поместите его на лоток с пуповиной, обращенной вверх.
  2. Используя стерильную хлопчатобумажную марлю, очистите сгустки крови с поверхности хорион-амниона, которая покрывает плаценту.
  3. Определите три области мембраны: пупочный амнион, окутывающий пуповину, плацентарный амнион, покрывающий базалис decidua, и отраженный регион, который является остальной частью амниона, который не прикреплен к плаценте (Рисунок 1).
  4. Расчлените пупочной амнион(рисунок 2A).
    1. Используя рассекающие щипцами, удерживайте часть мембраны амниона, которая покрывает стык плаценты и пуповины.
    2. С помощью скальпеля, вскрыть область, которая окружает шнур при растяжении, чтобы отделить его от хориона.
    3. Депозит разделенной ткани в помечены стакан с 100 мл солевым раствором.
  5. Вскрыть плацентарную амнионную область(рисунок 2B).
    1. С помощью стерильной хлопчатобумажной марли удалите сгустки крови с поверхности хорион-амниона, которая покрывает плаценту.
    2. Держите мембрану на границе между плацентой и отраженной областью с рассекающимищицами щипцами.
    3. Вырезать по окружности плаценты скальпелем.
    4. Отделите плацентарную амнион от хориона, стараясь не вырезать сосуды из плаценты.
    5. Поместите отделенную ткань в другой помеченный стакан с 300 мл соблюй раствора.
  6. Отделить остальную часть амниотической мембраны, которая не прикреплена к плаценте (т.е. отраженной части) от хориона(рисунок 2C).
    1. Соберите отраженную область в другой помеченный стакан с 300 мл сольного раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить сосуд постоянно во время вскрытия, чтобы предотвратить высыхание тканей.

4. Мытье мембран

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура должна проводиться в шкафу биобезопасности в стерильных условиях при комнатной температуре.

  1. Откажитесь от сольного раствора каждой мембранной области отдельно.
  2. Добавьте 100 мл свежего сольного раствора в пупочной области.
  3. Добавьте 300 мл свежего сольного раствора в плацентарные и отраженные области соответственно.
  4. Перемешать мембраны с помощью вскрытия щипцы для удаления остатков крови.
  5. Откажитесь от сольного раствора.
  6. Повторите стирание и возбуждение по крайней мере 3x, пока мембраны полупрозрачные.
  7. Поместите и удлините мембраны на доске, чтобы очистить стерильной марлей сгустки крови, которые не были удалены с омынием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно удалить как можно больше эритроцитов, так как их присутствие влияет на функцию трипсина и жизнеспособность последующих клеточных культур.

5. Ферментативное пищеварение мембран из разных регионов

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура должна проводиться в шкафу биобезопасности в стерильных условиях.

  1. Разрежьте отраженные и плацентарные области на два или три фрагмента.
  2. Не разрезайте пуповину.
  3. Поместите фрагменты каждого региона в центрифуги труб. Добавьте 20 мл 0,5% трипсина/ЭДТА в отраженные и плацентарные области и 5 мл 0,5% трипсина/ЭДТА в пупочный регион, соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы сократить отраженные и плацентарные области на более мелкие кусочки, потому что они должны быть полностью погружены в раствор трипсина.
  4. Встряхните центрифуги труб слегка в течение 30 с. Отбросьте трипсина.
  5. Добавьте 30 мл новых 0,5% трипсина/ЭДТА в отраженные и плацентарные области и 15 мл новых 0,5% трипсина/ЭДТА в пупочный регион, соответственно.
  6. Поместите трубки в ротатор внутри инкубатора.
  7. Инкубировать с вращением (20 об/мин) в течение 40 мин при 37 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ротатор трубки недоступен, встряхните трубки слегка вручную каждые 10 минут.
  8. Перенесите трипсин/клеточные растворы из каждого региона в новые центрифуги.
  9. Добавьте 2x том средств HAEC prewarmed на 37 c в пробку для того чтобы инактивировать энзим.
  10. Храните первое пищеварение на льду.
  11. Повторите шаги 5.6-5.8 на второй период пищеварения.
  12. Для каждой области, провести один конец амниона часть с помощью рассекающих щипцы, а с другой парой сжать вдоль ткани, чтобы удалить ряды эпителиальных клеток, которые не полностью слезть во время предыдущих инкубационных периодов.
  13. Соберите второе пищеварение в другой набор центрифуговых трубок и инактивируйте с 2-х объемом носителей HAEC.
  14. Отбросьте переваренные мембраны в контейнер для биоопасности.

6. Изоляция ГАЭК

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура должна проводиться в шкафу биобезопасности в стерильных условиях.

  1. Центрифуга все трубы на 200 х г в течение 10 мин при 4 кв. C.
  2. Откажитесь от супернатанта и добавьте 10 мл предварительно разогретых носителей HAEC (до 37 градусов по Цельсию) на трубку и трубку мягко дезагрегировать каждую гранулу.
  3. Объедините клеточные суспензии двух пищеварений в отдельной трубке для каждой мембранной области.
  4. Фильтр клеточных суспензий с помощью 100 мкм ячейки ситектов для удаления внеклеточного матричного мусора и получения одиночных клеток.
  5. Подготовьте три аликвота с 90 злицу трипан синего в микроцентрифуге трубки.
  6. Добавьте 10 кЛ каждой клеточной подвески на мембранную область в микроцентрифуговые трубки и перемешайте.
  7. Подсчитайте клетки гемоситометром под световым полевым микроскопом.

7. Культура HAEC

  1. Семена HAEC из трех регионов отдельно при плотности 3 и 104 клетки /см2 с предварительно разогретых HAEC средств массовой информации, дополненный 10 нг/мл человека эпидермального фактора роста (EGF).
    1. Семя клетки в 100 мм пластин для поддержания их в пробирке или в 24 пластин ы для иммунохимического анализа.
  2. Инкубировать блюда при 37 градусах Цельсия при нормокиси (5% CO2)в увлажненный инкубатор.
  3. Добавляйте EGF ежедневно и меняйте среду каждый третий день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки станут стыковочные через 4–6 дней.
  4. Используйте клетки для обычной иммуногистохимии, анализа клеточной сортировки, криоконсервирования, экстракции РНК и белка, или для продолжения прохождения.

8. Прохождение HAEC

  1. Удалите среду HAEC и промойте 2x с помощью PBS/EDTA 0.01M.
  2. Инкубировать раствором PBS/EDTA 0.01M на 15 мин при 37 градусах Цельсия.
  3. Удалить PBS/EDTA и добавить 1,5 мл 0,5% трипсин / EDTA.
  4. Инкубировать в течение 5-8 мин при 37 градусах По Цельсию.
  5. Инактивируйте фермент двумя томами медиаHAEC.
  6. Соберите смешанный раствор и центрифугу в течение 5 мин при 200 х г.
  7. Подсчитайте клетки и продолжайте следующие проходы или используйте клетки для дальнейшего анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HAEC были выделены из каждого из трех анатомических регионов амниотической мембраны и индивидуально культивируется в пробирке. После 48 ч культуры, клетки с эпителиальным фенотипом прилипли к поверхности пластины, хотя средства массовой информации также содержали мусор клетки и плавающие клетки, которые были удалены после того, как среда была изменена(рисунок 3).

Во время обработки первичной культуры (проход ноль, P0), некоторые осложнения могут возникнуть, которые могут помешать экспериментальному анализу данных(рисунок 4): Целесообразно отказаться от культур и процесс другой мембраны при выявлении присутствия бактерий из-за загрязнения реагентов или во время процесса изоляции (Рисунок 4A); чрезмерные эритроциты из-за недостаточного мытья мембран(рисунок 4B); нехватает или нет примыки клеток к пластинам(рисунок 4C); или клетки с морфологией фибробластов(Рисунок 4D),предполагая, что амниотические мезенхимальные клетки человека (HAMC) были изолированы вместо HAEC.

Морфология HAEC зависит от происхождения этих клеток: клетки из отраженной зоны имеют куоидальную морфологию и растут в мощеном монослойном, в отличие от клеток из плацентарных и пупочных областей, которые более плоские и плоскочные(рисунок 5). Эти данные подтверждают, что эпителиальный слой от амниона не является однородным по всей мембране. Во время проходов размер клеток из всех регионов увеличивается, но они сохраняют эпителиальную природу и не приобретают фибробластной морфологии. Действительно, иммунофлуоресценция против E-кадерин показал, что первичные культуры (P0) и субкультуры (P1-P2) поддерживали эпителиальный фенотип(рисунок 6), предполагая, что нет загрязнения другого типа клеток, таких как мезенхимальные стромальные клетки, или эпителиально-мезенхимальный переход. Кроме того, эти клетки не показывают никаких доказательств гибели клеток в соответствии с свидетельством TUNEL(Дополнительный рисунок 1),но являются положительными для KI-67 маркер распространения (Рисунок 6), хотя наши предыдущие результаты не нашли существенных различий для этого маркера между каждым проходом5.

Количество полученных клеток варьируется в зависимости от региона: 61,6 х 106 и 71,8 х 106 ячеек из отраженных и плацентарных областей, соответственно, и менее 1 х 106 на выборку из пупочной области(таблица 1). Было сообщено с этим протоколом, что плацентарные и пупочные области очень похожи в своих профилях выражения, в отличие от отраженных и плацентарных регионов, особенно в генах, которые участвуют в eCM взаимодействия рецепторов, координационной адгезии, и PI3K-Akt сигнальный путь через РНК-сек6. В согласии, предыдущее исследование сообщило дифференциальной экспрессии митогена активированного белка киназы и преобразования факторроста бета-пути, а также провоспалительных цитокинов между обоими регионами17.

Хотя данные показали, что субпопуляции от амниона отличаются по своей морфологии и физиологические свойства, мы ранее показали, что выражение и наличие ядра плюрипотентных факторов не меняется в HAEC, полученных из плацентарных и отраженных регионов6. В этом контексте, в дополнение к относительно ограниченному числу клеток из пупочной области, последующие исследования должны быть сосредоточены на изолированных HAEC от плацента и отраженных амнионов самостоятельно, учитывая физиологические последствия, потому что различные субпопуляции не будут реагировать в равной степени на конкретные события, такие как длительная беременность или воспалительные процессы во время родов, хотя Есть никаких конкретных положительных клеток основных маркеров плюрипотентности (Рисунок 7).

Figure 1
Рисунок 1: Анатомические области из амниотической мембраны в срок. Пуповинная амниотическая мембрана (желтая), плацентарная амниотическая мембрана (белая) и отраженная амниотическая мембрана (черная). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Механическое вскрытие амниотической мембраны. (A) Пуповина, (B)плацентарный регион, и (C) отражает регион. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Представитель первичной культуры HAEC, полученных из амниотической мембраны. Культура 48 h после изоляции без (A)и с (B) изменение средств. Шкала баров 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативные микрографы отрицательных результатов первичной культуры HAEC. (A) Избыток эритроцитов. (B) Бактериальное загрязнение. (C)HAEC не придерживается после 48 ч изоляции. (D) Первичная культура, состоящая из клеток с морфологией фибробластов. Шкала баров 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Морфология HAEC из различных анатомических регионов in vitro. Репрезентативные микрографы смещаемых HAEC из отраженных (верхняя панель), плацентарных (средняя панель) и пупочных (нижняя панель) регионов культивируется, хотя P0-P2. Шкала баров 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Выражение E-кадерин и KI-67 в HAEC. Представитель эпифлюоресценции микроскопии изображения E-кадхерини KI-67HAEC из отраженного (левая панель) и плацентарной (правая панель) амнион культивируется через P0-P2. Шкала баров 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: HAEC из различных анатомических областей отображает панель маркеров плюрипотентности. Представитель конфокальной микроскопии изображения двойной иммунофлуоресцентной амнион для NANOG с TRA-1-60, OCT4 с E-кадерин, и SOX2 с SSEA-4 в HAEC (P1) из отраженных (верхняя панель) регионов. Шкала баров 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

МЕМБРАМОН Отражены Плацентарный Пупочной ПОЛНАЯ MEMBRANE
1 75 X 106 130 X 106 0.2 X 106 205.2 X 106
2 38.5 X 106 52 X 106 0.53 X 106 91.03 X 106
3 59 X 106 53 X 106 0.2 X 106 112.2 X 106
4 42 X 106 27 X 106 0.36 X 106 69.36 X 106
5 44.8 X 106 22.3 X 106 Np 76.1 X 106
6 100 X 106 140 X 106 1 X 106 241 X 106
7 72 X 106 78 X 106 Np 150 X 106
Средняя 61.6 X 106 71.8 X 106 0.45 X 106 133.8 X 106

Таблица 1: Количество HAEC, изолированных в регионе от амниотических мембран. (NP - не обработано).

Дополнительная рисунок 1: TuneL окрашивания в HAEC (проход 2) из отраженной области и в положительных клеток контроля (HL-60 клетки, обработанные камптотецином). Шкала баров 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы внедрили новый протокол для изоляции HAEC от терминовых мембран. Он отличается от предыдущих докладов в том, что каждая мембрана была разделена на три анатомических регионов до изоляции для анализа клеток от каждого из них.

Одним из наиболее важных шагов в протоколе является промывка мембраны для удаления всех сгустков крови, так как они могут мешать активности трипсина при разделении эпителиальных клеток. Неспособность выполнить этот шаг должным образом может привести к получению первичной культуры с чрезмерным эритроцитов и несколько приверженцев эпителиальных клеток. Если после посева клеток в первые 24–48 ч не наблюдается привязанности, мы рекомендуем отказаться от культуры. Другим критическим моментом является время инкубации ферментативного пищеварения. Если инкубационный период слишком длинный, жизнеспособность клеток может уменьшиться и/или клеточные культуры с мезенхимальными вместо эпителиальной морфологии могут быть получены(рисунок 4). Кроме того, если переваривание мембраны не делается при правильном возбуждении, повышается вероятность получения низкого количества клеток на мембрану.

В этом протоколе, мы можем поддерживать популяции HAEC in vitro, не теряя эпителиального фенотипа, о чем свидетельствует наличие специфического эпителиального клеточного маркера E-кадерин для большинства клеток вдоль проходов (Рисунок 6). Однако, по нашему опыту, HAEC может быть расширен только на три прохода (P1-P3). Ограниченное число отрывков следует принимать во внимание для экспериментов, которые требуют длительных периодов культуры или нескольких отрывков. Кроме того, было сообщено, что после P3 клетки начинают менять свою морфологию и уменьшить экспрессию E-кадхерин, так что длительная культура может вызвать эпителиально-мезенхимальный переход (EMT)18. Недавно было продемонстрировано, что прогестерон предотвращает ЭМТ в амниотических эпителиальных клетках яйцеклетки19,20, поэтому было бы интересно проанализировать эффект различных концентраций прогестерона в среде культуры HAEC, чтобы избежать мезенхимального фенотипа после третьего прохода.

Во всех предыдущих докладах, где HAEC были изолированы, амнион, как предполагается, равномерной ткани, несмотря на возможную неоднородность эпителиальных популяций, которые составляют всю мембрану. В отличие от этого, этот протокол делит мембрану на три анатомические области, чтобы отдельно изолировать и культуры HAEC с учетом предыдущих морфологических и генных экспрессии докладов, которые предлагают функциональные различия. Также нет необходимости очищать через сортировку клеток, чтобы получить только эпителиальные популяции, о чем свидетельствует обнаружение маркера E-кадерин во время проходов до P2.

Было показано, что изолированные HAEC из каждого из мембранных регионов имеют аналогичное выражение плюрипотентного ядра, являясь скрытым резервуаром клеток со стеблей. В этом контексте эти клетки могут быть использованы в пробирке для изучения молекулярных механизмов, таких как динамическая локализация связанных с плюрипотентностью транскрипционных факторов или их способность оставаться тихим, несмотря на выражение связанных с раком генов, независимо от их анатомической области происхождения. Тем не менее, будущие исследования должны учитывать молекулярные различия, о которых сообщалось (гены глобального выражения, метаболическая активность, сигнальные пути) между каждым регионом, что будет иметь последствия для их применения в регенеративной медицине. Ранее мы сообщали о различных экспрессии генов, участвующих в PI3K / AKT и фокусных спарений сигнализации пути между различными амниотических регионов РНК-сек6. PI3K/AKT регулирует самообновление и поддерживает плюрипотентность в HPSC, в то время как активация фокусной адгезионной киназы способствует их дифференциации21,22. Таким образом, мы предлагаем охарактеризовать роль обоих путей в HAEC, изолированных от различных анатомических регионов во время протоколов дифференциации линий. Кроме того, несколько исследований демонстрируют различия между обоими регионами относительно клеточных компонентов, молекулярной функции и биологических процессов. Например, регион-специфические экспрессии генов и распределение белка аквапоринов, которые участвуют в процессе транспортировки интраимбранного поглощения, были зарегистрированы23. Другое исследование сравнило miRNome по microarrays, показывая регион-специфическое выражение miR-145 и miR-143, последнее мочь posttranscriptially отрегулировать prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 под специфическими условиями such as работа на термине16. Кроме того, плацентарная область представляет более высокое митохондриальное дыхание, но более низкое обнаружение реактивных видов кислорода по сравнению с отраженной тканью15. Рассекать амнион в отраженных и плацентарных регионах рекомендуется изолировать HAEC и анализировать их специфические свойства отдельно, такие как высвобождение факторов роста и цитокинов, их низкая иммуногенность, производство внеклеточной матрицы, эффект их условной среды в кокультурности с другими типами клеток, и новые функции, такие как их способность поддерживать линии HPSC как слойподачи 24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Наше исследование было поддержано грантами Национального института Перинатологии Мексики (21041 и 21081) и CONACYT (A1-S-8450 и 252756). Мы благодарим Джессику Гонсалес Норрис и Лидию Юририю Паредес Вивас за техническую поддержку.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Culture reagents
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific/Gibco 21985023 55 mM
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific/Gibco 15240062 100X
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific/Gibco 12430054 Supplemented with high glucose and HEPES
EDTA Thermo Fisher Scientific/Ambion AM9260G 0.5 M
Embryonic stem-cell FBS, qualified Thermo Fisher Scientific/Gibco 10439024
Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher Scientific/Gibco 11140050 100X
Paraformaldehyde any brand
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific/Gibco 10010023 1X
Saline solution (sodium chloride 0.9%) any brand
Sodium Pyruvate Thermo Fisher Scientific/Gibco 11360070 100 mM
Trypsin/EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific/Gibco 25300054
Disposable material
100 µm Cell Strainer Corning/Falcon 352360
100 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3526
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3516
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube any brand with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.
Sterile cotton gauzes
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL any brand
Sterile surgical gloves any brand
Equipment
Biological safety cabinet
Centrifuge
Micropipettes
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Sterile beakers of 500 mL
Sterile plastic cutting board
Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps
Sterile stainless steel container
Sterile tray
Tube Rotator MaCSmix
Antibodies and Kits Antibody ID
Anti-E-cadherin BD Biosciences 610181 RRID:AB_3975
Anti-KI67 Santa Cruz 23900 RRID:AB_627859)
Anti-NANOG Peprotech 500-P236 RRID:AB_1268274
Anti-OCT4 Abcam ab19857 RRID:AB_44517
Anti-SOX2 Millipore AB5603 RRID:AB_2286686
Anti-SSEA-4 Cell Signaling 4755 RRID:AB_1264259
Anti-TRA-1-60 Cell Signaling 4746 RRID:AB_2119059
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11029 RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11036 RRID:AB_10563566
Tunel Assay Kit Abcam 66110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, (6), 700-708 (2016).
  2. Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC). Gaceta Medica de Mexico. 151, (1), 66-74 (2015).
  3. Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures. Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).
  4. Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 1, Unit 1E 6 (2010).
  5. Garcia-Castro, I. L., et al. Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons. PLoS One. 10, (12), 0146082 (2015).
  6. Garcia-Lopez, G., et al. Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium. Experimental Cell Research. 375, (1), 31-41 (2019).
  7. Yang, P. J., et al. Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation. Acta Pharmacological Sinica. 39, (8), 1305-1316 (2018).
  8. Zou, G., et al. MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation. International Journal of Molecular Medicine. 41, (4), 1983-1991 (2018).
  9. Avila-Gonzalez, D., et al. Capturing the ephemeral human pluripotent state. Developmental Dynamics. 245, (7), 762-773 (2016).
  10. Niknejad, H., et al. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. European Cells & Materials. 15, 88-99 (2008).
  11. Miki, T. Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells. American Journal of Reproductive Immunology. 80, (4), 13003 (2018).
  12. Wu, Q., et al. Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells. International Journal of Molecular Medicine. 39, (4), 918-926 (2017).
  13. Hammer, A., et al. Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G. American Journal of Reproductive Immunology. 37, (2), 161-171 (1997).
  14. Benirschke, K., et al. Anatomy and Pathology of the Placental Membranes. Pathology of the Human Placenta. Springer. 268-318 (1995).
  15. Banerjee, A., et al. Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane. Placenta. 36, (11), 1329-1332 (2015).
  16. Kim, S. Y., et al. miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term. PLoS One. 6, (9), 24131 (2011).
  17. Han, Y. M., et al. Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion. Biology of Reproduction. 79, (5), 954-961 (2008).
  18. Alcaraz, A., et al. Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells. Cell Transplantation. 22, (8), 1351-1367 (2013).
  19. Canciello, A., et al. Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties. Scientific Reports. 7, (1), 3761 (2017).
  20. Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. Amniotic Epithelial Cell Culture. Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).
  21. Singh, A. M., et al. Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 10, (3), 312-326 (2012).
  22. Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal. Stem Cells. 34, (7), 1753-1764 (2016).
  23. Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies. Physiological Reports. 3, (3), 12320 (2015).
  24. Avila-Gonzalez, D., et al. Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos. Stem Cell Research. 15, (2), 322-324 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics